JP2004502434A - 細胞成分間の相互作用に関する量的情報の抽出方法 - Google Patents
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Abstract
生細胞でのタンパク質相互作用をアッセイする方法を記載する。方法は、対象となる成分と第二成分との相互作用の有無を示す検出成分の細胞分布の測定を用いる。方法は、ある成分が、細胞内の所定位置に再分布するよう刺激できるとの知識を用いている。誘導性再分布系は、成分間で特異的な相互作用が生じる場合に測定することができる。再分布刺激が、再分布が誘導される成分以外の細胞の他の系にアッセイ中に影響しない、再分布刺激が本質的に「無効」であることが証明されている誘導系を記載する。また、細胞内成分の細胞内分布に影響する薬剤のハイスループットスクリーニングに有用な抽出緩衝液を記載する。抽出緩衝液は、細胞固定剤と細胞透過剤からなる。抽出緩衝液の組成の最適化及びその種々の細胞種への適用を記載する。
Description
【0001】
分 野
この発明は、細胞に存在し、いずれもがほぼ通常は組成物中で全体に又は主としてタンパク様である2つの成分間の相互作用(つまり、相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用又はタンパク質−タンパク質結合事象である)の測定に関する。これは、現在、「相互作用タンパク質のGFP補助出力(GFP assisted Readout of Interacting Proteins)(GRIP)」」として言及されている。
また、この発明は、細胞内成分の細胞内分布に影響を及ぼす薬剤に対しハイスループットスクリーニングで使用される抽出緩衝液に関する。抽出緩衝液は、細胞固定剤及び細胞透過剤からなる。
【0002】
背 景
相互の、及び他の細胞成分とのタンパク質の相互作用は、ほぼ全ての細胞過程に固有な部分であり、これは、特に細胞内シグナル化システムに当てはまる。情報は、このような一連の相互作用によるシグナル化系をとおして、またシグナル化系間でやりとりされる。タンパク質の機能を研究するために、実際的なストラテジは、最初にタンパク質が相互作用する成分を同定することである。これらの多くは他のタンパク質、時には同種のタンパク質であるが、最も頻繁には、極めて異なるタイプで、非常に異なる機能特性を有する。
【0003】
新規な相互作用の同定は、細胞生物学及びシグナル変換において極めて急速に拡大している研究分野である。この分野での最近の発見に関して注目に値する性質は、細胞表面に見られるリガンド−レセプター相互作用に一般に認められる特異性の程度に匹敵するか、又はそれを超える、パートナーが相互作用する特異性である。相互作用する種の同定は、細胞シグナル化に関与するタンパク質の機能特性において非常に補助し得る新規なシグナル化相互作用を同定する機会をもたらす。さらに、その方法は、相互作用におけるパートナーを混乱させるか、又は束縛し得る新規な薬剤の開発に適用することができるであろう。この作用機序を有する化合物は、シグナル化経路を介して情報の流出を調節することができ、そうすることにおいて、ヒト及び動物の健康管理に関する非常に多くの分野での適用が見出されるであろう。そのような化合物は本質的に極めて選択的で、触媒活性の全体的な阻害に対する必要性なしにその作用を有するので、それらの使用に基づく治療は、多くの従来の活性部位阻害剤に一般的に伴われた、特異性の乏しさと、ダメージを与える副作用という問題を伴わないことが期待される。
【0004】
相互作用種の同定のための既存の方法は、2つの群に分けることができる:第一は、インビトロで一緒にした多少の精製成分を用いてのみ作用し得る方法、例えば対象の成分が細胞環境から単離されるという共通の性質を持つ、表面プラスモン共鳴(微細な波長の方法)、タンパク質質量分析、蛍光相関分光及び異方性手段である。第二の群には、生細胞内で作用することを目的とする全ての方法が含まれる。これらのうち、多くは酵母細胞で作用するように開発されている(酵母2ハイブリッド(two hybrid)、リバース酵母2ハイブリッド及びその変異体)が、哺乳動物細胞系での使用に適合しているものもある。タンパク質の相互作用についての細胞の検出方法は、Mendelsohn, A.R., Brent, R. (1999) (Science 284(5422):1948)によって十分に検証されている。これらの方法の多くは、従来の2−ハイブリッド法から派生している。その方法では、転写活性が、結合した「おとり(bait)」及び「餌食(prey)」成分の相互作用を介して2分した転写因子を一緒にすることで開始されるが、他の方法は、インビボでの生化学的な機能の再構築に依っている。この結果、Rossiら(2000) (Trends in Cell Biology 10:119−122)は、出力が転写ではなく、変異されたβ−ガラクトシダーゼ酵素の再構築である、哺乳動物細胞−ベースのタンパク質−タンパク質相互作用アッセイを開発した。テトラマー酵素の再構築によって、酵素活性をモニターすることができる。さらに、タンパク質−タンパク質の相互作用をモニターする方法は、光学的な出力、つまり蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、又は合致分析(蛍光相関分光の変形)、又は蛍光存在変化に基づいている。最後の3種は単純化されたインビトロ条件下でかなり一般的に適用されるが、生細胞のより複雑な環境に条件を移すための試みもなされている。
【0005】
近年、Tobias Meyerは、2つの異種接合体を細胞に導入する方法を報告した (WO00/17221)。第一の異種接合体は、検出基(例えばGFP)に接合した第一の対象タンパク質からなる。第二の異種接合体は、ホルボールエステルでの刺激により細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質に接合した第二の対象タンパク質からなる。第二タンパク質が、既知の分布で細胞内の内部構造に結合している場合、2つの対象タンパク質間の結合は、検出基が細胞内の内部構造に結合して局在しているので、視覚化することができる。
【0006】
細胞内器官又は区画に「固定」されていないが、サイトゾルで多少可動性のタンパク質(−GFP)は、課される透過度によって主に決定される速度で、細胞透過により周囲の媒体に拡散する。洗剤は、膜を崩壊するのみならず、時間中、細胞内成分を崩壊する傾向があるため、透過によっては細胞内容物の放出を制御しがたい。これに加えて、膜にダメージを与えると、幾つかの非制御プロテアーゼ活性が開始され、同一の意図しない結果を伴う。この現象は、非洗剤性の透過(例えばジギトニン)を用いてもみられる。
【0007】
固定剤は、顕微鏡用生物材料の調製に必要な処理中、細胞において構造上の完全性を保持するために一般に用いられる。細胞内のタンパク質構造の保持又は安定化を目的とする固定剤は、2つの群に分けられる; 有機酸又はアルコール(例えば酢酸、エタノール)のようなタンパク質を凝固する剤及びアルデヒド(例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド)のような架橋タンパク質が不溶性網になる剤である。このような剤による固定速度は、剤が達成し得る化学的な架橋又は凝固の速度と共に、細胞への浸透速度によって決定される。細胞固定の処理と方法は、完全に研究され、化学文献に記載されている(例えば、Fixation for Electron Microscopy by M.A. Hayat, 1981, Academic Press, New York参照)。
【0008】
移動は、通常、成分と固定(又は実際上非可動性の)成分間の相互作用変化による、又は成分の位置もしくは区画の変化、例えば核外細胞質から核自体への移動による、細胞内の少なくともひとつのタンパク質の事実上の可動変化を伴う。相互作用又は区画の変化は、移動を構成する。再分布(Redistribution(登録商標))は、測定可能な事象を移動させる技術である(WO98/45704)。移動は、対象成分が結合している成分、例えば対象成分を保持するモータータンパク質の可動性又は区画の変化を伴う可能性がある。幾つかの移動は、やや顕微鏡的な広がり、例えば細胞質中の可溶性シグナル化タンパク質と隣合うアクチンフィラメント又は細胞内膜との相互作用を伴う。あらかじめ可溶性成分の可動性は、そのような移動で大きく変化されるが、空間的な位置での変化は、顕微鏡的手段では解像できない可能性がある。この場合、再分布シグナルを顕在化するには、対象タンパク質の不動性形態から可動性形態を分離することが望ましい
【0009】
通常、再分布(登録商標)は「画像化」によって測定され、非常に時間がかかり、HT型での薬剤スクリーニングに不都合である。
再分布(登録商標)アッセイは、しばしば特定の対象タンパク質(最も頻繁には、対象タンパク質とGFPのような発光タンパク質との設計された融合タンパク質であるタンパク質)を安定的に発現する細胞系からなる。そのような細胞では、対象成分が、相互作用すべき細胞中の他の成分に対してある程度まで過剰発現される場合がある。これは、細胞で利用可能な限られた数のパートナー成分と物理的に相互作用できない過剰量の対象タンパク質によって、移動事象の遮蔽をもたらすことができる。そのような場合、過剰な対象成分の除去は、生じた移動の非遮蔽に十分であり得る。
透過前の細胞の固定は、そのような場合にいまだ成功していない。というのは、タンパク質全てが、固定剤の影響下でほぼ同程度まで事実上固定化され、その結果、細胞から特異的に除いたり、又は洗い出すことができないためである。
【0010】
発明の要約
SosとGrb2の相互作用は、種々の方法で測定することができる。実施例7に示すように、PDE4A4−SosA接合体とGrb2−EGFP接合体で同時にトランスフェクトした細胞は、SosAとGrb2との結合を示している。実施例8では、接合体は、 PKAcat−hGrb2 及びEGFP−Sos−Ctermである。PKAcat接合体の利点は、PKAが優勢的にその制御サブユニットに結合するように細胞内のcAMPレベルが十分に低いままである限り、相互作用を視覚化するための特別な処理が不要であることである。実施例9では、接合体はCys1−Grb2 及びEGFP−Sos−Ctermである。Cys1接合体の潜在的な利点は、接合体が、PMA又は幾つかの他の活性化刺激での処理時に原形質膜に対して一対の成分を採用することである。この特別な位置は、研究される成分の相互作用を活性化するために必要である可能性がある。
【0011】
実施例3は、各々が異種接合体を発現する2つのプラスミドの同時トランスフェクションによる細胞系の作製に一般的な方法を記載している。この実施例で例示されるように、アンカー−タンパク質としてPDE4A4ベースのアンカープローブを用いることにより、2つの密集した集合物の平均がロリプラムでの処理によって形成される。これらの集合物は、PDE4AのユニークなC−末端ペプチド配列に対する抗体を用いて直接検出することができる。密集した集合物(スポット)は、ロリプラムが除かれるか、又は特定のPDE4阻害剤群のひとつ(例えばRP73401)に対して競合した際に消失するであろう。ロリプラムでの処理が細胞における cAMPレベルに影響を及ぼさないことに留意することが重要である(実施例14)。
【0012】
実施例4は、アンカー−タンパク質としてPKAcatαベースのアンカープローブを用いて、細胞質cAMP濃度が低い際に集合物が細胞質に形成されることを記載している。これらの集合物は、PKAc又はPKA制御サブユニットに対する抗体を用いて直接検出することができる。これらの集合物は、cAMP濃度が上昇すると、細胞質に分散する。
実施例5は、アンカー−タンパク質としてPDE4A1ベースのアンカープローブを用いて、他の点では未処理の細胞の細胞質中に小さな核周囲スポットが形成されることを記載している。PDE4A1スポットは、PDE4AのユニークなC−末端ペプチド配列に対する抗体を用いて直接検出することができる。これらのスポットは、ロリプラムが細胞に加えられると、細胞質に分散する。
【0013】
実施例6は、アンカー−タンパク質としてCys1ドメインベースのアンカープローブが、例えばPMAでの処理により活性化されると、原形質膜へ再分布することを記載している。Cys1ドメインの局在化は、(myc又はflag配列が細胞をトランスフェクトするのに用いられる遺伝構築物に含まれる際には) myc又はflag抗原に対する抗体を用いて確認することができる。
【0014】
この文書に記載されるように、固定剤の適用と透過は同時に、可動形態又は非固着形態を自由に細胞から放出させながら、対象タンパク質の固着物、拡散して限定される物又は大部分が不動性形態の物の局所濃度を保持することを目的とする。特に洗剤による細胞透過処理は、適当な時期に比較的不動性のタンパク質、固着タンパク質又は区画化タンパク質を細胞から除くと予測され、その結果、洗剤によって生じる透過と可溶化の速度と、架橋又は固定が生じる速度との均衡を図る必要がある。この均衡は、固定剤と透過剤の相対濃度を制御しながら、これらを注意深く選択することにより、また剤が作用する物理的かつ化学的条件(pH、浸透度又はイオン強度、温度)を制御することによって達成してもよい。
細胞内の器官及び区画を崩壊せずに「浮遊(floating)」タンパク質を細胞から出すレベルまで透過を制御するため、細胞は透過処理中わずかに化学的に固定される。その目的は、まさに「非結合」タンパク質を細胞から出し、次いで残りを化学的に固定させることである。
【0015】
この出願は、細胞内の複雑な細胞内挙動を容易に測定できる方法を開示する。実施例10では、14−3−3タンパク質とBADとの結合で生じるBADの可動性変化は、PDE4A4−14−3−3 及びEGFP−BAD 融合体を用いて測定される。PDE4A4−14−3−3 タンパク質は、ロリプラムでの先立った処理によって細胞内のスポットに固着する。細胞透過剤及び細胞固定剤の組合せからなる緩衝液を用いてGFPに融合した可溶性(又は可動性)BADを抽出することによって、不動性GFPのみが細胞に残り、14−3−3タンパク質への結合によって生じるBADの可動性変化は、蛍光強度変化として読み取ることができる。実施例11は、NFkBの刺激によってサイトゾルから核へのNFkB(p65)の再分布(登録商標)に適用される同一の原理を示している。
細胞固定剤と細胞透過剤との最適比を同定するための抽出緩衝液の最適化を、実施例12に例示する。
【0016】
詳細な説明
この出願の対象である再分布−トラップ法は、PDE4からの位置情報、ある観点では細胞中のGFP−標識蛍光プローブの分布を利用し、特定の成分間の相互作用の有無を示す点で上記の方法と異なる。上記のことは細胞の複雑な環境でのことであり、自然系で生じるのと同様に相互作用を調節し得る因子が影響する見込みがあるので、方法に重要な生理学的関連性を付加している。方法は、細胞が生きており、モニターされながら活性であることを意味する非−破壊性の蛍光画像化に基づくので、また例えばロリプラムでの非−妨害処理に基づいているので、再分布−トラップ法によっても過渡的又は暫定的な相互作用をモニターすることができる。過渡的又は暫定的な相互作用は、成分がホスホリル化されているか、又はさもなければ操作サイクル中に修飾されている(例えばシグナル伝達)際に生じてもよく、そのような修飾は、細胞内シグナル化経路の成分に共通である。方法が共有的な相互作用に依存しておらず、必要な成分が相互作用によって特異的な方向を有してもいないので、方法は、極めて高感度であり、低いアフィニティ相互作用さえ測定することができる。
【0017】
したがって、ひとつの観点は、
(a) 第一の異種接合体が、検出基に接合される第一対象タンパク質からなり、第二の異種接合体が、細胞内の内部構造に特異的に結合できるアンカータンパク質に接合される第二対象タンパク質からなる、
2つの異種接合体を含む細胞を準備し、
(b) 2つの対象タンパク質間の結合を示すアンカー−タンパク質の細胞内分布を模倣する検出基の細胞内分布を検出し、
(c) 化合物を用いて、また用いないで工程(b)を繰り返す工程からなり、
化合物を用いての、又は用いないでの検出基の細胞内分布の変化が、タンパク質相互作用調節化合物を示す、
化合物が細胞内タンパク質相互作用を調節するかどうかを検出する方法に関する。
【0018】
この発明による再分布−トラップ法は、多くのシグナル化成分が特異的な刺激又は処理によって細胞内で特異的な位置に再分布するとの事実を利用している。成分が何らかの方法で標識され、細胞中で視覚化されると、その位置は、多くの画像化に基づく技術によってモニターし、測定することができる。画像化技術は非破壊性であるので、生細胞で測定を行うことができ、この結果、活性過程は、過渡的な事象をモニターする必要があるような、必要な場合に、時間中追跡することができる。この出願は、細胞内成分間の相互作用を研究する系を作製するために、特定の成分がある刺激(「アンカー」刺激)を受けて再分布する知見をどのように利用できるかを詳述している。成分がある刺激によって既知の細胞位置に分布することが知られている場合、別の成分(「おとり」)を第一の物(「アンカー」)に共有的に結合させてもよく、適当なアンカー刺激を与えると、それが結合しているアンカー成分と同一の分布を細胞内で呈することが予測されるであろう。おとり成分と相互作用することが予想される別の成分(「餌食」)は、同一細胞に導入される。餌食成分は、細胞中で視覚化させる何らかの方法で標識される。相互作用が(おそらくは別の「相互作用刺激」を要して)おとりと餌食の間で生じるならば、餌食成分は、アンカー−おとり成分と同一の分布を細胞内で踏襲するが、それも適当なアンカー刺激が適用される場合のみである。したがって、この系を用いて、特定のおとり餌食相互作用と検出可能なおとり成分の分布に影響を及ぼす他の条件とを識別することができる。
【0019】
したがって、再分布−トラップ法は、単離物中の成分が機能サイクルの一部として好ましい再分布を通常示していなくとも、細胞内の成分を相互作用することによって全体的な再分布を課すことができる。アンカー系は、相互作用している成分が、成分間の相互作用を通常は調節することが求められる影響を受けている細胞内の区画又は位置へ再分布するよう設計することができる。一例として、幾つかの成分は、原形質膜の平面に隔離された酵素によって通常はホスホリル化又は脱ホスホリル化される必要がある。そのような成分に対しては、アンカー刺激が原形質膜にアンカープローブを再分布するように選択し、相互作用している成分を適当に修飾できるアンカー系が適当である。そのようなアンカー系の例は、PKCγのCys1ドメインベースの系であろう。
【0020】
また、その方法は、局所特異的な状態が相互作用を生じるのに必要かどうかを研究する目的で細胞内の異なる位置に相互作用を標的化することができる。ひとつの具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分が核区画に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ミトコンドリアの内外膜に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ゴルジ体の異なる領域に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、限局性の接着複合体に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分が、F−アクチン鎖又は微小管束のような細胞骨格構造に標的化される。別の好ましい具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、原形質膜に標的化される。別の好ましい具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ロリプラムの存在下でPDE4A4によって形成されるような細胞質顆粒又は集合物に標的化される。
【0021】
つまり、この発明の詳細な具体例は、細胞内の内部構造への特異的結合が、独力で対象細胞内のシグナル化活性を刺激又は阻害する見込みがほとんどないアンカー刺激によって誘導される方法に関する。
ロリプラム及びRS25344のような他の特異的なPDE4阻害剤に対するPDE4A4の強力なアンカー反応のため、PDE4A4はアンカー種としてもっとも好ましい。さらに、アンカー部位に対するPDE4A4の結合は、PDE4A4分子のC−末端に結合する追加部分の存在によって影響されないと思われ、これらの結合は非常に多様な大きさであってもよい(10kDa未満から、少なくとも150kDaまで)。したがって、この発明の詳細な具体例は、特異的な結合がアンカー刺激ロリプラムの付加によって誘導され、アンカータンパク質がPDE4A4である上記方法に関する。
【0022】
刺激−誘導性分布、例えばPDE4A4アンカー又はPKCαCys1ドメインベースの分布の特別な有用性は、ある同じ細胞において、それ以前にはなかった特徴的な分布に切り替えることができることである。これは、あらかじめ、特徴的な分布が、純粋に、固着された検出可能な成分間の特異的な相互作用の結果であることを保証するだけでなく(刺激に応じたアンカー成分は、検出可能な成分によって修飾されない限り「不可視」である)、この相互作用が、アンカー成分の特異的かつ予想される分布を検出するように形成されるアッセイ機器によって測定できるシグナルを生じることも保証する。事実上、この後者の点は、測定機器又はアッセイ方法を再形成する必要なしに、多くの異なる相互作用を測定でき、アッセイできることを意味している。また、誘導刺激は、スクリーニングアッセイでの基準化合物を生じ、それにより、アッセイに対する最大及び最少の予想シグナルを測定することができる。
【0023】
多くのシグナル化成分は、細胞内で特異的な位置を有し、特定の刺激又は処理によって再分布する。それらの成分が何らかの方法で標識され、細胞中で視覚化されると、幾つかの画像化に基づく技術によってその位置をモニターし、測定することができる。画像化技術は非破壊性であるので、生細胞で測定することができ、この結果、活性過程は、過渡的な事象をモニターする必要がある場合のような必要な際に、時間中追跡することができる。この出願は、細胞内成分間の相互作用を研究する系を作製するために、特定の成分がある刺激(「アンカー」刺激)を受けて再分布する知見をどのように利用できるかを詳述している。成分が本質的に特徴的な細胞分布を有することが知られていれば、別の成分(「おとり」)を第一の物(「アンカー」)に共有的に結合させてもよく、アンカー刺激がなければ、それが結合しているアンカー成分と同一の分布を細胞内で呈することが予測されるであろう。おとり成分と相互作用することが予想される別の成分(「餌食」)は、同一細胞に導入される。餌食成分は、細胞中で視覚化させる何らかの方法で標識される。相互作用がおとりと餌食の間で(おそらくは別の「相互作用刺激」を要して)生じるならば、餌食成分は、最初の環境での特異的な位置によってアンカー刺激が付加されなくても、アンカー−おとり成分と同一の分布を細胞内でも踏襲する。さらに、アンカー成分の本質的に特徴的な分布がアンカー刺激の適用によって解消されれば、そのような系は、特異的なおとり餌食の相互作用と、検出可能な餌食成分の分布に影響する他の条件とを識別するのに有用である。
【0024】
したがって、再分布−トラップ法は、単離物中の成分が機能サイクルの一部として好ましい再分布を通常示さないとしても、細胞内の成分の相互作用によって全体的な再分布を課すことができる。アンカー系は、相互作用成分が成分間の相互作用を通常調節する必要のある影響を受けている細胞内の区画又は位置への再分布を達成するよう設計することができる。一例として、PKAのスポット様細胞質分布は、フォルスコリンの添加で解消することができる;PDE4A1のスポット様細胞質分布は、ロリプラムの添加で解消することができる;ヒストンデアセチラーゼ5 (HDAC5)のスポット様核分布は、トリコスタチンA (TSA)によって解消され; 又はアンカータンパク質の細胞膜に対する特異的結合はPLC−デルタであり、ATPの添加で解消され、細胞質内に分布される。
【0025】
特徴的な分布が特異的な刺激(アンカー刺激)、例えばPDE4A1、PKAcat、PLCデルタ又はHDAC5ベースの刺激によって分散又は解消されるこれらの系について、刺激は、特徴的な分布が、固着され、かつ検出可能な成分間の相互作用の結果であるか、又は細胞内の特徴的な分布を呈する検出可能な成分の幾らか本来的な傾向による結果であるかを確認する手段を提供している。このことは、相互作用についてのアッセイが測定されるある同一の細胞で確認することができる。刺激−誘導性分布を伴うので、アンカー成分について最初の特徴的な分布を有する系は、ある装置及びアッセイプロトコルの構成を用いて多くの異なる相互作用をアッセイできる利点を共有する。各場合のアンカー刺激は、スクリーニングアッセイの基準化合物を再提供し、それにより、アッセイについて最大及び最少の予想シグナルを測定することができる。アンカー刺激が分布を分散しているそれらの系の特に追加できる利点は、分布刺激での細胞の前処理又は同時処理が、アンカー刺激が試験される相互作用を直接又は間接に干渉し得るあらゆる可能性をアッセイ中に除外する必要のないことである。
【0026】
用語「化合物」は、細胞系において生物学的機能を有するか、又は生物学的作用を発揮する何らかの試料を意味することを意図する。試料は生物物質の試料、例えば血液、血漿、唾液、乳、尿を含む体液、又は微生物もしくは植物の抽出物の試料、重金属又は毒素を含む汚染物質含有環境試料であってもよく、又は有機合成もしくは遺伝技術によって調製される化合物又は混合化合物を含む試料であってもよい。化合物は、タンパク質及びペプチドを含む、小さな有機化合物又は生体ポリマーであってもよい。
試験される化合物は、特別な相互作用刺激とみなすことができる。
【0027】
多くの細胞系が、トランスフェクション用に存在する。少数の例が、クセノプスの卵母細胞又は昆虫細胞、例えばsf9細胞系、又は健康な動物もしくは疾患動物から採取される組織あるいは器官から直接単離される哺乳動物細胞(原始細胞)、又は細胞培養条件下で無期限に複製し得る形質転換哺乳動物細胞(細胞系)である。しかし、使用する細胞は哺乳動物細胞であることが好ましい。これは、各細胞型に特異的な複雑な生化学的相互作用に起因している。用語「哺乳動物細胞」は、哺乳動物起源の何らかの生細胞を示すことを意図する。細胞は確立された細胞系であってもよく、その多くはThe American Type Culture Collection (ATCC, Virginia, USA)又は同様の細胞培養コレクションから入手可能である。細胞は、トランスジェニック動物由来組織を含む、哺乳動物組織由来の寿命が限られた原始細胞、又はトランスジェニック組織を含む哺乳動物組織由来の新たに確立された不死細胞系、又は哺乳動物起源の異なる細胞型を融合して得られるハイブリッド細胞もしくは細胞系、例えばハイブリドーマ細胞系であってもよい。細胞は、蛍光プローブの前に、又はそれに加えて、1以上の非天然遺伝子産物、例えばレセプター、酵素、酵素基質を任意に発現してもよい。好ましい細胞系には、繊維芽細胞由来の系、例えばBHK、CHO、BALB、NIH−3T3、又は上皮細胞由来の系、例えばHUVEC、BAE (ウシ動脈内皮)、CPAE (ウシ肺動脈内皮)、HLMVEC (ヒト肺微小管内皮細胞)、又は気道上皮起源の系、例えばBEAS−2B、又は膵臓由来の系、例えばRIN、INS−1、MIN6、bTC3、aTC6、bTC6、HIT又は造血器官起源の系、例えば一次単離ヒト単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球走化因子及びリンパ球群、AML−14、AML−193、HL−60、RBL−1、U937、RAW、JAWS又は脂肪細胞起源の系、例えば3T3−L1、ヒト前−脂肪細胞、又は神経性内分泌起源の系、例えばAtT20、PC12、GH3、筋起源の系、例えばSKMC、A10、C2C12、腎臓起源の系、例えばHEK 293、LLC−PK1、又はニューロン起源の系、例えばSK−N−DZ、SK−N−BE(2)、HCN−1A、NT2/D1が含まれるが、これに限定されない。
【0028】
この発明の実施例は、CHO細胞に基づいている。したがって、繊維芽細胞由来細胞系、例えばBALB、NIH−3T3及びBHK細胞が好ましい。
2つの異種接合体は、トランスフェクト細胞が第一及び第二の異種接合体の双方を同時に発現し、組み込むように、プラスミド、例えばFugeneのような適当なトランスフェクション剤での細胞への適用によって混合される2つの個々のプラスミドとして細胞に導入されることが好ましい(実施例3、実施例4、実施例5及び実施例6参照)。ひとつ又は双方の接合体の導入のための多くの他の手段は、一様に実行可能な手段、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、アデノウイルス及びレトロウイルス法、両接合体をエンコードする2シストロン性(bicistronic)プラスミドなどである。
【0029】
この発明をとおして、用語「タンパク質」は一般的な意味を有するべきである。それには、翻訳産物のみならず、化学的な合成タンパク質が含まれる。細胞内で翻訳されるタンパク質については、天然の、又は誘導される、翻訳後修飾、例えばグリコシル化及び脂質化が起こることが予想され、それらのタンパク質は依然として考慮されるタンパク質である。
細胞内タンパク質相互作用の用語は、同一細胞内の上記のような2タンパク質間の相互作用の一般的な意味を有する。相互作用は、もっとも通常は、その物理−化学的性質が、多少特異的に認識し、その後、関与する2タンパク質成分間の相互作用を可能にする、各タンパク質の1以上の領域又はドメイン間のタンパク質成分間の非共有力に起因している。好ましい具体例では、細胞内相互作用は、タンパク質−タンパク質結合である。
【0030】
発光団は、光を発することによって、成分の空間分布を視覚化及び/又は記録することができる。この発明の好ましい観点では、発光団は、成分と実質的に同様にして再分布することができる。さらに別の発明の具体例では、発光団は、経路の調節によって分布される成分との空間的な結合によって消光することができ、消光は、発光の強度又は寿命の変化として測定される。
好ましい観点では、発光団は蛍光団である。この発明の好ましい具体例では、発光団は、細胞又は細胞類に収容されるヌクレオチド配列によってエンコードされ、発現されるポリペプチドである。例えば、発光団は、一方が発光ポリペプチドからなり、他方が成分からなる2つのポリペプチドの少なくとも各部分の融合体からなるハイブリッドポリペプチドの一部である。実施例がGFPを用いて行われるように、GFPが特に好ましい。
【0031】
この明細書で、用語「緑蛍光タンパク質」(GFP)は、(例えばChalfie, M.ら、(1994) Science 263, 802−805によって記載されるように)細胞での発現時に正確な励起波長光への暴露によって蛍光を発するタンパク質を示すことを意図する。1以上のアミノ酸が置換、挿入又は欠失されているような蛍光タンパク質も、「GFP」と称する。ここで使用される「GFP」には、クラゲAequorea Victoria又は腔腸動物類の他のメンバーから得られる野生型GFP、例えばDiscosoma sp.の赤色蛍光タンパク質(Matz, M.V.ら. 1999, Nature Biotechnology 17: 969−973)、又は他の動物、菌類もしくは植物由来の蛍光タンパク質、及びHeimら(Heim, R.ら、1994, Proc.Natl.Acad.Sci. 91:26, pp 12501−12504)によって開示されたGFPの青色蛍光変異体のようなGFP修飾型、及びGFP蛍光のスペクトル特性を変える他の修飾型、あるいは1997年3月27日にWO 97/11094として公開され、ここに引用により導入されたPCT/DK96/00051に記載の約30℃より高温での細胞での発現時に増大した蛍光を示す修飾型が含まれ、それは、発光団から1つ上流位置にあるアミノ酸が突然変異され、この発明の蛍光タンパク質を細胞で発現する際に蛍光強度を増すAequoreaの緑蛍光タンパク質由来の蛍光タンパク質又はその機能類似体からなる。好ましいGFP変異型は、F64L−GFP、F64L−Y66H−GFP、F64L−S65T−GFP、F64L−E222G−GFPである。この発明の全ての観点での使用に特に好ましいGFP変異型は、EGFPである(哺乳動物細胞での発現に最適化されたコドンを有するF64L−S65T 変異型である、EGFPをエンコードするDNAは、EGFP DNA配列を含むClontech, Palo Altoのプラスミドから入手可能である(GenBankアクセス番号U55762、 U55763参照))。別の特に好ましいGFP変異型は、F64L−E222G−GFPである。実施例で用いられるように、検出基は好ましくは緑蛍光タンパク質(GFP)である。GFPは、好ましくはここで定義されるF64L突然変異を有するGFP、例えばF64L−GFP、F64L−Y66H−GFP、F64L−S65T−GFP、EGFP及びF64L−E222G−GFPからなる群から選択される。GFPは、任意にペプチドリンカーを介して、生物学的に活性なポリペプチド又はその一部又はそのサブユニットにN− 又はC−末端タッグされる。
