JP6422172B2 - 結合解離プローブを用いた観察方法 - Google Patents
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Description
所定の条件の下で光を発する発光物質を含むプローブであって、前記標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すプローブを含む媒体を、前記試料と接触させた状態で、前記所定の条件の下で前記発光物質が発する光を輝点として含む輝点画像を得る工程をそれぞれ異なる時間に複数回行い、複数の輝点画像を得る撮像工程と、
前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記標的物の観察画像を生成する観察画像生成工程と
を含み、
前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下である、
方法。
(2) 前記観察画像生成工程が、前記複数の輝点画像の各々について、それに含まれる輝点の位置の情報を求め、前記複数の輝点画像からの前記情報に基づいて前記観察画像を生成する工程である、(1) に記載の方法。
(3) 前記試料が2以上の標的物を含み、
1つの試料に対して、前記撮像工程を、前記各標的物に特異的な前記プローブを用いて順に行い、
前記観察画像生成工程が、前記各撮像工程から得られた前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記各標的物の観察画像をそれぞれ生成する工程である、
(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記観察画像生成工程で生成された、前記試料中の前記各標的物の観察画像を重ね合わせて、前記試料中の前記2以上の標的物の観察画像である多重観察画像を生成する多重観察画像生成工程を更に含む、(3)に記載の方法。
(5) 前記発光物質が蛍光物質であり、
前記所定の条件が励起光照射である、
(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記プローブと、前記標的物との組み合わせが以下の群:
前記プローブが前記発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物がアクチン重合体である組み合わせ;
前記プローブが前記発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が微小管である組み合わせ;
前記プローブが前記発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が中間径フィラメントである組み合わせ;及び
前記プローブが前記発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下のアミノ酸配列、又は、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドあり、前記標的物が接着斑である組み合わせ
から選択される、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 前記プローブが、前記発光物質と連結された、前記標的物に対する抗体又は抗体の断片を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 前記抗体の断片がFabフラグメントである、(7)に記載の方法。
(9) 所定の条件の下で光を発する発光物質を含み、
標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すことが可能である、前記標的物を標識するためのプローブであって、
前記標的物がアクチン重合体であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
前記標的物が微小管であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
前記標的物が中間径フィラメントであり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、或いは
前記標的物が接着斑であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下のアミノ酸配列、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドで、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
プローブ。
(10) 前記発光物質と連結された、前記標的物に対する抗体又は抗体の断片を含む、(9)に記載のプローブ。
(11) 前記抗体の断片がFabフラグメントである、(10)に記載のプローブ。
(12) (9)〜(11)のいずれかに記載のプローブを少なくとも含む、標的物を標識するための試薬キット。
(13) (9)に記載のプローブにおける、標的物を認識する部位のスクリーニング方法であって、
