WO2024034543A1 - 多重抗原検出用抗体 - Google Patents

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WO2024034543A1
WO2024034543A1 PCT/JP2023/028634 JP2023028634W WO2024034543A1 WO 2024034543 A1 WO2024034543 A1 WO 2024034543A1 JP 2023028634 W JP2023028634 W JP 2023028634W WO 2024034543 A1 WO2024034543 A1 WO 2024034543A1
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WO
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amino acid
residue
antibody
acid residue
modification
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PCT/JP2023/028634
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English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 渡邊
章歳 宮本
千里 張
Original Assignee
国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present disclosure relates to modified antibodies that have a faster dissociation rate against antigens.
  • the present disclosure also relates to methods of controlling the dissociation rate of antibodies.
  • antibodies are analyzed to determine the presence or absence of the antigen, and the presence or absence of antibodies in tissues and cells. It is widely used as a means to visualize the localized state of substances that serve as antigens. In addition, when visualizing the presence or absence of antigens or the localization state of antigens, substances that directly or indirectly emit signals (e.g., fluorescent substances, chemiluminescent substances, enzymes that catalyze color reactions, etc.) may be used. Label the antibody.
  • signals e.g., fluorescent substances, chemiluminescent substances, enzymes that catalyze color reactions, etc.
  • Dissociation of the bond between antibodies and antigens used in the field of immunoassays is generally slow, with a half-life of several minutes to several hours. Therefore, in order to analyze various types of antigens in the same specimen, a combination of multiple types of labels is required, and in practice, it is said that analysis of up to about four types of multiple target molecules is possible. However, in order to perform multiple target analysis of more than four types, it is necessary to combine a plurality of different types of labels such as fluorescence, chemiluminescence, and enzyme coloring methods, which makes experimental operations complicated.
  • the recently developed image reconstruction method integrates an exchangeable single molecule localization method and realizes multiple super-resolution imaging.
  • Super-resolution microscopy based on such a single-molecule localization method exceeds the diffraction limit ( ⁇ 200 nm) of conventional optical microscopy, but the imaging accuracy of super-resolution microscopy is limited by the ability to detect labels in a limited resolution region. Limited by spatial interference of density.
  • fluorescently labeled antibodies fluorescent probes
  • an efficient image reconstruction method can be implemented (Patent Document 1).
  • the present inventors have discovered that there are certain rules regarding the amino acid sequences of antibodies that rapidly repeatedly bind and dissociate from antigens. In fact, when the present inventors artificially produce an antibody having an amino acid sequence that follows this rule, the antibody rapidly binds and binds to the antigen while maintaining antigen-binding specificity. We were able to confirm that it is possible to repeat the dissociation. The present inventors also discovered that the antibody can be suitably used in the field of immunochemical measurements such as IRIS.
  • the present disclosure broadly encompasses the subject matter of the embodiments set forth below, for example.
  • Item 1 A modified antibody, which A conserved amino acid residue present at the base of the complementarity determining region (CDR) loop structure (CDR loop base) of the antibody has been modified to another type of amino acid residue,
  • the conserved amino acid residue is at least one selected from the group consisting of tyrosine residue, phenylalanine residue, tryptophan residue, leucine residue, serine residue, valine residue, arginine residue, and threonine residue.
  • Item 2 The variant according to item 1, wherein the CDR loop base is located at the boundary between the CDR and the framework region (FR).
  • Item 3 The variant according to Item 1 or 2, wherein the conserved amino acid residue is not a cysteine residue, a proline residue, an alanine residue, or a glycine residue.
  • Item 4 The other types of amino acid residues are valine residues (limited to cases where the conserved amino acid residue before modification is other than valine residues), histidine residues, alanine residues, or glycine residues. The variant according to any one of items 1 to 3.
  • Item 5 The modified product according to any one of Items 1 to 4, wherein the number of the modified amino acid residues is 1 to 8.
  • the antibody is an immunoglobulin, or at least one antibody-binding fragment selected from the group consisting of Fab fragment, F(ab') 2 fragment, Fv fragment, scFv fragment, dAb fragment, Fd fragment, and nanobody. , the variant according to any one of items 1 to 5.
  • the antibody is an immunoglobulin or at least one antibody-binding fragment selected from the group consisting of Fab fragment, F(ab') 2 fragment, Fv fragment, scFv fragment, dAb fragment, and Fd fragment
  • the modification is a modification to at least one amino acid residue selected from the group consisting of the 27th, 28th, 32nd, 59th, and 102nd amino acid residues of the heavy chain variable region according to Chothia numbering, and/ or modification to at least one amino acid residue selected from the group consisting of the 26th, 32nd, 49th, and 96th amino acid residue of the light chain variable region according to Chothia numbering, according to any of Items 1 to 6. Variants described.
  • the antibody is a nanobody
  • the modification is a modification to at least one amino acid residue selected from the group consisting of the 27th, 28th, 32nd, 37th, 59th, and 102nd amino acid residue of the Nanobody according to Chothia numbering. 7.
  • the variant according to any one of 1 to 6.
  • the modification is a modification to at least one amino acid residue selected from the group consisting of Y27G, Y27A, F27G, F27A, T28A, S28A, Y32A, Y59A, Y59G, and Y102A of the heavy chain variable region according to Chothia numbering.
  • a modification to at least one amino acid residue selected from the group consisting of Y32A, Y49A, and Y96A in the light chain variable region according to Chothia numbering is a modification to at least one amino acid residue selected from the group consisting of Y27G, Y27A, F27G, F27A, T28A, S28A, Y32A, Y59A, Y59G, and Y102A of the heavy chain variable region according to Chothia numbering.
  • Item 10 wherein the modification is a modification to at least one amino acid residue selected from the group consisting of V27G, S27G, R27G, T28A, Y32A, Y37A, F37A, Y59A, and Y102A of the nanobody in Chothia numbering. Variants described.
  • Item 11 A polynucleotide encoding the variant according to any one of Items 1 to 10.
  • Item 12 A cell retaining the polynucleotide according to item 11.
  • Item 13 A method for producing the variant according to any one of Items 1 to 10, which comprises the step of culturing the cell according to Item 12.
  • CDR loop base CDR loop base 1.
  • a method for controlling the dissociation rate of an antibody against an antigen comprising the step of introducing a mutation into at least one amino acid residue selected from the group consisting of a threonine residue and a threonine residue.
  • the modified antibody of the present disclosure maintains the specificity for the antigen of the antibody before modification, and has a high dissociation rate for the antigen.
  • This variant can be particularly effectively utilized for multiplex analysis in the field of immunochemical measurements.
  • the variant can be suitably used in the IRIS method.
  • the antibody variants produced in this way can be easily applied to automation in multiplex detection of target molecules.
  • Figure 1 shows the results of extracting the sequences of 169 types of antibodies published on the Protein Structure Data Bank and analyzing the frequency of amino acid appearances.
  • the upper row of the horizontal axis shows the amino acid number according to Chothia classification, and the vertical axis shows the frequency of appearance of each amino acid. Blue and red backgrounds represent low and high frequencies, respectively.
  • Figure 2a shows the results of extracting the sequences of 100 types of nanobodies published on the protein structure data bank and analyzing the frequency of appearance of amino acids.
  • the upper row of the horizontal axis shows the amino acid number according to Chothia classification
  • the vertical axis shows the frequency of appearance of each amino acid. Blue and red backgrounds represent low and high frequencies, respectively.
  • FIG. 3 shows the results of Example 3.
  • (a) shows a super-resolution image of FLAG-actin expressed in XTC cells using 1 nM 2H8 H1L3 as a probe. Scale bar is 5 ⁇ m.
  • b is an enlarged image of a, scale bar is 500 nm.
  • the line shows a Gaussian fit with a half-width of 45 nm. Error bars are SD.
  • d represents the cross-sectional profile of the two actin bundles between the arrows in b.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Example 4. a shows single molecule imaging of six epitope-tagged proteins expressed in XTC cells.
  • Scale bar is 10 ⁇ m.
  • b is 80000 frames (V5-actinin), 100000 frames (F-actin), 60000 frames (FLAG-vinculin), 60000 frames (TARGET-paxillin), 60000 frames (ALFA-zyxin), 24000 frames (H2Bb-S)
  • This is a super-resolution image reconstructed from single molecule images of 160,000 frames (HA-MRLC).
  • Scale bar is 5 ⁇ m.
  • c is a super-resolution image showing six epitope-tagged proteins and endogenous F-actin in XTC cells in seven colors. Scale bar is 5 ⁇ m.
  • d is an enlarged image of areas A and B surrounded by the frame of c. The scale bar indicates 1 ⁇ m.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of Example 5.
  • a shows sequential single molecule imaging of endogenous neuronal proteins. Images were acquired using 1 nM Lifeact, 2 nM NV-Nb9 H4 , 2 nM wild-type L8/15 Fv-EGFP, and 1 nM HS69 H3 with exposure times of 50 ms, 100 ms, 200 ms, and 300 ms, respectively. Between successive probe irradiations, there were eight washes with PBS.
  • Scale bar is 15 ⁇ m.
  • b shows super-resolution images of F-actin (Lifeact), VGLUT, Snapin, and Homer, respectively, in primary cultured neurons reconstructed from 72,720 frames of single-molecule images in a. An overall image of neurons was obtained using overexpressed mCherry using epifluorescence.
  • Scale bar is 10 ⁇ m.
  • c is multiplex imaging obtained by combining the four super-resolution images of b.
  • d is an enlarged image of area C surrounded by the frame c.
  • Scale bar is 2 ⁇ m.
  • e and f are enlarged images of boxed synapses A and B in c. The yellow and cyan dotted lines indicate the shape of the spine and the position of the homer, respectively.
  • Scale bar is 500 nm. g is an enlarged image of the box area of d. A small Homeron cluster ( ⁇ 0.1 ⁇ m) is indicated by a white arrow in the figure on the right and labeled 155. Only clusters of VGLUT (magenta color) and Homer (cyan color) are shown in the right figure. Calibration bars indicate the number of labels within each pixel (13.5 nm long). The scale bar on the left panel is 500 nm and the scale bar on the right panel is 200 nm.
  • the amino acid numbers of antibodies were improved based on Kabat numbering proposed based on the conservation of primary structure (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed, NIH 1991) and the three-dimensional structure of antibodies.
  • the Chothia numbering (Chothia et al., 1989: Nature 342, 877-883.) is commonly used.
  • the numbering of the amino acid sequences of the antibodies described herein uses Chothia numbering, which is known to accurately indicate the positions of amino acid residues in CDR loops, and the CDRs and FRs defined therein.
  • conserved amino acid residues present at the base of the CDR loop structure (CDR loop base) of the antibody are modified to other types of amino acid residues.
  • Other types of amino acid residues mean amino acid residues different from conserved amino acids, and are appropriately selected from 20 types of amino acid residues controlled by codons that are constituent components of proteins.
  • the base of the antibody's CDR loop itself does not correspond to a site that constitutes the contact surface with the antigen. In many cases, even if it is included in the contact surface, it is often located outside the contact surface. Therefore, when the amino acid residue present at the base of the CDR loop is modified to another type of amino acid residue as in the antibody variant of the present disclosure, the position of the amino acid residue on the antigen contact surface in the antibody variant Since there is little possibility of major changes in the structure of the contact surface, it is presumed that the antibody variant tends to maintain its specificity for the antigen.