【0032】
代替的な具体例では、検出基は、インサイトゥで又はマイクロインジェクションによって化学蛍光団で標識されるか、さもなければ細胞に導入される。さらに別の具体例では、検出基は、蛍光団でタッグされているか、又はビオチン−ストレプトアビジン標識法もしくは蛍光団で標識した二次抗体によって検出し得るために、他の方法で検出可能な抗体に対するエピトープを含む。そのようなエピトープの例は、蛍光団でタッグされているか、又はビオチン−ストレプトアビジン標識法もしくは蛍光団で標識した二次抗体によって検出し得るために、他の方法で検出可能な抗体で検出され得るmyc又はflag抗原のような検出性tagを含む。
ここで使用されるような内部構造物は、細胞内に含まれる異なる個別の同一とみなし得る成分を意味する。そのような内部構造物は、一般に、それらを含む細胞の解剖学的構造物である。内部構造物の例には、サイトゾル又は核外の細胞質に局在する構造物(細胞質構造物とも称する)及び核内に局在する構造物(核構造物)の双方が含まれる。核膜を含む核自体は、内部構造物である。
【0033】
検出基の記録は、選択される検出基に伴って変化するであろう。例えば、GFPが検出基として使用される際には、発せられた光は、当業者に公知の種々の装置を用いて測定することができる。一般に、そのような装置は、以下の部分からなる: (a)光源、(b) 発光団の発光を励起させる光源からの光の波長の選択方法、(c)励起光を迅速にブロックするか、又は残りの系に通すことのできる装置、(d)励起光を試験片に運搬し、発せられた蛍光を空間的な解像様式で集め、この蛍光発光(又は検出及び測定方法に関連する別タイプの強度マップ)から画像を形成する一連の光学素子、(e)一連の光学素子に対し所定のジオメトリーで測定される細胞容器を収容するベンチ又はスタンド、(f)好ましくは画像形態で光強度を記録するための検出器、(g)コンピューター又は電子系及び記録された情報及び/又は画像を獲得して蓄積し、記録画像から再分布の程度を計算するための関連ソフトウエア。
【0034】
この発明の好ましい具体例では、装置系は自動化される。ひとつの具体例では、上記d及びe部分は蛍光顕微鏡からなる。ひとつの具体例では、上記f部分はCCDカメラである。ひとつの具体例では、上記f部分は光電子増倍管/装置のアレイである。
この発明のひとつの具体例では、実際の蛍光は、マイクロタイタープレート用の標準型蛍光光度計(蛍光プレートリーダー)で測定される。
ひとつの具体例では、光学走査系は、発光又は蛍光における変化の時間−解像記録が全空間制限から同時に成し得るように、マイクロタイター型プレートの底を照らすために用いられる。
【0035】
ひとつの具体例では、画像は、光学走査系によって形成され、記録される。好ましい具体例では、実際の発光又は蛍光測定は、Molecular Devices, Inc.から市販されているFLIPR(登録商標)機器でなされる。
細胞内経路に対する影響又は影響の結果に応じた細胞応答の程度を示す定量情報は、関連する特異的な影響の既知の程度に対して、同様に記録される、応答又は結果に基づく所定の較正による記録又は記録類から抽出される。この結果、影響によって引き起こされる再分布の程度は、同程度の細胞応答を引き起こす関連する特異的な影響の用量として示される。未知の影響、例えば細胞成分の再分布に対する影響が知られていない新たな化学物質又は化学品を試験することによって、再分布に影響を有する薬剤のスクリーニングアッセイが達成される。
【0036】
これらの科学的かつ知的な知見に基づけば、この発明は、
分子間レベルの細胞成分間の相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、細胞成分間の過渡的な相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
細胞成分間の暫定的な相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
互いに対して親和性の低い成分間の相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
特定の分子成分、例えばシグナル化分子種の可動性が条件付きで制限(監禁)され、その種の活性について機能的なノックアウトを達成し得る細胞試験系をつくり、
特定の分子成分、例えばシグナル化分子種の可動性が条件付で放出(分散)され、その種の活性について機能的なノックイン(knock−in)を達成し得る細胞試験系をつくり、
特定成分間の相互作用事象が特定の位置に制限される細胞系をつくる
ために特に有用である。
【0037】
使用例は、
相互作用の阻害剤を見出すための細胞アッセイ、
相互作用の活性因子を見出すための細胞アッセイ、
cDNAライブラリーのスクリーニングによって、いずれかの特異的な細胞成分に対する新規な結合パートナーを同定するための細胞アッセイ、
生物学的利用能の可能性を示すために、細胞膜の浸透能について活性化合物を自動的にスクリーンするための細胞アッセイ、
アッセイ中に化合物の細胞代謝及び排出を示すために、細胞環境での安定性について化合物を自動的にスクリーンするための細胞アッセイ、
特定の細胞成分の機能を研究するための細胞試験系、
オーファンレセプター及び/又はオーファンリガンドによって使用されるシグナル化経路を同定するための細胞アッセイ、
相互作用モジュレーターについてのハイスループットスクリーニングにおける細胞アッセイ
である。
【0038】
この発明の幾つかの特徴:
哺乳動物細胞アッセイにより相互作用について生理学的に関連する状況を提供し、因子の影響が天然系、例えば完全なヒト系の細胞で、相互作用を調節し得ることを可能にする、
再分布−トラップ構想が、生細胞又は化学的に固定された細胞を用いる、多様な蛍光画像化法に適合している、
再分布−トラップ構想に基づくアッセイの何らかの反応を、経時的な応答を作成するために、時間中、逐次的な測定として連続的に、又は1点測定(single end−point measurement)によりモニターすることができる(経時測定は終始、生細胞を要する。1点測定は生細胞又は化学的に固定した細胞で成すことができる)、
方法が、ロー(low)スループットならびにハイスループット測定に対応できる、方法が、哺乳動物細胞に有用である(哺乳動物細胞は、植物又は酵母細胞のような菌由来の細胞と異なって細胞壁を有しない。細胞壁は、化合物が細胞に入るのを妨げることができる)。
【0039】
上記のタンパク質相互作用の測定は、そのような相互作用を調節する化合物の同定/スクリーニングに理想的である。そのようなアッセイ及びハイスループットでの他のアッセイを実施するために、この発明のひとつの観点は、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性変化を測定する方法に関する。その方法は、
(a) 細胞成分に結合した発光団からなる細胞を、影響と、また影響なしに接触させるか、又はインキュベートし;
(b) 細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を工程(a)の細胞に加え;かつ
(c) 工程(b)の細胞由来の発光団から発せられる光を測定することからなり、
影響の存在又は不在で細胞から発せられる光の相違が、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性の相違を示す。原則は、刺激によって移動しているか、又は移動していない発光団−成分結合を除くことである。
【0040】
この発明のひとつの主要な利点は、可動性変化が光強度の変化として測定できることである。後述されるように、また実施例に記載されるように、この技術により蛍光強度変化として再分布(登録商標)を検出することができる。
多様な機器が、光強度を測定するために存在する。発光団がGFPである、この発明の好ましい観点では、発光団から発せられる光の測定機器はFLIPR (Molecular Devices)である。代替的な具体例では、発光団から発せられる光はプレートリーダーで測定される。この技術は、4時間/プレート(画像化)のスクリーン時間から約30秒/プレート(つまり480倍早い)まで、NFkBアッセイ(実施例11)のような改良された再分布(登録商標)アッセイ及びPDE4A4−トラップ(実施例10及び実施例12)のようなTRAPアッセイを有している。
【0041】
この出願をとおして、可動性変化は、成分が影響との接触又はインキュベーション前後のいずれかで実質的に固定していることで特徴付けられる。実質的な固定とは、抽出工程中に成分が検出域外に移動しないものとして定義される。細胞を抽出後に洗浄すると、検出域は、本質において細胞(又は浸透して化学的に固定されている際に、細胞から出されたものすべて)であろう。一般的な概要では、成分の可動性変化は、細胞成分と結合しているか、又はそれに付着している成分によって引き起こされる。例えば、不活性型PKAcat−GFPの多くは細胞質でスポットして凝集する。PKAcatスポットは、活性化によって、個々のPKAcat 分子がより可動性であるサイトゾルに解散する。
【0042】
この発明のひとつの観点で、固定は、細胞内分布が未知の結合パートナーへの成分の結合によって引き起こされる。この発明の具体例では、結合パートナーは、実質的に不動性の細胞内分布が知られているタンパク質と融合され、成分は依然として発光団に結合される。この結果、成分と結合パートナーとの結合は、成分を実質的に固定するであろう。
ひとつの観点において、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜結合性細胞質状態の変化である。つまり、細胞器官への結合、例えばIRへの結合である。別の観点では、可動性変化は、結合性細胞質状態〜可溶性細胞質状態の変化である。
【0043】
ひとつの観点では、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜成分が細胞膜に結合している状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が細胞膜に結合している状態〜成分が細胞質で可溶性の状態の変化である。ひとつの観点では、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜成分が核に結合又は導入されている状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が核に結合又は導入されている状態〜可溶性細胞質状態の変化である。
ひとつの観点では、可動性変化は、結合性細胞質状態〜成分が核に結合又は導入されている状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が核に結合又は導入されている状態〜結合性細胞質状態の変化である。
細胞での結合は、内部構造物、例えば細胞器官、膜、細胞骨格又は分子構造物によって媒介されるものと予想される。
【0044】
キナーゼ、プロテインキナーゼ及びホスファターゼを含む細胞内リン酸化及び脱リン酸化過程に関与する酵素のみならず、細胞内シグナル形質導入で重要な役割を果たす細胞骨格を構成するタンパク質のように、細胞成分が細胞内シグナル化経路に寄与することが好ましい。より好ましい具体例では、細胞成分は、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ又は転写因子である。
この発明の好ましい具体例では、影響は、機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群と化学物質との接触及び/又は機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群と化学物質とのインキュベーションである。
ひとつの具体例では、この発明は、化合物ライブラリーのような未知の影響の作用を標準条件下の既知の基準化合物の影響と比較できるスクリーニングプログラムに基づいて使用される。
【0045】
抽出緩衝液は、細胞固定剤及び細胞透過剤からなる。
この発明のひとつの観点では、細胞固定剤は、タンパク質凝固剤もしくはタンパク質架橋剤、例えばエタノール、酢酸、アクロレイン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過マンガン酸カリウム、タンニン酸、パラホルムアルデヒドのひとつ又は混合物である。もっとも好ましい固定剤は、ホルマリンである。
この発明の別の観点では、細胞透過剤は、細胞の原形質膜を穿孔し得る剤、例えばストレプトリジンO、又はアニオン性、ノニオン性、双性イオンもしくはカチオン性界面活性剤又は界面活性剤緩衝液、例えばラウリル硫酸塩、デオキシコール酸、ジギトニン、プルロニック(pluronic) F68、サポニン、トリトンX−100、トリトンX−114、ノニデット(nonidet)P40、CHAPS、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド又は塩もしくはジギトキシンのような浸透ショック誘導剤のひとつもしくは混合物である。もっとも好ましい透過剤は、トリトンX−100である。
【0046】
実験に適当な細胞型を支持するいずれの塩基性緩衝液も使用することができる。ひとつの好ましい塩基性緩衝液は、通常PBSである。最終的な洗浄緩衝液は、GFPから最大蛍光を得るのに適当なpH、例えばpH7.5〜9.0、もっとも好ましくはpH8.5で注意深く緩衝されるべきである。緩衝能は、洗浄後に細胞中又はその周囲に残存し得るホルマリン及びヘキスト染色の残量の作用を妨げるのに十分であるべきである。
固定剤と透過剤の割合は、本質的に重要である。一方では、細胞は細胞から可動性の成分を拡散させるように透過される必要があり、他方では、細胞は、全細胞画分の拡散を妨げるよう化学的に固定される必要がある。実施例10〜12に示すように、最適比は細胞種、より重要なことには(先に論じたように)不動性の成分及び種類によるので、各場合に割合を最適化することが最も重要である。0.1%ホルムアルデヒド及び0.1%トリトンX−100からなる抽出緩衝液は、我々の手法では、これらの濃度が最適ではなくても常にアッセイを向上するので、良好な開始点であることが分かっている。
【0047】
固定剤と透過剤の割合を最適化するためには、以下の工程が行われる:
(a) 発光団を含む細胞を基準化合物と接触させ;
(b) (a)の細胞に似た細胞を基準化合物なしに接触又はインキュベートし;
(c) 細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を、(a)及び(b)の細胞に加え;
(d) 発光団から発せられる光を測定し;
(e) 細胞固定剤と細胞透過剤を種々の濃度で有する抽出緩衝液を用いて工程(a)〜(d)を繰り返し;
(f) 工程(e)で試験される各抽出緩衝液について、(刺激細胞中の蛍光−非刺激細胞中の蛍光)/ 非刺激細胞中の蛍光×100%としてシグナル/ノイズ(s/n)割合を算出し、
最適化された抽出緩衝液は、最も高いシグナル/ノイズ割合を伴う緩衝液である。
基準化合物は、成分について高度な可動性変化を引き起こすことが知られた化合物である。
【0048】
細胞内再分布の測定時にバックグラウンドの蛍光を低下させる方法は、
(a) 物質の影響に関連して再分布しうる、及び/又は物質の影響に関連して再分布しうる成分と結合し得る発光団を含む機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群を物質と接触又はインキュベートし;
(b) 細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を細胞に加え; かつ
(c) 空間分布光の分布を測定する
工程からなる。
【0049】
実施例
実施例1: プローブ及び融合体の構築:
PS462は、CMVプロモーターの制御下でPDE4A4とEGFPの融合体を含み、選択マーカーとしてG418耐性を有する。PDE4A4−EGFP融合体を構築するために、全PDE4Aイソ型に共通のHSPDE4A4の約1.9 kbのC−末端部分(GenBank アクセス番号 L20965)を、後述のプライマー4A−Ct−トップ及び4A −ボトムでのPCRを用いて増幅する。トッププライマーの配列はサイレント突然変異を含み、これにより、共有される4A領域の最初に正確にDra1部位を導入する。ボトムプライマーは、停止コドン、BamH1 クローニング部位、pEGFP−N1へのクローン時にリーディングフレームを保存するための2つの余分なヌクレオチドのない共通のC−末端配列を含む。HSPDE4A4のユニークな約0.8 kbのN−末端部分は、後述の4A4−トップ及び4A4N−ボトムのプライマーで5% DMSO の存在下PCRを用いて増幅される。トッププライマーは、ATGに続く特定のHSPDE4A4配列、コザック(Kozak)配列及びHind3クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、ユニークな4A4 N−末端部分と共通の4A C−末端部分の接合点にわたっており、共有される4A 領域の最初に正確にDra1部位を導入するサイレント突然変異変異を含む。PCR産物を適当な制限酵素で消化し(ユニークなN−末端部分についてはHind3 及びDra1ならびに共通のC−末端部分についてはDra1及びBamH1)、Hind3とBamH1で消化したpEGFP−N1 (Clontech, Palo Alto; GenBank アクセス番号U55762)に共に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でPDE4A4−EGFP融合体を生じる。得られたプラスミドをPS462 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) に2000年4月17日に DSM 13450でブダペスト条約の下で寄託)と称する。
【0050】
4A−Ct−トップ: 5’−GTTTAAAAGGATGTTGAACCGTGAGCTC−3’
4A−ボトム: 5’−GTGGATCCCAGGTAGGGTCTCCACCTGA−3’
4A4−トップ: 5’−GTAAGCTTGCGCCATGGAACCCCCGACC−3’
4A4N−ボトム: 5’−GGTTTTAAACTTGTGCGAGGCCATCTCGCTGAC−3’
【0051】
プラスミドPS642はCMVプロモーターの制御下でPDE4A4とSOS1の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン(zeocin)耐性を有する。PS642は、PS462由来のPS614から誘導される。
PS462は、上記のように構築される。PS462でのネオマイシン耐性マーカーは、ネオマイシンを切出すAvr2でPS462を消化し、ゼオシン耐性をエンコードする約 0.5 kbのAvr2 フラグメントとベクターフラグメントを連結することにより、ゼオシン耐性マーカーと置換される。このフラグメントは、鋳型としてpZeoSV (Invitrogen)とともに後述のプライマー9655及び9658を用いるPCRにより単離される。プライマーは、いずれもAvr2クローニング部位を含み、その大腸菌プロモーターを含むゼオシン耐性遺伝子をフランクしている。トッププライマー9658はゼオシンの最初のAse1部位にわたっており、それを用いて、哺乳動物細胞に耐性を駆動するSV40プロモーターに対してAvr2インサートを方向づけることができる。得られたプラスミドをPS614と称する。
【0052】
9658−トップ: TCCTAGGCTGCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGG−3’
9655−ボトム: TCCTAGGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCAC−3’
【0053】
ヒトSOS1のコード配列(GenBankアクセス番号NM_005633)は、例えば後述のプライマー0099 及び0100を用いるPCRによってヒトの胎児又は脳のcDNAライブラリーから単離される。トッププライマーは、ATGに続く特定のSOS1配列及びBamH1クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びNot1クローニング部位を含む特定のSOS1配列を含む。PCR産物は制限酵素BamH1及びNot1で消化され、BamH1とNot1で消化したPS614ベクターDNAに連結される。これは、CMVプロモーターの制御下でPDE4A4とSOS1との融合体を生じる。得られたプラスミドを、PS642と称する。
【0054】
0099−トップ: 5’−GTTGGATCCCATGCAGCAGGCGCCGCAGCCTTAC −3’
0100−ボトム: 5’− GTTGCGGCCGCTCATTGGGGAGTTTCTGCATTTTC −3’
【0055】
プラスミドPS587は、CMVプロモーターの制御下でGRB2とEGFPの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。ヒトGRB2のコード配列(GenBank アクセス番号NM_002086)は、例えば後述のプライマー0073及び0074を用いるPCRにより、ヒトの胎児又は脳又は胎盤のcDNAライブラリーから単離される。トッププライマーは、ATGに続く特定のGRB2配列及びHind3 クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びEcoR1クローニング部位を含む特定のGRB2配列を含む。PCR産物は制限酵素Hind3 及びEcoR1で消化し、 Hind3 及びEcoR1で消化したpEGFP−N1ベクターDNA (Clontech, Palo Alto, GenBank アクセス番号U55672)に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でGRB2とEGFPとの融合体が生じる。ベクターは、EGFPのすぐ上流に(インビトロの転写に使用できる)T7プロモーターを含むように、任意に最初に修飾されてもよい。これは、EGFPのすぐ上流を切断する制限酵素Nhe1及びBgl2でpEGFP−N1を消化し、ベクターフラグメントをアニール化オリゴ9949 及び9950と連結して達成することができる。得られたプラスミドを、PS587と称する。
【0056】
0073−トップ: 5’−GCGAAGCTTTCAGAATGGAAGCCATCG −3’
0074−ボトム: 5’−GCCGAATTCGGACGTTCCGGTTCACG −3’
9949: 5’−CTAGCATTAATACGACTCACTATAGGGA−3’
9950: 5’−GATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATG−3’
【0057】
プラスミドPS639は、CMVプロモーターの制御下でPKAの触媒サブユニット(PKAcat)及びGRB2の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン耐性を有する。
PS639は、PS457由来のPS610から由来する。
プラスミドPS457 は、CMVプロモーター制御下でPKAcatとEGFPの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。17個のN−末端アミノ酸を除くヒトPKAcat (GenBank アクセス番号X07767)のコード配列は、例えば後述のプライマー9952 と9922 を用いるPCRによりヒトの肝臓又は脾臓のcDNAライブラリーから単離される。トッププライマーは、コード配列のN−末端近くの EcoR1部位にわたる特定のPKAcat配列を含む。ボトムプライマーは、停止コドンとBamH1クローニング部位のない特定のPKAcat配列を含む。PCR産物は制限酵素EcoR1及び BamH1で消化し、EcoR1と BamH1で消化したpEGFP−N1ベクターDNA (Clontech, Palo Alto, GenBankアクセス番号U55672)に連結する。この中間体を Hind3及びEcoR1で消化し、アニール化オリゴ9955及び9956と連結し、残りのN−末端アミノ酸をPKAcatに付加し、こうしてCMVプロモーターの制御下で PKAcatとEGFPとの融合体を生じる。この構築物をPS457と称する。
【0058】
9952−トップ: 5’−GAGCGTGAAAGAATTCTTAGCCAAAG−3’
9922−ボトム: 5’−GTGGATCCCAAAACTCAGAAAACTCCTTG−3’
9955:
5’−AGCTTCCGCGATGGGCAACGCCGCCGCCGCCAAGAAGGGCAGCGAGCAGGAGAGC
GTGAAAG−3’
9956:
5’−AATTCTTTCACGCTCTCCTGCTCGCTGCCCTTCTTGGCGGCGGCGGCGTTGCCCATC
GCGGA−3’
【0059】
PS610は、PS457のネオマイシン耐性を上記のゼオシン耐性に変えることによって構築される。
ヒト GRB2のコード配列は、後述のプライマー0143 及び0142を用いるPCRによって上記のPS587から単離される。トッププライマーは、ATG に続く特定の GRB2 配列及びBamH1クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びXba1クローニング部位を含む特定のGRB2配列を含む。PCR産物を制限酵素BamH1及びXba1で消化し、BamH1とXba1で消化したPS610 ベクターDNA (ダム(dam)−マイナス大腸菌から単離)に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でPKAcatとGRB2との融合体を生じる。得られたプラスミドをPS639と称する。
【0060】
0143−トップ: 5’−GTTGGATCCCATGGAAGCCATCGCCAAATATG−3’
0142−ボトム: 5’−GTTTCTAGATTAGACGTTCCGGTTCACGG−3’
【0061】
プラスミドPS602は、CMVプロモーターの制御下でEGFPとSOS1の 265個のC−末端アミノ酸との融合体とネオマイシン耐性マーカーを含む。ヒトSOS1のコード配列のC−末端部分(GenBankアクセス番号NM_005633)は、例えば後述のプライマー0122 と0123を用いるPCRによってヒトの胎児又は脳のcDNAから単離される。トッププライマーは、ATG及びXho1クローニング部位の付加したアミノ酸番号1067の後に特定のSOS1配列を含む。ボトムプライマーは、停止コドンとBamH1クローニング部位を含む特定のSOS1配列を含む。PCR産物を制限酵素Xho1 と BamH1で消化し、Xho1 と BamH1で消化したpEGFP−C1 ベクターDNA (Clontech, Palo Alto, GenBankアクセス番号U55673)に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFPとSOS1のC−末端部分との融合体を生じる。ベクターは、上記のEGFPのすぐ上流に(インビトロの転写に使用できる)T7プロモーターを含むように任意に最初に修飾されていてもよい。得られたプラスミドをPS602と称する。
【0062】
0122: 5’−GTTCTCGAGTCATGAGCTTTAGTCGGATTGCTG−3’
0123: 5’−GTTGGATCCTCATTGGGGAGTTTCTGCATTTTC−3’
【0063】
プラスミドPS628は、CMVプロモーターの制御下でPKCガンマ のCys1ドメインとGRB2の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン耐性を有する。PS628は、PS443由来のPS613に由来する。
プラスミドPS443は、CMVプロモーターの制御下でヒトPKCガンマ の90 N−末端アミノ酸(Cys1ドメイン)及びEGFPの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。ヒトPKCガンマのCys1ドメイン(GenBank アクセス番号 M13977及びZ15114)は、例えば後述のプライマー9916及び9935 を用いるPCRによってヒトの脳のcDNAライブラリーから単離される。トッププライマーは、ATG 及びEcoR1クローニング部位にわたる特定のPKCガンマ配列を含む。ボトムプライマーは、アミノ酸番号90及びAcc65クローニング部位の周囲に特定のPKCガンマ配列を含む。PCR産物を制限酵素EcoR1及びAcc65で消化し、EcoR1及びAcc65で消化したpEGFP−N1 ベクターDNA (Clontech, Palo Alto, GenBankアクセス番号U55672)に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でPKCガンマ−Cys1及びEGFPの融合体を生じる。この構築物を、PS443と称する。
【0064】
9916: 5’−GTGAATTCGGCCATGGCTGGTC−3’
9935: 5’−GTGGTACCTTCCCAGCGCCTGGACACTC−3’
【0065】
PS613は、上記のようにゼオシン耐性でPS443のネオマイシン耐性を置換することによって構築される。
ヒトGRB2のコード配列は、後述のプライマー0143 及び0142を用いるPCRによって上記のPS587から単離される。トッププライマーは、ATGに続く特定のGRB2配列及び BamH1クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドンと Xba1クローニング部位を含む特定のGRB2配列を含む。PCR産物は、制限酵素BamH1 及びXba1で消化し、BamH1とXba1で消化したPS610 ベクターDNA (ダム−マイナス大腸菌から単離)に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でCys1とGRB2の融合体が生じる。得られたプラスミドをPS628と称する。
【0066】
0143−トップ: 5’−GTTGGATCCCATGGAAGCCATCGCCAAATATG−3’
0142−ボトム: 5’−GTTTCTAGATTAGACGTTCCGGTTCACGG−3’
【0067】
HSPDE4A1−EGFP融合体を構築するために、HSPDE4A1 の約1.95 kbのコード領域(GenBankアクセス番号U97584)を、PCR及び後述のプライマー4A1−トップ及び 4A−ボトムを用いて増幅する。トッププライマーは、ATGに続く特定の HSPDE4A1配列、コザック配列及びHind3クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン、BamH1クローニング部位及びpEGFP−N1への挿入時にリーディングフレームを保存するための2つの余分なヌクレオチドのない共通のPDE4A C−末端配列を含む。PCR産物を制限酵素Hind3とBamH1で消化し、Hind3とBamH1で切断したpEGFP−N1 (Clontech, Palo Alto; GenBank アクセス番号U55762)にクローンする。これにより、CMVプロモーターの制御下でHSPDE4A1−EGFP融合体が生じる。得られたプラスミドをPS461と称し、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に2000年4月17日にDSM 13449でブダペスト条約の下で寄託した。
【0068】
4A1−トップ: 5’−GTAAGCTTAAGATGCCCTTGGTGGATTTCTTC−3’、PDE4A1に特異的、
4A−ボトム: 5’−GTGGATCCCAGGTAGGGTCTCCACCTGA−3’
【0069】
【表1】
1開始コドンから3’−末端のBamH1 クローニング部位までPS462にみ
られるようなPDE4A4のDNA配列
2PS462にみられるようなPDE4A4のタンパク質配列
3開始コドンから3’−末端のBamH1 クローニング部位までPS461にみ
られるようなPDE4A1のDNA配列
4PS461にみられるようなPDE4A1のタンパク質配列
5開始コドンから停止コドンまでPS642にみられるようなSOS1のDNA
配列
【0070】
実施例2: プロトコル及び方法
この実施例は、実施例1に記載のプローブのインビボ発現に用いるプロトコル及び方法、ならびに単一で、もしくはCHO細胞でのアンカープローブとの同時トランスフェクションとしてトランスフェクトされたEGFP融合プローブによる変化の視覚化及び測定を記載する。
【0071】
トランスフェクション及び細胞培養 :