前記部位の候補物質、又は、前記候補物質を一部に含む物質を固相担体に固定する固定化工程と、
媒体中で、発光物質と連結された標的物と、前記固定化工程で得られた固相担体とを、前記標的物と前記候補物質とが結合して形成される結合体における前記発光物質による発光が1分子単位で観察できる条件で、接触させながら観察する観察工程と、
前記観察工程での観察に基づいて、前記結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下となる前記候補物質を、前記部位として選抜するスクリーニング工程と
を含む方法。
(14) 前記候補物質が、前記標的物に対する抗体を産生するハイブリドーマのライブラリーからの抗体又は抗体の断片であり、
前記固定化工程において、前記抗体を固相担体に固定する、(13)に記載の方法。
1.IRISの原理
本発明者らは本発明の観察方法をIRIS(image reconstruction by integrating exchangeable single-molecule localization, 交換性単分子ローカライゼーションによる画像再構築)と命名した。
2.複数の標的物の観察
本発明の観察方法は、1つの試料中に複数の標的物が存在する場合にも好適に実施することができる。
3.試料及びプローブの説明
観察に用いる試料は、典型的には、細胞、複数の細胞からなる組織等の生体試料である。試料が生体試料である場合、固定した状態の試料を用いることが好ましく、必要に応じて更に透過処理した試料を用いることが特に好ましい。
前記プローブが発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物がアクチン重合体である組み合わせ;
前記プローブが発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下、好ましくは357以下、より好ましくは327以下、最も好ましくは307のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下、好ましくは358以下、より好ましくは328以下、最も好ましくは308のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下、好ましくは88以下、より好ましくは58以下、最も好ましくは38のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下、好ましくは958以下、より好ましくは928以下、最も好ましくは908のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下、好ましくは344以下、より好ましくは314以下、最も好ましくは294のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が微小管である組み合わせ;
前記プローブが発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下、好ましくは958以下、より好ましくは928以下、最も好ましくは908のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下、好ましくは638以下、より好ましくは608以下、最も好ましくは588のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下、好ましくは587以下、より好ましくは557以下、最も好ましくは537のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下、好ましくは393以下、より好ましくは363以下、最も好ましくは343のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が中間径フィラメントである組み合わせ;及び
前記プローブが発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下、より好ましくは524以下、最も好ましくは504のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下、好ましくは495以下、より好ましくは465以下、最も好ましくは445のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下、好ましくは441以下、より好ましくは411以下、最も好ましくは391のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下、好ましくは301以下、より好ましくは271以下、最も好ましくは251のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下、好ましくは299以下、より好ましくは269以下、最も好ましくは249のアミノ酸配列、又は、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドあり、前記標的物が接着斑である組み合わせ