  • amino acid residues present at the base of the CDR loops are modified to other types of amino acid residues, important functions other than antigen specificity in modified antibodies, specifically, It is presumed that the affinity between the variant and the antigen tends to be affected.
  • the half-life of binding to the antigen due to dissociation is 180 seconds or less, preferably about 120 seconds or less, and more preferably about 60 seconds or less.
  • the antigen is the same as the antigen of the antibody before modification.
  • binding half-life of 180 seconds or less has the same meaning as a dissociation rate of 0.00055 s -1 and a binding half-life of 180 seconds or less.
  • the dissociation constant for the antigen in the modified product of the present disclosure can also be specified as a change rate from the dissociation constant for the antigen before modification.
  • a ratio can usually be about 2 times, preferably about 10 times, and more preferably about 50 times. That is, the dissociation constant for the antigen of the modified antibody of the present disclosure is increased by 2 times, preferably 10 times, more preferably 50 times, as compared to the dissociation constant for the antigen of the antibody before modification.
  • CDR loop base is not particularly limited as long as it is near the CDR loop, but includes, for example, a region near the boundary between a CDR and a framework region (FR), a region that can be determined from the steric structure to be located near the CDR loop, etc. be able to. Among these, it is preferable to set it near the boundary between CDR and FR.
  • the boundary between CDR and FR can be the boundary proposed in the Chothia document mentioned above, and the vicinity of the boundary can be a range of 1 to 3 amino acids from the boundary.
  • the specific amino acid residue at the base of the CDR loop described above is not particularly limited.
  • the 27th to 29th, 32nd to 37th, 56th to 59th, and 102nd to 104th amino acid residues in the case of a light chain variable region, the 24th, 25th, 32nd to 35th, 48th, 49th, 53rd, 54th, 89th, 90th, 96th to 98th amino acid residue, or in the case of a minibody, 27th to 29th, 32nd to 37th, Examples include amino acid residues 56th to 59th and 102nd to 104th. Note that cysteine residues present before position 102 in the heavy chain variable region are excluded from the CDR loop base.
  • the method for measuring the dissociation rate described above can be widely adopted from known methods and is not particularly limited. Examples of such measurement methods include biolayer interferometry (BLI), surface plasmon resonance (SPR), and a method using a single molecule microscope.
  • a preferred measurement method is one using a single molecule microscope. A specific method using a single molecule microscope can be easily carried out with reference to the equipment and methods described in Examples below. Moreover, the method described in Patent Document 1 can also be adopted.
  • the "conserved amino acid residue” referred to herein is specified as follows. 1. Amino acid numbers in the amino acid sequences of multiple types of antibodies are numbered by Chothia's method. 2. Based on the above amino acid numbering, the amino acid sequences of multiple types of antibodies are aligned by a conventional method. 3. Calculate the frequency of appearance of amino acid residues at each amino acid number. 4. The amino acid numbers of antibodies in which the frequency of occurrence of a specific type of amino acid residue is 20 to 100% are defined as "positions where amino acid residues are conserved", and the amino acid residues that appear at the above-mentioned frequency at the relevant positions are "Conserved amino acid residues".
  • the amino acid sequences of the plurality of types of antibodies mentioned above include, for example, the amino acid sequences of antibodies arbitrarily extracted from the Protein Structure Data Bank (PDB; https://www.rcsb.org/). Can be done.
  • the type of antibody amino acid sequence arbitrarily extracted from the protein structure data bank is not particularly limited.
  • the number can be about 20 or more, preferably about 50 or more, more preferably about 100 or more, and most preferably about 150 or more. .
  • the frequency of appearance of the above-mentioned amino acid residues is not particularly limited as long as the effect is exerted, and is usually about 20 to 100%, preferably about 50 to 100%, more preferably about 70 to 100%, Most preferably it is about 90 to 100%.
  • conserved amino acid residues present at the base of the CDR loop are cysteine residues, proline residues, alanine residues, or glycine residues, these amino acid residues cannot be replaced with other types of amino acid residues. It is preferable not to modify it.
  • cysteine residues may play an important role in determining the three-dimensional structure of antibodies by forming SS bonds with other cysteine residues contained in antibodies; If the conserved cysteine residue present in the antibody is modified to another type of amino acid residue, the modified antibody's three-dimensional structure may change, leading to a decrease in specificity for the antigen. Therefore, it is preferable not to modify the cysteine residue to other types of amino acid residues.
  • proline residue is the only cyclic amino acid among the 20 types of amino acids controlled by codons that are constituent components of proteins, and is assumed to have a special function. Therefore, from the viewpoint of preventing loss of the special function of the proline residue, it is preferable not to modify the conserved proline residue present at the base of the CDR loop to another type of amino acid residue.
  • alanine residues and glycine residues have small side chains, from the viewpoint of achieving a half-life of binding to an antigen by dissociation of 60 seconds or less in the modified antibody of the present disclosure, conserved alanine residues present at the base of the CDR loops are used. It is preferred not to modify any of the groups and glycine residues to other types of amino acid residues.
  • the antibody in the modified antibody of the present disclosure is not particularly limited as long as it is a molecule that specifically binds to an antigen.
  • examples of such antibodies include immunoglobulins, antigen-binding fragments, and the like.
  • the subtype of the immunoglobulin described above is not particularly limited as long as it exhibits an effect, and examples thereof include IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • antigen-binding fragment is not particularly limited as long as it is a molecule that retains the ability to specifically interact with an epitope of an antigen and has the specific antigen-binding action exerted by the antibody before fragmentation.
  • antigen-binding fragments include, for example, Fab fragments, F(ab') 2 fragments, Fd fragments consisting of VH and CH1 domains, Fv fragments consisting of VL and VH domains of a single arm of an antibody, dAbs consisting of VH domains. Fragments, nanobodies, etc. can be mentioned.
  • amino acid residues to be modified to other amino acid residues include tyrosine residues, phenylalanine residues, tryptophan residues, leucine residues, and serine residues. group, a valine residue, an arginine residue, and a threonine residue.
  • Tyrosine residues have side chains that form multiple interactions such as hydrogen bonds, ⁇ - ⁇ interactions, and CH/ ⁇ interactions with alkyl groups. Therefore, the antibody variants of the present disclosure in which tyrosine residues are modified to other types of amino acid residues exhibit the above effects by appropriately changing the affinity for antigens.
  • Phenylalanine residues, tryptophan residues, and leucine residues have hydrophobic side chains with relatively large three-dimensional structures. Therefore, the modified antibody of the present disclosure, in which any of these amino acid residues is modified to other types of amino acid residues, can achieve the above effects by appropriately changing the affinity for the antigen. Demonstrate.
  • threonine residues and serine residues are frequently applied at the same position at the base of CDR loops, and are presumed to play an important role in antibodies. Therefore, the modified antibody of the present disclosure in which either the threonine residue or the serine residue is modified to another type of amino acid residue may cause a moderate change in the affinity for the antigen. This achieves the above effects.
  • ⁇ -sheets are known to be involved in the overall structure formation of antibodies. Therefore, if the amino acid residues constituting the ⁇ -sheet are modified to other types of amino acid residues, the specificity of the modified antibody for the antigen may decrease, so it is preferable not to make such modifications. .
  • the number of amino acid residue modifications to the antibody in the antibody variant of the present disclosure is not particularly limited as long as the effect is exerted, and can be, for example, 1 to 8. In view of further exerting the effect, the number is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4, and most preferably 1 to 3.
  • the antibody in the modified antibody of the present disclosure is a Fab fragment, F(ab') 2 fragment, Fv fragment, scFv fragment, dAb fragment, or Fd fragment having a heavy chain variable region and/or a light chain variable region.
  • Amino acid residues to be modified in the heavy chain variable region in a certain case are not particularly limited as long as the effect is exerted.
  • any one or more of the 27th, 28th, 32nd, 59th, and 102nd amino acid residues of the heavy chain variable region can be cited as the amino acid residue to be mutated, and among them, the 27th, 28th Any one or more of the amino acid residues at the 27th, 28th, and 59th positions are preferred, more preferably any one or more of the 27th, 28th, and 59th amino acid residues, and even more preferably the 28th and 59th amino acid residues. It is any one or more of the 59th amino acid residue, most preferably the 59th amino acid residue.
  • the antibody in the modified antibody of the present disclosure is any one of a Fab fragment, F(ab') 2 fragment, Fv fragment, scFv fragment, dAb fragment, and Fd fragment having a heavy chain variable region and/or a light chain variable region.
  • the amino acid residues to be modified in the light chain variable region are not particularly limited as long as they are effective.
  • any one or more of the 26th, 32nd, 49th, and 96th amino acid residues of the light chain variable region can be mentioned, and among them, the 32nd, 49th, and 96th amino acid residues can be mentioned.
  • Any one or more of the residues is preferred, more preferably any one or more of the 32nd and 49th amino acid residues, and most preferably the 49th amino acid residue.
  • the amino acid residues to be modified are not particularly limited as long as they are effective.
  • any one or more of the 27th, 28th, 32nd, 37th, 59th, and 102nd amino acid residues can be mentioned, and among them, the 27th, 28th, 32nd, 37th
  • any one or more of the amino acid residues at the 27th, 28th, 37th, and 59th amino acid residues are preferred, more preferably any one or more of the 27th, 28th, 37th, and 59th amino acid residues, and even more preferably the 28th and 37th amino acid residues.
  • the 59th amino acid residue even more preferably any one or more of the 37th and 59th amino acid residues, and most preferably the 37th amino acid residue.
  • the other amino acid residues mentioned above are not particularly limited as long as they are effective; for example, in order to prevent antibody specificity from changing due to modification, the other amino acid residues are valine residues, histidine residues, alanine residues, or glycine residues. It is preferable to use it as a base. Among these, alanine residues or glycine residues are more preferable.
  • the antibody in the modified antibody of the present disclosure is any of Fab fragments, F(ab') 2 fragments, Fv fragments, scFv fragments, dAb fragments, and Fd fragments having a heavy chain variable region and/or a light chain variable region.
  • Modifications to the heavy chain variable region in this case are not particularly limited as long as they are effective. For example, modification of any one or more of Y27G, Y27A, F27G, F27A, T28A, S28A, Y32A, Y59A, Y59G, and Y102A can be mentioned.
  • the antibody in the modified antibody of the present disclosure is any of Fab fragments, F(ab') 2 fragments, Fv fragments, scFv fragments, dAb fragments, and Fd fragments having a heavy chain variable region and/or a light chain variable region.
  • modifications to the light chain variable region are not particularly limited as long as they are effective. For example, modification of any one or more of Y32A, Y49A, and Y96A can be mentioned.
  • the modification is not particularly limited as long as it is effective.
  • modification of any one or more of V27G, S27G, R27G, T28A, Y32A, Y37A, F37A, Y59A, and Y102A can be mentioned.
  • At least one of E53A, R60A, and V99A can be modified as an amino acid residue modification to the nanobody.
  • the antibody in the modified antibody of the present disclosure may be derived from a human or a non-human animal.