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)を、1種のプラスミド又は供給者によって推奨される方法にしたがってトランスフェクション剤FuGENE(登録商標) 6 (Boehringer Mannheim Corp, USA)を用いて同時にトランスフェクションされた一対のプラスミドを用いて、上記実施例1に記載のプラスミドでトランスフェクトする。単一のGFPプローブの安定なトランスフェクタントを、適当な選択剤、通常は、増殖培地(グルタマクス(Glutamax)−1、10 % ウシ胎児血清(FBS)、100μg ペニシリン−ストレプトマイシン混合物 ml−1 (GibcoBRL, Life Technologies, Denmarkより供給)とのHAM’s F12 栄養ミックス)中0.5 mg/mlのG418 硫酸塩(Calbiochem)を用いて選択する。同時にトランスフェクトした細胞を、使用されるプラスミドに適当な2つの選択剤、通常は0.5 mg/mlのG418 硫酸塩及び1 mg/mlゼオシンを添加する以外は同一の培地で培養する。細胞を37℃で100%湿度及び5% CO2を追加した通常の雰囲気ガス条件で培養する。
【0072】
特定の性質を有するクローン細胞系を、個々の細胞を単離し、選択されるプラスミドに適当なように、0.5 mg/ml G418硫酸塩又は0.5 mg/ml G418 硫酸塩 + 1 mg/ml ゼオシンを有する新鮮な培養培地を含む滅菌培養フラスコに細胞を除くことにより、安定なトランスフェクト細胞の混合群から半培養(sub cultured)する。
蛍光顕微鏡検査用に、細胞を少なくとも24時間Lab−Tekチャンバーカバーガラス(Nalge Nunc International, Naperville USA)に接着させ、次いで約80%に集密(confluence)するまで培養する。画像化目的用にプラスチックの96−ウェルのプレート(Polyfiltronics Packard 96−View Plate 又は Costar Black Plate、透明底; いずれのタイプも組織培養を処理した)で細胞を成長させることができる。実験前に、グルタマクス、100 μg ペニシリン−ストレプトマイシン混合物 ml−1 及び10 % FBSを有するHAM F−12培地中で選択剤なしに一晩細胞を培養する。この培地は、インキュベーターから直接的な細胞の蛍光顕微鏡検査を可能にする低自動蛍光を有する。特に特定の細胞成長因子の存在に関して所定の組成の培地を要する試験用には、3.6 KCl、140 NaCl、2 NaHCO3、0.5 NaH2PO4、0.5 MgSO4、1.5 CaCl2、10 Hepes、5 グルコース、pH7.4を(mMで)含む緩衝生理食塩溶液(KRW緩衝液)でHAM培養培地を画像化前に置換する。
【0073】
共焦画像化 :
共焦画像を、488 nmで励起光を発するアルゴンイオンレーザーを備えたZeiss LSM 410顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)を用いて回収する。光路には、FT510 二色性ビーム分割機及び515 nmの長−路(long−path)フィルター又は510〜525 nm の帯域放射フィルターがある。画像を一般にFluar 40X, NA: 1.3 油浸対物レンズを用いて回収し、顕微鏡の共焦開口を(このレンズに最適な)10単位値にセットする。
【0074】
経時的なシークエンス及び分析 :
時間中(経時的(Time lapse)、例えば図5、6、11、12)の生細胞の画像シークエンスを、Fluar 40X, NA: 1.3油浸対物レンズを備え、Photometrics CH250電荷結合素子(CCD)カメラ(Photometrics, Tucson, AZ USA)に連結したZeiss Axiovert 135M 蛍光顕微鏡を用いて集める。細胞を100 W のHBO アーク灯で照らす。光路には、470±20 nmの励起フィルター、510 nmのダイクロイックミラー及び最少の画像バックグラウンド用の515±15 nm 励起フィルターがある。細胞を、誂えた段階ヒーターで37℃に維持する。
シークエンス中の各連続画像に同一の座標又は画素にわたって明確に定めた対象領域(region of interest (ROI))を用いる画像シークエンスから、経時的な反応プロフィルを抽出する:画素値を合計し、各画像で ROIに対して平均し、得られた値を画像数にプロットして、所定のシークエンス領域に対する経時的な反応プロフィルを得る。ROIには、多くの細胞、単細胞又は単細胞内の領域を含めることができる。
【0075】
自動画像化及び分析 :
細胞群におけるトランスフェクトプローブの蛍光スポット及び他の蓄積物の量は、スポットの平均数/細胞を測定するような自動化法で画像化し、定量することができる。この目的のため、細胞をほぼ80%〜90%の集密までカバーガラスチャンバー又はプラスチックの96−ウェルプレートで培養し、関連処理を行い、反応させる。反応段階の最後に、30分〜2時間4% ホルムアルデヒド緩衝液(Lillies 固定緩衝液、pH7.0: Bie and Berntsen A/S, Denmark)で細胞を化学的に固定し、次いでリン酸緩衝液(PBS, Life Technologies, Denmark)で3回洗浄する。細胞質から非局在(つまり可動性)GFPプローブを除くのに有用な、代替的な同時固定+透過法は、0.2〜1%のトリトンX−100を加えた0.4〜2%のホルムアルデヒド緩衝液(10〜50%強度のLillies 固定剤)を導入する1回の固定法を伴う。使用する実際の濃度を、使用する細胞種に最適化する必要がある;CHO細胞については、2%ホルムアルデヒド+1%トリトンX−100が優れた結果を生じる。固定剤+洗剤の組み合わせは、室温で10〜20分細胞に適用される。次いで、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄する。核DNAを25℃で10分PBS中10μMのヘキスト33258 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)で染色し、次いでPBSで2回洗浄する。自動画像を、Nikon Plan Fluor 20X/0.5NA 対物レンズを用いてNikon Diaphot 300 (Nikon, Japan)で回収する。基本顕微鏡は、電動の試験片足場と電動の焦点制御(Prior Scientific, Fulbourn, Cambridge UK)、励起フィルターホイール(Sutter Instruments, Novato CA USA)及びKAF1400 CCD チップを有するPhotometrics PXLシリーズカメラ(Photometrics, Tucson, AZ USA)(これらの品目は、それぞれMacintosh 7200/90コンピューター(Apple Computer, Cupertino, CA USA)の制御下にある)を備える。足場位置、焦点、励起フィルター選択及び画像捕捉の自動化は、Macintosh用のIPLab スペクトル(Scanalytics, Fairfax, VA USA)下で作動する、内部に書き込まれたマクロス(macros)を用いて行う。100 W のHBO ランプから、蛍光照明を生じる。最初に340/10 nm 励起フィルターを用いて、次に475RDF40 励起フィルター(Chroma, Brattleboro, Vermont)を用いて、画像を対で回収する。双方の画像を、EGFP用途(XF100 フィルターセット, Omega Optical, Brattleboro, Vermont)用に最適化した同じダイクロイック放出フィルターを介して回収する。核染色(ヘキスト33258)画像化用のフィルターの選択が色素のスペクトル特性に十分に合わず、画像強度が低下するが、同じダイクロイック放出フィルターを用いて双方の画像を回収できることによって、方法のスループットが大きく改善される。これにより、2つの異なるフィルターセットを用いることに起因し、捕捉方法にさらに数段階を要し、克服するのに広範囲な画像化処理を要する画像の登録問題及び焦点シフトが排除される。
【0076】
必要な画像を以下のとおり回収する: 4個の8−ウェルのカバーガラスチャンバーを含むホルダー又は1つの96−ウェルプレートを顕微鏡に載せる。プログラムを開始し、第1ウェルの細胞を位置に動かし、技師により手動で粗く焦点を合わす。340/10 励起を用いる自動焦点の機械的操作で、微細に画像の焦点を合わす。画像を捕捉し、この励起波長で蓄積し(核の画像)、次いで第二画像を捕捉し、長い波長励起で蓄積する(GFP画像)。足場を自動的に再度位置付け、顕微鏡の焦点を再度自動的に合わせ、同一ウェル内で第二画像対を捕捉する。この方法を、第一ウェルについて数回(一般に4〜8回)繰り返す。次に、足場を画像位置の隣のウェルに進め、数セットの画像対が各細胞ウェルから捕捉されるまで、方法を繰り返す。
【0077】
IPLab スペクトルソフトウェアで作動する一組のマクロスを用いて、以下のようにして画像対を自動的に分析する: 最初に、核の画像対をデジタルフィルターでフィルターにかけ、同時に縁をシャープにし、核の強度の相違を抑制する。フィルターの選択及びフィルターの定数(filter constant)は、種々のデータセットを用いて実験中に達せられた。次に、フィルターにかけた画像を、この閾値未満の画素が核領域内にないように、またこの閾値より大きい画素が核領域内にあるように、所定の強度値でセグメントに分ける。次に、核と核ではない他の対象物とを十分に正確に識別するように予め決定した領域より大きいか、又はある(異なる)領域より小さい隣接領域を除いた後、閾値より大きい隣接領域を計測する。最終的な総数は、その範囲で見積もられる核数である。各対のGFP画像を、次いで実験的に選択したフィルターでデジタルフィルターにかけ、このバックグランドに関して明ポイント(bright point)−様対象物の強度を減じながら、GFPの一般的な非局在化分布による強度変化を抑制する。次いで、このフィルターにかけた画像を実験的に決定した閾値でセグメントに分け、スポットにある可能性の高い(閾値より大きい)画素及びスポットにはない可能性の高い(閾値未満の)画素に画像を分ける。スポットに特有であることが予め決定された、ある形態学的特性を持たない領域を除いた後、閾値より大きい画素の隣接領域を計測する。各対について核の計測に対するスポットの計測の割合は、画像対における細胞当たりの平均スポット数の予測を示す。画像対全てをこうして処理し、最終的な値表を用いて、所定の処理に対する細胞の反応を確立する。図3は、HSPDE4A4−EGFP発現CHO細胞におけるスポット密度による化合物の作用が、自動画像化及び画像解析法を用いてどのように測定できるかについての一例である。
【0078】
細胞群におけるトランスフェクトプローブの蛍光スポット及び他の蓄積物の量は、TECAN Spectrafluor (Tecan U.S. Inc., Research Triangle Park, NC 27709, USA) のような蛍光プレートリーダー又は蛍光画像化プレートリーダー(FLIPR; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA 94089, USA)を用いて定量することもできる。固定剤+透過法を組合わせた使用は、特に蛍光プレートリーダーで測定される際に、細胞中のスポット及び他の蓄積物の測定用のバックグラウンドに対するシグナルを大きく改善する。図4は、HSPDE4A4−EGFP発現CHO細胞におけるスポット密度による化合物の作用を測定するためのFLIPRの使用例である。細胞を同時に固定及び透過プロトコルで処理し、これらのデータを得た。
【0079】
細胞質から原形質膜への蛍光プローブの再分布は、細胞質ROIの蛍光強度の変化の簡単な画像分析を用いて標準的な画像化法によって定量してもよい。同様の再分布は、FRIPRで、また標準的な蛍光プレートリーダー、特にマイクロタイタープレートで接着細胞からのシグナルを測定するよう形成したプレートリーダーにおいてでも測定できる。
PKC−様再分布(EGFP−Cys1(PKCγ)がその一例である)、またPKAc−様再分布を測定するためのFLIPRの使用は、実際には先の特許「細胞反応に対する影響に関する量的情報を抽出するための改良方法」(WO 00/23615)に詳述されている。図7は、Cys1γ−EGFPの再分布に対する化合物の作用がFLIPRを用いてどのように定量できるかを示している。
【0080】
実施例3: PDE4A4 アンカータンパク質でのタンパク質X及びYのプローブ
この実施例及び実施例4、実施例5ならびに実施例6は、2つのパートナー成分X及びY間の特異的な相互作用に対する標的化合物をスクリーニングするのに適当な細胞系を作製する一般的な方法を記載している。これらの実施例で、細胞は、一方がアンカー分子(アンカープローブ)のC又はN末端に結合するX又はYとの融合プローブをコードし、第二のものがGFP(検出基)のC又はN末端に結合した他のパートナーY又はXとの融合プローブをコードしている、2つのプラスミドで同時にトランスフェクトされたCHO細胞に由来する。したがって、相互作用対X−Y及び8個の有用な組合わせを同時にトランスフェクトし得る、4個の潜在的なアンカープローブと4個の潜在的な検出プローブがある。アンカー及び検出プローブは、異なる選択マーカーを用いて、選択中の細胞に両プラスミドを確実に維持させる;例えばアンカーは、ネオマイシンに対して検出性である、ゼオシン耐性を付与し得る。連続的な選択中(最低限2週間)に両プローブを維持する細胞を「安定」と称する。
【0081】
この実施例では、アンカープローブはHSPDE4A4B (ヒトのホスホジエステラーゼ タイプ4、イソ型A、スプライス変異体4B: 以降、PDE4A4と称する)に基づいており、これはPDE4阻害剤のロリプラムでの処理時に、各細胞の細胞質中に稠密な幾つかの集合物を形成する(EC50 0.2〜0.3 μM)。これらのロリプラム−誘導性集合物は、図10に示されるように、HSPDE4A のユニークなC−末端ペプチド配列に対する抗体で検出されてもよい。PDE4A4のC−末端に融合したGFPを有する融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、蛍光は細胞質内で包括的かつ全く均一に分布するが(図1)、ロリプラムで処理すると集合物が生じ、これらは細胞中の明るい緑蛍光のスポットとしてはっきり見える(図2)。核の側方の正反対に位置する、そのような集合物は、ロリプラム−処理細胞当たり平均2個ある。10μMのロリプラムに10〜16時間暴露した後、これらの集合物は、直径約2〜4μmに成長する。
【0082】
ロリプラムの除去は、60分以内にこれらの集合物を分散させる。同様のスポットは、PDE4 阻害剤RS25344 (EC50 0.02 μM, Syntex) 及びRo 20−1724 (EC50 4 μM, Roche)で処理すると、PDE4A4−トランスフェクト細胞ではっきりと見られる。EGFP−Y検出プローブを加えたPDE4A4−アンカープローブ−Xで同時にトランスフェクトした細胞では、GFP−明スポット(bright spot)は、XとYが相互作用し、互いを誘因するならば、ロリプラムでの処理後の細胞でのみはっきりと見られるであろう(図8)。ロリプラムを除くか、又は別の有力なPDE4阻害剤であるRP73401 (Piclamilast, Rhone−Poulenc Rorer)と競合させると(IC50 対 3 μM ロリプラム 約20 nM、図3及び4)、スポットは消失するであろう(図9)。
【0083】
PDE4A4 アンカー系のプロトコル:
1) PDE4A4 アンカー−検出対のCHOへの同時トランスフェクト、
2) GFP−明スポットがないことのチェックと開始。スポットがあるか、又は存在するGFPについて別の明確な分布があれば、(3)で細胞を試験する価値が依然としてある可能性がある: 分布変化は、このトランスフェクションが有用であれば、工程(3)で見られなければならない、
3) 10 μM ロリプラムと(個別に)1μM RS25344での一晩の過渡物(transient)の試験、
a. スポットの出現: 過渡物から細胞をクローン、及び(4にあるような)二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
b. スポットなし: 二重選択下の細胞からの安定な細胞系形成を待機(4参照)、
【0084】
4) 二重選択(例えば1 mg/mlゼオシン+0.5 mg/mlネオマイシン/G418) を用いる安定な細胞系の作製。10 μMのロリプラム及び1 μM RS25344での個別の試験、
a. スポットの出現: スクリーニング用途のため二重選択下の安定物(stable)から細胞をクローン、
b. スポットなし: 抗−4A 抗体で固定と染色(ロリプラム又はRS25344−処理細胞)、
i. 抗体でスポット染色: (5)に進む
ii. スポットなし: アンカー系が存在しないか又は作用していない −同時トランスフェクションを反復、又は別のアンカー系もしくは方向付けを試験、
5) 暫定的な結合を試験(以下のA及びB参照)、
6) 結合状態が見られない場合、アンカー/検出対の別の組合わせを選択し、再度開始する。
【0085】
適当な相互作用刺激:A及びBでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのB試験。
A i) 10Mのロリプラムと別々の1M RS25344で一晩、安定物をインキュベート、
ii) 相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、NBこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る:
a. スポットの出現: 安定物から細胞をクローン、
b. スポットなし: (B)を行う、
【0086】
B i) 10 μM のロリプラムと別々の1 μM RS25344で一晩、安定物をインキュベート、
ii) ロリプラム又はRSの洗い出し、60分インキュベート(PDE4A4アンカーをその結合から解放する)、
iii) 10 μMロリプラム又は1 μM RS25344とともに(又はそれによって迅速に続けて)相互作用刺激、つまり対を一緒にするような適当な処理で試験、
a. スポットの出現: 安定物から細胞をクローン、
b. スポットなし: (6)を参照のこと。
【0087】
実施例4:PKAcatαアンカータンパク質でのタンパク質X及びYのプローブ
この実施例で、アンカープローブはHSPKAcatα(ヒトサイクリックAMP−依存プロテインキナーゼの触媒サブユニット、イソ型α:以降、PKAcとして言及)に基づいており、これは、細胞へのトランスフェクト時に低濃度の細胞質cAMP条件下で細胞質に集合物を形成する。これらの集合物は、PKAcに対する抗体、またPKA制御サブユニット1α型(R1α)に対する抗体を用いて検出され得る。PKAcのC末端に融合されるGFPを有する融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、そのような集合物は、細胞で明るい緑色の蛍光スポットとして見られる(図5)。これらの集合物は、cAMPが細胞で上昇する場合、例えば細胞を500μMイソブチルメチルキサンチン(IBMX)を加えた25μMのフォルスコリンで処理する場合、細胞質に分散する。検出可能なEGFP(一方がX、他方がY)を加えたPKAcアンカープローブで同時にトランスフェクトした細胞では、GFP−明スポットは、XとYが相互作用して互いに引き寄せるならば、細胞でのみ見られるであろう(図11a)。スポットは、cAMPが細胞で上昇する場合に消失するであろう(図11b)。
【0088】
PKAcアンカー系のプロトコル:
1) アンカー−検出対のCHOへの同時トランスフェクト、
2) 過渡物の分布のチェック
a) スポットあり: 過渡物から細胞をクローン、及び(3にあるような)二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
b) スポットなし: 安定物3)を待機、
c) 他の分布が存在し、正常なPKAスポットとは異なれば、50μMフォルスコリン+500μM IBMXで試験し、
i) 分布が変化すれば、(3)に記載する二重選択下でのスクリーニングで用いる細胞を準備し、
ii) 変化なし: (3)の安定物に続行する価値が依然としてあり得る、
【0089】
3) 二重選択(例えばゼオシン1mg/ml+0.5mg/mlネオマイシン/G418)を用いて安定な細胞系を作製、
a) スポットの出現:50μM フォルスコリン + 500 μM IBMXで試験;分布が変化すれば、スクリーニングで用いるための細胞を二重選択下でクローン、
b) スポットなし: 抗−PKAcat抗体で固定し、染色
i) PKAcat抗体で染色: (4)に進む
ii) スポットなし:アンカー系が存在していないか、作用していない、又はcAMPが極めて高い
・ PKA制御サブユニット1α型(R1α)に対する抗体で染色 − これは、触媒サブユニットが分離していても(高cAMP)PKA「スポット」を示すであろう: スポットが見られなければ、再トランスフェクトする、
4) 暫定的結合を試験(以下のA及びB参照)、
5) 結合状態が見られなければ、アンカー/検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【0090】
適当な相互作用刺激:A及びBでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのB試験。
A i) 相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、NBこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る:
a. スポットの出現: スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
b. スポットなし: (B)を行う、
【0091】
B i) 50 μM のフォルスコリン+500μMのIBMXで30分安定物をインキュベート(PKAアンカーを解放する)、
ii) フォルスコリン+IBMXの洗い出し、相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、30〜60分インキュベート、
a. スポットの出現: スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
b. スポットなし: (5)を参照のこと。
【0092】
実施例5:PDE4A1ドメインアンカータンパク質でのタンパク質X及びYのプローブ
この実施例で、アンカープローブはPDE4A1ドメインに基づいている。PDE4A1は、他の点では未処理の細胞で小さな核周辺スポットとして蓄積する。これらのスポットは、PDE4AのユニークなC末端部分に対する抗体で容易に検出される。ロリプラムでの処理は、これらのスポットを細胞質へ分散させる(図13)。その後、ロリプラムを除くと、核周辺スポットが迅速に再現される。
【0093】
図13aで、HSPDE4A1−GFPを安定的に発現するCHO細胞は、10%FBSを有するHAM’sF12培地でのみ生育する;GFP蛍光は、各細胞の核周辺の細胞質内の明るい顆粒状のスポットに限定される。スポットは、ゴルジ膜の周囲、内部又は膜上に密集していてもよい。図13bで、13aで見られたのと同様の細胞を、2μMのロリプラムで2時間処理した。大部分のGFP−明スポットはロリプラム処理下の全細胞で消失し、細胞質が一般に明るくなる。大きなスポットは、幾つかの細胞では完全には分散しない可能性がある。ロリプラムを洗い出すと、スポットは、1.75時間以内に再形成する。
さらに、PDE4A1の分布及びそのあらゆる変化は、自動画像化によって容易に測定できる。
【0094】
図14は、ロリプラムに対するスポットの分散についての用量反応曲線を示す。各濃度のロリプラムについて、細胞当たりのスポット数は4回の測定±semの平均であり、各測定はそれ自体100個以上の細胞から得た平均である。様々な濃度のロリプラムと10%FBSを加えたHAM’s F12培地で細胞を7時間生育させる。そして、細胞を4%のホルマリン緩衝液(pH7.5)で15分間化学的に固定し、PBSで洗浄し、PBS 中10μMのヘキスト33258で25℃で10分間染色し、そしてPBSで2回洗浄する。実施例2に記載のように、自動画像を収集し、細胞当たりのスポット数を分析する。
【0095】
PDE4A1アンカー系のプロトコル:
1) アンカー−検出対のCHOへの同時トランスフェクト、
2) 過渡物の分布のチェック
a) スポットあり: 過渡物から細胞をクローン、及び(3にあるような)二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
b) スポットなし: 安定物3)を待機、
c) 他の分布が存在し、正常なPDE4A1スポットとは異なれば、10μMロリプラムで試験し、
i) 分布が変化すれば、(3)に記載する二重選択下でのスクリーニングで用いる細胞を準備し、
ii) 変化なし: (3)の安定物に続行する価値が依然としてあり得る、
【0096】
3) 二重選択(例えばゼオシン1mg/ml+0.5mg/mlネオマイシン/G418)を用いて安定な細胞系を作製、
a) スポットの出現:10μM ロリプラムで試験;分布が変化すれば、スクリーニングで用いるための細胞を二重選択下でクローン、
b) スポットなし: 抗− PDE4A抗体で固定し、染色
i) PDE4A抗体で染色: (4)に進む
ii) スポットなし:アンカー系が存在していないか、作用していない、再トランスフェクト、
4) 暫定的結合を試験(以下のA及びB参照)、
5) 結合状態が見られなければ、アンカー/検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【0097】
適当な相互作用刺激:A及びBでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのB試験。
A ii) 相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、NBこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る:
a. スポットの出現: スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
b. スポットなし: (B)を行う、
【0098】
B i) 10 μM のロリプラムで7時間安定物をインキュベート(PDE4A1アンカーを解放する)、
ii) ロリプラムの洗い出し、相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、2〜4時間インキュベート、
a. スポットの出現: スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
b. スポットなし: (5)を参照のこと。
【0099】
実施例6:Cys1ドメインアンカータンパク質でのタンパク質X及びYのプローブ
この実施例で、アンカープローブは、myc 又は flag抗原のコード配列が任意に含まれる PKCγのCys1ドメイン(プロテインキナーゼCイソ型γのCys1ドメイン)に基づいており、これは、細胞へのトランスフェクト時に、PMA(ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート)での処理時に原形質膜に再分布する一般的な細胞質分布を有する。これらがCys1構築物内に設計されるならば、細胞質から原形質膜への再分布は、PKCγのCys1ドメインに対する抗体、又はmycもしくはflag抗原に対する抗体を用いて検出され得る。PKCγのCys1ドメインのC末端にGFPが融合した融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、myc又はflag抗原配列を用いて、あるいは用いないで、PMA−誘導性再分布を、原形質膜でのGFP蛍光の随伴する増加に伴う細胞質中のGFP蛍光の低下として検出することができる(図6)。EGFP検出プローブ(一方がX、他方がY)を加えたPKCγアンカープローブのCys1ドメインで同時にトランスフェクトした細胞では、GFP蛍光は、X及びYが相互作用して互いを引き寄せる場合に、PMA処理によって原形質膜に再分布するにすぎないであろう(図12)。
【0100】
Cys1アンカー
1) 新たなアンカー−検出対のCHOへの同時トランスフェクト、
2) 過渡物で分布が細胞質であることをチェック。スポット又は他の明確な分布が存在すれば、(3)の試験をする価値が依然としてある可能性がある、しかし、分布変化が測定可能な場合のみである、
3) 過渡物を30分100nM PMAで試験、
a) 原形質膜へのプローブの分布:(4)にあるような二重選択下で過渡物から細胞をクローン、
b) 再分布なし:安定物を待機(4参照)、
【0101】
4) 二重選択(例えばゼオシン1mg/ml+0.5mg/mlネオマイシン/G418)を用いて安定な細胞系を作製。PMAで試験、
a) 原形質膜へのプローブの分布:二重選択下、クリーニングで用いるための備、
b) 再分布なし:抗−myc抗原で固定し、染色、
i) 抗体でPM染色: (5)に進む
ii) PM染色なし:アンカー系が存在していないか、作用していない−再トランスフェクト、
5) 暫定的結合を試験(以下のA及びB参照)、
6) 結合状態が見られなければ、アンカー/検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【0102】
適当な相互作用刺激:A及びBでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。PMへの標的化を課す前に、「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのB試験。
A i) 100nM PMAで安定物を30分インキュベート、
ii) 相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、NBこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る:
(a) PMに対して再分布:安定物などから細胞をクローン、
(b) 再分布なし:(B)を試験、
【0103】
B i) 100nM PMAで安定物を30分インキュベート、
ii) 相互作用刺激、つまり100nM PMAとともに(又はそれにより迅速に続けて)対を一緒にするような処理で試験、
(a) PMに対して再分布:(4)のような二重選択下で安定物から細胞をクローン、
(b) 再分布なし:(6)参照。
【0104】
実施例7:PDE4A4でのSosとGrb2の相互作用の評価
この実施例は、SosとGrb2との相互作用に対する化合物、哺乳動物細胞の原形質膜に局在するあるチロシンキナーゼレセプターからすぐ下流のシグナル経路に関与する成分、例えばインスリン及び上皮細胞成長因子レセプターをスクリーニングするのに適した細胞系を作成する再分布トラップ法の使用を説明する。SosはRas−様GTPaseの活性化をもたらすグアニンヌクレオチド変換因子であり、Grb2は活性レセプターへのSosの補充をもたらすアダプター成分である。この実施例で、アンカープローブはHSPDE4A4に基づいている。CHO細胞を、実施例2及び3に記載のように、アンカープローブHSPDE4A4−SosA及び「検出性」プローブhGrb2−EGFPを用いて安定的に同時トランスフェクトさせる。ゼオシンを用いてアンカープローブを選択し、ネオマイシン(G418)を用いて検出性プローブを選択する。図8aは、10%FBSを有するHAM’s F12培地で成長する、そのような細胞の共焦画像であり、図8bは、10μMのロリプラムでの処理後の同様の細胞を示す。トランスフェクト細胞は、混合された非−クローン群である。GFP−標識した検出プローブ(GFP蛍光)は、核中わずかに高い濃度で、ロリプラム処理前の細胞一面に分布している。ロリプラム処理(20時間)後、幾つかの細胞は、クローン群で明瞭な明スポットを生じる(図8b)。スポットの出現とロリプラムの必要性は、PDE4A4に予測されるように、これらの細胞でアンカープローブがロリプラムに反応すること(図2)、及び、GFP−標識した検出プローブがそれと結合しているに違いなことを示している。スポットがアンカープローブに対するロリプラム誘導性作用の結果であることを確認するため、PDE4特異的阻害剤RP73401をロリプラムの存在下で適用する(図9)。RP73401はロリプラムと競合し、そしてPDE4A4スポットを分散させる(図3及び4)。図9に見られるように、スポットはRP73401処理で消失し、それが、検出プローブのまばらな分布をもたらすアンカープローブであること、またアンカーと検出対が相互作用していることを立証している。HSPDE4A4及びEGFPは同時トランスフェクト及びロリプラム処理時に相互作用しない(示していない、しかしEGFP分布は、そのような細胞中の核及び細胞質の双方で常に総−細胞性であり、その分布はロリプラムによって影響されない)ので、相互作用は、SosとGrb2の天然の相互作用によって媒介される必要がある。