から選択されることが好ましい。前記各組み合わせにおいて結合体の半減期のより好ましい範囲は上記の通りであり、特に10ミリ秒以上500ミリ秒以下或いはより短い時間であることが好ましい。
4.顕微鏡を用いる本発明の観察方法の一実施形態
本発明による観察方法に使用する装置は特に限定されない。
5.プローブ及びキット
本発明はまた、前記プローブ自体、並びに、前記プローブを少なくとも備えるキットを提供する。
6. スクリーニング方法
本発明はまた、前記プローブにおける、標的物を認識する部位(標的物認識部位、又は、結合物質ともいう)のスクリーニング方法であって、
前記部位の候補物質、又は、前記候補物質を一部に含む物質を固相担体に固定する固定化工程と、
媒体中で、発光物質と連結された標的物と、前記固定化工程で得られた固相担体とを、前記標的物と前記候補物質とが結合して形成される結合体における前記発光物質による発光が1分子単位で観察できる条件で、接触させながら観察する観察工程と、
前記観察工程での観察に基づいて、前記結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下となる前記候補物質を、前記部位として選抜するスクリーニング工程と
を含む方法を提供する。
<1. 実験1>
方法
プラスミド及び試薬
N末端にFLAG (配列番号2)をタグ付けしたEGFP (配列番号1)をコードする発現プラスミド(pFLAG-EGFP-C1)と、C末端に3×FLAG (配列番号3)をタグ付けしたEGFPをコードする発現プラスミド(p3×FLAG-EGFP-N3)を、それぞれ、pEGFP-C1ベクター及びpEGFP-N3ベクター(Clontech Laboratories, Inc)を用いて構築した。
BC055332 (MAP4), BC114948 (タウアイソフォーム3), BC101936 (タウアイソフォーム4), BC062891 (KIF1A), BM559026 (Plectin-1), CF282569 (Talin1) 及びBC035404 (FAK)。
交換性タンパク質プローブの製造とスクリーニング
微小管、中間径フィラメント及び接着斑の超解像用交換性プローブを見出すために、各標的構造に局在化できることが知られているタンパク質(ポリペプチド)及びタンパク質断片をプローブの候補分子として試験した。ここでプローブが「交換性」であるとは、標的構造への結合と脱離を繰り返すことができることを指す。
(1)前記構造での標的物の分布を、SiMS画像を足し合わせた画像において確認することができる;
(2)SiMSイメージング(撮像工程)の後でプローブを洗浄除去することができる;
(3) 結合したプローブは、標的物から急速に解離することができる(半減期500ms以下);
(4)各輝点の中心位置を積算することにより標的物の像を再構築することができる。
IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順
Xenopus laevis XTC細胞を、10%ウシ胎児血清を添加した70% ライボビッツ(Leibovitz’s) L15培地中で培養した。種々の交換性プローブを用い、固定XTC細胞から連続的に取得した多数の蛍光単分子輝点(SiMS)画像(1つのプローブあたり20,000〜50,000フレーム)から、多重染色超解像を作製した。血清を含まない70% ライボビッツL15培地中で0.1 mg/mlポリ-L-リジンと10 μg/mlフィブロネクチンとで被覆したカバーガラス上に前記細胞を展開し、明確なストレスファイバー及び接着斑(focal adhesions)を形成させた(文献33)。2時間経過後、前記細胞を、3.7% PFA及び0.5% Triton-X 100を含む細胞骨格用緩衝液(10 mM Mes pH6.1, 90 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mMグリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA))を用いて固定及び透過処理した。4%ウシ血清アルブミンにより30分間ブロッキングした後、酸素除去用混合物(200 μg/mlグルコースオキシダーゼ、35 μg/ml カタラーゼ、4.5 mg/ml グルコース, 0.5% 2-メルカプトエタノール)(文献34)を添加した前記Hepes緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 90 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 μM DTT)からなるイメージング用溶液中で、前記細胞に、精製IRISプローブを接触させた。IRISプローブの濃度は1〜100nMとした。前記酸素除去用混合物を用いない場合は、SiMS画像を数万回取得した後のレーザー照射によるダメージが顕著であった。
(a) 明視野での撮像;
(b) 落射蛍光によるSiMS画像(輝点画像)の撮像(1フレームの露光時間: 50ms, フレームレート: 20Hz(1秒間に20フレーム), 連続撮像フレーム数: 250フレーム);