  • Non-human animals are not particularly limited as long as they are effective, and include, for example, rabbits, mice, rats, sheep, goats, cows, horses, guinea pigs, monkeys, dogs, cats, hamsters, chickens, etc. .
  • the antibody in the modified antibody of the present disclosure may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody. Such monoclonal antibodies can also be chimeric antibodies. Moreover, the above-mentioned antibody may have bispecificity.
  • the antigen of the antibody in the modified antibody of the present disclosure is not particularly limited as long as it exhibits an effect, and can be any target molecule that is desired to be analyzed.
  • epitope tags frequently used in immunochemical measurements can be mentioned.
  • the epitope tag can be appropriately selected from widely known tags, and includes, for example, V5 tag, FLAG tag, TARGET tag, HA tag, S tag, ALFA tag, HIS tag, Myc tag, and the like.
  • such antibodies may be labeled with a substance that directly or indirectly emits a signal, such as a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or an enzyme that catalyzes a color reaction.
  • the most preferred embodiment of the above antibody includes an antibody comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 19, 20, 22, 24, or 26.
  • Polynucleotides of the present disclosure encode antibody variants in the antibody variants of the present disclosure described above.
  • the type of polynucleotide is not particularly limited, and may be, for example, DNA, RNA, peptide nucleic acid, or a combination thereof.
  • the chain form of the polynucleotide is not particularly limited, and examples thereof include single-strand, double-strand, triple-strand, quadruple-strand, plasmid, and the like.
  • the cell of the present disclosure retains the above polynucleotide. In particular, it is preferable that the cell of the present disclosure stably retains the polynucleotide within the cell.
  • the type of cell is not particularly limited, and for example, host cells widely known in the field of antibody production are preferably used.
  • host cells include mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast cells, and microbial cells.
  • the method for producing a variant antibody of the present disclosure includes the step of culturing the cells described above.
  • a specific cell culture method can be carried out by suitably employing widely known culture media, temperature, pH, time, additives, etc. when producing antibodies.
  • the modified antibody of the present disclosure can be recovered from the intracellular or extracellular medium. The modified antibody thus recovered can be subjected to known purification steps as appropriate.
  • the method of controlling the dissociation rate of antibodies against antigens of the present disclosure includes the use of conserved tyrosine residues present at the base of complementarity determining region (CDR) loop structures (CDR loop bases). , phenylalanine residue, tryptophan residue, leucine residue, serine residue, valine residue, arginine residue, and threonine residue.
  • CDR complementarity determining region
  • the antibody whose dissociation rate is controlled is similar to the antibody described above. Furthermore, a method for confirming whether or not the dissociation rate has been controlled can be confirmed in accordance with the method for measuring the dissociation rate explained for the above-mentioned antibodies.
  • Example 1 Figure 1 shows the results of extracting the sequences of antibodies (169 types: Table 1) published on the Protein Data Bank (PDB, Berman et al., 2003) and analyzing the appearance frequency of amino acids. show.
  • Anti-TARGET tag antibody (clone name: P20.1), anti-HA tag antibody (clone name: 12CA5), anti-FLAG antibody (clone name: 2H8), anti-V5 tag (clone name: V302A), and anti-S tag (clone name) :S66B) were prepared by introducing the above mutations into the five types of Fv-EGFP. Specifically, various mutants shown in Table 2 below (P20.1 clone: 4 types, 12CA5 clone: 11 types, 2H8 clone: 8 types, V302A clone: 9 types, 66B clone: 2 types) were introduced into WO2018/ 088403.
  • the heavy chain amino acid sequence of the WT (wild type) P20.1 clone is shown in SEQ ID NO: 1, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the heavy chain amino acid sequence of the P20.1 mutant whose mutant code is H1L0 is shown in SEQ ID NO: 3, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the WT heavy chain amino acid sequence of the 12CA5 clone is shown in SEQ ID NO: 5, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the heavy chain amino acid sequence of the mutant 12CA5 whose mutant code is H6L2 is shown in SEQ ID NO: 7, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain amino acid sequence of the WT clone of 2H8 is shown in SEQ ID NO: 9, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the heavy chain amino acid sequence of the 2H8 mutant whose mutant code is H1L3 is shown in SEQ ID NO: 11, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the WT heavy chain amino acid sequence of the V302A clone is shown in SEQ ID NO: 13, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the heavy chain amino acid sequence of the mutant V302A with the mutant code H2L1 is shown in SEQ ID NO: 15, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the WT heavy chain amino acid sequence of the S66B clone is shown in SEQ ID NO: 17, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the heavy chain amino acid sequence of the S66B mutant whose mutant code is H1L0 is shown in SEQ ID NO: 19, and its light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20.
  • a plasmid containing DNA encoding the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 20 above was introduced into HEK293 cells, and various wild type and mutant Fv-EGFP were collected from the culture supernatant and then purified.
  • the dissociation constants of these various antibodies and their mutants were measured by the following method.
  • XTC cells expressing actin fused with various epitope tags were prepared as measurement cells. The cells were spread for 1 hour on coverslips coated with 100 ⁇ g/ml poly-L-lysine (Sigma) and 10 ⁇ g/ml fibronectin (Sigma) to ensure the formation of flat lamellar podia and lamellae. Then, 3.7% PFA in cytoskeleton buffer (10mM MES, 90mM KCl, 3mM MgCl2 , 2mM EGTA, pH 6.1) containing 0.5% Triton-X100 (Nacalai Tesque) for 20 min.
  • cytoskeleton buffer 10mM MES, 90mM KCl, 3mM MgCl2 , 2mM EGTA, pH 6.1
  • HEPES-KCl-Tx buffer (10mM HEPES-KOH, 90mM KCl, 3mM MgCl 2 , 0.1mM dithiothreitol, 0.2% Triton-X100, pH 7.2) and deoxidized.
  • various epitope tags at 0.05 to 0.1 nM. was applied to XTC cells expressing actin fused to XTC cells.
  • time-lapse imaging of single molecules of various antibodies or their variants bound to XTC cells expressing actin fused with various epitope tags was performed using IX3-ZDC2 Z-drift compensator (Olympus), UPlans Apo 100, 1.40 NA oil.
  • Olympus equipped with objective Olympus
  • Evolve512 EMCCD camera Roper Scientific
  • Cobolt Blues 50mW laser 488nm; Cobolt
  • Bound antibody fragments in the first frame of the time-lapse stack were tracked by the python program (https://github.com/takushim/tanitracer).
  • the dissociation constant of WT was 0.00621
  • the 28th threonine in the heavy chain was changed to alanine (HT28A)
  • the tyrosine at 32nd position in the heavy chain was changed to alanine (HY32A)
  • the 49th tyrosine in the heavy chain was changed to alanine (HY32A).
  • H6L2 the dissociation constant of the mutant in which the th tyrosine was replaced with alanine
  • LY49A was 0.601, which was about 100 times higher than before the mutation was introduced.
  • the dissociation constant of WT was 0.00803
  • the 28th serine in the heavy chain was replaced with alanine (HS28A)
  • the 96th tyrosine in the light chain was replaced with alanine (LY96A). It was revealed that the dissociation constant of the mutated mutant (H1L3) was 0.407, which is about 50 times higher than before the mutation was introduced.
  • the WT dissociation constant was 0.0322, whereas the 27th tyrosine in the heavy chain was replaced with glycine (HY28G), and the 32nd tyrosine in the light chain was replaced with alanine (LY32A). It was revealed that the dissociation constant of the mutated mutant (H2L1) was 0.567, which is about 20 times higher than before the mutation was introduced.
  • the WT dissociation constant was 0.139
  • the dissociation constant of the mutant (H1L0) in which the 28th serine in the heavy chain was replaced with alanine (HS28A) was 0.276.
  • Example 2 As in Example 1, the sequences of nanobodies (100 types: Table 2) published on the PDB were extracted, and the frequency of appearance of amino acids was analyzed. The results are shown in FIG. 2.
  • the 37th amino acid residue (Nb37) near CDR1 is a conserved site occupied by F (phenylalanine) or Y (tyrosine) and is different from the corresponding position in VH. Therefore, the 27th amino acid residue (Nb27), the 28th amino acid residue (Nb28), the 32nd amino acid residue (Nb32), the 59th amino acid residue (Nb59), and the 102nd amino acid residue of the nanobody
  • the 37th amino acid residue (Nb37) was used as the mutation introduction site of the nanobody, and mutants were created in which these amino acid residues were appropriately replaced with glycine or alanine.
  • Fv-EGFP of anti-ALTA tag antibody (clone name: NbALFA) was produced.
  • three types of Fv-EGFP, an antibody whose antigen is Hommr expressed in nerve cells (anti-Hommer antibody; clone name: HS69) and an antibody whose antigen is VGLUT (anti-VGLUT antibody; clone name NV-Nb9) , we created one with the above mutations introduced.
  • various mutants shown in Table 2 below (NbALFA clones: 2 types, HS69 clones: 5 types, NV-Nb9 clones: 4 types) were produced by the method described in WO2018/088403.
  • the WT amino acid sequence of the NbALFA clone is shown in SEQ ID NO: 21.
  • the heavy chain amino acid sequence of the mutant NbALFA whose mutant code is H2 is shown in SEQ ID NO: 22.
  • the WT amino acid sequence of the HS69 clone is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the heavy chain amino acid sequence of the mutant HS69 whose mutant code is H3 is shown in SEQ ID NO: 24.
  • the WT amino acid sequence of the NV-Nb9 clone is shown in SEQ ID NO:25.
  • the heavy chain amino acid sequence of the mutant of NV-Nb9 whose mutant code is H4 is shown in SEQ ID NO: 26.
  • the dissociation constants of the nanobodies and variants thereof prepared by the above method were measured in the same manner as in Example 1. However, for calculating the dissociation constant of the NbALFA clone, XTC cells expressing actin fused with an ALFA tag were used, and for calculating the dissociation constant of the HS69 clone, CTC cells overexpressing mCherry-Hommer1 and NV-Nb9 were used. CTC cells overexpressing mCherry-VGLUT1 were used to calculate the clonal dissociation constant. The results are shown in Table 4.
  • the dissociation constant of WT was 0.000897, whereas the 27th serine was changed to glycine (S27G), the 28th threonine was changed to alanine (T28A), and the 37th phenylalanine was changed to alanine (F37A). ), and the mutant (H3) in which the 59th tyrosine was replaced with alanine (Y59A) had a dissociation constant of 0.0971, which was found to be about 100 times higher than before the mutation.
  • the dissociation constant of WT was 0.00164, whereas the 27th arginine was changed to glycine (R27G), the 28th threonine was changed to alanine (T28A), and the 32nd tyrosine was changed to alanine. (Y32A), the 37th phenylalanine is replaced with alanine (F37A), and the 102nd tyrosine is replaced with alanine (Y5102).
  • the dissociation constant of the mutant (H4) is 0.0923, which is higher than before the mutation was introduced. It was revealed that the increase was approximately 50 times.
  • Example 3 Experiments were conducted to determine whether the various mutants produced above were effective as IRIS probes (tags).