【0105】
クローン時、Sos−Grb2相互作用に対する化合物をスクリーニングするために同時トランスフェクト細胞を使用してもよい。これらの同時トランスフェクト細胞でロリプラム−誘導性スポットをつくり、消失するが、HSPDE4A4−EGFPプローブのみを安定的に発現する細胞ではロリプラム−誘導性スポットに影響しない化合物は、SosとGrb2との相互作用を特に崩壊させる化合物である。
【0106】
実施例8:PKAcatαでのSosとGrb2の相互作用の評価
この実施例は、Grb2とSosのC末端配列(Sosの1067〜1332アミノ酸)との相互作用に対する化合物をスクリーニングするのに適した細胞系の作成を記載している。これは、アンカープローブがcAMP−依存プロテインキナーゼイソ型αの触媒サブユニット(HSPKAcat−hGrb2)に基づく以外は、実施例7に記載の相互作用対に類似しており、それゆえ、それらが引き寄せ合えば、検出プローブ(EGFP−Sos−Cterm)がGFP−鮮やかとなる集合物として非刺激細胞に局在する。このアンカー系のひとつの潜在的な利点は、事前のアンカー刺激が、相互作用を評価するには必要でないが、相互作用を同定した後に確認試験として使用されることである。したがって、この系を用いる相互作用調節物のスクリーニング工程は、試験中の相互作用を干渉し得る他の細胞シグナル系路の活性を変える見込みを伴わない。
【0107】
フォルスコリン±IBMX(イソブチルメチルキサンチン、非特異的PDE阻害剤)での処理は、あらゆるGFP−鮮やかな集合物がこの系でのアンカーと検出プローブとの特異的相互作用の結果であることを確認するために、PKAcat系で用いられる。というのは、PKAcatの集合物は、この処理下の細胞質に分解するためである。
実施例2及び実施例4に記載のように、アンカープローブHSPKAcat−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermを用いてCHO細胞を安定的に同時トランスフェクトさせる。ゼオシンを用いてアンカープローブを選択し、そしてネオマイシン(G418)を用いて検出プローブを選択する。アンカープローブHSPKAcat−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermの双方を安定的に発現するCHO細胞を、50μMのフォルスコリン+500μMのIBMXでの処理前(図11a)及び処理から10分後(図11b)の図11に示す。非刺激細胞(図5、t=0分)で見られるPKAcat−EGFPの分布に典型的なGFP−鮮やかな集合物を有する3個の細胞を、(図11a)に明らかにする。フォルスコリン+IBMXによるこれらのスポットの分散、細胞中のcAMPを増加させる処理は、GFP−標識した検出プローブが同時トランスフェクト細胞中のアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している。というのは、アンカープローブのみがこうして増加したcAMPに反応できるためである(図5)。
【0108】
スポットを示す細胞は、クローニングに適しており、Grb2とSos−Ctermとの相互作用に対する化合物のスクリーニングに使用してもよい。GFP−鮮やかな集合物をこれらの同時トランスフェクト細胞で消失させるが、PKAcat−EGFPプローブのみで安定的にトランスフェクトされた細胞では集合物に影響しない化合物は、Sos−CtermとGrb2との相互作用を特に崩壊させる化合物である。
【0109】
実施例9:Cys1ドメインでのSosとGrb2の相互作用の評価
この実施例は、Grb2とSosのC末端配列(Sosの1067〜1332アミノ酸)との相互作用に対する化合物のスクリーニングに適した別の細胞系の作成を記載している。これは、アンカープローブがプロテインキナーゼCイソ型ガンマのCys1ドメインに基づく以外は、実施例6に記載されるものと同一の相互作用対であり、このため、非刺激細胞で細胞質及び核一面に局在する。これらの細胞を100nMのPMAで処理すると、アンカープローブが原形質膜に再分布し、相互作用がアンカーと検出プローブとの間で発生すれば、GFP蛍光が原形質膜に再分布することも認められるであろう。このアンカー系の利点は、PMAでの刺激時に、アンカープローブが、アンカーに結合する成分とEGFP分子との相互作用を調節する上で重要な可能性がある他の成分と極めて接近するような原形質膜に取り込まれることである。Grb2及びSos−Ctermの場合、原形質膜への接近は、それらの相互作用の開始には不要と思われるが、ある成分対は、この条件に合致しなければ、相互作用しない可能性がある。PMAでの処理は、2つのプローブの相互作用が最初に起これば、原形質膜への蛍光の再分布のみが生じるので、アンカーと検出プローブとの相互作用がこの系で生じることを確認するために用いられる。これは、PMAが蛍光の分布に影響しないEGFP−Sos−CtermのみでトランスフェクトしたCHO細胞でチェックすることができる。
【0110】
実施例2及び実施例6に記載のように、アンカープローブCys1−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermを用いてCHO細胞を安定的に同時トランスフェクトする。アンカープローブをゼオシンで選択し、検出プローブをネオマイシン(G418)で選択する。図12は、100nMのPMAでの処理前(図12a)及び処理から5分後(図12b)のアンカープローブCys1−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermの双方を安定的に発現するCHO細胞を示す。PMA処理前の細胞の大多数は、かなり一般的な細胞質様及び核様の蛍光分布を有する。PMAでの処理は、原形質膜に対し測定可能な蛍光のシフトを引き起こし、同様に、Cys1−EGFPがPMAに応じて再分布するであろう(図6)。この結果は、アンカープローブのみがこうしてPMAに反応できるため、GFP−標識した検出プローブがアンカープローブと相互作用しているに違いないことを示している。
【0111】
この様相を示す細胞は、クローニングに適しており、Grb2とSos−Ctermとの相互作用に対する化合物のスクリーニングに使用してもよい。これらの同時トランスフェクト細胞でEGFP蛍光のPMA−誘導性再分布を妨げるが、Cys1−EGFPプローブのみで安定的にトランスフェクトされた細胞で蛍光再分布に影響しない化合物は、Sos−CtermとGrb2との相互作用を特異的に崩壊させる化合物である。
【0112】
実施例10:トラップアッセイのアッセイ方法
選択的なPDE4阻害剤のロリプラムは、大部分の細胞で一般的なPDE4A4の細胞質分布が、細胞質内の幾つかの明瞭なスポットに局在するPDE4A4の濃度からなる分布に徐々に変化するように、PDE4A4の物理特性及び挙動に影響を及ぼす(実施例3参照)。
この実施例は、14−3−3タンパク質とBADとの結合が、PDE4A4−14−3β及びeGFP−BAD融合体を用いてどのようにして可視化できるかを示している。それは、可溶性の細胞質状態から、eGFP−BAD融合体が結合されているか、又は細胞質中で実際に凝集している状態への可動性変化の一例である。
【0113】
使用される化学製品:
グルタマクス−1を有するNUT.MIX F−12(HAM).Gibco Bri 31765−027。
「FCS」、仔ウシ血清、Gibco Bri 10084−168。
Pen/strep(100u/ml/100μg/ml、Gibco cat Bri 15140−122。
4%のホルムアルデヒド、Bie&Berntsen Lab 00220。
トリトン−X 100、Sigma
ヘキスト33258(貯蔵液:10mM)
ロリプラム、RBI
DMSO、Sigma D−5879。
【0114】
器具:
Fluoscan ASCENT CFプレートリーダー(Labsystems)
フィルター: 485/527(GFP)及び355/460(ヘキスト)、全てLabsystemsのもの
緩衝液:
抽出緩衝液:PBSで1:40(=0.1%)に希釈したホルムアルデヒド4%+トリトン−X 100 1%+ヘキスト33258 10μM
PBS ダルベッコ:GIBCO 14190−094
【0115】
細胞:
細胞型:PDE4A4とヒト14−3−3βとのインフレームの融合タンパク質を発現するプラスミドと、EGFPとヒトBADとのインフレームの融合タンパク質を発現する別のプラスミドでトランスフェクトしたCHO細胞(このようなプローブの構築についての詳細は、実施例1及び3に見出すことができる)。
密度:96ウェル−マイクロタイタープレート(ViewPlate96、黒色;Packard)中、1.0×10E5/ウェル(接種日)
【0116】
方法:
細胞を、スクリーニングの20〜24時間前に、200μlのHAM F−12w.10%FCS及び5% pen/strep中の1.0×10E5/ウェルにプレートする。刺激細胞に、さらに10μMのロリプラムを加える。
14−3−3とBADとの相互作用を阻害し得る薬剤を試験するため、試験化合物を200μlのHAM F−12生育培地の上部に加え、CO2インキュベーターで2時間培養する。
試験化合物を有するHAM F−12をマイクロタイタープレートの全ウェルから出し、細胞を200μlの抽出緩衝液で5分間抽出する。
細胞に200μlの抽出緩衝液の上部で100μlのホルムアルデヒド4%緩衝液を加え、5分インキュベートする。
抽出緩衝液を除き、細胞を100μl のPBSで2回洗浄する。細胞に200μlのPBS緩衝液を加える。
【0117】
予めプログラム化した方法及びGFPならびにヘキスト33258蛍光団に適したフィルター設定を用いて、ASCENTプレートリーダーで蛍光を読み取る。ヘキストの読み取りを用いて、細胞数を予測でき、それによって、同数の細胞の含んでいない可能性のあるウェルからGFPシグナルの標準化に有用なシグナルを供する。結果を図15に示す。
【0118】
実施例11:再分布(登録商標)アッセイのアッセイ法
NFkB(p65)がII−1とのNFkBの刺激でサイトソルから核へ移動することは、十分に立証されている。このことは、NFkB(p65)−GFP融合体を用いて視覚化できる。サイトゾルのNFkB(p65)−GFPの移動後に測定される総GFP濃度は、核への移動度、つまりNFkBの活性化度を示す。これは、可溶性細胞質NFkBから核中に結合された成分への変化としての可動性変化の一例である。
抽出法を適用することで、非刺激細胞及び刺激細胞との相違を蛍光の強度によって読み取ることができる(図16参照)。
【0119】
実施例12:抽出最適化
細胞を既知の濃度で接種し、24時間生育させる。トリトン−x 100とホルマリンを様々に組み合わせて刺激細胞と非刺激細胞(完全な「運的」範囲を示す)を抽出し、シグナルをプレートリーダーで読み取る。本目的は、ノイズに対する最適なシグナル(s/n)割合を示すホルマリンとトリトン−xとの割合を同定することである。s/nは、(刺激細胞中の蛍光−非刺激細胞中の蛍光)/非刺激細胞での蛍光×100%として算出される。
【0120】
【数1】
【0121】
14−3−3タンパク質とBADとの結合用抽出緩衝液の最適化
最適化を図17で例示する。
【0122】
実施例13:抽出物を用いるフォルスコリン誘導性PKAcat移動の定量
PKAcat−GFPは、不活性な四量体形態の明瞭なスポットを形成する。細胞cAMPの増加(例えばフォルスコリンによるアデニレートシクラーゼ活性の刺激による)によって、PKAcatがその制御サブユニットから分離し、スポットをサイトゾルに「分解」する。抽出方法をとおしてサイトソルPKAcat−GFPを除いた後に測定される総GFP強度は、不活性化、非−分離PKAcatのレベルを示している。
この実施例では、抽出法を用いて、PKAcat−GFPアッセイでのフォルスコリン用量反応を定量している。
細胞を、種々の濃度のフォルスコリンで15分間処理する(スポットの除去)。細胞を抽出する(0.2%のホルマリン/ 0.2%のトリトン−x)。シグナルをFLIPRで読み取る。結果を図18に示す。約3μMで測定されたED50は、文献の基準と一致している。
【0123】
実施例14:正常なCHO細胞とHSPDE4A4B−GFP融合タンパク質を安定的に発現するCHO細胞におけるロリプラム処理の作用の比較
PDE4阻害剤のロリプラムは、実施例3に記載のPDE4A4に対する融合体でトランスフェクトした細胞の細胞質中で、稠密なPDE4A4集合物の生成を刺激するために用いられる。そのような刺激を用いることに関して有り得る懸念は、PDE4酵素の基質である二次メッセンジャー分子cAMPのレベルが、ロリプラム処理細胞で望ましくないcAMP−依存性工程も活性化され得るような程度に、それらの細胞で増加する可能性があることである。cAMP−依存性エフェクタータンパク質の例には、PKAファミリーのキナーゼ、幾つかのイオンチャンネル及びcAMP−GEF1ならびに2のような、あるグアニンヌクレオチド変換因子が含まれる。この実施例は、ロリプラムでの処理が、融合タンパク質はホスホジエステラーゼ活性を有するが、HSPDE4A4B−GFPを発現するCHO細胞では細胞cAMPレベルを独力で増さないことを立証している。したがって、これらの細胞での望ましくないcAMP−依存性工程の活性化は、ロリプラムが、これらの細胞でPDE4A4の稠密な集合物の生成を刺激する際には、極めて見込みがない。
【0124】
HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現するCHO細胞(実施例2参照)及び非トランスフェクトCHO細胞を、1.2×105細胞/ウェルの密度で96−ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに接種し、グルタマクス、100μgのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ml−1及び種々の濃度のロリプラムを加えた10%FBSを有するHAM F−12培地で16〜18時間培養する。インキュベート後、Amarsham−Pharmacia Biotechの市販キット、キット♯RPA538を用い、製造元の指示にしたがってcAMP含量を測定する。
【0125】
アッセイキットの製造元が推奨するように、cAMP/ウェルの量を、cAMP標準曲線から回帰分析を用いて算出した。この実験の結果を図19に示す。正常な非トランスフェクトCHO細胞(◆)及びHSPDE4A4B−GFPを安定的に発現する細胞(■)の曲線は、いずれも0.03μM〜3μMのロリプラム処理の範囲に対し細胞cAMP濃度の際立った増加を示さない。10μMのロリプラムでの正常なCHO細胞の僅かなcAMP増加は、この濃度が公知のPDE4イソ型のロリプラムによる阻害について報告されているあらゆるIC50値よりも30〜300倍高いため、おそらく有意ではないであろう。
【0126】
別の実験で、非トランスフェクトCHO細胞及び安定的にHSPDE4A4B−GFPを発現するCHO細胞を、図19に記載のようにロリプラムを加えずに、但し種々の濃度のフォルスコリンを添加し、cAMPレベルの測定前に60分培養した。この実験の結果を図20に示す。正常な非トランスフェクトCHO細胞(◆)の曲線は、アデニレートシクラーゼ活性体に応じて予想される細胞cAMPの用量−依存増加を示す。HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現する細胞(■)は、0.3μM〜100μMのフォルスコリン処理の範囲に対し細胞cAMP濃度の際立った増加を示さない。この結果は、HSPDE4A4−GFP融合タンパク質が活性なホスホジエステラーゼ酵素であること、及び、その大きく増した発現は、試験範囲にわたるフォルスコリンによるアデニレートシクラーゼ活性化にも関わらず、これらの細胞でのあらゆるcAMP増加を効果的に妨げることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図1】
10%FBSを有するHAM’s F12培地で成育する、プローブHSPDE4A4−EGFP−N1で安定的にトランスフェクトされたCHO細胞を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン混合群由来のクローンである。GFP蛍光は、ほぼ均等に非−核細胞質に分布しており、この範囲内の暗領域は、おそらく、見かけ上プローブが除かれたミトコンドリアであろう。
【図2】
10%FBS及び2μMロリプラムを有するHAM’s F12培地で成育する、プローブHSPDE4A4−EGFP−N1で安定的にトランスフェクトされたCHO細胞を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン群から単離した単細胞に由来する。細胞を6.7時間ロリプラムで処理した。GFP蛍光は、95%以上の細胞の明スポットに集中している。
【図3】
HSPDE4A4−EGFPを発現するクローン細胞での3μMロリプラムに対するRP73401の用量反応。細胞を96−ウェルのPackard ViewPlateに接種し、約80%の集密まで3μMロリプラムと10%FBSを加えたHAM’s F12培地で生育させる。ロリプラム処理は、計16時間であった。種々の濃度のRP73401をロリプラム−含有ウェルに加え、さらに4時間インキュベートした。次いで、細胞を化学的に固定し、洗浄し、ヘキスト 33258で染色し、自動画像化を用いて各処理ウェルについて細胞当たりの平均スポットを計測した(全て実施例2に記載のとおり)。各ポイントは、同濃度のRP73401 で5個の処理ウェルから測定される細胞当たりの平均スポットの平均である。結果を4−パラメータのヒルプロット(Hill plot)に適合させ、3μMロリプラムによるスポット形成のRP73401での競合阻害に対する20nMのIC50数を出す。
【図4】
FIPRで測定される、HSPDE4A4−EGFPを発現するクローン細胞での1μMロリプラムに対するRP73401の用量反応。細胞を96−ウェルPackard ViewPlateに接種し、約80%の集密まで1μMロリプラムと10%FBSを加えたHAM’s F12培地で生育させる。ロリプラム処理は、計16時間であった。様々な濃度のRP73401をロリプラム−含有ウェルに加え、さらに4時間インキュベートした。次いで、細胞を同時にかつ化学的に固定し、浸透させ、洗浄し、そしてスポット形成をFLIPR装置で測定した(全て実施例2に記載のとおり)。スポット形成の程度(縦座標値)を、バックグラウンドシグナル(ロリプラム未処理細胞からの値)±標準偏差を含む未修正値として得る。
結果を4−パラメータのヒルプロットに適合させ、1μMロリプラムによるスポット形成のRP73401での競合阻害に対する約50nMのIC50数を出す。
【図5】
フォルスコリン処理した、ヒトcAMP−依存プロテインキナーゼ触媒サブユニットイソ型αのC末端へのEGFPの融合体である、HSPKAcat−EGFPを発現するCHO細胞の経時的画像。細胞は、10%FBSを加えたHAM’s F12培地で生育するクローン細胞系で、これにt=0時で1μMフォルスコリンを加えた。連続画像は、cAMPレベルがフォルスコリン処理の結果として細胞内で増すにつれて、蛍光タッグされたPKAの触媒サブユニットが、数分のあいだに鮮やかな集合物から細胞質にどのようにして再分布するかを示している。スケールバー=10μ。
【図6】
100nMPMAでの処理前(a)及び処理から5分後の、ヒトプロテインキナーゼCイソ型ガンマ由来cys1ドメインのC末端へのEGFPの融合体であるCys1−EGFPを発現するCHO細胞の経時的画像。細胞は、10%FBSを加えたHAM’s F12培地で生育するクローン細胞系である。100nM PMAでの処理から5分後(b)、蛍光タッグされたPKCガンマのCys1ドメインは、細胞質及び核から原形質膜に再分布する。
【図7】
C−末端をGFPでタッグしたPKCガンマのヒトイソ型のCys1ドメインを安定的に発現するCHOクローン細胞系を、96−ウェルのマイクロタイタープレート(Packard View−Plate)で培養した。KRW(実験緩衝液、NaCl 140、KCl 3.6、NaH2PO4 0.5、MgSO4 0.5、NaHCO3 2.0、CaCl2 1.5及びHEPES 10、D−グルコース 5(pH 7.4、1M NaOHで滴定)を(mMで)含む改質クレブス−リンゲル緩衝液)中で20分、事前にインキュベートした後、細胞プレートをFIPRに置く。続いて、1:3工程で10μM〜0.5nMの用量で得たホルボールエステルPMAを用いて細胞をFIPR装置上で刺激した。これは、PKCガンマ−Cys1が最初の1〜5分の刺激中にサイトゾル及び核の画分から原形質膜に移動するので、蛍光強度の縮小として定量できるタイプの再分布反応をこれらの細胞で生じる。図は、PMAでの刺激の最初の3分間に蓄積される蛍光変化(n=8)の平均(+SD)として用量反応を示す。8個のバックグラウンドトレースに基づくバックグラウンドトレースの控除によって全データをバックグラウンドに対して補正し、PMAの添加時を0に設定した。
【図8】
10%FBSを有するHAM’s F12培地で生育する、アンカープローブHSPDE4A4−SosA及び検出プローブhGrb2−EGFPで安定的に同時トランスフェクトされたCHO細胞(a)、及び10μMロリプラム処理後の同様の細胞(b)を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン混合群である。GFP−標識した検出プローブ(GFP蛍光)は、ロリプラム処理前(a)、核で僅かに高い濃度を有しながら、細胞一面に分布している。ロリプラム処理後(20時間;b)、クローン群中、幾つかの細胞は明瞭な明スポットを生じる。スポットの出現とロリプラムの必要性は、PDE4A4に予想されるように、これらの細胞でアンカープローブがロリプラムに反応すること(図2)、及び、GFP−標識した検出プローブがそれと結合しているに違いなことを示している。
【図9】
10μMのロリプラムで20時間処理した図8b と同一の細胞群(a)を、室温で75分10μM RP73401を用いてさらに処理する(b)。この処理は、HSPDE4A4−EGFPのロリプラム−誘導性スポットを分解し(図3及び4)、これらの細胞でGFP−明スポットに同一の作用を有する。これは、これらのスポットが、アンカープローブとGFP−標識した検出プローブとの相互作用の結果であることを立証している。
【図10】
HSPDE4A4−EGFPを発現するCHO細胞を、10μMロリプラムで20時間処理し、次いで化学的に固定し、HSPDE4A4酵素のユニークなC末端配列の一部と同一のペプチドに対して宿主のヒツジで生じる抗体を用いて免疫染色した。抗体は、Alexa 549接合性ロバ抗ヒツジ抗体(Molecular Probes Inc、Oregon、USA)を用いて検出される。この共焦顕微鏡写真対は、Alexa549蛍光で得られる画像(b)と比較した細胞中のEGFP蛍光の画像(a)を示している。GFPとAlexa 594の画像とに有意なブリード−スルー(bleed−through)蛍光が確実にないように、放射フィルター(a:515〜525nm帯域、b:590nm長−路)を選択する。これらの画像は、ロリプラム処理した同時トランスフェクト細胞で未標識HSPDE4A4−ベースのアンカープローブの存在を確認するのに有用な、EGFPタグを個々に要するHSPDE4A4の集合物をPDE4A4抗体を用いてどのようにして検出できるかを立証している。
【図11】
50μMフォルスコリン+500μM IBMXでの処理前(a)ならびに処理から10分後(b)のアンカープローブHSPKAcat−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermの双方を安定的に発現するCHO細胞。非刺激細胞で見られるPKAcat−EGFPの分布に典型的なGFP−鮮やかな集合物を有する3個の細胞が、(a)で明らかである(図5、t=0分)。フォルスコリン+IBMXによるこれらのスポットの分散、細胞でcAMPを増す処理は、アンカープローブのみがこうして増加したcAMPに反応できるため、GFP−標識した検出プローブが同時トランスフェクト細胞でアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している(図5)。
【図12】
100nM PMAでの処理前(a)及び処理から5分後(b)のアンカープローブCys1−hGrb2とGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermの双方を安定的に発現するCHO細胞。(a)の細胞の大多数は、かなり一般的な細胞質及び核の蛍光分布を有する。PMAでの処理で、原形質膜への蛍光の測定可能なシフトが引き起こされ、同様にしてCys1−EGFPがPMAに応じて再分布する(図6)。この結果は、アンカープローブのみがこうしてPMAに反応できるため、GFP−標識した検出プローブがアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している。
【図13】
プローブHSPDE4A4−EGFPで安定的にトランスフェクトされたCHO細胞を示す共焦蛍光画像。画像を、強度を直接比較するため、同一の顕微鏡設定で記録する。トランスフェクト細胞は、単一親細胞由来のクローン群である。図13aでは、細胞は10%FBSを有するHAM’s F12培地のみで生育する;GFP蛍光は、各細胞の核周辺細胞質内の鮮やかな顆粒様スポットに限定される。図13bでは、図13aで見られるのと同様の細胞を2μMロリプラムで2時間処理した。GFP−明スポットの大多数はロリプラム処理中の全細胞で消失し、細胞質は一般に明るくなる。大きなスポットは、幾つかの細胞では消失しない。ロリプラムを洗い流すと、スポットは1.75時間以内に再形成する。
【図14】
図14は、ロリプラムに対するPDE4A1スポット分散の用量反応曲線を示す。種々の阻害剤の各濃度に対する細胞当たりのスポット数は4回の測定±semの平均であり、各測定はそれ自体100個以上の細胞から得た平均である。細胞を、様々な濃度のロリプラムと10%FBSを加えたHAM’s F12培地で7時間生育させる。次いで、細胞を4%のホルマリン緩衝液(pH 7)で15分間化学的に固定し、PBSで洗い、PBS中10μMのヘキスト33258で25℃で10分間染色し、そしてPBSで2回洗浄する。実施例2に記載のように自動画像を収集し、細胞当たりのスポット数を分析する。
【図15】
PDE4A4とヒト14−3−3βとのインフレーム融合タンパク質及びEGFPとヒトBADとのインフレーム融合タンパク質を発現するCHO細胞の刺激作用。著しいスポットの出現が、ロリプラムで刺激した細胞で観察される(左パネル)。抽出細胞は、スポット及び集合物に局在する蛍光を大部分保持するが、細胞質により一般的に分布している蛍光を失う。この非−アンカー蛍光は恐らく可動性で、それゆえ、その浸透により細胞から迅速に洗い流される。
【図16】
1ng/mlのII−1でのNFkB(p65)−EGFP融合体を発現するCHO細胞の刺激作用。サイトソルから核への著しい再分布が観察される(左パネル)。抽出細胞は、核由来の蛍光の大部分を保持するが、サイトソル由来の蛍光は失われる(右パネル)。
【図17】
トラップアッセイ(スポット):4A4−14−3−3b+eGFP−BAD
A:測定される完全な蛍光
B:図Aのデータに基づくシグナル/ノイズ割合。見られるように、最適なシグナル/ノイズ割合は、この場合、ホルマリン0.8%+トリトン−x 100 2%を用いて得られる。
【図18】
PKA移動を刺激するフォルスコリンの作用に対する用量反応。算出されるEC50=3.28uMフォルスコリン。
【図19】
HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現するCHO細胞(実施例2参照)及び非トランスフェクトCHO細胞を、96−ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェルに1.2×105細胞/ウェルの密度で接種し、グルタマクス、100μgのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ml−1及び様々な濃度のロリプラムを加えた10%FBSを有するHAM’s F12培地で16〜18時間培養する。インキュベート後、Amersham−Pharmacia Biotechの市販キット、kit♯RPA538を用い、製造元の指示に従ってcAMP含量を測定する。
アッセイキットの製造元によって推奨されるようにして、cAMP標準曲線から回帰分析を用いてcAMP/ウェルの量を算出した。正常な非トランスフェクトCHO細胞(◆)及びHSPDE4A4B−GFPを安定的に発現する細胞(■)の曲線は、いずれも0.03μM〜3μMのロリプラム処理の範囲に対し細胞cAMP濃度の際立った増加を示さない。10μMのロリプラムでの正常なCHO細胞の僅かなcAMP増加は、おそらく有意ではない。
【図20】
HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現するCHO細胞(実施例2参照)及び非トランスフェクトCHO細胞を、96−ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェルに1.2×105細胞/ウェルの密度で接種し、グルタマクス、100μgのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ml−1及び10%FBSを有するHAM’s F12培地で16〜18時間培養する。16〜18時間培養後、細胞を様々な濃度のフォルスコリンを用いて60分処理する。
処理後、Amersham−Pharmacia Biotechの市販キット、kit♯RPA538を用い、製造元の指示に従ってcAMP含量を測定する。
cAMP/ウェルの量を、アッセイキットの製造元が推奨しているように、cAMP標準曲線から回帰分析を用いて算出した。
正常な非トランスフェクトCHO細胞(◆)の曲線は、このアデニレートシクラーゼ活性体に応じて予想される細胞cAMPの用量−依存増加を示す。HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現する細胞(■)は、0.3μM〜100μMのフォルスコリン処理の範囲に対し細胞cAMP濃度の際立った増加を示さない。
【0127】
【表A】 【0128】
【表B】
分 野
この発明は、細胞に存在し、いずれもがほぼ通常は組成物中で全体に又は主としてタンパク様である2つの成分間の相互作用(つまり、相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用又はタンパク質−タンパク質結合事象である)の測定に関する。これは、現在、「相互作用タンパク質のGFP補助出力(GFP assisted Readout of Interacting Proteins)(GRIP)」」として言及されている。
また、この発明は、細胞内成分の細胞内分布に影響を及ぼす薬剤に対しハイスループットスクリーニングで使用される抽出緩衝液に関する。抽出緩衝液は、細胞固定剤及び細胞透過剤からなる。
【0002】
背 景
相互の、及び他の細胞成分とのタンパク質の相互作用は、ほぼ全ての細胞過程に固有な部分であり、これは、特に細胞内シグナル化システムに当てはまる。情報は、このような一連の相互作用によるシグナル化系をとおして、またシグナル化系間でやりとりされる。タンパク質の機能を研究するために、実際的なストラテジは、最初にタンパク質が相互作用する成分を同定することである。これらの多くは他のタンパク質、時には同種のタンパク質であるが、最も頻繁には、極めて異なるタイプで、非常に異なる機能特性を有する。
【0003】
新規な相互作用の同定は、細胞生物学及びシグナル変換において極めて急速に拡大している研究分野である。この分野での最近の発見に関して注目に値する性質は、細胞表面に見られるリガンド−レセプター相互作用に一般に認められる特異性の程度に匹敵するか、又はそれを超える、パートナーが相互作用する特異性である。相互作用する種の同定は、細胞シグナル化に関与するタンパク質の機能特性において非常に補助し得る新規なシグナル化相互作用を同定する機会をもたらす。さらに、その方法は、相互作用におけるパートナーを混乱させるか、又は束縛し得る新規な薬剤の開発に適用することができるであろう。この作用機序を有する化合物は、シグナル化経路を介して情報の流出を調節することができ、そうすることにおいて、ヒト及び動物の健康管理に関する非常に多くの分野での適用が見出されるであろう。そのような化合物は本質的に極めて選択的で、触媒活性の全体的な阻害に対する必要性なしにその作用を有するので、それらの使用に基づく治療は、多くの従来の活性部位阻害剤に一般的に伴われた、特異性の乏しさと、ダメージを与える副作用という問題を伴わないことが期待される。