(c) TIRFによるSiMS画像(輝点画像)の撮像(1フレームの露光時間: 50ms, フレームレート: 20Hz(1秒間に20フレーム), 連続撮像フレーム数: 250フレーム)。
IRISでの画像再構築の手順
個々の蛍光輝点の中心位置をブランク画像上にサブピクセル精度でプロットし、超解像を再構築した。プロットした点の数は典型的には106〜108個であった。この顕微鏡の点拡がり関数(a point-spread function, PSF)の、DAOSTORM(文献14)と呼ばれるコンピュータプログラムを用いたフィッティングにより、サブピクセル精度で中心位置を推定した。顕微鏡ステージのドリフトを補正するために、上記撮像手順の各セットで得られる明視野像の自動補正関数AN(xdrift, ydrift)によりドリフト距離を算出した:
明視野像における所定の領域内で、I0(x,y)とIN(x+xdrift,y+ydrift)との積を積算する。変数xdrift及びydriftの関数であるAN(xdrift, ydrift)は、前記二つの明視野像が一致する場合に、最大となる。ImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)におけるカスタマイズされたプラグインを用いて、AN(xdrift, ydrift)が最大となるxdrift及びydriftを算出した。はじめに、第Nセットの明視野像のドリフトを、算出された前記xdrift及びydriftを用いてピクセル精度で補正した。更にドリフト距離をサブピクセル精度で決定するために、第1セット及び第Nセットでの明視野像及び補正された明視野像を、バイキュービック法を用い拡大した。拡大された画像のAN(xdrift, ydrift)を用いて、ドリフト距離をサブピクセルの精度で決定した。第NセットでのSiMS画像中の輝点の中心位置を、前記ドリフト距離を用いて補正した。補正後の中心位置をプロットすることにより、超解像を生成した。Lifeactによる再構築画像(観察画像)又はPlectin-1による再構築画像(観察画像)を生成する際には、10フレーム以上または20フレーム以上連続して観察された輝点の位置は用いなかった。これら二つのプローブは、強い励起レーザー出力を用いたときに標的物に結合する場合があった。
観察対象物のz位置をマッピングするための画像処理
TIRF励起光の強度はカバーガラスから遠ざかると指数関数的に低減することから、TIRF画像と、落射蛍光画像との比率から観察対象物の高さを推定した。カバーガラス表面からのz位置を、文献18に記載の、低融点アガロースゲル中でのカバーガラスに対し傾斜した蛍光微小管を用いた方法により測定した。HiLight488標識チューブリンをCytoskeleton, Inc.から購入した。前記標識微小管は文献18に記載の方法に従い調製した。一方の端がカバーガラスに接触した傾斜した微小管をTIRF及び落射蛍光により撮像した。落射蛍光画像はz-スタック画像(0.2μmステップサイズ)として取得した(図14a)。落射蛍光画像の微小管に沿った強度線プロファイルにおいて、最も高強度のx-y位置を用いて、傾斜した微小管と焦平面との交点(図14a矢印)を決定した。zスタック画像間で前記交点をつなぐことにより、傾斜した微小管に沿った各点のz方向距離を求めた。各点のz方向距離を、TIRF画像での微小管の強度と底位置の落射蛍光画像での微小管の強度との比に関連付けることにより、TIRF法での励起光強度のzプロファイルを決定した(図14b)。このzプロファイルを単一指数関数的減衰関数にフィットさせた(図14b)。z位置を、イマージョンオイルと前記イメージング用溶液との間の屈折率の違いを勘案して0.82の係数で再度スケール調整した(文献18)。前記指数関数の逆関数を用いて、観察対象物のz位置を次式により決定した:
三種の細胞骨格のz位置マップは、TIRFによるIRIS画像(観察画像)の、落射蛍光によるIRIS画像(観察画像)に対する比の画像から変換した。この目的のために、蛍光輝点のピーク強度を、DAOSTORMを用いてフィッティングした。輝点の中心位置にピーク強度をプロットすることによりIRIS画像を再構築した。得られたz位置マップは、TIRFによるIRIS画像と落射蛍光によるIRIS画像とを足し合わせた画像での蛍光強度を、閾値によりマスクし、細胞骨格のない領域でのノイズを除去した。アクチンストレスファイバー等の層状構造では、算出されたz位置は、該構造のz軸方向での重心の高さ位置を示す。
微小管プラス端の動きの生細胞イメージング
EGFP融合EB1の発現プラスミドによりXTC細胞をトランスフェクトした。3〜4日後、該細胞に対し、EB1-EGFPのライブセルイメージングを1秒間インターバルで行った。各インターバル期間に、落射蛍光観察のための励起光による蛍光の露光時間100msでの撮像と、全反射蛍光観察のための励起光による蛍光の露光時間100msでの撮像とを行った。このとき、各励起光は、生細胞を傷めないようにレーザーパワーをIRIS超解像撮像の際の20%程度に低減させて照射した点を除いて、IRIS超解像について上記した条件で照射した。各撮像時点で、交互に全反射照明及び落射照明を用いて2つの蛍光画像を100ミリ秒の露光時間で取得した。ImageJプラグインである Speckle TrackerJ (文献33、37) を用いてEB1で標識された微小管プラス端を追跡した。追跡された微小管プラス端のz位置を上述の方法で算出した。微小管プラス端の部位の速度を、5つの連続した撮像時点でのそのx-y位置の線形近似により算出した。