  • XTC cells expressing actin fused with various tags (TARGET tag, HA tag, FLAG tag, V5 tag, S tag, and ALFA tag) were prepared. The cells were fixed with PFA and then subjected to blocking treatment. Thereafter, the various antibody variants produced in Examples 1 and 2 were allowed to act, to produce samples for IRIS observation. This sample was observed under the inverted microscope used when measuring the dissociation constant. The results are shown in FIG.
  • Example 4 Experiments were conducted to confirm whether the various mutants produced above can be multiple-stained as IRIS probes. Specifically, V5-actinin, FLAG-vinculin, HA-myosin regulatory light chain2 (HA-MRLC), TARGET-paxillin, ALFA-zyxin and S-histone2B (S-H2Bb) were Overexpress in cells and sequentially After being subjected to fixation and blocking, the various mutants were treated with 2 nM V302A H2L1 , 0.5 nM Lifeact, 2 nM 2H8 H1L3 , 1.5 nM P20.1 H1L0 , 1 nM NbALFA H2 , 1 nM S66B H1L0 and 1 nM. Each image stack was acquired sequentially by applying 12CA 5H6L2 sequentially. Each variant was applied to the next sample after washing the previously used variant with PBS. The results are shown in Figure 4.
  • Example 5 Experiments were conducted to confirm whether the various mutants produced above have specificity for endogenous proteins as IRIS probes. Specifically, multiplex super-resolution imaging of primary cultured neurons was obtained using the nanobody variants (HS69 H3 and NV-Nb9 H4 probes) produced in Example 2. Next, the primary cultured neurons were subjected to prescribed fixation and blocking treatments, and then treated with 1 nM Lifeact, 2 nM NV-Nb9 H4 , 2 nM wild type L8/15 Fv-EGFP, and 1 nM HS69 H3 , respectively. Images were acquired with exposure times of 50ms, 100ms, 200ms and 300ms. Between successive probe irradiations, there were eight washes with PBS. The results are shown in FIG.
  • the above mutant was able to recognize target molecules in primary cultured neurons. Furthermore, as shown in FIGS. 5b and 5c, it was possible to obtain super-resolution images of F-actin (Lifeact), VGLUT, Snapin, and Homer in primary cultured neurons. As a result, we were able to clearly separate and observe presynaptic VGLUT, postsynaptic actin, and the scaffolding protein Homer (Fig. 5e). A small Homer cluster paired with the VGLUT was visualized with 155 labels by HS69 H3 and NV-Nb9 H4 (Fig. 5g). The staining pattern of the multiplexed image shown in FIG. 5 is more continuous than the image obtained with conventional techniques using PAINT35. As described above, the antibody mutant produced in Example 2 can be subjected to super-resolution analysis of multiple endogenous targets at a high labeling density.

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Abstract

抗体の改変体であって、 該抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ構造の基部（ＣＤＲループ基部）に存在する保存されたアミノ酸残基が他の種類のアミノ酸残基へ改変されており、 該保存されたアミノ酸残基が、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、セリン残基、バリン残基、アルギニン残基及びスレオニン残基からなる群より選択される少なくとも一種であり、 該抗体の改変体の抗原に対する解離による結合半減期が１８０秒以下である改変体 が提供される。

Description

多重抗原検出用抗体
　本開示は、抗原に対する解離速度が早い抗体の改変体に関する。また、本開示は、抗体の解離速度を制御する方法に関する。
　ウエスタンブロッティング法、免疫組織化学染色法、免疫細胞化学染色法、フローサイトメトリー法等に代表される免疫化学測定の分野において、抗体は、その抗原となる物質の存在の有無並びに組織及び細胞内での抗原となる物質の局在状態を可視化する手段等として広く利用されている。また、抗原の存在の有無又は抗原の局在状態を可視化する際には、直接的に又は間接的にシグナルを発する物質（例えば、蛍光物質、化学発光物質、発色反応を触媒する酵素等）で抗体を標識する。このようなシグナルの有無により、その抗体の存在の有無、ひいては抗体に結合している抗原の有無を観察することができ、結果として抗原の存在の有無並びに組織内及び細胞内での抗原の局在状態を可視化することが可能になる。
　免疫学的測定の分野で使用される抗体と抗原との結合の解離は、一般的に遅く、半減期として数分間から数時間である。そのため、多種の抗原を同一標本内で解析するためには、複数種の標識の組合せが必要となり、実践的には、４種類程度までの多重標的分子の解析が可能であるとされている。しかしながら、４種類を超える多重標的解析するためには、蛍光、化学発光、酵素発色法等の異なる複数種の標識を組み合わせる必要があり、実験操作が煩雑となる。
　このように、実験操作が煩雑になるにつれて、技能に長けた研究者による操作が必要となり、当該実験操作を自動化することも困難である。また、解析対象の組織や細胞等のサンプルを固定操作に供する必要がある場合、サンプルが劣化してしまうといった問題も生じ、サンプルの劣化前にシグナル検出を済ませることを要求されるので、シグナルの検出間隔を早める必要がある等といった問題点も生じる。
　近年、開発された画像再構成法（ＩＲＩＳ）は、交換可能な一分子局在法を統合したものであり、多重超解像イメージングを実現する。このような一分子局在法に基づく超解像顕微鏡は、従来の光学顕微鏡の回折限界（～２００ｎｍ）を超えるものであるが、超解像顕微鏡のイメージング精度は、限られた分解領域における標識密度の空間的干渉によって制限されている。この空間的干渉による制限を乗り越えるために、抗原に対して迅速に結合及び解離を繰り返す蛍光標識化抗体（蛍光プローブ）を用いることにより、高密度での蛍光標識化抗体によるラベリングが可能になり、ひいては、効率的な画像再構成法を実施することができる（特許文献１）。
ＷＯ２０１６／１４３９００
　上記特許文献１に記載の方法で用いている抗原に対して迅速に結合及び解離を繰り返す蛍光標識化抗体（蛍光プローブ）を簡便に製造することは、困難であるといった問題がある。
　本発明者らは、抗原に対して迅速に結合及び解離を繰り返す抗体のアミノ酸配列について一定の法則性があることを見出した。実際に、本発明者らは、この法則性に従ったアミノ酸配列を有する抗体を人為的に製造すると、その抗体は、抗原への結合特異性を維持したまま、抗原に対して迅速に結合及び解離を繰り返すことが可能であることを確認することができた。また、本発明者らは、ＩＲＩＳ等の免疫化学測定の分野に当該抗体を好適に使用できることも見出した。本開示は、例えば下記に示す態様の主題を広く包含する。
項１　抗体の改変体であって、
　該抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ構造の基部（ＣＤＲループ基部）に存在する保存されたアミノ酸残基が他の種類のアミノ酸残基に改変されており、
該保存されたアミノ酸残基が、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、セリン残基、バリン残基、アルギニン残基及びスレオニン残基からなる群より選択される少なくとも一種であり、
　該抗体の改変体の抗原に対する解離による結合半減期が１８０秒以下である改変体。
項２　上記ＣＤＲループ基部が、ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）との境界に位置する、項１に記載の改変体。
項３　前記保存されたアミノ酸残基が、システイン残基、プロリン残基、アラニン残基及びグリシン残基ではない、項１又は２に記載の改変体。
項４　前記他の種類のアミノ酸残基が、バリン残基（ただし、改変前の保存されたアミノ酸残基がバリン残基以外の場合に限る）、ヒスチジン残基、アラニン残基又はグリシン残基である項１～３の何れかに記載の改変体。
項５　前記改変されたアミノ酸残基の個数が１～８個である、項１～４の何れかに記載の改変体。
項６　前記抗体が、イムノグロブリン、又はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆｄ断片及びナノボディーからなる群より選択される少なくとも一種の抗体結合断片である、項１～５の何れかに記載の改変体。
項７　前記抗体が、イムノグロブリン、又はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片及びＦｄ断片からなる群より選択される少なくとも一種の抗体結合断片であって、
前記改変が、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおける重鎖可変領域の２７番目、２８番目、３２番目、５９番目及び１０２番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変であり、及び／又は
Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおける軽鎖可変領域の２６番目、３２番目、４９番目及び９６番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変である、項１～６の何れかに記載の改変体。
項８　前記抗体がナノボディーであって、