【0004】
相互作用種の同定のための既存の方法は、2つの群に分けることができる:第一は、インビトロで一緒にした多少の精製成分を用いてのみ作用し得る方法、例えば対象の成分が細胞環境から単離されるという共通の性質を持つ、表面プラスモン共鳴(微細な波長の方法)、タンパク質質量分析、蛍光相関分光及び異方性手段である。第二の群には、生細胞内で作用することを目的とする全ての方法が含まれる。これらのうち、多くは酵母細胞で作用するように開発されている(酵母2ハイブリッド(two hybrid)、リバース酵母2ハイブリッド及びその変異体)が、哺乳動物細胞系での使用に適合しているものもある。タンパク質の相互作用についての細胞の検出方法は、Mendelsohn, A.R., Brent, R. (1999) (Science 284(5422):1948)によって十分に検証されている。これらの方法の多くは、従来の2−ハイブリッド法から派生している。その方法では、転写活性が、結合した「おとり(bait)」及び「餌食(prey)」成分の相互作用を介して2分した転写因子を一緒にすることで開始されるが、他の方法は、インビボでの生化学的な機能の再構築に依っている。この結果、Rossiら(2000) (Trends in Cell Biology 10:119−122)は、出力が転写ではなく、変異されたβ−ガラクトシダーゼ酵素の再構築である、哺乳動物細胞−ベースのタンパク質−タンパク質相互作用アッセイを開発した。テトラマー酵素の再構築によって、酵素活性をモニターすることができる。さらに、タンパク質−タンパク質の相互作用をモニターする方法は、光学的な出力、つまり蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、又は合致分析(蛍光相関分光の変形)、又は蛍光存在変化に基づいている。最後の3種は単純化されたインビトロ条件下でかなり一般的に適用されるが、生細胞のより複雑な環境に条件を移すための試みもなされている。
【0005】
近年、Tobias Meyerは、2つの異種接合体を細胞に導入する方法を報告した (WO00/17221)。第一の異種接合体は、検出基(例えばGFP)に接合した第一の対象タンパク質からなる。第二の異種接合体は、ホルボールエステルでの刺激により細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質に接合した第二の対象タンパク質からなる。第二タンパク質が、既知の分布で細胞内の内部構造に結合している場合、2つの対象タンパク質間の結合は、検出基が細胞内の内部構造に結合して局在しているので、視覚化することができる。
【0006】
細胞内器官又は区画に「固定」されていないが、サイトゾルで多少可動性のタンパク質(−GFP)は、課される透過度によって主に決定される速度で、細胞透過により周囲の媒体に拡散する。洗剤は、膜を崩壊するのみならず、時間中、細胞内成分を崩壊する傾向があるため、透過によっては細胞内容物の放出を制御しがたい。これに加えて、膜にダメージを与えると、幾つかの非制御プロテアーゼ活性が開始され、同一の意図しない結果を伴う。この現象は、非洗剤性の透過(例えばジギトニン)を用いてもみられる。
【0007】
固定剤は、顕微鏡用生物材料の調製に必要な処理中、細胞において構造上の完全性を保持するために一般に用いられる。細胞内のタンパク質構造の保持又は安定化を目的とする固定剤は、2つの群に分けられる; 有機酸又はアルコール(例えば酢酸、エタノール)のようなタンパク質を凝固する剤及びアルデヒド(例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド)のような架橋タンパク質が不溶性網になる剤である。このような剤による固定速度は、剤が達成し得る化学的な架橋又は凝固の速度と共に、細胞への浸透速度によって決定される。細胞固定の処理と方法は、完全に研究され、化学文献に記載されている(例えば、Fixation for Electron Microscopy by M.A. Hayat, 1981, Academic Press, New York参照)。
【0008】
移動は、通常、成分と固定(又は実際上非可動性の)成分間の相互作用変化による、又は成分の位置もしくは区画の変化、例えば核外細胞質から核自体への移動による、細胞内の少なくともひとつのタンパク質の事実上の可動変化を伴う。相互作用又は区画の変化は、移動を構成する。再分布(Redistribution(登録商標))は、測定可能な事象を移動させる技術である(WO98/45704)。移動は、対象成分が結合している成分、例えば対象成分を保持するモータータンパク質の可動性又は区画の変化を伴う可能性がある。幾つかの移動は、やや顕微鏡的な広がり、例えば細胞質中の可溶性シグナル化タンパク質と隣合うアクチンフィラメント又は細胞内膜との相互作用を伴う。あらかじめ可溶性成分の可動性は、そのような移動で大きく変化されるが、空間的な位置での変化は、顕微鏡的手段では解像できない可能性がある。この場合、再分布シグナルを顕在化するには、対象タンパク質の不動性形態から可動性形態を分離することが望ましい
【0009】
通常、再分布(登録商標)は「画像化」によって測定され、非常に時間がかかり、HT型での薬剤スクリーニングに不都合である。
再分布(登録商標)アッセイは、しばしば特定の対象タンパク質(最も頻繁には、対象タンパク質とGFPのような発光タンパク質との設計された融合タンパク質であるタンパク質)を安定的に発現する細胞系からなる。そのような細胞では、対象成分が、相互作用すべき細胞中の他の成分に対してある程度まで過剰発現される場合がある。これは、細胞で利用可能な限られた数のパートナー成分と物理的に相互作用できない過剰量の対象タンパク質によって、移動事象の遮蔽をもたらすことができる。そのような場合、過剰な対象成分の除去は、生じた移動の非遮蔽に十分であり得る。
透過前の細胞の固定は、そのような場合にいまだ成功していない。というのは、タンパク質全てが、固定剤の影響下でほぼ同程度まで事実上固定化され、その結果、細胞から特異的に除いたり、又は洗い出すことができないためである。
【0010】
発明の要約
SosとGrb2の相互作用は、種々の方法で測定することができる。実施例7に示すように、PDE4A4−SosA接合体とGrb2−EGFP接合体で同時にトランスフェクトした細胞は、SosAとGrb2との結合を示している。実施例8では、接合体は、 PKAcat−hGrb2 及びEGFP−Sos−Ctermである。PKAcat接合体の利点は、PKAが優勢的にその制御サブユニットに結合するように細胞内のcAMPレベルが十分に低いままである限り、相互作用を視覚化するための特別な処理が不要であることである。実施例9では、接合体はCys1−Grb2 及びEGFP−Sos−Ctermである。Cys1接合体の潜在的な利点は、接合体が、PMA又は幾つかの他の活性化刺激での処理時に原形質膜に対して一対の成分を採用することである。この特別な位置は、研究される成分の相互作用を活性化するために必要である可能性がある。
【0011】
実施例3は、各々が異種接合体を発現する2つのプラスミドの同時トランスフェクションによる細胞系の作製に一般的な方法を記載している。この実施例で例示されるように、アンカー−タンパク質としてPDE4A4ベースのアンカープローブを用いることにより、2つの密集した集合物の平均がロリプラムでの処理によって形成される。これらの集合物は、PDE4AのユニークなC−末端ペプチド配列に対する抗体を用いて直接検出することができる。密集した集合物(スポット)は、ロリプラムが除かれるか、又は特定のPDE4阻害剤群のひとつ(例えばRP73401)に対して競合した際に消失するであろう。ロリプラムでの処理が細胞における cAMPレベルに影響を及ぼさないことに留意することが重要である(実施例14)。
【0012】
実施例4は、アンカー−タンパク質としてPKAcatαベースのアンカープローブを用いて、細胞質cAMP濃度が低い際に集合物が細胞質に形成されることを記載している。これらの集合物は、PKAc又はPKA制御サブユニットに対する抗体を用いて直接検出することができる。これらの集合物は、cAMP濃度が上昇すると、細胞質に分散する。
実施例5は、アンカー−タンパク質としてPDE4A1ベースのアンカープローブを用いて、他の点では未処理の細胞の細胞質中に小さな核周囲スポットが形成されることを記載している。PDE4A1スポットは、PDE4AのユニークなC−末端ペプチド配列に対する抗体を用いて直接検出することができる。これらのスポットは、ロリプラムが細胞に加えられると、細胞質に分散する。
【0013】
実施例6は、アンカー−タンパク質としてCys1ドメインベースのアンカープローブが、例えばPMAでの処理により活性化されると、原形質膜へ再分布することを記載している。Cys1ドメインの局在化は、(myc又はflag配列が細胞をトランスフェクトするのに用いられる遺伝構築物に含まれる際には) myc又はflag抗原に対する抗体を用いて確認することができる。
【0014】
この文書に記載されるように、固定剤の適用と透過は同時に、可動形態又は非固着形態を自由に細胞から放出させながら、対象タンパク質の固着物、拡散して限定される物又は大部分が不動性形態の物の局所濃度を保持することを目的とする。特に洗剤による細胞透過処理は、適当な時期に比較的不動性のタンパク質、固着タンパク質又は区画化タンパク質を細胞から除くと予測され、その結果、洗剤によって生じる透過と可溶化の速度と、架橋又は固定が生じる速度との均衡を図る必要がある。この均衡は、固定剤と透過剤の相対濃度を制御しながら、これらを注意深く選択することにより、また剤が作用する物理的かつ化学的条件(pH、浸透度又はイオン強度、温度)を制御することによって達成してもよい。
細胞内の器官及び区画を崩壊せずに「浮遊(floating)」タンパク質を細胞から出すレベルまで透過を制御するため、細胞は透過処理中わずかに化学的に固定される。その目的は、まさに「非結合」タンパク質を細胞から出し、次いで残りを化学的に固定させることである。
【0015】
この出願は、細胞内の複雑な細胞内挙動を容易に測定できる方法を開示する。実施例10では、14−3−3タンパク質とBADとの結合で生じるBADの可動性変化は、PDE4A4−14−3−3 及びEGFP−BAD 融合体を用いて測定される。PDE4A4−14−3−3 タンパク質は、ロリプラムでの先立った処理によって細胞内のスポットに固着する。細胞透過剤及び細胞固定剤の組合せからなる緩衝液を用いてGFPに融合した可溶性(又は可動性)BADを抽出することによって、不動性GFPのみが細胞に残り、14−3−3タンパク質への結合によって生じるBADの可動性変化は、蛍光強度変化として読み取ることができる。実施例11は、NFkBの刺激によってサイトゾルから核へのNFkB(p65)の再分布(登録商標)に適用される同一の原理を示している。
細胞固定剤と細胞透過剤との最適比を同定するための抽出緩衝液の最適化を、実施例12に例示する。
【0016】
詳細な説明
この出願の対象である再分布−トラップ法は、PDE4からの位置情報、ある観点では細胞中のGFP−標識蛍光プローブの分布を利用し、特定の成分間の相互作用の有無を示す点で上記の方法と異なる。上記のことは細胞の複雑な環境でのことであり、自然系で生じるのと同様に相互作用を調節し得る因子が影響する見込みがあるので、方法に重要な生理学的関連性を付加している。方法は、細胞が生きており、モニターされながら活性であることを意味する非−破壊性の蛍光画像化に基づくので、また例えばロリプラムでの非−妨害処理に基づいているので、再分布−トラップ法によっても過渡的又は暫定的な相互作用をモニターすることができる。過渡的又は暫定的な相互作用は、成分がホスホリル化されているか、又はさもなければ操作サイクル中に修飾されている(例えばシグナル伝達)際に生じてもよく、そのような修飾は、細胞内シグナル化経路の成分に共通である。方法が共有的な相互作用に依存しておらず、必要な成分が相互作用によって特異的な方向を有してもいないので、方法は、極めて高感度であり、低いアフィニティ相互作用さえ測定することができる。
【0017】
したがって、ひとつの観点は、
(a) 第一の異種接合体が、検出基に接合される第一対象タンパク質からなり、第二の異種接合体が、細胞内の内部構造に特異的に結合できるアンカータンパク質に接合される第二対象タンパク質からなる、
2つの異種接合体を含む細胞を準備し、
(b) 2つの対象タンパク質間の結合を示すアンカー−タンパク質の細胞内分布を模倣する検出基の細胞内分布を検出し、
(c) 化合物を用いて、また用いないで工程(b)を繰り返す工程からなり、
化合物を用いての、又は用いないでの検出基の細胞内分布の変化が、タンパク質相互作用調節化合物を示す、
化合物が細胞内タンパク質相互作用を調節するかどうかを検出する方法に関する。
【0018】
この発明による再分布−トラップ法は、多くのシグナル化成分が特異的な刺激又は処理によって細胞内で特異的な位置に再分布するとの事実を利用している。成分が何らかの方法で標識され、細胞中で視覚化されると、その位置は、多くの画像化に基づく技術によってモニターし、測定することができる。画像化技術は非破壊性であるので、生細胞で測定を行うことができ、この結果、活性過程は、過渡的な事象をモニターする必要があるような、必要な場合に、時間中追跡することができる。この出願は、細胞内成分間の相互作用を研究する系を作製するために、特定の成分がある刺激(「アンカー」刺激)を受けて再分布する知見をどのように利用できるかを詳述している。成分がある刺激によって既知の細胞位置に分布することが知られている場合、別の成分(「おとり」)を第一の物(「アンカー」)に共有的に結合させてもよく、適当なアンカー刺激を与えると、それが結合しているアンカー成分と同一の分布を細胞内で呈することが予測されるであろう。おとり成分と相互作用することが予想される別の成分(「餌食」)は、同一細胞に導入される。餌食成分は、細胞中で視覚化させる何らかの方法で標識される。相互作用が(おそらくは別の「相互作用刺激」を要して)おとりと餌食の間で生じるならば、餌食成分は、アンカー−おとり成分と同一の分布を細胞内で踏襲するが、それも適当なアンカー刺激が適用される場合のみである。したがって、この系を用いて、特定のおとり餌食相互作用と検出可能なおとり成分の分布に影響を及ぼす他の条件とを識別することができる。
【0019】
したがって、再分布−トラップ法は、単離物中の成分が機能サイクルの一部として好ましい再分布を通常示していなくとも、細胞内の成分を相互作用することによって全体的な再分布を課すことができる。アンカー系は、相互作用している成分が、成分間の相互作用を通常は調節することが求められる影響を受けている細胞内の区画又は位置へ再分布するよう設計することができる。一例として、幾つかの成分は、原形質膜の平面に隔離された酵素によって通常はホスホリル化又は脱ホスホリル化される必要がある。そのような成分に対しては、アンカー刺激が原形質膜にアンカープローブを再分布するように選択し、相互作用している成分を適当に修飾できるアンカー系が適当である。そのようなアンカー系の例は、PKCγのCys1ドメインベースの系であろう。
【0020】
また、その方法は、局所特異的な状態が相互作用を生じるのに必要かどうかを研究する目的で細胞内の異なる位置に相互作用を標的化することができる。ひとつの具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分が核区画に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ミトコンドリアの内外膜に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ゴルジ体の異なる領域に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、限局性の接着複合体に標的化される。別の具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分が、F−アクチン鎖又は微小管束のような細胞骨格構造に標的化される。別の好ましい具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、原形質膜に標的化される。別の好ましい具体例では、ひとつ又は双方の相互作用成分は、ロリプラムの存在下でPDE4A4によって形成されるような細胞質顆粒又は集合物に標的化される。
【0021】
つまり、この発明の詳細な具体例は、細胞内の内部構造への特異的結合が、独力で対象細胞内のシグナル化活性を刺激又は阻害する見込みがほとんどないアンカー刺激によって誘導される方法に関する。
ロリプラム及びRS25344のような他の特異的なPDE4阻害剤に対するPDE4A4の強力なアンカー反応のため、PDE4A4はアンカー種としてもっとも好ましい。さらに、アンカー部位に対するPDE4A4の結合は、PDE4A4分子のC−末端に結合する追加部分の存在によって影響されないと思われ、これらの結合は非常に多様な大きさであってもよい(10kDa未満から、少なくとも150kDaまで)。したがって、この発明の詳細な具体例は、特異的な結合がアンカー刺激ロリプラムの付加によって誘導され、アンカータンパク質がPDE4A4である上記方法に関する。
【0022】
刺激−誘導性分布、例えばPDE4A4アンカー又はPKCαCys1ドメインベースの分布の特別な有用性は、ある同じ細胞において、それ以前にはなかった特徴的な分布に切り替えることができることである。これは、あらかじめ、特徴的な分布が、純粋に、固着された検出可能な成分間の特異的な相互作用の結果であることを保証するだけでなく(刺激に応じたアンカー成分は、検出可能な成分によって修飾されない限り「不可視」である)、この相互作用が、アンカー成分の特異的かつ予想される分布を検出するように形成されるアッセイ機器によって測定できるシグナルを生じることも保証する。事実上、この後者の点は、測定機器又はアッセイ方法を再形成する必要なしに、多くの異なる相互作用を測定でき、アッセイできることを意味している。また、誘導刺激は、スクリーニングアッセイでの基準化合物を生じ、それにより、アッセイに対する最大及び最少の予想シグナルを測定することができる。
【0023】
多くのシグナル化成分は、細胞内で特異的な位置を有し、特定の刺激又は処理によって再分布する。それらの成分が何らかの方法で標識され、細胞中で視覚化されると、幾つかの画像化に基づく技術によってその位置をモニターし、測定することができる。画像化技術は非破壊性であるので、生細胞で測定することができ、この結果、活性過程は、過渡的な事象をモニターする必要がある場合のような必要な際に、時間中追跡することができる。この出願は、細胞内成分間の相互作用を研究する系を作製するために、特定の成分がある刺激(「アンカー」刺激)を受けて再分布する知見をどのように利用できるかを詳述している。成分が本質的に特徴的な細胞分布を有することが知られていれば、別の成分(「おとり」)を第一の物(「アンカー」)に共有的に結合させてもよく、アンカー刺激がなければ、それが結合しているアンカー成分と同一の分布を細胞内で呈することが予測されるであろう。おとり成分と相互作用することが予想される別の成分(「餌食」)は、同一細胞に導入される。餌食成分は、細胞中で視覚化させる何らかの方法で標識される。相互作用がおとりと餌食の間で(おそらくは別の「相互作用刺激」を要して)生じるならば、餌食成分は、最初の環境での特異的な位置によってアンカー刺激が付加されなくても、アンカー−おとり成分と同一の分布を細胞内でも踏襲する。さらに、アンカー成分の本質的に特徴的な分布がアンカー刺激の適用によって解消されれば、そのような系は、特異的なおとり餌食の相互作用と、検出可能な餌食成分の分布に影響する他の条件とを識別するのに有用である。
【0024】
したがって、再分布−トラップ法は、単離物中の成分が機能サイクルの一部として好ましい再分布を通常示さないとしても、細胞内の成分の相互作用によって全体的な再分布を課すことができる。アンカー系は、相互作用成分が成分間の相互作用を通常調節する必要のある影響を受けている細胞内の区画又は位置への再分布を達成するよう設計することができる。一例として、PKAのスポット様細胞質分布は、フォルスコリンの添加で解消することができる;PDE4A1のスポット様細胞質分布は、ロリプラムの添加で解消することができる;ヒストンデアセチラーゼ5 (HDAC5)のスポット様核分布は、トリコスタチンA (TSA)によって解消され; 又はアンカータンパク質の細胞膜に対する特異的結合はPLC−デルタであり、ATPの添加で解消され、細胞質内に分布される。
【0025】
特徴的な分布が特異的な刺激(アンカー刺激)、例えばPDE4A1、PKAcat、PLCデルタ又はHDAC5ベースの刺激によって分散又は解消されるこれらの系について、刺激は、特徴的な分布が、固着され、かつ検出可能な成分間の相互作用の結果であるか、又は細胞内の特徴的な分布を呈する検出可能な成分の幾らか本来的な傾向による結果であるかを確認する手段を提供している。このことは、相互作用についてのアッセイが測定されるある同一の細胞で確認することができる。刺激−誘導性分布を伴うので、アンカー成分について最初の特徴的な分布を有する系は、ある装置及びアッセイプロトコルの構成を用いて多くの異なる相互作用をアッセイできる利点を共有する。各場合のアンカー刺激は、スクリーニングアッセイの基準化合物を再提供し、それにより、アッセイについて最大及び最少の予想シグナルを測定することができる。アンカー刺激が分布を分散しているそれらの系の特に追加できる利点は、分布刺激での細胞の前処理又は同時処理が、アンカー刺激が試験される相互作用を直接又は間接に干渉し得るあらゆる可能性をアッセイ中に除外する必要のないことである。
【0026】
用語「化合物」は、細胞系において生物学的機能を有するか、又は生物学的作用を発揮する何らかの試料を意味することを意図する。試料は生物物質の試料、例えば血液、血漿、唾液、乳、尿を含む体液、又は微生物もしくは植物の抽出物の試料、重金属又は毒素を含む汚染物質含有環境試料であってもよく、又は有機合成もしくは遺伝技術によって調製される化合物又は混合化合物を含む試料であってもよい。化合物は、タンパク質及びペプチドを含む、小さな有機化合物又は生体ポリマーであってもよい。
試験される化合物は、特別な相互作用刺激とみなすことができる。
【0027】
多くの細胞系が、トランスフェクション用に存在する。少数の例が、クセノプスの卵母細胞又は昆虫細胞、例えばsf9細胞系、又は健康な動物もしくは疾患動物から採取される組織あるいは器官から直接単離される哺乳動物細胞(原始細胞)、又は細胞培養条件下で無期限に複製し得る形質転換哺乳動物細胞(細胞系)である。しかし、使用する細胞は哺乳動物細胞であることが好ましい。これは、各細胞型に特異的な複雑な生化学的相互作用に起因している。用語「哺乳動物細胞」は、哺乳動物起源の何らかの生細胞を示すことを意図する。細胞は確立された細胞系であってもよく、その多くはThe American Type Culture Collection (ATCC, Virginia, USA)又は同様の細胞培養コレクションから入手可能である。細胞は、トランスジェニック動物由来組織を含む、哺乳動物組織由来の寿命が限られた原始細胞、又はトランスジェニック組織を含む哺乳動物組織由来の新たに確立された不死細胞系、又は哺乳動物起源の異なる細胞型を融合して得られるハイブリッド細胞もしくは細胞系、例えばハイブリドーマ細胞系であってもよい。細胞は、蛍光プローブの前に、又はそれに加えて、1以上の非天然遺伝子産物、例えばレセプター、酵素、酵素基質を任意に発現してもよい。好ましい細胞系には、繊維芽細胞由来の系、例えばBHK、CHO、BALB、NIH−3T3、又は上皮細胞由来の系、例えばHUVEC、BAE (ウシ動脈内皮)、CPAE (ウシ肺動脈内皮)、HLMVEC (ヒト肺微小管内皮細胞)、又は気道上皮起源の系、例えばBEAS−2B、又は膵臓由来の系、例えばRIN、INS−1、MIN6、bTC3、aTC6、bTC6、HIT又は造血器官起源の系、例えば一次単離ヒト単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球走化因子及びリンパ球群、AML−14、AML−193、HL−60、RBL−1、U937、RAW、JAWS又は脂肪細胞起源の系、例えば3T3−L1、ヒト前−脂肪細胞、又は神経性内分泌起源の系、例えばAtT20、PC12、GH3、筋起源の系、例えばSKMC、A10、C2C12、腎臓起源の系、例えばHEK 293、LLC−PK1、又はニューロン起源の系、例えばSK−N−DZ、SK−N−BE(2)、HCN−1A、NT2/D1が含まれるが、これに限定されない。
【0028】
この発明の実施例は、CHO細胞に基づいている。したがって、繊維芽細胞由来細胞系、例えばBALB、NIH−3T3及びBHK細胞が好ましい。
2つの異種接合体は、トランスフェクト細胞が第一及び第二の異種接合体の双方を同時に発現し、組み込むように、プラスミド、例えばFugeneのような適当なトランスフェクション剤での細胞への適用によって混合される2つの個々のプラスミドとして細胞に導入されることが好ましい(実施例3、実施例4、実施例5及び実施例6参照)。ひとつ又は双方の接合体の導入のための多くの他の手段は、一様に実行可能な手段、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、アデノウイルス及びレトロウイルス法、両接合体をエンコードする2シストロン性(bicistronic)プラスミドなどである。
【0029】
この発明をとおして、用語「タンパク質」は一般的な意味を有するべきである。それには、翻訳産物のみならず、化学的な合成タンパク質が含まれる。細胞内で翻訳されるタンパク質については、天然の、又は誘導される、翻訳後修飾、例えばグリコシル化及び脂質化が起こることが予想され、それらのタンパク質は依然として考慮されるタンパク質である。
細胞内タンパク質相互作用の用語は、同一細胞内の上記のような2タンパク質間の相互作用の一般的な意味を有する。相互作用は、もっとも通常は、その物理−化学的性質が、多少特異的に認識し、その後、関与する2タンパク質成分間の相互作用を可能にする、各タンパク質の1以上の領域又はドメイン間のタンパク質成分間の非共有力に起因している。好ましい具体例では、細胞内相互作用は、タンパク質−タンパク質結合である。
【0030】
発光団は、光を発することによって、成分の空間分布を視覚化及び/又は記録することができる。この発明の好ましい観点では、発光団は、成分と実質的に同様にして再分布することができる。さらに別の発明の具体例では、発光団は、経路の調節によって分布される成分との空間的な結合によって消光することができ、消光は、発光の強度又は寿命の変化として測定される。
好ましい観点では、発光団は蛍光団である。この発明の好ましい具体例では、発光団は、細胞又は細胞類に収容されるヌクレオチド配列によってエンコードされ、発現されるポリペプチドである。例えば、発光団は、一方が発光ポリペプチドからなり、他方が成分からなる2つのポリペプチドの少なくとも各部分の融合体からなるハイブリッドポリペプチドの一部である。実施例がGFPを用いて行われるように、GFPが特に好ましい。
【0031】
この明細書で、用語「緑蛍光タンパク質」(GFP)は、(例えばChalfie, M.ら、(1994) Science 263, 802−805によって記載されるように)細胞での発現時に正確な励起波長光への暴露によって蛍光を発するタンパク質を示すことを意図する。1以上のアミノ酸が置換、挿入又は欠失されているような蛍光タンパク質も、「GFP」と称する。ここで使用される「GFP」には、クラゲAequorea Victoria又は腔腸動物類の他のメンバーから得られる野生型GFP、例えばDiscosoma sp.の赤色蛍光タンパク質(Matz, M.V.ら. 1999, Nature Biotechnology 17: 969−973)、又は他の動物、菌類もしくは植物由来の蛍光タンパク質、及びHeimら(Heim, R.ら、1994, Proc.Natl.Acad.Sci. 91:26, pp 12501−12504)によって開示されたGFPの青色蛍光変異体のようなGFP修飾型、及びGFP蛍光のスペクトル特性を変える他の修飾型、あるいは1997年3月27日にWO 97/11094として公開され、ここに引用により導入されたPCT/DK96/00051に記載の約30℃より高温での細胞での発現時に増大した蛍光を示す修飾型が含まれ、それは、発光団から1つ上流位置にあるアミノ酸が突然変異され、この発明の蛍光タンパク質を細胞で発現する際に蛍光強度を増すAequoreaの緑蛍光タンパク質由来の蛍光タンパク質又はその機能類似体からなる。好ましいGFP変異型は、F64L−GFP、F64L−Y66H−GFP、F64L−S65T−GFP、F64L−E222G−GFPである。この発明の全ての観点での使用に特に好ましいGFP変異型は、EGFPである(哺乳動物細胞での発現に最適化されたコドンを有するF64L−S65T 変異型である、EGFPをエンコードするDNAは、EGFP DNA配列を含むClontech, Palo Altoのプラスミドから入手可能である(GenBankアクセス番号U55762、 U55763参照))。別の特に好ましいGFP変異型は、F64L−E222G−GFPである。実施例で用いられるように、検出基は好ましくは緑蛍光タンパク質(GFP)である。GFPは、好ましくはここで定義されるF64L突然変異を有するGFP、例えばF64L−GFP、F64L−Y66H−GFP、F64L−S65T−GFP、EGFP及びF64L−E222G−GFPからなる群から選択される。GFPは、任意にペプチドリンカーを介して、生物学的に活性なポリペプチド又はその一部又はそのサブユニットにN− 又はC−末端タッグされる。
【0032】
代替的な具体例では、検出基は、インサイトゥで又はマイクロインジェクションによって化学蛍光団で標識されるか、さもなければ細胞に導入される。さらに別の具体例では、検出基は、蛍光団でタッグされているか、又はビオチン−ストレプトアビジン標識法もしくは蛍光団で標識した二次抗体によって検出し得るために、他の方法で検出可能な抗体に対するエピトープを含む。そのようなエピトープの例は、蛍光団でタッグされているか、又はビオチン−ストレプトアビジン標識法もしくは蛍光団で標識した二次抗体によって検出し得るために、他の方法で検出可能な抗体で検出され得るmyc又はflag抗原のような検出性tagを含む。
ここで使用されるような内部構造物は、細胞内に含まれる異なる個別の同一とみなし得る成分を意味する。そのような内部構造物は、一般に、それらを含む細胞の解剖学的構造物である。内部構造物の例には、サイトゾル又は核外の細胞質に局在する構造物(細胞質構造物とも称する)及び核内に局在する構造物(核構造物)の双方が含まれる。核膜を含む核自体は、内部構造物である。
【0033】
検出基の記録は、選択される検出基に伴って変化するであろう。例えば、GFPが検出基として使用される際には、発せられた光は、当業者に公知の種々の装置を用いて測定することができる。一般に、そのような装置は、以下の部分からなる: (a)光源、(b) 発光団の発光を励起させる光源からの光の波長の選択方法、(c)励起光を迅速にブロックするか、又は残りの系に通すことのできる装置、(d)励起光を試験片に運搬し、発せられた蛍光を空間的な解像様式で集め、この蛍光発光(又は検出及び測定方法に関連する別タイプの強度マップ)から画像を形成する一連の光学素子、(e)一連の光学素子に対し所定のジオメトリーで測定される細胞容器を収容するベンチ又はスタンド、(f)好ましくは画像形態で光強度を記録するための検出器、(g)コンピューター又は電子系及び記録された情報及び/又は画像を獲得して蓄積し、記録画像から再分布の程度を計算するための関連ソフトウエア。
【0034】
この発明の好ましい具体例では、装置系は自動化される。ひとつの具体例では、上記d及びe部分は蛍光顕微鏡からなる。ひとつの具体例では、上記f部分はCCDカメラである。ひとつの具体例では、上記f部分は光電子増倍管/装置のアレイである。
この発明のひとつの具体例では、実際の蛍光は、マイクロタイタープレート用の標準型蛍光光度計(蛍光プレートリーダー)で測定される。
ひとつの具体例では、光学走査系は、発光又は蛍光における変化の時間−解像記録が全空間制限から同時に成し得るように、マイクロタイター型プレートの底を照らすために用いられる。
【0035】
ひとつの具体例では、画像は、光学走査系によって形成され、記録される。好ましい具体例では、実際の発光又は蛍光測定は、Molecular Devices, Inc.から市販されているFLIPR(登録商標)機器でなされる。