結果
プローブ候補のスクリーニング試験の結果は以下の通りであった。
IRISによる高標識密度でのアクチンフィラメントの超解像
本発明者らは、一般的なアクチンマーカーであるLifeactを用いてIRIS法により超解像を生成できるかを確認した。Lifeactは生細胞及び固定細胞におけるアクチンフィラメントを染色する短いペプチドである(文献10)。Lifeactはアクチンフィラメント上で0.4秒以内に交換される性質を有する(文献10)。本発明者らは単分子輝点(SiMS)顕微鏡法によりLifeactの高速交換性を確認している(文献11-13)。Atto488標識Lifeactの滞留時間は、半減期23ミリ秒の単一指数関数的減衰を示した(図9a)。本発明者らはイメージング用溶液中でのAtto488標識Lifeact濃度を2.4 nMとし、488nmの全反射照明を用いた露光時間50ms/フレーム、フレームレート20Hzでの連続撮像でin vitroでのアクチンフィラメント上でのLifeactのSiMS画像を2×105枚取得した。各蛍光輝点の中心位置をDAOSTORM(文献14)と呼ばれるコンピュータプログラムを用いて決定した(図9b)。前記2×105フレームの輝点画像における数多くのLifeact輝点からの位置情報を積算してアクチンフィラメントの画像を再構築した(図5b及び図9c)。単一のアクチンフィラメントの平均幅は、高いローカライゼーションの精度を担保するために高輝度の輝点(上位約12%)のみを用いて再構築した画像での半値全幅(FWHM)として23nmであった(図5c及び図9d)。
IRISプローブのスクリーニング法の確立
Lifeactプローブを用いたデータにより決定された必要な分子的特徴を踏まえて、本発明者らは、他の細胞構造に対するIRISプローブを速やかに決定する効率的な方法を確立した。標的物に結合することが知られているタンパク質断片とEGFPとを融合してプローブ候補を生成した。生細胞蛍光単分子スペックル(SiMS)顕微鏡法(文献11,12)もプローブ候補を試験するために有用である。しかし本発明者らは、EGFP融合プローブ候補を発現する細胞の粗溶解液を固定細胞と接触させることにより、プローブ候補の結合特異性と解離動態を容易に明らかにできることを見出した。本発明者らは、以下の4工程によりIRISプローブを選択した:
(i)50ms又は100msのインターバルで10,000フレームのSiMS画像(輝点画像)を撮像し、積算したSiMS画像中で標的に局在できなかったプローブ候補は除外した;
(ii) 洗浄により容易に除去できないプローブ候補は除外した;
(iii) 解離速度の高いプローブ候補(半減期が10〜500ms、図11参照)を選択した;
(iv) プローブ候補が標的に局在できることを再構築IRIS画像(観察画像)において確認した。
IRISによる複数の標的物の超解像
アクチン、微小管、中間径フィラメント、及び接着斑の観察のためのIRISプローブとしては、Lifeact、CLIP-170断片(残基3-309)、Plecin-1断片(残基4022-4364)、及びフォスファチジルイノシトール-(4)-フォスフェート5-キナーゼタイプIγ-90 (PIPKIγ)断片(残基641-668)がそれぞれ好適であることを見出した(図6)(文献15-17)。IRISプローブの交換性を利用して、異なる4種の細胞骨格構造に前記IRISプローブが結合した画像を順次連続して取得した。
生細胞での微小管プラス端の挙動と、細胞骨格ネットワークの超解像との対比
本発明者らは、接着斑とストレスファイバーの近傍では、微小管の高さが局部的に変化することを見出した。微小管が、接着斑及びストレスファイバーと交差するとき、ガラス表面から100nmの位置から200nmの位置へと持ち上がっていた(図8a矢頭, 8b, 16)。接着斑の成分はガラス表面から30-から80nmの高さに位置する(文献19)。従って、持ち上がった微小管は接着斑と接触せずアクチンストレスファイバー上に乗り上げていると考えられる。
考察
考察1:PAINTとの比較
文献20(非特許文献4)では、PAINT(point accumulation for imaging in nanoscale topography)と呼ばれる手法が報告されている。この文献では、PAINTによって、水溶液と脂質二重層との間を素早く行き来する蛍光色素Nile-redを用いて脂質二重層の形態を超解像観察したことが開示されている。しかし、Nile-redは、特定の脂質分子種に結合解離するプローブではない。このため脂質膜を構成する特定の脂質分子種の位置を高い精度で決定できない。一方、IRISのプローブは、細胞内に存在する多種のタンパク質の中の特定の標的タンパク質に結合解離し、その分子の位置を高い精度で決定できる。加えてIRISのプローブ交換によって複数の標的物の分布を得るという概念は、このPAINTの概念に含まれてない。IRISによる多種の標的物の高分解能画像化は、このPAINTの概念では実現できない。またこの文献ではPAINTにおいて観察回数を増やすことによって解像度を高めることは開示していない。その理由は、観測回数を増やしても、標的物である脂質膜が固定されていないことから、その形状変化によって解像度が高まらないためであると考えられる。加えて標識密度の問題は、その数年後にようやく未解決の問題として当業者に広く認識されたためであると考えられる(文献4-7)。