前記改変が、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおけるナノボディーの２７番目、２８番目、３２番目、３７番目、５９番目及び１０２番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変である、項１～６の何れかに記載の改変体。
項９　前記改変が、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおける重鎖可変領域のＹ２７Ｇ、Ｙ２７Ａ、Ｆ２７Ｇ、Ｆ２７Ａ、Ｔ２８Ａ、Ｓ２８Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｙ５９Ａ、Ｙ５９Ｇ及びＹ１０２Ａからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変であり、及び／又は
Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおける軽鎖可変領域のＹ３２Ａ、Ｙ４９Ａ及びＹ９６Ａからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変である、項７に記載の改変体。
項１０　前記改変が、ＣｈｏｔｈｉａナンバリングにおけるナノボディーのＶ２７Ｇ、Ｓ２７Ｇ、Ｒ２７Ｇ、Ｔ２８Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｙ３７Ａ、Ｆ３７Ａ、Ｙ５９Ａ及びＹ１０２Ａからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変である、項８に記載の改変体。
項１１　項１～１０の何れかに記載の改変体をコードするポリヌクレオチド。
項１２　項１１に記載のポリヌクレオチドを保持する細胞。
項１３　項１２に記載の細胞を培養する工程を含む、項１～１０の何れかに記載の改変体を製造する方法。
項１４　相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ構造の基部（ＣＤＲループ基部）に存在する保存されたチロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、セリン残基、バリン残基、アルギニン残基及びスレオニン残基からなる群より選択される少なくとも一種のアミノ酸残基に変異を導入する工程を含む、抗原に対する抗体の解離速度を制御する方法。
　本開示の抗体の改変体は、改変前の抗体の抗原に対する特異性を保持しつつ、該抗原に対する解離速度が速い。当該改変体は、免疫化学測定の分野における多重解析に特に有効に利用することができる。更に、当該改変体は、ＩＲＩＳ法に好適に使用することができる。
　このようにして製造した抗体の改変体は、標的分子の多重検出における自動化に容易に適用することができる。
図１は、蛋白質構造データバンク上に公開されている１６９種類の抗体の配列を抽出し、アミノ酸の出現頻度を分析した結果を示す。横軸上段はＣｈｏｔｈｉａ分類によるアミノ酸番号、縦軸は各アミノ酸の出現頻度を示す。青、赤の背景はそれぞれ低頻度、高頻度を表す。 図２ａは、蛋白質構造データバンク上に公開されている１００種類のナノボディーの配列を抽出し、アミノ酸の出現頻度を分析した結果に示す。横軸上段はＣｈｏｔｈｉａ分類によるアミノ酸番号、縦軸は各アミノ酸の出現頻度を示す。青、赤の背景はそれぞれ低頻度、高頻度を表す。図２ｂは、ナノボディーと重鎖可変領域の候補部位におけるアミノ酸頻度の比較を示す。 図３は、実施例３の結果を示す。ａは、ＸＴＣ細胞に発現させたＦＬＡＧ－ａｃｔｉｎを１ｎＭの２Ｈ８Ｈ１Ｌ３をプローブとして用いた超解像画像を示す。スケールバーは５μｍである。ｂは、ａの拡大画像であり、スケールバーは５００ｎｍである。ｃは、アクチン束の断面プロファイル（ｎ＝１０）で、各束の中心で整列した結果である。線は半値幅４５ｎｍのガウシアンフィットを示す。エラーバーは、ＳＤである。ｄは、ｂの矢印の間にある２つのアクチン束の断面プロファイルを表す。ｅは、ａのプローブを洗い流した後、Ｌｉｆｅａｃｔ　Ａｔｔｏ－４８８で撮像した超解像アクチンを示す。ａのＦＬＡＧ－ａｃｔｉｎ（緑）とＬｉｆｅａｃｔの画像（赤）を合成したものである。画像のスケールバーは、５μｍであり、拡大画像のスケールバーは、２．５μｍである。ｆは、ｅの青点線を横切るアクチンフィラメントの断面プロファイルである。ｇ及びｈは、他の変異体プローブ（緑）とＬｉｆｅａｃｔ（赤）を用いた超解像アクチンの比較を示す。スケールバーは５μｍであり、拡大画像のスケールバーは、２．５μｍである。 図４は、実施例４の結果を示す図である。ａは、ＸＴＣ細胞で発現させた６つのエピトープタグ付きタンパク質の１分子イメージングを示す。スケールバーは、１０μｍである。ｂは、８００００フレーム（Ｖ５－ａｃｔｉｎｉｎ）、１０００００フレーム（Ｆ－ａｃｔｉｎ）、６００００フレーム（ＦＬＡＧ－ｖｉｎｃｕｌｉｎ）、６００００フレーム（ＴＡＲＧＥＴ－ｐａｘｉｌｌｉｎ）、６００００フレーム（ＡＬＦＡ－ｚｙｘｉｎ）、２４０００フレーム（Ｈ２Ｂｂ－Ｓ）及び１６００００フレーム（ＨＡ－ＭＲＬＣ）の単一分子画像から超解像画像を再構成したものである。スケールバーは、５μｍである。ｃは、ＸＴＣ細胞における６つのエピトープタグ付きタンパク質と内在性Ｆ－アクチンとを７色で示す超解像画像である。スケールバーは、５μｍである。ｄは、ｃの枠で囲んだ領域ＡとＢの拡大画像である。スケールバーは、１μｍを示す。ｅは、ｃのラメラ領域（領域Ｃ）のアクチン円弧に沿ったＶ５－アクチニン（シアン）とＨＡ－ＭＲＬＣ（赤）との拡大画像を示す（時計方向に９０°回転させている）。スケールバーは、１μｍを示す。 図５は、実施例５の結果を示す図である。ａは、内在性神経細胞タンパク質の連続的な単一分子イメージングを示す。１ｎＭのＬｉｆｅａｃｔ、２ｎＭのＮＶ－Ｎｂ９Ｈ４、２ｎＭの野生型Ｌ８／１５　Ｆｖ－ＥＧＦＰ、１ｎＭのＨＳ６９Ｈ３を用いて、それぞれ５０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ及び３００ｍｓの露出時間で画像を取得した。連続したプローブ照射の間に、ＰＢＳで８回洗浄した。スケールバーは、１５μｍである。ｂは、ａの１分子画像７２７２０フレームから再構成した初代培養神経細胞における、それぞれＦ－アクチン（Ｌｉｆｅａｃｔ）、ＶＧＬＵＴ、Ｓｎａｐｉｎ、Ｈｏｍｅｒの超解像画像を示す。神経細胞の全体像は、落射蛍光で過剰発現させたｍＣｈｅｒｒｙを用いて取得した。スケールバーは、１０μｍである。ｃは、ｂの４つの超解像画像を合成したマルチプレックスイメージングである。ｄは、ｃの枠で囲まれた領域Ｃの拡大画像である。スケールバーは、２μｍである。ｅ及びｆは、ｃの枠付きシナプスＡ及びＢの拡大画像である。黄色及びシアンの点線は、それぞれスパインの形及びホーマーの位置を示している。スケールバーは、５００ｎｍである。ｇは、ｄのボックス領域の拡大画像である。小さなホメロンクラスター（～０．１μｍ）を右図の白い矢印で示し、１５５のラベルを付けた。ＶＧＬＵＴ（マゼンタ色）とＨｏｍｅｒ（シアン色）とのクラスターのみ、右図に示す。キャリブレーションバーは、各ピクセル（長さ１３．５ｎｍ）内のラベルの数を示す。左パネルのスケールバーは、５００ｎｍであり、右パネルのスケールバーは、２００ｎｍである。
　以下、本開示内容について詳細に説明する。以下に示す文献の内容は、参照により本明細書に組み込むことができる。
　本明細書において、特に断らない限り、数値範囲を示す「～」との標記は、「未満」及び「超過」の意味ではなく「以上」及び「以下」を示す。つまり、「Ａ～Ｂ」は「Ａ以上Ｂ以下」を意味し、Ａ及びＢも含まれる。
　本明細書において、「含む」及び「含有する」の用語には、「からなる」及び「から実質的になる」という意味が含まれる。
　抗体のアミノ酸番号については、一次構造の保存性に基づいて提唱されたＫａｂａｔナンバリング（Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ　Ｅｄ，ＮＩＨ　１９９１）及び抗体の立体構造を考慮して改良されたＣｈｏｔｈｉａナンバリング（Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９：Ｎａｔｕｒｅ　３４２，８７７－８８３．）が一般に用いられる。本明細書に記載する抗体のアミノ酸配列のナンバリングは、ＣＤＲループのアミノ酸残基の位置を精度よく示すことが知られているＣｈｏｔｈｉａナンバリングとそれに定義されるＣＤＲ及びＦＲを用いる。
抗体の改変体
　本開示の抗体の改変体は、抗体のＣＤＲループ構造の基部（ＣＤＲループ基部）に存在する保存されたアミノ酸残基が他の種類のアミノ酸残基に改変されている。他の種類のアミノ酸残基とは、保存されたアミノ酸とは異なるアミノ酸残基であることを意味し、タンパク質の構成成分となるコドンによって支配される２０種類のアミノ酸残基から適宜選択される。
　抗体のＣＤＲループ基部に存在する保存されたアミノ酸残基は、抗体にとって重要な役割を果たしていると推察されるものの、抗体のＣＤＲループ基部自体は抗原との接触面を構成する部位には該当しない場合が多く、接触面に含まれる場合もその外側に位置する場合が多い。そのため、本開示の抗体の改変体のように、ＣＤＲループ基部に存在するアミノ酸残基を他の種類のアミノ酸残基に改変すると、抗体の改変体における抗原との接触面のアミノ酸残基の位置及び接触面の構造には大きな変化をもたらす可能性が少ないので、抗体の改変体の抗原に対する特異性は保持される傾向にあると推察される。
　その一方で、ＣＤＲループ基部に存在するアミノ酸残基を他の種類のアミノ酸残基に改変すると、抗体の改変体における抗原との特異性とは別の重要な機能、具体的には、抗体の改変体と抗原との親和性には影響が及ぼされる傾向があると推定される。
　本開示の抗体の改変体では、抗原に対する解離による結合半減期が１８０秒以下であり、１２０秒程度以下であることが好ましく、６０秒以下程度とすることが更に好ましい。なお、前記抗原とは、改変前の抗体の抗原と同一である。
　なお、上記結合半減期が１８０秒以下とは、解離速度が０．０００５５ｓ－１で結合の半減期が１８０秒以下と同じ意味である。
　また、本開示の改変体における、抗原に対する解離定数は、改変前の抗原に対する解離定数から変化した割合として特定することもできる。このような割合は、通常、２倍程度とすることができ、１０倍程度が好ましく、５０倍程度とすることがより好ましい。すなわち、本開示の抗体の改変体の抗原に対する解離定数は、改変前の抗体の抗原に対する解離定数よりも、２倍、好ましくは１０倍、より好ましくは５０倍上昇する。
　上記「ＣＤＲループ基部」とは、ＣＤＲループ近傍である限り特に限定されないが、例えば、ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）との境界付近、ＣＤＲループ付近に位置すると立体構造から判断できる領域等を挙げることができる。これらの中でも、ＣＤＲとＦＲとの境界付近とすることが好ましい。なお、ＣＤＲとＦＲの境界とは、上記Ｃｈｏｔｈｉａの文献が提唱する境界とすることができ、境界付近とは、当該境界から１～３個のアミノ酸の範囲とすることができる。
　上記するＣＤＲループ基部の具体的なアミノ酸残基は、特に限定されない。例えば、重鎖可変領域であれば、その２７～２９番目、３２～３７番目、５６～５９番目、１０２～１０４番目のアミノ酸残基、軽鎖可変領域であれば、その２４番目、２５番目、３２～３５番目、４８番目、４９番目、５３番目、５４番目、８９番目、９０番目、９６～９８番目のアミノ酸残基、又はミニボディであれば、その２７～２９番目、３２～３７番目、５６～５９番目、１０２～１０４番目のアミノ酸残基を挙げることができる。なお、重鎖可変領域の１０２番目よりも前に存在するシステイン残基は、ＣＤＲループ基部から除外される。
　上記の解離速度の測定方法は、公知の方法から広く採用することができ、特に限定されない。このような測定方法として、例えば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、一分子顕微鏡を使用した方法等を挙げることができる。好ましい測定方法として、一分子顕微鏡を使用した方法を挙げることができる。具体的な一分子顕微鏡を使用した方法は、後記する実施例に記載の機器及び方法などを参考にして、容易に実施することができる。また、特許文献１に記載の方法を採用することもできる。
　本明細書にいう「保存されたアミノ酸残基」は、次のように特定する。
１．複数種の抗体のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号をＣｈｏｔｈｉａの手法によってナンバリングする。
２．上記アミノ酸番号のナンバリングに基づき、通常の方法により、複数種の抗体のアミノ酸配列をアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）する。
３．各アミノ酸番号におけるアミノ酸残基の出現頻度を算出する。