細胞内経路に対する影響又は影響の結果に応じた細胞応答の程度を示す定量情報は、関連する特異的な影響の既知の程度に対して、同様に記録される、応答又は結果に基づく所定の較正による記録又は記録類から抽出される。この結果、影響によって引き起こされる再分布の程度は、同程度の細胞応答を引き起こす関連する特異的な影響の用量として示される。未知の影響、例えば細胞成分の再分布に対する影響が知られていない新たな化学物質又は化学品を試験することによって、再分布に影響を有する薬剤のスクリーニングアッセイが達成される。
【0036】
これらの科学的かつ知的な知見に基づけば、この発明は、
分子間レベルの細胞成分間の相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、細胞成分間の過渡的な相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
細胞成分間の暫定的な相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
互いに対して親和性の低い成分間の相互作用をモニターするための細胞アッセイをつくり、
特定の分子成分、例えばシグナル化分子種の可動性が条件付きで制限(監禁)され、その種の活性について機能的なノックアウトを達成し得る細胞試験系をつくり、
特定の分子成分、例えばシグナル化分子種の可動性が条件付で放出(分散)され、その種の活性について機能的なノックイン(knock−in)を達成し得る細胞試験系をつくり、
特定成分間の相互作用事象が特定の位置に制限される細胞系をつくる
ために特に有用である。
【0037】
使用例は、
相互作用の阻害剤を見出すための細胞アッセイ、
相互作用の活性因子を見出すための細胞アッセイ、
cDNAライブラリーのスクリーニングによって、いずれかの特異的な細胞成分に対する新規な結合パートナーを同定するための細胞アッセイ、
生物学的利用能の可能性を示すために、細胞膜の浸透能について活性化合物を自動的にスクリーンするための細胞アッセイ、
アッセイ中に化合物の細胞代謝及び排出を示すために、細胞環境での安定性について化合物を自動的にスクリーンするための細胞アッセイ、
特定の細胞成分の機能を研究するための細胞試験系、
オーファンレセプター及び/又はオーファンリガンドによって使用されるシグナル化経路を同定するための細胞アッセイ、
相互作用モジュレーターについてのハイスループットスクリーニングにおける細胞アッセイ
である。
【0038】
この発明の幾つかの特徴:
哺乳動物細胞アッセイにより相互作用について生理学的に関連する状況を提供し、因子の影響が天然系、例えば完全なヒト系の細胞で、相互作用を調節し得ることを可能にする、
再分布−トラップ構想が、生細胞又は化学的に固定された細胞を用いる、多様な蛍光画像化法に適合している、
再分布−トラップ構想に基づくアッセイの何らかの反応を、経時的な応答を作成するために、時間中、逐次的な測定として連続的に、又は1点測定(single end−point measurement)によりモニターすることができる(経時測定は終始、生細胞を要する。1点測定は生細胞又は化学的に固定した細胞で成すことができる)、
方法が、ロー(low)スループットならびにハイスループット測定に対応できる、方法が、哺乳動物細胞に有用である(哺乳動物細胞は、植物又は酵母細胞のような菌由来の細胞と異なって細胞壁を有しない。細胞壁は、化合物が細胞に入るのを妨げることができる)。
【0039】
上記のタンパク質相互作用の測定は、そのような相互作用を調節する化合物の同定/スクリーニングに理想的である。そのようなアッセイ及びハイスループットでの他のアッセイを実施するために、この発明のひとつの観点は、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性変化を測定する方法に関する。その方法は、
(a) 細胞成分に結合した発光団からなる細胞を、影響と、また影響なしに接触させるか、又はインキュベートし;
(b) 細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を工程(a)の細胞に加え;かつ
(c) 工程(b)の細胞由来の発光団から発せられる光を測定することからなり、
影響の存在又は不在で細胞から発せられる光の相違が、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性の相違を示す。原則は、刺激によって移動しているか、又は移動していない発光団−成分結合を除くことである。
【0040】
この発明のひとつの主要な利点は、可動性変化が光強度の変化として測定できることである。後述されるように、また実施例に記載されるように、この技術により蛍光強度変化として再分布(登録商標)を検出することができる。
多様な機器が、光強度を測定するために存在する。発光団がGFPである、この発明の好ましい観点では、発光団から発せられる光の測定機器はFLIPR (Molecular Devices)である。代替的な具体例では、発光団から発せられる光はプレートリーダーで測定される。この技術は、4時間/プレート(画像化)のスクリーン時間から約30秒/プレート(つまり480倍早い)まで、NFkBアッセイ(実施例11)のような改良された再分布(登録商標)アッセイ及びPDE4A4−トラップ(実施例10及び実施例12)のようなTRAPアッセイを有している。
【0041】
この出願をとおして、可動性変化は、成分が影響との接触又はインキュベーション前後のいずれかで実質的に固定していることで特徴付けられる。実質的な固定とは、抽出工程中に成分が検出域外に移動しないものとして定義される。細胞を抽出後に洗浄すると、検出域は、本質において細胞(又は浸透して化学的に固定されている際に、細胞から出されたものすべて)であろう。一般的な概要では、成分の可動性変化は、細胞成分と結合しているか、又はそれに付着している成分によって引き起こされる。例えば、不活性型PKAcat−GFPの多くは細胞質でスポットして凝集する。PKAcatスポットは、活性化によって、個々のPKAcat 分子がより可動性であるサイトゾルに解散する。
【0042】
この発明のひとつの観点で、固定は、細胞内分布が未知の結合パートナーへの成分の結合によって引き起こされる。この発明の具体例では、結合パートナーは、実質的に不動性の細胞内分布が知られているタンパク質と融合され、成分は依然として発光団に結合される。この結果、成分と結合パートナーとの結合は、成分を実質的に固定するであろう。
ひとつの観点において、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜結合性細胞質状態の変化である。つまり、細胞器官への結合、例えばIRへの結合である。別の観点では、可動性変化は、結合性細胞質状態〜可溶性細胞質状態の変化である。
【0043】
ひとつの観点では、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜成分が細胞膜に結合している状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が細胞膜に結合している状態〜成分が細胞質で可溶性の状態の変化である。ひとつの観点では、可動性変化は、可溶性細胞質状態〜成分が核に結合又は導入されている状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が核に結合又は導入されている状態〜可溶性細胞質状態の変化である。
ひとつの観点では、可動性変化は、結合性細胞質状態〜成分が核に結合又は導入されている状態の変化である。別の観点では、可動性変化は、成分が核に結合又は導入されている状態〜結合性細胞質状態の変化である。
細胞での結合は、内部構造物、例えば細胞器官、膜、細胞骨格又は分子構造物によって媒介されるものと予想される。
【0044】
キナーゼ、プロテインキナーゼ及びホスファターゼを含む細胞内リン酸化及び脱リン酸化過程に関与する酵素のみならず、細胞内シグナル形質導入で重要な役割を果たす細胞骨格を構成するタンパク質のように、細胞成分が細胞内シグナル化経路に寄与することが好ましい。より好ましい具体例では、細胞成分は、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ又は転写因子である。
この発明の好ましい具体例では、影響は、機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群と化学物質との接触及び/又は機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群と化学物質とのインキュベーションである。
ひとつの具体例では、この発明は、化合物ライブラリーのような未知の影響の作用を標準条件下の既知の基準化合物の影響と比較できるスクリーニングプログラムに基づいて使用される。
【0045】
抽出緩衝液は、細胞固定剤及び細胞透過剤からなる。
この発明のひとつの観点では、細胞固定剤は、タンパク質凝固剤もしくはタンパク質架橋剤、例えばエタノール、酢酸、アクロレイン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過マンガン酸カリウム、タンニン酸、パラホルムアルデヒドのひとつ又は混合物である。もっとも好ましい固定剤は、ホルマリンである。
この発明の別の観点では、細胞透過剤は、細胞の原形質膜を穿孔し得る剤、例えばストレプトリジンO、又はアニオン性、ノニオン性、双性イオンもしくはカチオン性界面活性剤又は界面活性剤緩衝液、例えばラウリル硫酸塩、デオキシコール酸、ジギトニン、プルロニック(pluronic) F68、サポニン、トリトンX−100、トリトンX−114、ノニデット(nonidet)P40、CHAPS、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド又は塩もしくはジギトキシンのような浸透ショック誘導剤のひとつもしくは混合物である。もっとも好ましい透過剤は、トリトンX−100である。
【0046】
実験に適当な細胞型を支持するいずれの塩基性緩衝液も使用することができる。ひとつの好ましい塩基性緩衝液は、通常PBSである。最終的な洗浄緩衝液は、GFPから最大蛍光を得るのに適当なpH、例えばpH7.5〜9.0、もっとも好ましくはpH8.5で注意深く緩衝されるべきである。緩衝能は、洗浄後に細胞中又はその周囲に残存し得るホルマリン及びヘキスト染色の残量の作用を妨げるのに十分であるべきである。
固定剤と透過剤の割合は、本質的に重要である。一方では、細胞は細胞から可動性の成分を拡散させるように透過される必要があり、他方では、細胞は、全細胞画分の拡散を妨げるよう化学的に固定される必要がある。実施例10〜12に示すように、最適比は細胞種、より重要なことには(先に論じたように)不動性の成分及び種類によるので、各場合に割合を最適化することが最も重要である。0.1%ホルムアルデヒド及び0.1%トリトンX−100からなる抽出緩衝液は、我々の手法では、これらの濃度が最適ではなくても常にアッセイを向上するので、良好な開始点であることが分かっている。
【0047】
固定剤と透過剤の割合を最適化するためには、以下の工程が行われる:
(a) 発光団を含む細胞を基準化合物と接触させ;
(b) (a)の細胞に似た細胞を基準化合物なしに接触又はインキュベートし;
(c) 細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を、(a)及び(b)の細胞に加え;
(d) 発光団から発せられる光を測定し;
(e) 細胞固定剤と細胞透過剤を種々の濃度で有する抽出緩衝液を用いて工程(a)〜(d)を繰り返し;
(f) 工程(e)で試験される各抽出緩衝液について、(刺激細胞中の蛍光−非刺激細胞中の蛍光)/ 非刺激細胞中の蛍光×100%としてシグナル/ノイズ(s/n)割合を算出し、
最適化された抽出緩衝液は、最も高いシグナル/ノイズ割合を伴う緩衝液である。
基準化合物は、成分について高度な可動性変化を引き起こすことが知られた化合物である。
【0048】
細胞内再分布の測定時にバックグラウンドの蛍光を低下させる方法は、
(a) 物質の影響に関連して再分布しうる、及び/又は物質の影響に関連して再分布しうる成分と結合し得る発光団を含む機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群を物質と接触又はインキュベートし;
(b) 細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を細胞に加え; かつ
(c) 空間分布光の分布を測定する
工程からなる。
【0049】
実施例
実施例1: プローブ及び融合体の構築:
PS462は、CMVプロモーターの制御下でPDE4A4とEGFPの融合体を含み、選択マーカーとしてG418耐性を有する。PDE4A4−EGFP融合体を構築するために、全PDE4Aイソ型に共通のHSPDE4A4の約1.9 kbのC−末端部分(GenBank アクセス番号 L20965)を、後述のプライマー4A−Ct−トップ及び4A −ボトムでのPCRを用いて増幅する。トッププライマーの配列はサイレント突然変異を含み、これにより、共有される4A領域の最初に正確にDra1部位を導入する。ボトムプライマーは、停止コドン、BamH1 クローニング部位、pEGFP−N1へのクローン時にリーディングフレームを保存するための2つの余分なヌクレオチドのない共通のC−末端配列を含む。HSPDE4A4のユニークな約0.8 kbのN−末端部分は、後述の4A4−トップ及び4A4N−ボトムのプライマーで5% DMSO の存在下PCRを用いて増幅される。トッププライマーは、ATGに続く特定のHSPDE4A4配列、コザック(Kozak)配列及びHind3クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、ユニークな4A4 N−末端部分と共通の4A C−末端部分の接合点にわたっており、共有される4A 領域の最初に正確にDra1部位を導入するサイレント突然変異変異を含む。PCR産物を適当な制限酵素で消化し(ユニークなN−末端部分についてはHind3 及びDra1ならびに共通のC−末端部分についてはDra1及びBamH1)、Hind3とBamH1で消化したpEGFP−N1 (Clontech, Palo Alto; GenBank アクセス番号U55762)に共に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でPDE4A4−EGFP融合体を生じる。得られたプラスミドをPS462 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) に2000年4月17日に DSM 13450でブダペスト条約の下で寄託)と称する。
【0050】
4A−Ct−トップ: 5’−GTTTAAAAGGATGTTGAACCGTGAGCTC−3’
4A−ボトム: 5’−GTGGATCCCAGGTAGGGTCTCCACCTGA−3’
4A4−トップ: 5’−GTAAGCTTGCGCCATGGAACCCCCGACC−3’
4A4N−ボトム: 5’−GGTTTTAAACTTGTGCGAGGCCATCTCGCTGAC−3’
【0051】
プラスミドPS642はCMVプロモーターの制御下でPDE4A4とSOS1の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン(zeocin)耐性を有する。PS642は、PS462由来のPS614から誘導される。
PS462は、上記のように構築される。PS462でのネオマイシン耐性マーカーは、ネオマイシンを切出すAvr2でPS462を消化し、ゼオシン耐性をエンコードする約 0.5 kbのAvr2 フラグメントとベクターフラグメントを連結することにより、ゼオシン耐性マーカーと置換される。このフラグメントは、鋳型としてpZeoSV (Invitrogen)とともに後述のプライマー9655及び9658を用いるPCRにより単離される。プライマーは、いずれもAvr2クローニング部位を含み、その大腸菌プロモーターを含むゼオシン耐性遺伝子をフランクしている。トッププライマー9658はゼオシンの最初のAse1部位にわたっており、それを用いて、哺乳動物細胞に耐性を駆動するSV40プロモーターに対してAvr2インサートを方向づけることができる。得られたプラスミドをPS614と称する。
【0052】
9658−トップ: TCCTAGGCTGCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGG−3’
9655−ボトム: TCCTAGGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCAC−3’
【0053】
ヒトSOS1のコード配列(GenBankアクセス番号NM_005633)は、例えば後述のプライマー0099 及び0100を用いるPCRによってヒトの胎児又は脳のcDNAライブラリーから単離される。トッププライマーは、ATGに続く特定のSOS1配列及びBamH1クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びNot1クローニング部位を含む特定のSOS1配列を含む。PCR産物は制限酵素BamH1及びNot1で消化され、BamH1とNot1で消化したPS614ベクターDNAに連結される。これは、CMVプロモーターの制御下でPDE4A4とSOS1との融合体を生じる。得られたプラスミドを、PS642と称する。
【0054】
0099−トップ: 5’−GTTGGATCCCATGCAGCAGGCGCCGCAGCCTTAC −3’
0100−ボトム: 5’− GTTGCGGCCGCTCATTGGGGAGTTTCTGCATTTTC −3’
【0055】
プラスミドPS587は、CMVプロモーターの制御下でGRB2とEGFPの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。ヒトGRB2のコード配列(GenBank アクセス番号NM_002086)は、例えば後述のプライマー0073及び0074を用いるPCRにより、ヒトの胎児又は脳又は胎盤のcDNAライブラリーから単離される。トッププライマーは、ATGに続く特定のGRB2配列及びHind3 クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びEcoR1クローニング部位を含む特定のGRB2配列を含む。PCR産物は制限酵素Hind3 及びEcoR1で消化し、 Hind3 及びEcoR1で消化したpEGFP−N1ベクターDNA (Clontech, Palo Alto, GenBank アクセス番号U55672)に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でGRB2とEGFPとの融合体が生じる。ベクターは、EGFPのすぐ上流に(インビトロの転写に使用できる)T7プロモーターを含むように、任意に最初に修飾されてもよい。これは、EGFPのすぐ上流を切断する制限酵素Nhe1及びBgl2でpEGFP−N1を消化し、ベクターフラグメントをアニール化オリゴ9949 及び9950と連結して達成することができる。得られたプラスミドを、PS587と称する。
【0056】
0073−トップ: 5’−GCGAAGCTTTCAGAATGGAAGCCATCG −3’
0074−ボトム: 5’−GCCGAATTCGGACGTTCCGGTTCACG −3’
9949: 5’−CTAGCATTAATACGACTCACTATAGGGA−3’
9950: 5’−GATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATG−3’
【0057】
プラスミドPS639は、CMVプロモーターの制御下でPKAの触媒サブユニット(PKAcat)及びGRB2の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン耐性を有する。
PS639は、PS457由来のPS610から由来する。
プラスミドPS457 は、CMVプロモーター制御下でPKAcatとEGFPの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。17個のN−末端アミノ酸を除くヒトPKAcat (GenBank アクセス番号X07767)のコード配列は、例えば後述のプライマー9952 と9922 を用いるPCRによりヒトの肝臓又は脾臓のcDNAライブラリーから単離される。トッププライマーは、コード配列のN−末端近くの EcoR1部位にわたる特定のPKAcat配列を含む。ボトムプライマーは、停止コドンとBamH1クローニング部位のない特定のPKAcat配列を含む。PCR産物は制限酵素EcoR1及び BamH1で消化し、EcoR1と BamH1で消化したpEGFP−N1ベクターDNA (Clontech, Palo Alto, GenBankアクセス番号U55672)に連結する。この中間体を Hind3及びEcoR1で消化し、アニール化オリゴ9955及び9956と連結し、残りのN−末端アミノ酸をPKAcatに付加し、こうしてCMVプロモーターの制御下で PKAcatとEGFPとの融合体を生じる。この構築物をPS457と称する。
【0058】
9952−トップ: 5’−GAGCGTGAAAGAATTCTTAGCCAAAG−3’
9922−ボトム: 5’−GTGGATCCCAAAACTCAGAAAACTCCTTG−3’
9955:
5’−AGCTTCCGCGATGGGCAACGCCGCCGCCGCCAAGAAGGGCAGCGAGCAGGAGAGC
GTGAAAG−3’
9956:
5’−AATTCTTTCACGCTCTCCTGCTCGCTGCCCTTCTTGGCGGCGGCGGCGTTGCCCATC
GCGGA−3’
【0059】
PS610は、PS457のネオマイシン耐性を上記のゼオシン耐性に変えることによって構築される。
ヒト GRB2のコード配列は、後述のプライマー0143 及び0142を用いるPCRによって上記のPS587から単離される。トッププライマーは、ATG に続く特定の GRB2 配列及びBamH1クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン及びXba1クローニング部位を含む特定のGRB2配列を含む。PCR産物を制限酵素BamH1及びXba1で消化し、BamH1とXba1で消化したPS610 ベクターDNA (ダム(dam)−マイナス大腸菌から単離)に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でPKAcatとGRB2との融合体を生じる。得られたプラスミドをPS639と称する。
【0060】
0143−トップ: 5’−GTTGGATCCCATGGAAGCCATCGCCAAATATG−3’
0142−ボトム: 5’−GTTTCTAGATTAGACGTTCCGGTTCACGG−3’
【0061】
プラスミドPS602は、CMVプロモーターの制御下でEGFPとSOS1の 265個のC−末端アミノ酸との融合体とネオマイシン耐性マーカーを含む。ヒトSOS1のコード配列のC−末端部分(GenBankアクセス番号NM_005633)は、例えば後述のプライマー0122 と0123を用いるPCRによってヒトの胎児又は脳のcDNAから単離される。トッププライマーは、ATG及びXho1クローニング部位の付加したアミノ酸番号1067の後に特定のSOS1配列を含む。ボトムプライマーは、停止コドンとBamH1クローニング部位を含む特定のSOS1配列を含む。PCR産物を制限酵素Xho1 と BamH1で消化し、Xho1 と BamH1で消化したpEGFP−C1 ベクターDNA (Clontech, Palo Alto, GenBankアクセス番号U55673)に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFPとSOS1のC−末端部分との融合体を生じる。ベクターは、上記のEGFPのすぐ上流に(インビトロの転写に使用できる)T7プロモーターを含むように任意に最初に修飾されていてもよい。得られたプラスミドをPS602と称する。
【0062】
0122: 5’−GTTCTCGAGTCATGAGCTTTAGTCGGATTGCTG−3’
0123: 5’−GTTGGATCCTCATTGGGGAGTTTCTGCATTTTC−3’
【0063】
プラスミドPS628は、CMVプロモーターの制御下でPKCガンマ のCys1ドメインとGRB2の融合体を含み、選択マーカーとしてゼオシン耐性を有する。PS628は、PS443由来のPS613に由来する。
プラスミドPS443は、CMVプロモーターの制御下でヒトPKCガンマ の90 N−末端アミノ酸(Cys1ドメイン)及びEGFPの融合体を含み、選択マーカーとしてネオマイシン耐性を有する。ヒトPKCガンマのCys1ドメイン(GenBank アクセス番号 M13977及びZ15114)は、例えば後述のプライマー9916及び9935 を用いるPCRによってヒトの脳のcDNAライブラリーから単離される。トッププライマーは、ATG 及びEcoR1クローニング部位にわたる特定のPKCガンマ配列を含む。ボトムプライマーは、アミノ酸番号90及びAcc65クローニング部位の周囲に特定のPKCガンマ配列を含む。PCR産物を制限酵素EcoR1及びAcc65で消化し、EcoR1及びAcc65で消化したpEGFP−N1 ベクターDNA (Clontech, Palo Alto, GenBankアクセス番号U55672)に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でPKCガンマ−Cys1及びEGFPの融合体を生じる。この構築物を、PS443と称する。
【0064】
9916: 5’−GTGAATTCGGCCATGGCTGGTC−3’
9935: 5’−GTGGTACCTTCCCAGCGCCTGGACACTC−3’
【0065】
PS613は、上記のようにゼオシン耐性でPS443のネオマイシン耐性を置換することによって構築される。
ヒトGRB2のコード配列は、後述のプライマー0143 及び0142を用いるPCRによって上記のPS587から単離される。トッププライマーは、ATGに続く特定のGRB2配列及び BamH1クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドンと Xba1クローニング部位を含む特定のGRB2配列を含む。PCR産物は、制限酵素BamH1 及びXba1で消化し、BamH1とXba1で消化したPS610 ベクターDNA (ダム−マイナス大腸菌から単離)に連結する。これにより、CMVプロモーターの制御下でCys1とGRB2の融合体が生じる。得られたプラスミドをPS628と称する。
【0066】
0143−トップ: 5’−GTTGGATCCCATGGAAGCCATCGCCAAATATG−3’
0142−ボトム: 5’−GTTTCTAGATTAGACGTTCCGGTTCACGG−3’
【0067】
HSPDE4A1−EGFP融合体を構築するために、HSPDE4A1 の約1.95 kbのコード領域(GenBankアクセス番号U97584)を、PCR及び後述のプライマー4A1−トップ及び 4A−ボトムを用いて増幅する。トッププライマーは、ATGに続く特定の HSPDE4A1配列、コザック配列及びHind3クローニング部位を含む。ボトムプライマーは、停止コドン、BamH1クローニング部位及びpEGFP−N1への挿入時にリーディングフレームを保存するための2つの余分なヌクレオチドのない共通のPDE4A C−末端配列を含む。PCR産物を制限酵素Hind3とBamH1で消化し、Hind3とBamH1で切断したpEGFP−N1 (Clontech, Palo Alto; GenBank アクセス番号U55762)にクローンする。これにより、CMVプロモーターの制御下でHSPDE4A1−EGFP融合体が生じる。得られたプラスミドをPS461と称し、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)に2000年4月17日にDSM 13449でブダペスト条約の下で寄託した。
【0068】
4A1−トップ: 5’−GTAAGCTTAAGATGCCCTTGGTGGATTTCTTC−3’、PDE4A1に特異的、
4A−ボトム: 5’−GTGGATCCCAGGTAGGGTCTCCACCTGA−3’
【0069】
【表1】
1開始コドンから3’−末端のBamH1 クローニング部位までPS462にみ
られるようなPDE4A4のDNA配列
2PS462にみられるようなPDE4A4のタンパク質配列
3開始コドンから3’−末端のBamH1 クローニング部位までPS461にみ
られるようなPDE4A1のDNA配列
4PS461にみられるようなPDE4A1のタンパク質配列
5開始コドンから停止コドンまでPS642にみられるようなSOS1のDNA
配列
【0070】
実施例2: プロトコル及び方法
この実施例は、実施例1に記載のプローブのインビボ発現に用いるプロトコル及び方法、ならびに単一で、もしくはCHO細胞でのアンカープローブとの同時トランスフェクションとしてトランスフェクトされたEGFP融合プローブによる変化の視覚化及び測定を記載する。
【0071】
トランスフェクション及び細胞培養 :
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)を、1種のプラスミド又は供給者によって推奨される方法にしたがってトランスフェクション剤FuGENE(登録商標) 6 (Boehringer Mannheim Corp, USA)を用いて同時にトランスフェクションされた一対のプラスミドを用いて、上記実施例1に記載のプラスミドでトランスフェクトする。単一のGFPプローブの安定なトランスフェクタントを、適当な選択剤、通常は、増殖培地(グルタマクス(Glutamax)−1、10 % ウシ胎児血清(FBS)、100μg ペニシリン−ストレプトマイシン混合物 ml−1 (GibcoBRL, Life Technologies, Denmarkより供給)とのHAM’s F12 栄養ミックス)中0.5 mg/mlのG418 硫酸塩(Calbiochem)を用いて選択する。同時にトランスフェクトした細胞を、使用されるプラスミドに適当な2つの選択剤、通常は0.5 mg/mlのG418 硫酸塩及び1 mg/mlゼオシンを添加する以外は同一の培地で培養する。細胞を37℃で100%湿度及び5% CO2を追加した通常の雰囲気ガス条件で培養する。
【0072】
特定の性質を有するクローン細胞系を、個々の細胞を単離し、選択されるプラスミドに適当なように、0.5 mg/ml G418硫酸塩又は0.5 mg/ml G418 硫酸塩 + 1 mg/ml ゼオシンを有する新鮮な培養培地を含む滅菌培養フラスコに細胞を除くことにより、安定なトランスフェクト細胞の混合群から半培養(sub cultured)する。
蛍光顕微鏡検査用に、細胞を少なくとも24時間Lab−Tekチャンバーカバーガラス(Nalge Nunc International, Naperville USA)に接着させ、次いで約80%に集密(confluence)するまで培養する。画像化目的用にプラスチックの96−ウェルのプレート(Polyfiltronics Packard 96−View Plate 又は Costar Black Plate、透明底; いずれのタイプも組織培養を処理した)で細胞を成長させることができる。実験前に、グルタマクス、100 μg ペニシリン−ストレプトマイシン混合物 ml−1 及び10 % FBSを有するHAM F−12培地中で選択剤なしに一晩細胞を培養する。この培地は、インキュベーターから直接的な細胞の蛍光顕微鏡検査を可能にする低自動蛍光を有する。特に特定の細胞成長因子の存在に関して所定の組成の培地を要する試験用には、3.6 KCl、140 NaCl、2 NaHCO3、0.5 NaH2PO4、0.5 MgSO4、1.5 CaCl2、10 Hepes、5 グルコース、pH7.4を(mMで)含む緩衝生理食塩溶液(KRW緩衝液)でHAM培養培地を画像化前に置換する。
【0073】
共焦画像化 :
共焦画像を、488 nmで励起光を発するアルゴンイオンレーザーを備えたZeiss LSM 410顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)を用いて回収する。光路には、FT510 二色性ビーム分割機及び515 nmの長−路(long−path)フィルター又は510〜525 nm の帯域放射フィルターがある。画像を一般にFluar 40X, NA: 1.3 油浸対物レンズを用いて回収し、顕微鏡の共焦開口を(このレンズに最適な)10単位値にセットする。
【0074】
経時的なシークエンス及び分析 :