考察2:プローブ
上記表に示す通り、本発明者らは、19のプローブが実際にIRIS法に有効であることを確認した。上記プローブは、標的物物質に会合することが知られている結合パートナーを用いたプローブであったが、これには限定されない。ファージディスプレイ、酵母ツーハイブリッド系等のタンパク質の相互作用を確認するアッセイを用いることで、有用なIRISプローブをスクリーニングすることができる。
<2.実験2>
2.1.ポリクローナル抗体からのFabプローブの作製方法
抗p40抗体を含む抗血清は、当研究室で作製した抗原 (Xenopus laevis由来p40) を使ってウサギで作製された。抗原を充填したアフィニティーカラムにウサギ抗血清を入れ、ポリクローナル抗体をカラムに吸着させた。カラム内のpHを段階的に低下させ(pH 5 〜pH 2)、吸着させた抗体を溶出させた。高いpH(pH 4 〜 pH 3.5)で溶出された画分2 mlをProtein A ビーズ(Protein A Sepharose CL-4B, GE)の50%スラリー溶液1.4 mlに加え、4 ℃で一晩かけて抗体をビーズに吸着させた。吸着されなかった抗体をPBSで洗浄して取り除いたのち、ビーズを1 mlのPBSに懸濁した。このビーズの懸濁液にDMSOに溶かした1 μg/μl DyLight 488 NHS Ester (ThermoScientific)を50 μl加え、室温で1時間かけて抗体を蛍光標識した。未反応のDyLight 488 NHS EsterはPBSで洗浄して除去し、遠心してビーズのみを回収した。ビーズに吸着した抗体からFabフラグメントを作製するため、Digestion Buffer (50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM Cysteine-HCl, 2 mM EDTA)に溶かした7 μg/ml パパインを1 ml加え、37℃で1時間反応させた。遠心後、Fabフラグメントの含まれる上清を回収し、1 mg/mlロイペプチンを1 μl加え、パパインの活性を阻害した。得られたFabフラグメントを、抗原を充填したアフィニティーカラムに入れ、前記Fabフラグメントを吸着させた。カラム内のpHを段階的に低下させ、高いpH(pH 5 〜 pH 4)で溶出された画分のFabフラグメントを得た。このようにポリクローナル抗体からのFabフラグメントの作製は、カラム精製を2回行った。1回目のアフィニティーカラムによって抗原結合力の弱い抗体を精製した。その抗体からさらに抗原結合力の弱いFabフラグメントを作製した。2回目のアフィニティーカラムによって、まだ抗原結合力が残っているFabフラグメントを精製した。この方法で調製されたFabフラグメントはIgGに由来するものである。
2.2.アクチンのIRIS超解像イメージング
Arp2/3複合体観察用細胞試料の調製
実験1の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」で詳述した手順により、Xenopus laevis XTC細胞を固定及び透過処理した。4%ウシ血清アルブミンにより30分間ブロッキングした後、酸素除去用混合物(200 μg/mlグルコースオキシダーゼ、35 μg/ml カタラーゼ、4.5 mg/ml グルコース, 0.5% 2-メルカプトエタノール)を添加したHepes緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 90 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 μM DTT, 0.1% Triton X-100)からなるイメージング用溶液中で、前記細胞に、上記のFabプローブを接触させた。前記イメージング用溶液中でのFabプローブ濃度は、100 nMとした。
実験1の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」と同様に、Olympus PlanApo NA 1.45 ×100対物レンズと、×2 中間レンズと、EM-CCDカメラ(Evolve 512, Roper)とを備え、MetaMorphソフトウェア(Molecular Device)により制御された倒立顕微鏡(Olympus IX83-ZDC)を用いてSiMS画像(輝点画像)を取得した。TIRF観察のために、488 nmレーザー線(50mW)を照射して蛍光標識された前記Fabプローブを励起した。1フレームの露光時間は100ミリ秒、フレームレート(撮像速度)は10Hz (1秒間に10フレーム)で250フレームずつ連続撮像し、合計33,750フレームのSiMS画像(輝点画像)を撮像した。