４．特定種類のアミノ酸残基の出現頻度が２０～１００％となっている抗体のアミノ酸番号を「アミノ酸残基が保存された位置」とし、当該位置に上述のような出現頻度で現れるアミノ酸残基を「保存されたアミノ酸残基」とする。
　なお、上述の複数種の抗体のアミノ酸配列としては、例えば、蛋白質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ：ＰＤＢ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）から任意に抽出した抗体のアミノ酸配列を挙げることができる。ここで、蛋白質構造データバンクから任意に抽出される抗体のアミノ酸配列の種類は、特に限定されない。上記アミノ酸残基が保存された位置をより正確に特定するために、２０種類程度以上とすることができ、５０種類程度以上が好ましく、１００種類程度以上がより好ましく、１５０種類程度以上が最も好ましい。
　上述するアミノ酸残基の出現頻度は、効果を発揮する範囲において、特に限定されず、通常２０～１００％程度であり、好ましくは５０～１００％程度、更に好ましくは７０～１００％程度であり、最も好ましくは９０～１００％程度である。
　なお、ＣＤＲループ基部に存在する保存されたアミノ酸残基がシステイン残基、プロリン残基、アラニン残基又はグリシン残基であったとしても、これらのアミノ酸残基を他の種類のアミノ酸残基に改変しないすることが好ましい。
　例えば、システイン残基は、抗体に含有される他のシステイン残基とＳ－Ｓ結合を形成することにより、抗体の立体構造の決定に重要な役割を果たしている可能性があるので、ＣＤＲループ基部に存在する保存されたシステイン残基を他の種類のアミノ酸残基に改変すると、改変後の抗体の立体構造に変化を生じてしまい、抗原に対する特異性の低下を引き起こす可能性がある。そのため、当該システイン残基を他の種類のアミノ酸残基に改変しないことが好ましい。
　また、プロリン残基は、タンパク質の構成成分となるコドンによって支配される２０種類のアミノ酸の中でも唯一の環状アミノ酸であり特別な機能を有することが想定される。そのため、当該プロリン残基の持つ特別な機能を喪失させてしまうことを防ぐ観点から、ＣＤＲループ基部に存在する保存されたプロリン残基を他の種類のアミノ酸残基に改変しないことが、好ましい。
　アラニン残基及びグリシン残基は側鎖が小さいので、本開示の抗体の改変体において、抗原に対する解離による結合半減期が６０秒以下とする観点から、ＣＤＲループ基部に存在する保存されたアラニン残基及びグリシン残基の何れかを他の種類のアミノ酸残基に改変しないことが好ましい。
　本開示の抗体の改変体における抗体とは、抗原に対して特異的に結合する分子である限り、特に限定されない。このような抗体として、例えば、イムノグロブリン、抗原結合断片等を挙げることができる。
　上記イムノグロブリンのサブタイプは、効果を発揮する範囲において特に限定されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥを挙げることができる。
　上記抗原結合断片とは、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持し、断片化前の抗体が発揮する抗原への特異的な結合作用を有する分子である限り、特に限定されない。このような抗原結合断片として、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、ナノボディー等を挙げることができる。
　本開示の抗体の改変体において、他のアミノ酸残基への改変の対象とする、「保存されたアミノ酸残基」は、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、セリン残基、バリン残基、アルギニン残基及びスレオニン残基のうちの何れかである。
　チロシン残基は、水素結合、π－π相互作用、アルキル基との間のＣＨ／π相互作用等といった複数の相互作用を形成する側鎖を有する。そのため、チロシン残基を他の種類のアミノ酸残基に改変させた本開示の抗体の改変体は、抗原に対する親和性に適度な変化を生じさせることにより、上記効果を発揮する。
　フェニルアラニン残基、トリプトファン残基及びロイシン残基は、比較的大きな立体構造を有する疎水性側鎖を有する。そのため、これらのアミノ酸残基のうちの何れかを他の種類のアミノ酸残基に改変させた本開示の抗体の改変体は、抗原に対する親和性に適度な変化を生じさせることにより、上記効果を発揮する。
　スレオニン残基及びセリン残基は、上述のチロシン残基と同様にＣＤＲループ基部の同じ位置で出願頻度が高く、抗体にとって重要な役割を果たしていると推察される。そのためスレオニン残基及びセリン残基のうちの何れかのアミノ酸残基を他の種類のアミノ酸残基に改変させた本開示の抗体の改変体は、抗原に対する親和性に適度な変化を生じさせることにより、上記効果を発揮する。
　βシートは、抗体全体の構造形成に関与することが知られている。このため、βシートを構成するアミノ酸残基を他の種類のアミノ酸残基に改変すると、改変後の抗体の抗原に対する特異性が低下してしまう可能性があるので、当該改変をしないことが好ましい。
　本開示の抗体の改変体における抗体に対するアミノ酸残基の改変の個数は、効果を発揮する範囲において特に限定されず、例えば、１～８個とすることができる。効果をより一層発揮することに鑑みて、１～６個とすることが好ましく、更に好ましくは１～４個であり、最も好ましくは１～３個である。
　本開示の抗体の改変体における抗体が重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有するＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片及びＦｄの断片の何れかである場合に重鎖可変領域の改変対象となるアミノ酸残基は、効果を発揮する範囲において特に限定されない。例えば、重鎖可変領域の２７番目、２８番目、３２番目、５９番目及び１０２番目のアミノ酸残基の何れか１種以上を変異対象となるアミノ酸残基として挙げることができ、中でも２７番目、２８番目、３２番目及び５９番目のアミノ酸残基の何れか１種以上が好ましく、より好ましくは２７番目、２８番目及び５９番目のアミノ酸残基の何れか１種以上であり、更に好ましくは２８番目及び５９番目のアミノ酸残基の何れか１種以上であり、最も好ましくは５９番目のアミノ酸残基である。
　また、本開示の抗体の改変体における抗体が重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有するＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片及びＦｄ断片の何れかである場合に軽鎖可変領域の改変対象となるアミノ酸残基は、効果を発揮する範囲において特に限定されない。例えば、軽鎖可変領域の軽鎖可変領域の２６番目、３２番目、４９番目及び９６番目のアミノ酸残基の何れか１種以上を挙げることができ、中でも３２番目、４９番目及び９６番目のアミノ酸残基の何れか１種以上が好ましく、より好ましくは３２番目及び４９番目のアミノ酸残基の何れか１種以上であり、最も好ましくは４９番目のアミノ酸残基である。
　本開示の抗体の改変体における抗体がナノボディーである場合に改変対象となるアミノ酸残基は、効果を発揮する範囲において特に限定されない。例えば、２７番目、２８番目、３２番目、３７番目、５９番目及び１０２番目のアミノ酸残基のアミノ酸残基の何れか１種以上を挙げることができ、中でも２７番目、２８番目、３２番目、３７番目及び５９番目のアミノ酸残基の何れか１種以上が好ましく、より好ましくは２７番目、２８番目、３７番目及び５９番目のアミノ酸残基の何れか１種以上、更に好ましくは２８番目、３７番目及び５９番目のアミノ酸残基の何れか１種以上、更により好ましくは３７番目及び５９番目のアミノ酸残基の何れか１種以上であり、最も好ましくは３７番目のアミノ酸残基である。
　上記他のアミノ酸残基は、効果を発揮する範囲において特に限定されず、例えば、改変により抗体の特異性が変化しないようにするために、バリン残基、ヒスチジン残基、アラニン残基又はグリシン残基とすることが好ましい。これらの中でも、アラニン残基又はグリシン残基とすることがより好ましい。
　本開示の抗体の改変体における抗体が重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有するＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片及びＦｄ断片の何れかである場合の重鎖可変領域に対する改変は、効果を発揮する範囲において特に限定されない。例えば、Ｙ２７Ｇ、Ｙ２７Ａ、Ｆ２７Ｇ、Ｆ２７Ａ、Ｔ２８Ａ、Ｓ２８Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｙ５９Ａ、Ｙ５９Ｇ及びＹ１０２Ａの何れか１種以上の改変を挙げることができる。
　本開示の抗体の改変体における抗体が重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有するＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片及びＦｄ断片の何れかである場合の軽鎖可変領域に対する改変は、効果を発揮する範囲において特に限定されない。例えば、Ｙ３２Ａ、Ｙ４９Ａ及びＹ９６Ａの何れか１種以上の改変を挙げることができる。
　本開示の抗体の改変体における抗体がナノボディーである場合の改変は、効果を発揮する範囲において特に限定されない。例えば、Ｖ２７Ｇ、Ｓ２７Ｇ、Ｒ２７Ｇ、Ｔ２８Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｙ３７Ａ、Ｆ３７Ａ、Ｙ５９Ａ及びＹ１０２Ａの何れか１種以上の改変を挙げることができる。
　上記ナノボディーに対するアミノ酸残基の改変として、更に、Ｅ５３Ａ、Ｒ６０Ａ及びＶ９９Ａの少なくとも１つの改変を行うこともできる。
　本開示の抗体の改変体における抗体の由来は、ヒト由来であっても非ヒト動物由来であってもよい。非ヒト動物とは、効果を発揮する範囲において特に限定されず、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ニワトリ等を挙げることができる。
　本開示の抗体の改変体における抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の何れでもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。このようなモノクローナル抗体は、キメラ抗体とすることもできる。また、上記抗体は、二重特異性を有していてもよい。
　本開示の抗体の改変体における抗体の抗原は、効果を発揮する範囲において特に限定されず、解析を所望するあらゆる標的分子を挙げることができる。これらの抗原の中でも、例えば、免疫化学測定にて多用されるエピトープタグを挙げることができる。エピトープタグとしては、広く公知のものから適宜選択することができ、例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、ＴＡＲＧＥＴダグ、ＨＡタグ、Ｓタグ、ＡＬＦＡタグ、ＨＩＳタグ、Ｍｙｃタグ等を挙げることができる。また、このような抗体は、蛍光物質、化学発光物質、発色反応を触媒する酵素等の直接的に又は間接的にシグナルを発する物質によって標識されていても良い。
　上記抗体の最も好ましい態様として、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２２、２４又は２６に示すアミノ酸配列を含む抗体を挙げることができる。
ポリヌクレオチド
　本開示のポリヌクレオチドは、上記の本開示の抗体の改変体における抗体の改変体をコードする。
　上記ポリヌクレオチドの種類は、特に限定されず、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸又はこれらを組み合わせたものとすることができる。当該ポリヌクレオチドの鎖状は、特に限定されず、例えば１本鎖、２本鎖、３本鎖、４本鎖、プラスミド等の鎖状を挙げることができる。
細胞
　本開示の細胞は、上記ポリヌクレオチドを保持するものである。特に、本開示の細胞は、当該細胞内に前記ポリヌクレオチドを安定的に保持することが好ましい。
　上記細胞の種類は、特に限定されず、例えば、抗体の製造の分野で広く公知の宿主細胞とすることが好ましい。具体的な宿主細胞として、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、微生物細胞等を挙げることができる。
製造方法
　本開示の抗体の改変体の製造方法は、上記細胞を培養する工程を含有する。具体的な細胞の培養方法は、抗体製造する際に広く公知の培地、温度、ｐＨ、時間、添加物等を適宜採用することによって実施することができる。上記細胞の培養工程の後に、細胞内又は細胞外の培地から、本開示の抗体の改変体を回収することができる。このように回収された抗体の改変体は、適宜、公知の精製工程に供することができる。