時間中(経時的(Time lapse)、例えば図5、6、11、12)の生細胞の画像シークエンスを、Fluar 40X, NA: 1.3油浸対物レンズを備え、Photometrics CH250電荷結合素子(CCD)カメラ(Photometrics, Tucson, AZ USA)に連結したZeiss Axiovert 135M 蛍光顕微鏡を用いて集める。細胞を100 W のHBO アーク灯で照らす。光路には、470±20 nmの励起フィルター、510 nmのダイクロイックミラー及び最少の画像バックグラウンド用の515±15 nm 励起フィルターがある。細胞を、誂えた段階ヒーターで37℃に維持する。
シークエンス中の各連続画像に同一の座標又は画素にわたって明確に定めた対象領域(region of interest (ROI))を用いる画像シークエンスから、経時的な反応プロフィルを抽出する:画素値を合計し、各画像で ROIに対して平均し、得られた値を画像数にプロットして、所定のシークエンス領域に対する経時的な反応プロフィルを得る。ROIには、多くの細胞、単細胞又は単細胞内の領域を含めることができる。
【0075】
自動画像化及び分析 :
細胞群におけるトランスフェクトプローブの蛍光スポット及び他の蓄積物の量は、スポットの平均数/細胞を測定するような自動化法で画像化し、定量することができる。この目的のため、細胞をほぼ80%〜90%の集密までカバーガラスチャンバー又はプラスチックの96−ウェルプレートで培養し、関連処理を行い、反応させる。反応段階の最後に、30分〜2時間4% ホルムアルデヒド緩衝液(Lillies 固定緩衝液、pH7.0: Bie and Berntsen A/S, Denmark)で細胞を化学的に固定し、次いでリン酸緩衝液(PBS, Life Technologies, Denmark)で3回洗浄する。細胞質から非局在(つまり可動性)GFPプローブを除くのに有用な、代替的な同時固定+透過法は、0.2〜1%のトリトンX−100を加えた0.4〜2%のホルムアルデヒド緩衝液(10〜50%強度のLillies 固定剤)を導入する1回の固定法を伴う。使用する実際の濃度を、使用する細胞種に最適化する必要がある;CHO細胞については、2%ホルムアルデヒド+1%トリトンX−100が優れた結果を生じる。固定剤+洗剤の組み合わせは、室温で10〜20分細胞に適用される。次いで、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を3回洗浄する。核DNAを25℃で10分PBS中10μMのヘキスト33258 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)で染色し、次いでPBSで2回洗浄する。自動画像を、Nikon Plan Fluor 20X/0.5NA 対物レンズを用いてNikon Diaphot 300 (Nikon, Japan)で回収する。基本顕微鏡は、電動の試験片足場と電動の焦点制御(Prior Scientific, Fulbourn, Cambridge UK)、励起フィルターホイール(Sutter Instruments, Novato CA USA)及びKAF1400 CCD チップを有するPhotometrics PXLシリーズカメラ(Photometrics, Tucson, AZ USA)(これらの品目は、それぞれMacintosh 7200/90コンピューター(Apple Computer, Cupertino, CA USA)の制御下にある)を備える。足場位置、焦点、励起フィルター選択及び画像捕捉の自動化は、Macintosh用のIPLab スペクトル(Scanalytics, Fairfax, VA USA)下で作動する、内部に書き込まれたマクロス(macros)を用いて行う。100 W のHBO ランプから、蛍光照明を生じる。最初に340/10 nm 励起フィルターを用いて、次に475RDF40 励起フィルター(Chroma, Brattleboro, Vermont)を用いて、画像を対で回収する。双方の画像を、EGFP用途(XF100 フィルターセット, Omega Optical, Brattleboro, Vermont)用に最適化した同じダイクロイック放出フィルターを介して回収する。核染色(ヘキスト33258)画像化用のフィルターの選択が色素のスペクトル特性に十分に合わず、画像強度が低下するが、同じダイクロイック放出フィルターを用いて双方の画像を回収できることによって、方法のスループットが大きく改善される。これにより、2つの異なるフィルターセットを用いることに起因し、捕捉方法にさらに数段階を要し、克服するのに広範囲な画像化処理を要する画像の登録問題及び焦点シフトが排除される。
【0076】
必要な画像を以下のとおり回収する: 4個の8−ウェルのカバーガラスチャンバーを含むホルダー又は1つの96−ウェルプレートを顕微鏡に載せる。プログラムを開始し、第1ウェルの細胞を位置に動かし、技師により手動で粗く焦点を合わす。340/10 励起を用いる自動焦点の機械的操作で、微細に画像の焦点を合わす。画像を捕捉し、この励起波長で蓄積し(核の画像)、次いで第二画像を捕捉し、長い波長励起で蓄積する(GFP画像)。足場を自動的に再度位置付け、顕微鏡の焦点を再度自動的に合わせ、同一ウェル内で第二画像対を捕捉する。この方法を、第一ウェルについて数回(一般に4〜8回)繰り返す。次に、足場を画像位置の隣のウェルに進め、数セットの画像対が各細胞ウェルから捕捉されるまで、方法を繰り返す。
【0077】
IPLab スペクトルソフトウェアで作動する一組のマクロスを用いて、以下のようにして画像対を自動的に分析する: 最初に、核の画像対をデジタルフィルターでフィルターにかけ、同時に縁をシャープにし、核の強度の相違を抑制する。フィルターの選択及びフィルターの定数(filter constant)は、種々のデータセットを用いて実験中に達せられた。次に、フィルターにかけた画像を、この閾値未満の画素が核領域内にないように、またこの閾値より大きい画素が核領域内にあるように、所定の強度値でセグメントに分ける。次に、核と核ではない他の対象物とを十分に正確に識別するように予め決定した領域より大きいか、又はある(異なる)領域より小さい隣接領域を除いた後、閾値より大きい隣接領域を計測する。最終的な総数は、その範囲で見積もられる核数である。各対のGFP画像を、次いで実験的に選択したフィルターでデジタルフィルターにかけ、このバックグランドに関して明ポイント(bright point)−様対象物の強度を減じながら、GFPの一般的な非局在化分布による強度変化を抑制する。次いで、このフィルターにかけた画像を実験的に決定した閾値でセグメントに分け、スポットにある可能性の高い(閾値より大きい)画素及びスポットにはない可能性の高い(閾値未満の)画素に画像を分ける。スポットに特有であることが予め決定された、ある形態学的特性を持たない領域を除いた後、閾値より大きい画素の隣接領域を計測する。各対について核の計測に対するスポットの計測の割合は、画像対における細胞当たりの平均スポット数の予測を示す。画像対全てをこうして処理し、最終的な値表を用いて、所定の処理に対する細胞の反応を確立する。図3は、HSPDE4A4−EGFP発現CHO細胞におけるスポット密度による化合物の作用が、自動画像化及び画像解析法を用いてどのように測定できるかについての一例である。
【0078】
細胞群におけるトランスフェクトプローブの蛍光スポット及び他の蓄積物の量は、TECAN Spectrafluor (Tecan U.S. Inc., Research Triangle Park, NC 27709, USA) のような蛍光プレートリーダー又は蛍光画像化プレートリーダー(FLIPR; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA 94089, USA)を用いて定量することもできる。固定剤+透過法を組合わせた使用は、特に蛍光プレートリーダーで測定される際に、細胞中のスポット及び他の蓄積物の測定用のバックグラウンドに対するシグナルを大きく改善する。図4は、HSPDE4A4−EGFP発現CHO細胞におけるスポット密度による化合物の作用を測定するためのFLIPRの使用例である。細胞を同時に固定及び透過プロトコルで処理し、これらのデータを得た。
【0079】
細胞質から原形質膜への蛍光プローブの再分布は、細胞質ROIの蛍光強度の変化の簡単な画像分析を用いて標準的な画像化法によって定量してもよい。同様の再分布は、FRIPRで、また標準的な蛍光プレートリーダー、特にマイクロタイタープレートで接着細胞からのシグナルを測定するよう形成したプレートリーダーにおいてでも測定できる。
PKC−様再分布(EGFP−Cys1(PKCγ)がその一例である)、またPKAc−様再分布を測定するためのFLIPRの使用は、実際には先の特許「細胞反応に対する影響に関する量的情報を抽出するための改良方法」(WO 00/23615)に詳述されている。図7は、Cys1γ−EGFPの再分布に対する化合物の作用がFLIPRを用いてどのように定量できるかを示している。
【0080】
実施例3: PDE4A4 アンカータンパク質でのタンパク質X及びYのプローブ
この実施例及び実施例4、実施例5ならびに実施例6は、2つのパートナー成分X及びY間の特異的な相互作用に対する標的化合物をスクリーニングするのに適当な細胞系を作製する一般的な方法を記載している。これらの実施例で、細胞は、一方がアンカー分子(アンカープローブ)のC又はN末端に結合するX又はYとの融合プローブをコードし、第二のものがGFP(検出基)のC又はN末端に結合した他のパートナーY又はXとの融合プローブをコードしている、2つのプラスミドで同時にトランスフェクトされたCHO細胞に由来する。したがって、相互作用対X−Y及び8個の有用な組合わせを同時にトランスフェクトし得る、4個の潜在的なアンカープローブと4個の潜在的な検出プローブがある。アンカー及び検出プローブは、異なる選択マーカーを用いて、選択中の細胞に両プラスミドを確実に維持させる;例えばアンカーは、ネオマイシンに対して検出性である、ゼオシン耐性を付与し得る。連続的な選択中(最低限2週間)に両プローブを維持する細胞を「安定」と称する。
【0081】
この実施例では、アンカープローブはHSPDE4A4B (ヒトのホスホジエステラーゼ タイプ4、イソ型A、スプライス変異体4B: 以降、PDE4A4と称する)に基づいており、これはPDE4阻害剤のロリプラムでの処理時に、各細胞の細胞質中に稠密な幾つかの集合物を形成する(EC50 0.2〜0.3 μM)。これらのロリプラム−誘導性集合物は、図10に示されるように、HSPDE4A のユニークなC−末端ペプチド配列に対する抗体で検出されてもよい。PDE4A4のC−末端に融合したGFPを有する融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、蛍光は細胞質内で包括的かつ全く均一に分布するが(図1)、ロリプラムで処理すると集合物が生じ、これらは細胞中の明るい緑蛍光のスポットとしてはっきり見える(図2)。核の側方の正反対に位置する、そのような集合物は、ロリプラム−処理細胞当たり平均2個ある。10μMのロリプラムに10〜16時間暴露した後、これらの集合物は、直径約2〜4μmに成長する。
【0082】
ロリプラムの除去は、60分以内にこれらの集合物を分散させる。同様のスポットは、PDE4 阻害剤RS25344 (EC50 0.02 μM, Syntex) 及びRo 20−1724 (EC50 4 μM, Roche)で処理すると、PDE4A4−トランスフェクト細胞ではっきりと見られる。EGFP−Y検出プローブを加えたPDE4A4−アンカープローブ−Xで同時にトランスフェクトした細胞では、GFP−明スポット(bright spot)は、XとYが相互作用し、互いを誘因するならば、ロリプラムでの処理後の細胞でのみはっきりと見られるであろう(図8)。ロリプラムを除くか、又は別の有力なPDE4阻害剤であるRP73401 (Piclamilast, Rhone−Poulenc Rorer)と競合させると(IC50 対 3 μM ロリプラム 約20 nM、図3及び4)、スポットは消失するであろう(図9)。
【0083】
PDE4A4 アンカー系のプロトコル:
1) PDE4A4 アンカー−検出対のCHOへの同時トランスフェクト、
2) GFP−明スポットがないことのチェックと開始。スポットがあるか、又は存在するGFPについて別の明確な分布があれば、(3)で細胞を試験する価値が依然としてある可能性がある: 分布変化は、このトランスフェクションが有用であれば、工程(3)で見られなければならない、
3) 10 μM ロリプラムと(個別に)1μM RS25344での一晩の過渡物(transient)の試験、
a. スポットの出現: 過渡物から細胞をクローン、及び(4にあるような)二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
b. スポットなし: 二重選択下の細胞からの安定な細胞系形成を待機(4参照)、
【0084】
4) 二重選択(例えば1 mg/mlゼオシン+0.5 mg/mlネオマイシン/G418) を用いる安定な細胞系の作製。10 μMのロリプラム及び1 μM RS25344での個別の試験、
a. スポットの出現: スクリーニング用途のため二重選択下の安定物(stable)から細胞をクローン、
b. スポットなし: 抗−4A 抗体で固定と染色(ロリプラム又はRS25344−処理細胞)、
i. 抗体でスポット染色: (5)に進む
ii. スポットなし: アンカー系が存在しないか又は作用していない −同時トランスフェクションを反復、又は別のアンカー系もしくは方向付けを試験、
5) 暫定的な結合を試験(以下のA及びB参照)、
6) 結合状態が見られない場合、アンカー/検出対の別の組合わせを選択し、再度開始する。
【0085】
適当な相互作用刺激:A及びBでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのB試験。
A i) 10Mのロリプラムと別々の1M RS25344で一晩、安定物をインキュベート、
ii) 相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、NBこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る:
a. スポットの出現: 安定物から細胞をクローン、
b. スポットなし: (B)を行う、
【0086】
B i) 10 μM のロリプラムと別々の1 μM RS25344で一晩、安定物をインキュベート、
ii) ロリプラム又はRSの洗い出し、60分インキュベート(PDE4A4アンカーをその結合から解放する)、
iii) 10 μMロリプラム又は1 μM RS25344とともに(又はそれによって迅速に続けて)相互作用刺激、つまり対を一緒にするような適当な処理で試験、
a. スポットの出現: 安定物から細胞をクローン、
b. スポットなし: (6)を参照のこと。
【0087】
実施例4:PKAcatαアンカータンパク質でのタンパク質X及びYのプローブ
この実施例で、アンカープローブはHSPKAcatα(ヒトサイクリックAMP−依存プロテインキナーゼの触媒サブユニット、イソ型α:以降、PKAcとして言及)に基づいており、これは、細胞へのトランスフェクト時に低濃度の細胞質cAMP条件下で細胞質に集合物を形成する。これらの集合物は、PKAcに対する抗体、またPKA制御サブユニット1α型(R1α)に対する抗体を用いて検出され得る。PKAcのC末端に融合されるGFPを有する融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、そのような集合物は、細胞で明るい緑色の蛍光スポットとして見られる(図5)。これらの集合物は、cAMPが細胞で上昇する場合、例えば細胞を500μMイソブチルメチルキサンチン(IBMX)を加えた25μMのフォルスコリンで処理する場合、細胞質に分散する。検出可能なEGFP(一方がX、他方がY)を加えたPKAcアンカープローブで同時にトランスフェクトした細胞では、GFP−明スポットは、XとYが相互作用して互いに引き寄せるならば、細胞でのみ見られるであろう(図11a)。スポットは、cAMPが細胞で上昇する場合に消失するであろう(図11b)。
【0088】
PKAcアンカー系のプロトコル:
1) アンカー−検出対のCHOへの同時トランスフェクト、
2) 過渡物の分布のチェック
a) スポットあり: 過渡物から細胞をクローン、及び(3にあるような)二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
b) スポットなし: 安定物3)を待機、
c) 他の分布が存在し、正常なPKAスポットとは異なれば、50μMフォルスコリン+500μM IBMXで試験し、
i) 分布が変化すれば、(3)に記載する二重選択下でのスクリーニングで用いる細胞を準備し、
ii) 変化なし: (3)の安定物に続行する価値が依然としてあり得る、
【0089】
3) 二重選択(例えばゼオシン1mg/ml+0.5mg/mlネオマイシン/G418)を用いて安定な細胞系を作製、
a) スポットの出現:50μM フォルスコリン + 500 μM IBMXで試験;分布が変化すれば、スクリーニングで用いるための細胞を二重選択下でクローン、
b) スポットなし: 抗−PKAcat抗体で固定し、染色
i) PKAcat抗体で染色: (4)に進む
ii) スポットなし:アンカー系が存在していないか、作用していない、又はcAMPが極めて高い
・ PKA制御サブユニット1α型(R1α)に対する抗体で染色 − これは、触媒サブユニットが分離していても(高cAMP)PKA「スポット」を示すであろう: スポットが見られなければ、再トランスフェクトする、
4) 暫定的結合を試験(以下のA及びB参照)、
5) 結合状態が見られなければ、アンカー/検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【0090】
適当な相互作用刺激:A及びBでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのB試験。
A i) 相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、NBこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る:
a. スポットの出現: スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
b. スポットなし: (B)を行う、
【0091】
B i) 50 μM のフォルスコリン+500μMのIBMXで30分安定物をインキュベート(PKAアンカーを解放する)、
ii) フォルスコリン+IBMXの洗い出し、相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、30〜60分インキュベート、
a. スポットの出現: スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
b. スポットなし: (5)を参照のこと。
【0092】
実施例5:PDE4A1ドメインアンカータンパク質でのタンパク質X及びYのプローブ
この実施例で、アンカープローブはPDE4A1ドメインに基づいている。PDE4A1は、他の点では未処理の細胞で小さな核周辺スポットとして蓄積する。これらのスポットは、PDE4AのユニークなC末端部分に対する抗体で容易に検出される。ロリプラムでの処理は、これらのスポットを細胞質へ分散させる(図13)。その後、ロリプラムを除くと、核周辺スポットが迅速に再現される。
【0093】
図13aで、HSPDE4A1−GFPを安定的に発現するCHO細胞は、10%FBSを有するHAM’sF12培地でのみ生育する;GFP蛍光は、各細胞の核周辺の細胞質内の明るい顆粒状のスポットに限定される。スポットは、ゴルジ膜の周囲、内部又は膜上に密集していてもよい。図13bで、13aで見られたのと同様の細胞を、2μMのロリプラムで2時間処理した。大部分のGFP−明スポットはロリプラム処理下の全細胞で消失し、細胞質が一般に明るくなる。大きなスポットは、幾つかの細胞では完全には分散しない可能性がある。ロリプラムを洗い出すと、スポットは、1.75時間以内に再形成する。
さらに、PDE4A1の分布及びそのあらゆる変化は、自動画像化によって容易に測定できる。
【0094】
図14は、ロリプラムに対するスポットの分散についての用量反応曲線を示す。各濃度のロリプラムについて、細胞当たりのスポット数は4回の測定±semの平均であり、各測定はそれ自体100個以上の細胞から得た平均である。様々な濃度のロリプラムと10%FBSを加えたHAM’s F12培地で細胞を7時間生育させる。そして、細胞を4%のホルマリン緩衝液(pH7.5)で15分間化学的に固定し、PBSで洗浄し、PBS 中10μMのヘキスト33258で25℃で10分間染色し、そしてPBSで2回洗浄する。実施例2に記載のように、自動画像を収集し、細胞当たりのスポット数を分析する。
【0095】
PDE4A1アンカー系のプロトコル:
1) アンカー−検出対のCHOへの同時トランスフェクト、
2) 過渡物の分布のチェック
a) スポットあり: 過渡物から細胞をクローン、及び(3にあるような)二重選択下で操作。安定時にスクリーニングするための細胞の準備、
b) スポットなし: 安定物3)を待機、
c) 他の分布が存在し、正常なPDE4A1スポットとは異なれば、10μMロリプラムで試験し、
i) 分布が変化すれば、(3)に記載する二重選択下でのスクリーニングで用いる細胞を準備し、
ii) 変化なし: (3)の安定物に続行する価値が依然としてあり得る、
【0096】
3) 二重選択(例えばゼオシン1mg/ml+0.5mg/mlネオマイシン/G418)を用いて安定な細胞系を作製、
a) スポットの出現:10μM ロリプラムで試験;分布が変化すれば、スクリーニングで用いるための細胞を二重選択下でクローン、
b) スポットなし: 抗− PDE4A抗体で固定し、染色
i) PDE4A抗体で染色: (4)に進む
ii) スポットなし:アンカー系が存在していないか、作用していない、再トランスフェクト、
4) 暫定的結合を試験(以下のA及びB参照)、
5) 結合状態が見られなければ、アンカー/検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【0097】
適当な相互作用刺激:A及びBでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのB試験。
A ii) 相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、NBこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る:
a. スポットの出現: スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
b. スポットなし: (B)を行う、
【0098】
B i) 10 μM のロリプラムで7時間安定物をインキュベート(PDE4A1アンカーを解放する)、
ii) ロリプラムの洗い出し、相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、2〜4時間インキュベート、
a. スポットの出現: スクリーニングで用いるための細胞をクローン、
b. スポットなし: (5)を参照のこと。
【0099】
実施例6:Cys1ドメインアンカータンパク質でのタンパク質X及びYのプローブ
この実施例で、アンカープローブは、myc 又は flag抗原のコード配列が任意に含まれる PKCγのCys1ドメイン(プロテインキナーゼCイソ型γのCys1ドメイン)に基づいており、これは、細胞へのトランスフェクト時に、PMA(ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート)での処理時に原形質膜に再分布する一般的な細胞質分布を有する。これらがCys1構築物内に設計されるならば、細胞質から原形質膜への再分布は、PKCγのCys1ドメインに対する抗体、又はmycもしくはflag抗原に対する抗体を用いて検出され得る。PKCγのCys1ドメインのC末端にGFPが融合した融合タンパク質をコードするプラスミドで成功裏にトランスフェクトされた細胞では、myc又はflag抗原配列を用いて、あるいは用いないで、PMA−誘導性再分布を、原形質膜でのGFP蛍光の随伴する増加に伴う細胞質中のGFP蛍光の低下として検出することができる(図6)。EGFP検出プローブ(一方がX、他方がY)を加えたPKCγアンカープローブのCys1ドメインで同時にトランスフェクトした細胞では、GFP蛍光は、X及びYが相互作用して互いを引き寄せる場合に、PMA処理によって原形質膜に再分布するにすぎないであろう(図12)。
【0100】
Cys1アンカー
1) 新たなアンカー−検出対のCHOへの同時トランスフェクト、
2) 過渡物で分布が細胞質であることをチェック。スポット又は他の明確な分布が存在すれば、(3)の試験をする価値が依然としてある可能性がある、しかし、分布変化が測定可能な場合のみである、
3) 過渡物を30分100nM PMAで試験、
a) 原形質膜へのプローブの分布:(4)にあるような二重選択下で過渡物から細胞をクローン、
b) 再分布なし:安定物を待機(4参照)、
【0101】
4) 二重選択(例えばゼオシン1mg/ml+0.5mg/mlネオマイシン/G418)を用いて安定な細胞系を作製。PMAで試験、
a) 原形質膜へのプローブの分布:二重選択下、クリーニングで用いるための備、
b) 再分布なし:抗−myc抗原で固定し、染色、
i) 抗体でPM染色: (5)に進む
ii) PM染色なし:アンカー系が存在していないか、作用していない−再トランスフェクト、
5) 暫定的結合を試験(以下のA及びB参照)、
6) 結合状態が見られなければ、アンカー/検出対の別の組み合わせを選択肢、再度開始する。
【0102】
適当な相互作用刺激:A及びBでの暫定的結合についての試験を、同時に行うことができる。PMへの標的化を課す前に、「可溶性段階」でのみ生じる潜在的な状態又は結合についてのB試験。
A i) 100nM PMAで安定物を30分インキュベート、
ii) 相互作用刺激、つまり対を一緒にするような処理で試験、NBこれは、過渡物を捕捉するため時間経過を要し得る:
(a) PMに対して再分布:安定物などから細胞をクローン、
(b) 再分布なし:(B)を試験、
【0103】
B i) 100nM PMAで安定物を30分インキュベート、
ii) 相互作用刺激、つまり100nM PMAとともに(又はそれにより迅速に続けて)対を一緒にするような処理で試験、
(a) PMに対して再分布:(4)のような二重選択下で安定物から細胞をクローン、
(b) 再分布なし:(6)参照。
【0104】
実施例7:PDE4A4でのSosとGrb2の相互作用の評価
この実施例は、SosとGrb2との相互作用に対する化合物、哺乳動物細胞の原形質膜に局在するあるチロシンキナーゼレセプターからすぐ下流のシグナル経路に関与する成分、例えばインスリン及び上皮細胞成長因子レセプターをスクリーニングするのに適した細胞系を作成する再分布トラップ法の使用を説明する。SosはRas−様GTPaseの活性化をもたらすグアニンヌクレオチド変換因子であり、Grb2は活性レセプターへのSosの補充をもたらすアダプター成分である。この実施例で、アンカープローブはHSPDE4A4に基づいている。CHO細胞を、実施例2及び3に記載のように、アンカープローブHSPDE4A4−SosA及び「検出性」プローブhGrb2−EGFPを用いて安定的に同時トランスフェクトさせる。ゼオシンを用いてアンカープローブを選択し、ネオマイシン(G418)を用いて検出性プローブを選択する。図8aは、10%FBSを有するHAM’s F12培地で成長する、そのような細胞の共焦画像であり、図8bは、10μMのロリプラムでの処理後の同様の細胞を示す。トランスフェクト細胞は、混合された非−クローン群である。GFP−標識した検出プローブ(GFP蛍光)は、核中わずかに高い濃度で、ロリプラム処理前の細胞一面に分布している。ロリプラム処理(20時間)後、幾つかの細胞は、クローン群で明瞭な明スポットを生じる(図8b)。スポットの出現とロリプラムの必要性は、PDE4A4に予測されるように、これらの細胞でアンカープローブがロリプラムに反応すること(図2)、及び、GFP−標識した検出プローブがそれと結合しているに違いなことを示している。スポットがアンカープローブに対するロリプラム誘導性作用の結果であることを確認するため、PDE4特異的阻害剤RP73401をロリプラムの存在下で適用する(図9)。RP73401はロリプラムと競合し、そしてPDE4A4スポットを分散させる(図3及び4)。図9に見られるように、スポットはRP73401処理で消失し、それが、検出プローブのまばらな分布をもたらすアンカープローブであること、またアンカーと検出対が相互作用していることを立証している。HSPDE4A4及びEGFPは同時トランスフェクト及びロリプラム処理時に相互作用しない(示していない、しかしEGFP分布は、そのような細胞中の核及び細胞質の双方で常に総−細胞性であり、その分布はロリプラムによって影響されない)ので、相互作用は、SosとGrb2の天然の相互作用によって媒介される必要がある。
【0105】
クローン時、Sos−Grb2相互作用に対する化合物をスクリーニングするために同時トランスフェクト細胞を使用してもよい。これらの同時トランスフェクト細胞でロリプラム−誘導性スポットをつくり、消失するが、HSPDE4A4−EGFPプローブのみを安定的に発現する細胞ではロリプラム−誘導性スポットに影響しない化合物は、SosとGrb2との相互作用を特に崩壊させる化合物である。
【0106】
実施例8:PKAcatαでのSosとGrb2の相互作用の評価
この実施例は、Grb2とSosのC末端配列(Sosの1067〜1332アミノ酸)との相互作用に対する化合物をスクリーニングするのに適した細胞系の作成を記載している。これは、アンカープローブがcAMP−依存プロテインキナーゼイソ型αの触媒サブユニット(HSPKAcat−hGrb2)に基づく以外は、実施例7に記載の相互作用対に類似しており、それゆえ、それらが引き寄せ合えば、検出プローブ(EGFP−Sos−Cterm)がGFP−鮮やかとなる集合物として非刺激細胞に局在する。このアンカー系のひとつの潜在的な利点は、事前のアンカー刺激が、相互作用を評価するには必要でないが、相互作用を同定した後に確認試験として使用されることである。したがって、この系を用いる相互作用調節物のスクリーニング工程は、試験中の相互作用を干渉し得る他の細胞シグナル系路の活性を変える見込みを伴わない。
【0107】
フォルスコリン±IBMX(イソブチルメチルキサンチン、非特異的PDE阻害剤)での処理は、あらゆるGFP−鮮やかな集合物がこの系でのアンカーと検出プローブとの特異的相互作用の結果であることを確認するために、PKAcat系で用いられる。というのは、PKAcatの集合物は、この処理下の細胞質に分解するためである。
実施例2及び実施例4に記載のように、アンカープローブHSPKAcat−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermを用いてCHO細胞を安定的に同時トランスフェクトさせる。ゼオシンを用いてアンカープローブを選択し、そしてネオマイシン(G418)を用いて検出プローブを選択する。アンカープローブHSPKAcat−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermの双方を安定的に発現するCHO細胞を、50μMのフォルスコリン+500μMのIBMXでの処理前(図11a)及び処理から10分後(図11b)の図11に示す。非刺激細胞(図5、t=0分)で見られるPKAcat−EGFPの分布に典型的なGFP−鮮やかな集合物を有する3個の細胞を、(図11a)に明らかにする。フォルスコリン+IBMXによるこれらのスポットの分散、細胞中のcAMPを増加させる処理は、GFP−標識した検出プローブが同時トランスフェクト細胞中のアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している。というのは、アンカープローブのみがこうして増加したcAMPに反応できるためである(図5)。
【0108】
スポットを示す細胞は、クローニングに適しており、Grb2とSos−Ctermとの相互作用に対する化合物のスクリーニングに使用してもよい。GFP−鮮やかな集合物をこれらの同時トランスフェクト細胞で消失させるが、PKAcat−EGFPプローブのみで安定的にトランスフェクトされた細胞では集合物に影響しない化合物は、Sos−CtermとGrb2との相互作用を特に崩壊させる化合物である。
【0109】
実施例9:Cys1ドメインでのSosとGrb2の相互作用の評価