2.3.結果
図17にアクチン重合促進因子であるArp2/3複合体のp40サブユニットに対するウサギ由来のポリクローナル抗体から作成された前記Fabプローブによる再構築画像を示す。細胞の辺縁領域にp40が多く分布することが知られており、その通りの分布がFabプローブで可視化された。
<3.実験3>
3.1.Fabプローブのスクリーニング
ハイブリドーマのライブラリー(1200サンプル)は、抗原としてFLAGペプチド(配列番号2)を用いて作製された。マウスを抗原で免疫したのち、腸骨リンパ節よりリンパ球を回収、マウスミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマを作成する。ハイブリドーマは希釈培養によってライブラリーとした。ハイブリドーマライブラリーから培養上清をサンプル毎に回収し、Protein Gを固相化した96 ウェルガラスボトムプレートに反応させることで、培養上清中の抗体を底面ガラスの表面に固定した。
2.2.アクチンのIRIS超解像イメージング
FLAGタグ融合アクチン発現XTC細胞試料の調製
配列番号20に示す塩基配列によりコードされるFLAGタグ融合アクチンをXTC細胞で発現させた。
上記発現プラスミドによりXenopus laevis XTC細胞を次の手順によりトランスフェクトした。1 μg/μlのFLAG融合アクチンの発現プラスミド 3μlを無血清培地(70%希釈Leibovitz's L-15 medium) 200 μlに溶かし、1 mg/mlのPolyethylenimine, linear, M.W. 25,000 (Polysciences)を8 μl加え、ボルテックスした。30分室温で静置した後に1mlの血清入り培地(70%希釈Leibovitz's L-15 medium、10%FCS添加)を加えた。このプラスミドの含まれた溶液と6ウェルにまいたXTC細胞の培地を交換し、一晩かけて細胞にプラスミドを取り込ませた。
トランスフェクトの3〜4日後に、実験1の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」で詳述した手順により、前記細胞を固定及び透過処理した。4%ウシ血清アルブミンにより30分間ブロッキングした後、酸素除去用混合物(200 μg/mlグルコースオキシダーゼ、35 μg/ml カタラーゼ、4.5 mg/ml グルコース, 0.5% 2-メルカプトエタノール)を添加したHepes緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 3 mM MgCl2, 100 μM DTT, 1μg/ml ロイペプチン)からなるイメージング用溶液中で、前記細胞に、上記のFabプローブをそれぞれ接触させた。前記イメージング用溶液中でのFabプローブ濃度は3 nMとした。
実験1の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」と同様に、Olympus PlanApo NA 1.45 ×100対物レンズと、×2 中間レンズと、EM-CCDカメラ(Evolve 512, Roper)とを備え、MetaMorphソフトウェア(Molecular Device)により制御された倒立顕微鏡(Olympus IX83-ZDC)を用いてSiMS画像(輝点画像)を取得した。TIRF観察のために、488 nmレーザー線(50 mW)を照射して蛍光標識された前記Fabプローブを励起した。1フレームの露光時間は50ミリ秒、フレームレート(撮像速度)は20Hz (1秒間に20フレーム)で500フレームずつ連続撮像し、合計120,000フレームのSiMS画像(輝点画像)を撮像した。
2.4.結果
図19に上記のスクリーニング方法で選別された抗FLAGモノクローナル抗体由来のFabプローブによるFLAG融合アクチンのIRIS超解像画像を示す。このIRIS超解像画像の作製に用いたFabプローブとFLAG融合アクチンの結合体の半減期は、203ミリ秒であった。
<4. 文献>
以下に本明細書で参照した文献を記載する。
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Claims (14)
- 標的物を含む試料の観察方法であって、
所定の条件の下で光を発する発光物質を含むプローブであって、前記標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すプローブを含む媒体を、前記試料と接触させた状態で、前記所定の条件の下で前記発光物質が発する光を輝点として含む輝点画像を得る工程をそれぞれ異なる時間に複数回行い、複数の輝点画像を得る撮像工程と、
前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記標的物の観察画像を生成する観察画像生成工程と
を含み、
前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下である、