抗原に対する抗体の解離速度を制御する方法
　本開示の抗原に対する抗体の解離速度を制御する方法は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ構造の基部（ＣＤＲループ基部）に存在する保存されたチロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、セリン残基、バリン残基、アルギニン残基及びスレオニン残基からなる群より選択される少なくとも一種のアミノ酸残基に変異を導入する工程を含む。
　上記解離速度が制御される抗体は、上記に説明した抗体と同様の抗体である。また、解離速度の制御が達成できたかどうかを確認する方法も、上記の抗体で説明した解離速度の測定方法に準じて確認することができる。
　なお、上記の用語「変異」とは、「改変」と同意に解釈することができる。
　上述した本開示の各実施態様又は実施形態について説明した性質、構造、機能等の各種の特性は、本開示に包含される態様又は主題を特定するにあたり、適宜組み合わせることができる。すなわち、本開示には、本明細書で開示する、組み合わせることができる各特性の態様の全ての発明を包含することができる。
　以下に、本開示内容をより詳細に説明するための実施例を示す。本開示内容が下記に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。
実施例１
　蛋白質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ：ＰＤＢ、Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００３）上に公開されている抗体（１６９種類：表１）の配列を抽出し、アミノ酸の出現頻度を分析した結果を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１に示す結果と抗体の立体構造とを照らし合わせると、ＣＤＲのループ構造とＦＲとの境界であるＣＤＲループ基部に保存されるアミノ酸残基の出現頻度が高いことが明らかとなった。その中から、変異導入アミノ酸残基の対象として重鎖２７番目アミノ酸残基（Ｈ２７）、重鎖３２番目のアミノ酸残基（Ｈ３２）、重鎖５２番目のアミノ酸残基（Ｈ５２）、重鎖１０２番目のアミノ酸残基（Ｈ１０２）、軽鎖３２番目のアミノ酸残基（Ｌ３２）、軽鎖４９番目のアミノ酸残基（Ｌ４９）及び軽鎖９６番目のアミノ酸残基（Ｌ９６）を選択した。併せて、重鎖２８番目アミノ酸残基（Ｈ２８）も選択した。これらのアミノ酸残基をグリシン又はアラニンに適宜置換した変異体を作製した。
　抗ＴＡＲＧＥＴタグ抗体（クローン名：Ｐ２０．１）、抗ＨＡタグ抗体（クローン名：１２ＣＡ５）、抗ＦＬＡＧ抗体（クローン名：２Ｈ８）、抗Ｖ５タグ（クローン名：Ｖ３０２Ａ）及び抗Ｓタグ（クローン名：Ｓ６６Ｂ）の５種類のＦｖ－ＥＧＦＰに対して、上記の変異を導入したものを作製した。具体的には、下記表２に示す各種変異体（Ｐ２０．１クローン：４種類、１２ＣＡ５クローン：１１種類、２Ｈ８クローン：８種類、Ｖ３０２Ａクローン：９種類、６６Ｂクローン：２種類）を、ＷＯ２０１８／０８８４０３に記載された方法によって製造した。
　Ｐ２０．１クローンのＷＴ（野生型）の重鎖アミノ酸配列は、配列番号１に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２に示すものである。Ｐ２０．１のＭｕｔａｎｔ　ｃｏｄｅがＨ１Ｌ０である変異体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号３に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４に示すものである。
　１２ＣＡ５クローンのＷＴの重鎖アミノ酸配列は、配列番号５に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号６に示すものである。１２ＣＡ５のＭｕｔａｎｔ　ｃｏｄｅがＨ６Ｌ２である変異体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号７に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８に示すものである。
　２Ｈ８のＷＴクローンの重鎖アミノ酸配列は、配列番号９に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１０に示すものである。２Ｈ８のＭｕｔａｎｔ　ｃｏｄｅがＨ１Ｌ３である変異体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号１１に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１２に示すものである。
　Ｖ３０２ＡクローンのＷＴの重鎖アミノ酸配列は、配列番号１３に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１４に示すものである。Ｖ３０２ＡのＭｕｔａｎｔ　ｃｏｄｅがＨ２Ｌ１である変異体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号１５に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１６に示すものである。
　Ｓ６６ＢクローンのＷＴの重鎖アミノ酸配列は、配列番号１７に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１８に示すものである。Ｓ６６ＢのＭｕｔａｎｔ　ｃｏｄｅがＨ１Ｌ０である変異体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号１９に示すものであり、その軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２０に示すものである。
　上記の配列番号１～２０に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入し、この培養上清から各種野生型及び変異体Ｆｖ－ＥＧＦＰを回収して、その後、精製した。
　これらの各種抗体及びその変異体の解離定数を以下の方法によって測定した。先ず、測定用の細胞として、各種エピトープタグが融合したアクチンを発現するＸＴＣ細胞を準備した。この細胞を１００μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）と１０μｇ／ｍｌのｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）とでコートしたカバースリップ上に１時間スプレッドし、平坦なラメラポディアとラメラとを確実に形成させた。次いで、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ナカライテスク）を含む細胞骨格バッファー（１０ｍＭのＭＥＳ、９０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ６．１）中の３．７％ＰＦＡで２０分間固定し、３％ＢＳＡ（ナカライテスク）を含有するＰＢＳ中でブロッキングを行った。各種抗体及びその変異体をＨＥＰＥＳ－ＫＣｌ－Ｔｘバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、９０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ｐＨ７．２）及び脱酸素剤（０．２ｍｇ／ｍＬのｇｌｕｃｏｓｅ　ｏｘｉｄａｓｅ、０．０３５ｍｇ／ｍＬのｃａｔａｌｏｇａｓｅ、０．４５％のｇｌｕｃｏｓｅ及び０．５％の２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）に混合し、０．０５～０．１ｎＭで各種エピトープタグが融合したアクチンを発現するＸＴＣ細胞に作用させた。
　その後、各種エピトープタグが融合したアクチンを発現するＸＴＣ細胞に結合した各種抗体又はその変異体の単一分子のタイムラプスイメージングを、ＩＸ３－ＺＤＣ２　Ｚ－ｄｒｉｆｔ　ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ＵＰｌａｎｓＡｐｏ　１００、１．４０ＮＡ　ｏｉｌ　ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、Ｅｖｏｌｖｅ５１２　ＥＭＣＣＤ　ｃａｍｅｒａ（Ｒｏｐｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＣｏｂｏｌｔ　Ｂｌｕｅｓ　５０ｍＷ　ｌａｓｅｒ（４８８ｎｍ；Ｃｏｂｏｌｔ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ　ＩＸ８３倒立顕微鏡により４８８ｎｍ照明下で取得した。タイムラプススタックの最初のフレームにある結合抗体フラグメントを、ｐｙｔｈｏｎ　プログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔａｋｕｓｈｉｍ／ｔａｎｉｔｒａｃｅｒ）によってトラックした。各抗体又はその変異体の解離速度を、Ｐｒｉｓｍ７．０を用いて、結合した抗体の回帰を一相減衰モデル（ｙ＝Ｙ０×ｅｘｐ（－ｋｏｆｆ×ｔ））にフィッティングすることにより算出した。さらに、解離速度は、測定したｋｏｆｆ値からフォトブリーチングレートＫを差し引くことで補正した。また、半減期（ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）をｌｏｇ２／解離速度にて算出した。このようにして測定した解離速度等を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す結果から、Ｐ２０．１クローンでは、ＷＴの解離定数が０．０３３であったのに対して、重鎖５９番目のチロシンをグリシン（ＨＹ５９Ｇ）に置換変異を施した変異体（Ｈ１Ｌ０）の解離定数が０．３３２と、変異導入前より約１０倍も上昇することが明らかとなった。
　１２ＣＡ５クローンでは、ＷＴの解離定数が０．００６２１であったのに対して、重鎖２８番目のスレオニンをアラニン（ＨＴ２８Ａ）に、重鎖３２番目のチロシンをアラニン（ＨＹ３２Ａ）に、及び軽鎖４９番目のチロシンをアラニン（ＬＹ４９Ａ）に置換変異を施した変異体（Ｈ６Ｌ２）の解離定数が０．６０１と、変異導入前より約１００倍も上昇することが明らかとなった。
　２Ｈ８クローンでは、ＷＴの解離定数が０．００８０３であったのに対して、重鎖２８番目のセリンをアラニン（ＨＳ２８Ａ）に、及び軽鎖９６番目のチロシンをアラニン（ＬＹ９６Ａ）に置換変異を施した変異体（Ｈ１Ｌ３）の解離定数が０．４０７と、変異導入前より約５０倍も上昇することが明らかとなった。
　Ｖ３０２Ａクローンでは、ＷＴの解離定数が０．０３２２であったのに対して、重鎖２７番目のチロシンをグリシン（ＨＹ２８Ｇ）に、及び軽鎖３２番目のチロシンをアラニン（ＬＹ３２Ａ）に置換変異を施した変異体（Ｈ２Ｌ１）の解離定数が０．５６７と、変異導入前より約２０倍も上昇することが明らかとなった。
　Ｓ６６Ｂクローンでは、ＷＴの解離定数が０．１３９であったのに対して、重鎖２８番目のセリンをアラニン（ＨＳ２８Ａ）に置換変異を施した変異体（Ｈ１Ｌ０）の解離定数が０．２７６と、変異導入前より約２倍も上昇することが明らかとなった。
実施例２
　実施例１と同様に、ＰＤＢ上に公開されているナノボディー（１００種類：表２）の配列を抽出し、アミノ酸の出現頻度を分析した結果を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＣＤＲ１近傍の３７番目のアミノ酸残基（Ｎｂ３７）は、Ｆ（フェニルアラニン）又はＹ（チロシン）が占める保存部位であり、ＶＨの対応する位置とは異なることが分った。そこで、ナノボディーの２７番目のアミノ酸残基（Ｎｂ２７）、２８番目のアミノ酸残基（Ｎｂ２８）、３２番目のアミノ酸残基（Ｎｂ３２）、５９番目のアミノ酸残基（Ｎｂ５９）及び１０２番目のアミノ酸残基（Ｎｂ１０２）に加え、３７番目のアミノ酸残基（Ｎｂ３７）をナノボディーの変異導入部位とし、これらのアミノ酸残基をグリシン又はアラニンに適宜置換した変異体を作製した。
　実施例１と同様に、抗ＡＬＴＡタグ抗体（クローン名：ＮｂＡＬＦＡ）のＦｖ－ＥＧＦＰを作製した。併せて、神経細胞に発現するＨｏｍｍｒを抗原とする抗体（抗Ｈｏｍｍｅｒ抗体；クローン名：ＨＳ６９）と、ＶＧＬＵＴを抗原とする抗体（抗ＶＧＬＵＴ抗体；クローン名ＮＶ－Ｎｂ９）の３種類のＦｖ－ＥＧＦＰに対して、上記の変異を導入したものを作製した。具体的には、下記表２に示す各種変異体（ＮｂＡＬＦＡクローン：２種類、ＨＳ６９クローン：５種類、ＮＶ－Ｎｂ９クローン：４種類）を、ＷＯ２０１８／０８８４０３に記載された方法によって製造した。