この実施例は、Grb2とSosのC末端配列(Sosの1067〜1332アミノ酸)との相互作用に対する化合物のスクリーニングに適した別の細胞系の作成を記載している。これは、アンカープローブがプロテインキナーゼCイソ型ガンマのCys1ドメインに基づく以外は、実施例6に記載されるものと同一の相互作用対であり、このため、非刺激細胞で細胞質及び核一面に局在する。これらの細胞を100nMのPMAで処理すると、アンカープローブが原形質膜に再分布し、相互作用がアンカーと検出プローブとの間で発生すれば、GFP蛍光が原形質膜に再分布することも認められるであろう。このアンカー系の利点は、PMAでの刺激時に、アンカープローブが、アンカーに結合する成分とEGFP分子との相互作用を調節する上で重要な可能性がある他の成分と極めて接近するような原形質膜に取り込まれることである。Grb2及びSos−Ctermの場合、原形質膜への接近は、それらの相互作用の開始には不要と思われるが、ある成分対は、この条件に合致しなければ、相互作用しない可能性がある。PMAでの処理は、2つのプローブの相互作用が最初に起これば、原形質膜への蛍光の再分布のみが生じるので、アンカーと検出プローブとの相互作用がこの系で生じることを確認するために用いられる。これは、PMAが蛍光の分布に影響しないEGFP−Sos−CtermのみでトランスフェクトしたCHO細胞でチェックすることができる。
【0110】
実施例2及び実施例6に記載のように、アンカープローブCys1−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermを用いてCHO細胞を安定的に同時トランスフェクトする。アンカープローブをゼオシンで選択し、検出プローブをネオマイシン(G418)で選択する。図12は、100nMのPMAでの処理前(図12a)及び処理から5分後(図12b)のアンカープローブCys1−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermの双方を安定的に発現するCHO細胞を示す。PMA処理前の細胞の大多数は、かなり一般的な細胞質様及び核様の蛍光分布を有する。PMAでの処理は、原形質膜に対し測定可能な蛍光のシフトを引き起こし、同様に、Cys1−EGFPがPMAに応じて再分布するであろう(図6)。この結果は、アンカープローブのみがこうしてPMAに反応できるため、GFP−標識した検出プローブがアンカープローブと相互作用しているに違いないことを示している。
【0111】
この様相を示す細胞は、クローニングに適しており、Grb2とSos−Ctermとの相互作用に対する化合物のスクリーニングに使用してもよい。これらの同時トランスフェクト細胞でEGFP蛍光のPMA−誘導性再分布を妨げるが、Cys1−EGFPプローブのみで安定的にトランスフェクトされた細胞で蛍光再分布に影響しない化合物は、Sos−CtermとGrb2との相互作用を特異的に崩壊させる化合物である。
【0112】
実施例10:トラップアッセイのアッセイ方法
選択的なPDE4阻害剤のロリプラムは、大部分の細胞で一般的なPDE4A4の細胞質分布が、細胞質内の幾つかの明瞭なスポットに局在するPDE4A4の濃度からなる分布に徐々に変化するように、PDE4A4の物理特性及び挙動に影響を及ぼす(実施例3参照)。
この実施例は、14−3−3タンパク質とBADとの結合が、PDE4A4−14−3β及びeGFP−BAD融合体を用いてどのようにして可視化できるかを示している。それは、可溶性の細胞質状態から、eGFP−BAD融合体が結合されているか、又は細胞質中で実際に凝集している状態への可動性変化の一例である。
【0113】
使用される化学製品:
グルタマクス−1を有するNUT.MIX F−12(HAM).Gibco Bri 31765−027。
「FCS」、仔ウシ血清、Gibco Bri 10084−168。
Pen/strep(100u/ml/100μg/ml、Gibco cat Bri 15140−122。
4%のホルムアルデヒド、Bie&Berntsen Lab 00220。
トリトン−X 100、Sigma
ヘキスト33258(貯蔵液:10mM)
ロリプラム、RBI
DMSO、Sigma D−5879。
【0114】
器具:
Fluoscan ASCENT CFプレートリーダー(Labsystems)
フィルター: 485/527(GFP)及び355/460(ヘキスト)、全てLabsystemsのもの
緩衝液:
抽出緩衝液:PBSで1:40(=0.1%)に希釈したホルムアルデヒド4%+トリトン−X 100 1%+ヘキスト33258 10μM
PBS ダルベッコ:GIBCO 14190−094
【0115】
細胞:
細胞型:PDE4A4とヒト14−3−3βとのインフレームの融合タンパク質を発現するプラスミドと、EGFPとヒトBADとのインフレームの融合タンパク質を発現する別のプラスミドでトランスフェクトしたCHO細胞(このようなプローブの構築についての詳細は、実施例1及び3に見出すことができる)。
密度:96ウェル−マイクロタイタープレート(ViewPlate96、黒色;Packard)中、1.0×10E5/ウェル(接種日)
【0116】
方法:
細胞を、スクリーニングの20〜24時間前に、200μlのHAM F−12w.10%FCS及び5% pen/strep中の1.0×10E5/ウェルにプレートする。刺激細胞に、さらに10μMのロリプラムを加える。
14−3−3とBADとの相互作用を阻害し得る薬剤を試験するため、試験化合物を200μlのHAM F−12生育培地の上部に加え、CO2インキュベーターで2時間培養する。
試験化合物を有するHAM F−12をマイクロタイタープレートの全ウェルから出し、細胞を200μlの抽出緩衝液で5分間抽出する。
細胞に200μlの抽出緩衝液の上部で100μlのホルムアルデヒド4%緩衝液を加え、5分インキュベートする。
抽出緩衝液を除き、細胞を100μl のPBSで2回洗浄する。細胞に200μlのPBS緩衝液を加える。
【0117】
予めプログラム化した方法及びGFPならびにヘキスト33258蛍光団に適したフィルター設定を用いて、ASCENTプレートリーダーで蛍光を読み取る。ヘキストの読み取りを用いて、細胞数を予測でき、それによって、同数の細胞の含んでいない可能性のあるウェルからGFPシグナルの標準化に有用なシグナルを供する。結果を図15に示す。
【0118】
実施例11:再分布(登録商標)アッセイのアッセイ法
NFkB(p65)がII−1とのNFkBの刺激でサイトソルから核へ移動することは、十分に立証されている。このことは、NFkB(p65)−GFP融合体を用いて視覚化できる。サイトゾルのNFkB(p65)−GFPの移動後に測定される総GFP濃度は、核への移動度、つまりNFkBの活性化度を示す。これは、可溶性細胞質NFkBから核中に結合された成分への変化としての可動性変化の一例である。
抽出法を適用することで、非刺激細胞及び刺激細胞との相違を蛍光の強度によって読み取ることができる(図16参照)。
【0119】
実施例12:抽出最適化
細胞を既知の濃度で接種し、24時間生育させる。トリトン−x 100とホルマリンを様々に組み合わせて刺激細胞と非刺激細胞(完全な「運的」範囲を示す)を抽出し、シグナルをプレートリーダーで読み取る。本目的は、ノイズに対する最適なシグナル(s/n)割合を示すホルマリンとトリトン−xとの割合を同定することである。s/nは、(刺激細胞中の蛍光−非刺激細胞中の蛍光)/非刺激細胞での蛍光×100%として算出される。
【0120】
【数1】
【0121】
14−3−3タンパク質とBADとの結合用抽出緩衝液の最適化
最適化を図17で例示する。
【0122】
実施例13:抽出物を用いるフォルスコリン誘導性PKAcat移動の定量
PKAcat−GFPは、不活性な四量体形態の明瞭なスポットを形成する。細胞cAMPの増加(例えばフォルスコリンによるアデニレートシクラーゼ活性の刺激による)によって、PKAcatがその制御サブユニットから分離し、スポットをサイトゾルに「分解」する。抽出方法をとおしてサイトソルPKAcat−GFPを除いた後に測定される総GFP強度は、不活性化、非−分離PKAcatのレベルを示している。
この実施例では、抽出法を用いて、PKAcat−GFPアッセイでのフォルスコリン用量反応を定量している。
細胞を、種々の濃度のフォルスコリンで15分間処理する(スポットの除去)。細胞を抽出する(0.2%のホルマリン/ 0.2%のトリトン−x)。シグナルをFLIPRで読み取る。結果を図18に示す。約3μMで測定されたED50は、文献の基準と一致している。
【0123】
実施例14:正常なCHO細胞とHSPDE4A4B−GFP融合タンパク質を安定的に発現するCHO細胞におけるロリプラム処理の作用の比較
PDE4阻害剤のロリプラムは、実施例3に記載のPDE4A4に対する融合体でトランスフェクトした細胞の細胞質中で、稠密なPDE4A4集合物の生成を刺激するために用いられる。そのような刺激を用いることに関して有り得る懸念は、PDE4酵素の基質である二次メッセンジャー分子cAMPのレベルが、ロリプラム処理細胞で望ましくないcAMP−依存性工程も活性化され得るような程度に、それらの細胞で増加する可能性があることである。cAMP−依存性エフェクタータンパク質の例には、PKAファミリーのキナーゼ、幾つかのイオンチャンネル及びcAMP−GEF1ならびに2のような、あるグアニンヌクレオチド変換因子が含まれる。この実施例は、ロリプラムでの処理が、融合タンパク質はホスホジエステラーゼ活性を有するが、HSPDE4A4B−GFPを発現するCHO細胞では細胞cAMPレベルを独力で増さないことを立証している。したがって、これらの細胞での望ましくないcAMP−依存性工程の活性化は、ロリプラムが、これらの細胞でPDE4A4の稠密な集合物の生成を刺激する際には、極めて見込みがない。
【0124】
HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現するCHO細胞(実施例2参照)及び非トランスフェクトCHO細胞を、1.2×105細胞/ウェルの密度で96−ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに接種し、グルタマクス、100μgのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ml−1及び種々の濃度のロリプラムを加えた10%FBSを有するHAM F−12培地で16〜18時間培養する。インキュベート後、Amarsham−Pharmacia Biotechの市販キット、キット♯RPA538を用い、製造元の指示にしたがってcAMP含量を測定する。
【0125】
アッセイキットの製造元が推奨するように、cAMP/ウェルの量を、cAMP標準曲線から回帰分析を用いて算出した。この実験の結果を図19に示す。正常な非トランスフェクトCHO細胞(◆)及びHSPDE4A4B−GFPを安定的に発現する細胞(■)の曲線は、いずれも0.03μM〜3μMのロリプラム処理の範囲に対し細胞cAMP濃度の際立った増加を示さない。10μMのロリプラムでの正常なCHO細胞の僅かなcAMP増加は、この濃度が公知のPDE4イソ型のロリプラムによる阻害について報告されているあらゆるIC50値よりも30〜300倍高いため、おそらく有意ではないであろう。
【0126】
別の実験で、非トランスフェクトCHO細胞及び安定的にHSPDE4A4B−GFPを発現するCHO細胞を、図19に記載のようにロリプラムを加えずに、但し種々の濃度のフォルスコリンを添加し、cAMPレベルの測定前に60分培養した。この実験の結果を図20に示す。正常な非トランスフェクトCHO細胞(◆)の曲線は、アデニレートシクラーゼ活性体に応じて予想される細胞cAMPの用量−依存増加を示す。HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現する細胞(■)は、0.3μM〜100μMのフォルスコリン処理の範囲に対し細胞cAMP濃度の際立った増加を示さない。この結果は、HSPDE4A4−GFP融合タンパク質が活性なホスホジエステラーゼ酵素であること、及び、その大きく増した発現は、試験範囲にわたるフォルスコリンによるアデニレートシクラーゼ活性化にも関わらず、これらの細胞でのあらゆるcAMP増加を効果的に妨げることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図1】
10%FBSを有するHAM’s F12培地で成育する、プローブHSPDE4A4−EGFP−N1で安定的にトランスフェクトされたCHO細胞を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン混合群由来のクローンである。GFP蛍光は、ほぼ均等に非−核細胞質に分布しており、この範囲内の暗領域は、おそらく、見かけ上プローブが除かれたミトコンドリアであろう。
【図2】
10%FBS及び2μMロリプラムを有するHAM’s F12培地で成育する、プローブHSPDE4A4−EGFP−N1で安定的にトランスフェクトされたCHO細胞を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン群から単離した単細胞に由来する。細胞を6.7時間ロリプラムで処理した。GFP蛍光は、95%以上の細胞の明スポットに集中している。
【図3】
HSPDE4A4−EGFPを発現するクローン細胞での3μMロリプラムに対するRP73401の用量反応。細胞を96−ウェルのPackard ViewPlateに接種し、約80%の集密まで3μMロリプラムと10%FBSを加えたHAM’s F12培地で生育させる。ロリプラム処理は、計16時間であった。種々の濃度のRP73401をロリプラム−含有ウェルに加え、さらに4時間インキュベートした。次いで、細胞を化学的に固定し、洗浄し、ヘキスト 33258で染色し、自動画像化を用いて各処理ウェルについて細胞当たりの平均スポットを計測した(全て実施例2に記載のとおり)。各ポイントは、同濃度のRP73401 で5個の処理ウェルから測定される細胞当たりの平均スポットの平均である。結果を4−パラメータのヒルプロット(Hill plot)に適合させ、3μMロリプラムによるスポット形成のRP73401での競合阻害に対する20nMのIC50数を出す。
【図4】
FIPRで測定される、HSPDE4A4−EGFPを発現するクローン細胞での1μMロリプラムに対するRP73401の用量反応。細胞を96−ウェルPackard ViewPlateに接種し、約80%の集密まで1μMロリプラムと10%FBSを加えたHAM’s F12培地で生育させる。ロリプラム処理は、計16時間であった。様々な濃度のRP73401をロリプラム−含有ウェルに加え、さらに4時間インキュベートした。次いで、細胞を同時にかつ化学的に固定し、浸透させ、洗浄し、そしてスポット形成をFLIPR装置で測定した(全て実施例2に記載のとおり)。スポット形成の程度(縦座標値)を、バックグラウンドシグナル(ロリプラム未処理細胞からの値)±標準偏差を含む未修正値として得る。
結果を4−パラメータのヒルプロットに適合させ、1μMロリプラムによるスポット形成のRP73401での競合阻害に対する約50nMのIC50数を出す。
【図5】
フォルスコリン処理した、ヒトcAMP−依存プロテインキナーゼ触媒サブユニットイソ型αのC末端へのEGFPの融合体である、HSPKAcat−EGFPを発現するCHO細胞の経時的画像。細胞は、10%FBSを加えたHAM’s F12培地で生育するクローン細胞系で、これにt=0時で1μMフォルスコリンを加えた。連続画像は、cAMPレベルがフォルスコリン処理の結果として細胞内で増すにつれて、蛍光タッグされたPKAの触媒サブユニットが、数分のあいだに鮮やかな集合物から細胞質にどのようにして再分布するかを示している。スケールバー=10μ。
【図6】
100nMPMAでの処理前(a)及び処理から5分後の、ヒトプロテインキナーゼCイソ型ガンマ由来cys1ドメインのC末端へのEGFPの融合体であるCys1−EGFPを発現するCHO細胞の経時的画像。細胞は、10%FBSを加えたHAM’s F12培地で生育するクローン細胞系である。100nM PMAでの処理から5分後(b)、蛍光タッグされたPKCガンマのCys1ドメインは、細胞質及び核から原形質膜に再分布する。
【図7】
C−末端をGFPでタッグしたPKCガンマのヒトイソ型のCys1ドメインを安定的に発現するCHOクローン細胞系を、96−ウェルのマイクロタイタープレート(Packard View−Plate)で培養した。KRW(実験緩衝液、NaCl 140、KCl 3.6、NaH2PO4 0.5、MgSO4 0.5、NaHCO3 2.0、CaCl2 1.5及びHEPES 10、D−グルコース 5(pH 7.4、1M NaOHで滴定)を(mMで)含む改質クレブス−リンゲル緩衝液)中で20分、事前にインキュベートした後、細胞プレートをFIPRに置く。続いて、1:3工程で10μM〜0.5nMの用量で得たホルボールエステルPMAを用いて細胞をFIPR装置上で刺激した。これは、PKCガンマ−Cys1が最初の1〜5分の刺激中にサイトゾル及び核の画分から原形質膜に移動するので、蛍光強度の縮小として定量できるタイプの再分布反応をこれらの細胞で生じる。図は、PMAでの刺激の最初の3分間に蓄積される蛍光変化(n=8)の平均(+SD)として用量反応を示す。8個のバックグラウンドトレースに基づくバックグラウンドトレースの控除によって全データをバックグラウンドに対して補正し、PMAの添加時を0に設定した。
【図8】
10%FBSを有するHAM’s F12培地で生育する、アンカープローブHSPDE4A4−SosA及び検出プローブhGrb2−EGFPで安定的に同時トランスフェクトされたCHO細胞(a)、及び10μMロリプラム処理後の同様の細胞(b)を示す共焦蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非−クローン混合群である。GFP−標識した検出プローブ(GFP蛍光)は、ロリプラム処理前(a)、核で僅かに高い濃度を有しながら、細胞一面に分布している。ロリプラム処理後(20時間;b)、クローン群中、幾つかの細胞は明瞭な明スポットを生じる。スポットの出現とロリプラムの必要性は、PDE4A4に予想されるように、これらの細胞でアンカープローブがロリプラムに反応すること(図2)、及び、GFP−標識した検出プローブがそれと結合しているに違いなことを示している。
【図9】
10μMのロリプラムで20時間処理した図8b と同一の細胞群(a)を、室温で75分10μM RP73401を用いてさらに処理する(b)。この処理は、HSPDE4A4−EGFPのロリプラム−誘導性スポットを分解し(図3及び4)、これらの細胞でGFP−明スポットに同一の作用を有する。これは、これらのスポットが、アンカープローブとGFP−標識した検出プローブとの相互作用の結果であることを立証している。
【図10】
HSPDE4A4−EGFPを発現するCHO細胞を、10μMロリプラムで20時間処理し、次いで化学的に固定し、HSPDE4A4酵素のユニークなC末端配列の一部と同一のペプチドに対して宿主のヒツジで生じる抗体を用いて免疫染色した。抗体は、Alexa 549接合性ロバ抗ヒツジ抗体(Molecular Probes Inc、Oregon、USA)を用いて検出される。この共焦顕微鏡写真対は、Alexa549蛍光で得られる画像(b)と比較した細胞中のEGFP蛍光の画像(a)を示している。GFPとAlexa 594の画像とに有意なブリード−スルー(bleed−through)蛍光が確実にないように、放射フィルター(a:515〜525nm帯域、b:590nm長−路)を選択する。これらの画像は、ロリプラム処理した同時トランスフェクト細胞で未標識HSPDE4A4−ベースのアンカープローブの存在を確認するのに有用な、EGFPタグを個々に要するHSPDE4A4の集合物をPDE4A4抗体を用いてどのようにして検出できるかを立証している。
【図11】
50μMフォルスコリン+500μM IBMXでの処理前(a)ならびに処理から10分後(b)のアンカープローブHSPKAcat−hGrb2及びGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermの双方を安定的に発現するCHO細胞。非刺激細胞で見られるPKAcat−EGFPの分布に典型的なGFP−鮮やかな集合物を有する3個の細胞が、(a)で明らかである(図5、t=0分)。フォルスコリン+IBMXによるこれらのスポットの分散、細胞でcAMPを増す処理は、アンカープローブのみがこうして増加したcAMPに反応できるため、GFP−標識した検出プローブが同時トランスフェクト細胞でアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している(図5)。
【図12】
100nM PMAでの処理前(a)及び処理から5分後(b)のアンカープローブCys1−hGrb2とGFP−標識した検出プローブEGFP−Sos−Ctermの双方を安定的に発現するCHO細胞。(a)の細胞の大多数は、かなり一般的な細胞質及び核の蛍光分布を有する。PMAでの処理で、原形質膜への蛍光の測定可能なシフトが引き起こされ、同様にしてCys1−EGFPがPMAに応じて再分布する(図6)。この結果は、アンカープローブのみがこうしてPMAに反応できるため、GFP−標識した検出プローブがアンカープローブと相互作用するに違いないことを示している。
【図13】
プローブHSPDE4A4−EGFPで安定的にトランスフェクトされたCHO細胞を示す共焦蛍光画像。画像を、強度を直接比較するため、同一の顕微鏡設定で記録する。トランスフェクト細胞は、単一親細胞由来のクローン群である。図13aでは、細胞は10%FBSを有するHAM’s F12培地のみで生育する;GFP蛍光は、各細胞の核周辺細胞質内の鮮やかな顆粒様スポットに限定される。図13bでは、図13aで見られるのと同様の細胞を2μMロリプラムで2時間処理した。GFP−明スポットの大多数はロリプラム処理中の全細胞で消失し、細胞質は一般に明るくなる。大きなスポットは、幾つかの細胞では消失しない。ロリプラムを洗い流すと、スポットは1.75時間以内に再形成する。
【図14】
図14は、ロリプラムに対するPDE4A1スポット分散の用量反応曲線を示す。種々の阻害剤の各濃度に対する細胞当たりのスポット数は4回の測定±semの平均であり、各測定はそれ自体100個以上の細胞から得た平均である。細胞を、様々な濃度のロリプラムと10%FBSを加えたHAM’s F12培地で7時間生育させる。次いで、細胞を4%のホルマリン緩衝液(pH 7)で15分間化学的に固定し、PBSで洗い、PBS中10μMのヘキスト33258で25℃で10分間染色し、そしてPBSで2回洗浄する。実施例2に記載のように自動画像を収集し、細胞当たりのスポット数を分析する。
【図15】
PDE4A4とヒト14−3−3βとのインフレーム融合タンパク質及びEGFPとヒトBADとのインフレーム融合タンパク質を発現するCHO細胞の刺激作用。著しいスポットの出現が、ロリプラムで刺激した細胞で観察される(左パネル)。抽出細胞は、スポット及び集合物に局在する蛍光を大部分保持するが、細胞質により一般的に分布している蛍光を失う。この非−アンカー蛍光は恐らく可動性で、それゆえ、その浸透により細胞から迅速に洗い流される。
【図16】
1ng/mlのII−1でのNFkB(p65)−EGFP融合体を発現するCHO細胞の刺激作用。サイトソルから核への著しい再分布が観察される(左パネル)。抽出細胞は、核由来の蛍光の大部分を保持するが、サイトソル由来の蛍光は失われる(右パネル)。
【図17】
トラップアッセイ(スポット):4A4−14−3−3b+eGFP−BAD
A:測定される完全な蛍光
B:図Aのデータに基づくシグナル/ノイズ割合。見られるように、最適なシグナル/ノイズ割合は、この場合、ホルマリン0.8%+トリトン−x 100 2%を用いて得られる。
【図18】
PKA移動を刺激するフォルスコリンの作用に対する用量反応。算出されるEC50=3.28uMフォルスコリン。
【図19】
HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現するCHO細胞(実施例2参照)及び非トランスフェクトCHO細胞を、96−ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェルに1.2×105細胞/ウェルの密度で接種し、グルタマクス、100μgのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ml−1及び様々な濃度のロリプラムを加えた10%FBSを有するHAM’s F12培地で16〜18時間培養する。インキュベート後、Amersham−Pharmacia Biotechの市販キット、kit♯RPA538を用い、製造元の指示に従ってcAMP含量を測定する。
アッセイキットの製造元によって推奨されるようにして、cAMP標準曲線から回帰分析を用いてcAMP/ウェルの量を算出した。正常な非トランスフェクトCHO細胞(◆)及びHSPDE4A4B−GFPを安定的に発現する細胞(■)の曲線は、いずれも0.03μM〜3μMのロリプラム処理の範囲に対し細胞cAMP濃度の際立った増加を示さない。10μMのロリプラムでの正常なCHO細胞の僅かなcAMP増加は、おそらく有意ではない。
【図20】
HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現するCHO細胞(実施例2参照)及び非トランスフェクトCHO細胞を、96−ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェルに1.2×105細胞/ウェルの密度で接種し、グルタマクス、100μgのペニシリン−ストレプトマイシン混合物ml−1及び10%FBSを有するHAM’s F12培地で16〜18時間培養する。16〜18時間培養後、細胞を様々な濃度のフォルスコリンを用いて60分処理する。
処理後、Amersham−Pharmacia Biotechの市販キット、kit♯RPA538を用い、製造元の指示に従ってcAMP含量を測定する。
cAMP/ウェルの量を、アッセイキットの製造元が推奨しているように、cAMP標準曲線から回帰分析を用いて算出した。
正常な非トランスフェクトCHO細胞(◆)の曲線は、このアデニレートシクラーゼ活性体に応じて予想される細胞cAMPの用量−依存増加を示す。HSPDE4A4B−GFPを安定的に発現する細胞(■)は、0.3μM〜100μMのフォルスコリン処理の範囲に対し細胞cAMP濃度の際立った増加を示さない。
【0127】
【表A】 【0128】
【表B】
Claims (28)
- (a) 第一の異種接合体が、検出基に接合される第一対象タンパク質からなり、
第二の異種接合体が、細胞内の内部構造に特異的に結合できるアンカータンパク質に接合される第二対象タンパク質からなる、
2つの異種接合体を含む細胞を準備し、
(b) 2つの対象タンパク質間の結合を示すアンカー−タンパク質の細胞内分布を模倣する検出基の細胞内分布を検出し、
(c) 化合物を用いて、また用いないで工程(b)を繰り返す工程からなり、
化合物を用いる、又は用いない検出基の細胞内分布の変化が、タンパク質相互作用調節化合物を示す、
化合物が細胞内タンパク質相互作用を調節するかどうかを検出する方法。 - 細胞内の内部構造物への特異的結合が、アンカー刺激の添加によって解消される請求項1に記載の方法。
- 特異的結合がフォルスコリンの添加によって解消され、アンカータンパク質がPKAである前記請求項に記載の方法。
- アンカータンパク質がPKAcatαである前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 特異的結合がロリプラムの添加によって解消され、アンカータンパク質がPDE4A1である前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 特異的結合がATPの添加で解消され、アンカータンパク質がPLC−デルタである前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 特異的結合がトリコスタチンA(TSA)の添加で解消され、アンカータンパク質がヒストンデアセチラーゼ5(HDAC5)である前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 細胞内の内部構造物への特異的結合が、独力で対象の細胞内のシグナル化活性を刺激又は阻害する見込みがほとんどないアンカー刺激によって誘導される前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 特異的結合がロリプラムの添加で誘導され、アンカータンパク質がPDE4A4である前記請求項のいずれかに記載の方法。
- アンカータンパク質がCys1ドメインである前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 検出基がGFPである前記請求項のいずれかに記載の方法。
- (a) 細胞成分に結合した発光団を含む細胞を、影響と、また影響なしに接触させ;
(b) 細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を工程(a)の細胞に加え;かつ
(c) 工程(b)の細胞由来の発光団から発せられる光を測定することからなり、
影響の存在、また不在で細胞から発せられる光強度の相違が、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性の相違を示す、影響によって引き起こされる細胞成分の可動性変化の測定方法。 - 可動性の変化が、可溶性の細胞質状態〜結合性の細胞質状態、又はその逆の変化である、前記請求項のいずれかに記載の細胞成分の可動性変化の測定方法。
- 可動性変化が、可溶性の細胞質状態〜成分が細胞膜に結合した状態、又はその逆の変化である、前記請求項のいずれかに記載の細胞成分の可動性変化の測定方法。
- 可動性変化が、可溶性の細胞質状態〜成分が核に結合しているか、又は導入されている状態、又はその逆の変化である、前記請求項のいずれかに記載の細胞成分の可動性変化の測定方法。
- 可動性変化が、結合性の細胞質状態〜成分が核に結合しているか、もしくは導入されている状態、又はその逆の変化である、前記請求項のいずれかに記載の細胞成分の可動性変化の測定方法。
- 影響が、化学物質である前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 発光団が、細胞に収容されるヌクレオチド配列によってエンコードされ、またこれから発現されるポリペプチドである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 発光団が、一方が発光性ポリペプチドからなり、他方が細胞成分からなる2つのポリペプチドそれぞれの少なくとも一部の融合体からなるハイブリッドポリペプチドである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 発光ポリペプチドが緑蛍光タンパク質(GFP)である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- GFPが、F64L突然変異を有するGFPである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- GFPが、F64L−GFP、F64L−Y66H−GFP、F64L−S65T−GFP、F64L−E222D−GFP及びEGFPからなる群から選択されるGFP変異体である前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 抽出緩衝液が、細胞固定剤としてホルマリンを含む前記請求項のいずれかに記載の細胞内再分布の測定方法。
- 抽出緩衝液が、細胞透過剤としてトリトンX−100からなる、前記請求項のいずれかに記載の細胞内再分布の測定方法。
- (a) 物質の影響に関連して再分布しうる、及び/又は物質の影響に関連して再分布しうる成分と結合し得る発光団を含む機械的に無傷な生細胞又は機械的に無傷な生細胞群を基準化合物と接触又はインキュベートし;
(b) (a)の細胞に似た細胞を基準化合物なしに接触又はインキュベートし;
(c) 細胞固定剤及び細胞透過剤からなる抽出緩衝液を、(a)及び(b)の細胞に加え;
(d) 発光団から発せられる光を測定し;
(e) 細胞固定剤と細胞透過剤を種々の濃度で有する抽出緩衝液を用いて工程(a)〜(d)を繰り返し;
(f) 工程(e)で試験される各抽出緩衝液について、(刺激細胞中の蛍光−非刺激細胞中の蛍光)/ 非刺激細胞中の蛍光×100%としてシグナル/ノイズ(s/n)割合を算出する工程からなり、
最適化された抽出緩衝液は、最も高いシグナル/ノイズ割合を伴う緩衝液である、抽出緩衝液の最適化方法。 - 細胞固定剤と細胞透過剤からなる抽出緩衝液。
- 抽出緩衝液が細胞固定剤としてホルマリンを含む前記請求項のいずれかに記載の抽出緩衝液。
- 抽出緩衝液が、細胞透過剤としてトリトン−Xを含む前記請求項のいずれかに記載の抽出緩衝液。
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