方法。 - 前記観察画像生成工程が、前記複数の輝点画像の各々について、それに含まれる輝点の位置の情報を求め、前記複数の輝点画像からの前記情報に基づいて前記観察画像を生成する工程である、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が2以上の標的物を含み、
1つの試料に対して、前記撮像工程を、前記各標的物に特異的な前記プローブを用いて順に行い、
前記観察画像生成工程が、前記各撮像工程から得られた前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記各標的物の観察画像をそれぞれ生成する工程である、
請求項1又は2に記載の方法。 - 前記観察画像生成工程で生成された、前記試料中の前記各標的物の観察画像を重ね合わせて、前記試料中の前記2以上の標的物の観察画像である多重観察画像を生成する多重観察画像生成工程を更に含む、請求項3に記載の方法。
- 前記発光物質が蛍光物質であり、
前記所定の条件が励起光照射である、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記プローブと、前記標的物との組み合わせが以下の群:
前記プローブが前記発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物がアクチン重合体である組み合わせ;
前記プローブが前記発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が微小管である組み合わせ;
前記プローブが前記発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が中間径フィラメントである組み合わせ;及び
前記プローブが前記発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下のアミノ酸配列、又は、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドあり、前記標的物が接着斑である組み合わせ
から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記プローブが、前記発光物質と連結された、前記標的物に対する抗体又は抗体の断片を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体の断片がFabフラグメントである、請求項7に記載の方法。
- 所定の条件の下で光を発する発光物質を含み、
標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すことが可能である、前記標的物を標識するためのプローブであって、
前記標的物がアクチン重合体であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
前記標的物が微小管であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
前記標的物が中間径フィラメントであり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、或いは
前記標的物が接着斑であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下のアミノ酸配列、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドで、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
プローブ。 - 前記発光物質と連結された、前記標的物に対する抗体又は抗体の断片を含む、請求項9に記載のプローブ。
- 前記抗体の断片がFabフラグメントである、請求項10に記載のプローブ。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載のプローブを少なくとも含む、標的物を標識する
ための試薬キット。 - 請求項9に記載のプローブにおける、標的物を認識する部位のスクリーニング方法であって、
前記部位の候補物質、又は、前記候補物質を一部に含む物質を固相担体に固定する固定化工程と、
媒体中で、発光物質と連結された標的物と、前記固定化工程で得られた固相担体とを、前記標的物と前記候補物質とが結合して形成される結合体における前記発光物質による発光が1分子単位で観察できる条件で、接触させながら観察する観察工程と、
前記観察工程での観察に基づいて、前記結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下となる前記候補物質を、前記部位として選抜するスクリーニング工程と
を含む方法。 - 前記候補物質が、前記標的物に対する抗体を産生するハイブリドーマのライブラリーからの抗体又は抗体の断片であり、
前記固定化工程において、前記抗体を固相担体に固定する、請求項13に記載の方法。
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