　ＮｂＡＬＦＡクローンのＷＴのアミノ酸配列は、配列番号２１に示すものである。ＮｂＡＬＦＡのＭｕｔａｎｔ　ｃｏｄｅがＨ２である変異体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号２２に示すものである。
　ＨＳ６９クローンのＷＴのアミノ酸配列は、配列番号２３に示すものである。ＨＳ６９のＭｕｔａｎｔ　ｃｏｄｅがＨ３である変異体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号２４に示すものである。ＮＶ－Ｎｂ９クローンのＷＴのアミノ酸配列は、配列番号２５に示すものである。ＮＶ－Ｎｂ９のＭｕｔａｎｔ　ｃｏｄｅがＨ４である変異体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号２６に示すものである。
　上記の方法にて作成したナノボディー及びその変異体の解離定数を、実施例１に記載の方法と同様に測定した。但し、ＮｂＡＬＦＡクローンの解離定数の算出には、ＡＬＦＡタグが融合したアクチンを発現するＸＴＣ細胞を、ＨＳ６９クローンの解離定数の算出には、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｈｏｍｍｅｒ１を過剰発現するＣＴＣ細胞を、及びＮＶ－Ｎｂ９クローンの解離定数の算出には、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＶＧＬＵＴ１を過剰発現するＣＴＣ細胞を使用した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示す結果から、ＮｂＡＬＦＡクローンでは、ＷＴの解離定数が０．００００３４８以下であったのに対して、２７番目のバリンをグリシン（Ｖ２７Ｇ）に、２８番目のスレオニンをアラニン（Ｔ２８Ａ）に、３７番目のチロシンをアラニン（Ｙ３７Ａ）に、５３番目のグルタミン酸をアラニンに（Ｅ５３Ａ）、６０番目のアルギニンをアラニン（Ｒ６０Ａ）に、及び９９番目のバリンをアラニン（Ｖ９９Ａ）に置換変異を施した変異体（Ｈ２）の解離定数が０．３３１と、変異導入前より約１０００倍も上昇することが明らかとなった。
　ＨＳ９６クローンでは、ＷＴの解離定数が０．０００８９７であったのに対して、２７番目のセリンをグリシン（Ｓ２７Ｇ）に、２８番目のスレオニンをアラニン（Ｔ２８Ａ）に、３７番目のフェニルアラニンをアラニン（Ｆ３７Ａ）に、及び５９番目のチロシンをアラニン（Ｙ５９Ａ）に置換変異を施した変異体（Ｈ３）の解離定数が０．０９７１と、変異導入前より約１００倍も上昇することが明らかとなった。
　ＮＶ－ＮＢ９クローンでは、ＷＴの解離定数が０．００１６４であったのに対して、２７番目のアルギニンをグリシン（Ｒ２７Ｇ）に、２８番目のスレオニンをアラニン（Ｔ２８Ａ）に、３２番目チロシンをアラニンに（Ｙ３２Ａ）に、３７番目のフェニルアラニンをアラニン（Ｆ３７Ａ）に、及び１０２番目のチロシンをアラニン（Ｙ５１０２）に置換変異を施した変異体（Ｈ４）の解離定数が０．０９２３と、変異導入前より約５０倍も上昇することが明らかとなった。
実施例３
　上記に製造した各種変異体がＩＲＩＳプローブ（タグ）として有効かどうかについての実験を行った。各種タグ（ＴＡＲＧＥＴタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５タグ、Ｓタグ及びＡＬＦＡタグ）が融合したアクチンを発現するＸＴＣ細胞を準備した。この細胞をＰＦＡにて固定し、その後ブロッキング処理に供した。その後、実施例１及び２にて作製した各種抗体の変異体を作用させ、ＩＲＩＳ観察用サンプルを作製した。このサンプルを、解離定数の測定時に使用した倒立顕微鏡下で観察した。その結果を図３に示す。
　図３ａ、ｅ、ｇ及びｈに示すように、各エピトープタグ付きアクチンの超解像画像を２８０００フレームから再構成することができた。ＦＬＡＧ、ＴＡＲＧＥＴ、ＨＡ、Ｖ５、Ｓ及びＡＬＦＡタグは、図３ｂ及びｃに示すように約４５ｎｍの半値幅でアクチン束を明確に可視化し、６０ｎｍ離れた２つのアクチン束を分解した（図３ｄ）。上記タグはすべて、Ｌｉｆｅａｃｔ　ｐｒｏｂｅと同じ分布と程度でアクチンフィラメントを認識することが明らかとなった（図３ｅ、ｆ及びｇ）。
実施例４
　上記に製造した各種変異体がＩＲＩＳプローブとして多重染色できるかどうか確認する実験を行った。具体的に、Ｖ５－ａｃｔｉｎｉｎ、ＦＬＡＧ－ｖｉｎｃｕｌｉｎ、ＨＡーｍｙｏｓｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ２（ＨＡ－ＭＲＬＣ）、ＴＡＲＧＥＴ－ｐａｘｉｌｌｉｎ、ＡＬＦＡ－ｚｙｘｉｎ及びＳ－ｈｉｓｔｏｎｅ２Ｂ（Ｓ－Ｈ２Ｂｂ）をＸＴＣ細胞に過剰発現させて、順次固定及びブロッキングに供した後に、上記各種変異体として２ｎＭのＶ３０２ＡＨ２Ｌ１、０．５ｎＭのＬｉｆｅａｃｔ、２ｎＭの２Ｈ８Ｈ１Ｌ３、１．５ｎＭのＰ２０．１Ｈ１Ｌ０、１ｎＭのＮｂＡＬＦＡＨ２、１ｎＭのＳ６６ＢＨ１Ｌ０及び１ｎＭの１２ＣＡ５Ｈ６Ｌ２を順次作用させて、各イメージスタックを連続取得した。各変異体は、先行して使用する変異体をＰＢＳで洗浄した後、次のサンプルに適用した。結果を図４に示す。
　図４のａから、すべての変異体は、連続したイメージング手順で十分に洗浄することができることが明らかとなった。多重超解像画像では、Ｖ３０２ＡＨ２Ｌ１、２Ｈ８Ｈ１Ｌ３、Ｐ２０．１Ｈ１Ｌ０及びＮｂＡＬＦＡＨ２が、アクチン応力線維の先端と会合している厚い焦点接着複合体を可視化することが明らかとなった（図４ｃ及びｄ）。ＨＡ－ＭＲＬＣは細胞中心部ではＦ－アクチンと重なっているが、細胞辺縁部付近では観察されなかった（図４ｃ）。ＨＡ－ＭＲＬＣは、ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓとほとんど共局在していなかった（図４ｄ）、これは以前に報告された免疫染色の結果と一致している（Ｂｅｔａｐｕｄｉ，Ｖ，ｅｔａｌ．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　５，ｅ８５６０）。さらに、以前の研究で報告されたように（Ｔｏｊｋａｎｄｅｒ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ　２１，５３９－５５０）、細胞のラメラのアクチン円弧に沿ってＶ５－アクチニンとＨＡ－ＭＲＬＣの間で交互のパターンが可視化された（図４ｅ）。この円弧上のサルコマー様組織は、アクチンの収縮と短縮を促進すると考えられている。また、Ｓ６６ＢＨ１Ｌ０により、細胞核内に空間的に分離したＨ２Ｂナノドメインのクラスターが確認され（図４ｄ）、これは過去の超解像研究（Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ，Ｃｅｌｌ　１６０，１１４５－１１５８）と一致している。したがって、実施例１及び２で作製した抗体の変異体は、単一細胞内の複数のエピトープタグ付き成分を可視化することが可能であり、容易に入手できる抗体がないタンパク質の多重超解像イメージングの原理を証明することができた。
実施例５
　上記に製造した各種変異体がＩＲＩＳプローブとして内在性タンパク質に特異性を有しているのかどうかを確認する実験を行った。具体的に、初代培養神経細胞の多重超解像イメージングを、実施例２で製造したナノボディーの変異体（ＨＳ６９Ｈ３及びＮＶ－Ｎｂ９Ｈ４プローブ）を用いて取得した。次いで、初代培養神経細胞を所定の固定及びブロッキング処理に供した後に、１ｎＭのＬｉｆｅａｃｔ、２ｎＭのＮＶ－Ｎｂ９Ｈ４、２ｎＭの野生型Ｌ８／１５　Ｆｖ－ＥＧＦＰ、１ｎＭのＨＳ６９Ｈ３を作用させて、それぞれ５０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ及び３００ｍｓの露出時間で画像を取得した。連続したプローブ照射の間に、ＰＢＳで８回洗浄した。その結果を図５に示す。
　図５ａに示すように、上記変異体は、初代培養神経細胞内の標的分子を認識することができた。また、図５ｂ及びｃに示すように、初代培養神経細胞におけるＦ－アクチン（Ｌｉｆｅａｃｔ）、ＶＧＬＵＴ、Ｓｎａｐｉｎ及びＨｏｍｅｒの超解像画像の取得が可能であった。その結果、シナプス前のＶＧＬＵＴ、シナプス後のアクチン、足場タンパク質であるＨｏｍｅｒを明確に分離して観察することができた（図５ｅ）。ＶＧＬＵＴと対になる小さなＨｏｍｅｒクラスターは、ＨＳ６９Ｈ３及びＮＶ－Ｎｂ９Ｈ４によって１５５個のラベルで可視化された（図５ｇ）。図５に示す多重化画像の染色パターンは、ＰＡＩＮＴ３５を用いた従来の技術で得られる画像よりも連続的である。このように実施例２にて製造した抗体の変異体は、複数の内在性標的を高い標識密度で超解像解析に供することができる。

Claims (10)

  1. 　抗体の改変体であって、
    　該抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ構造の基部（ＣＤＲループ基部）に存在する保存されたアミノ酸残基が他の種類のアミノ酸残基へ改変されており、
    該保存されたアミノ酸残基が、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、セリン残基、バリン残基、アルギニン残基及びスレオニン残基から構成される群より選択される少なくとも一種であり、
    　前記抗体の改変体の抗原に対する解離による結合半減期が１８０秒以下である改変体。
  2. 　上記ＣＤＲループ基部が、ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）との境界に位置する、請求項１に記載の改変体。
  3. 　前記他の種類のアミノ酸残基が、バリン残基（ただし、改変前の保存されたアミノ酸残基がバリン残基以外の場合に限る）、ヒスチジン残基、アラニン残基又はグリシン残基である請求項１又は２に記載の改変体。
  4. 　前記改変の個数が１～８個である、請求項１又は２に記載の改変体。
  5. 　前記抗体が、イムノグロブリン又はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆｄ断片及びナノボディーからなる群より選択される少なくとも一種の抗体結合断片である、請求項１又は２に記載の改変体。
  6. 　前記抗体が、イムノグロブリン又はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄＡｂ断片及びＦｄ断片からなる群より選択される少なくとも一種の抗体結合断片であって、
    前記改変が、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおける重鎖可変領域の２７番目、２８番目、３２番目、５９番目及び１０２番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変であり、及び／又は
    Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおける軽鎖可変領域の２６番目、３２番目、４９番目及び９６番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変である、請求項１又は２に記載の改変体。
  7. 　前記抗体がナノボディーであって、
    前記改変が、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおけるナノボディーの２７番目、２８番目、３２番目、３７番目、５９番目及び１０２番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に対する改変である、請求項１又は２に記載の改変体。
  8. 　前記改変が、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおける重鎖可変領域のＹ２７Ｇ、Ｙ２７Ａ、Ｆ２７Ｇ、Ｆ２７Ａ、Ｔ２８Ａ、Ｓ２８Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｙ５９Ａ、Ｙ５９Ｇ及びＹ１０２Ａからなる群より選択される少なくとも１つの変異であり、及び／又は
    　Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングにおける軽鎖可変領域のＹ３２Ａ、Ｙ４９Ａ及びＹ９６Ａからなる群より選択される少なくとも改変である、請求項６に記載の改変体。
  9. 　前記変異が、ＣｈｏｔｈｉａナンバリングにおけるナノボディーのＶ２７Ｇ、Ｓ２７Ｇ、Ｒ２７Ｇ、Ｔ２８Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｙ３７Ａ、Ｆ３７Ａ、Ｙ５９Ａ及びＹ１０２Ａからなる群より選択される少なくとも１つの変異である、請求項７に記載の改変体。
  10. 　請求項１又は２に記載の改変体をコードするポリヌクレオチド。
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