CN117003863A - 针对p-tau 217的抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物医药技术领域,更具体地,本申请涉及能够特异性结合p‑tau 217的抗体或其抗原结合片段,以及包含其的多特异性分子、药物组合物和试剂盒,本申请还涉及所述抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒或药物中的用途。本申请的单克隆抗体(例如,2A7抗体)在AD的检测、预防、以及AD与其它tau蛋白病的治疗中具有较高的临床应用价值。
Description
技术领域
本申请属于生物医药技术领域,更具体地,本申请涉及能够特异性结合p-tau 217(第217位氨基酸磷酸化的tau蛋白)的抗体或其抗原结合片段,以及包含其的多特异性分子、药物组合物和试剂盒,本申请还涉及所述抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒或药物中的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种最常见的与年龄相关的神经退行性疾病,随着年龄的增加,患病率逐渐上升。根据美国阿尔茨海默病协会2021年的年度报告,目前美国65岁以上的人群中约有 620万AD患者,预计到2060年,将达到1380万。随着我国人口的老龄化,AD以及其他形式的痴呆症也正在急剧增加。根据山西医科大学研究人员2020年的荟萃分析(meta-analysis),目前我国AD的综合患病率约为4%,同时发现其患病率与性别、年龄、受教育程度和地区密切相关。AD不仅严重损害老年人的健康与生活质量,还给家庭和社会都带来巨大的经济负担。
AD的主要病理特征包括β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉积形成的神经炎性斑块和过度磷酸化tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结 (neurofibrillary tangles,NFTs)、小胶质和星形胶质细胞的激活、神经突触的丢失及神经元死亡等。其临床症状包括进行性记忆衰退、执行功能受损和日常活动困难。AD发病的早期常表现为思维或无意识行为的改变,对新信息的记忆障碍,以及语言功能障碍性改变等等。晚期 AD患者会出现严重的记忆丧失、幻觉、定向障碍和缺乏自理能力,最终危及生命。由于AD致病原因复杂,而且缺乏明确的病理机制,目前还没有任何干预方法能阻止或逆转AD的进展,仅能暂时改善或减缓症状发展,因此寻找新的临床治疗药物迫在眉睫。
AD的发病机制尚不明确,科学家提出多种AD发病机制假说,如 Aβ级联假说、胆碱能假说、tau蛋白异常磷酸化假说、神经炎症假说、金属离子紊乱假说等。根据这些假说,许多药物研究者研发出针对不同途径的药物,并进行相应的临床实验,但都收效甚微。目前上市的抗 AD药物主要包括4类,胆碱酯酶抑制剂(如他克林、多奈哌齐、加兰他敏和卡巴拉汀等)、NMDA受体拮抗剂(如美金刚)、Aβ和tau的抗体或抑制剂(如Aducanumab、solanezumab和TPI-287等)以及肠道菌群调节剂(如GV-971)。这些药物对于初期和中期AD患者具有一定的治疗作用,可以维持患者认知状态。但是,这些药物并不能改善 AD患者病情发展,而且基本都具有严重副作用,如他克林具有肝毒性,卡巴拉汀有恶心、呕吐等胃肠道不良反应等。许多医药公司的研发重点主要为症状明显的临床治疗阶段,对于预防研究相对较少。当AD 患者出现早期临床症状时,体内病理早已出现。AD疗效差一个最主要的原因是临床治疗干预时间太晚目前的治疗往往在患者出现明显的临床症状的中晚期才开始,从而导致治疗效果非常不想理。因此早期检测、诊断以及有效的风险预测对于AD的预防和治疗至关重要。
目前AD治疗的靶点主要包括致病性Aβ和tau蛋白。但大量靶向 Aβ的药物在临床试验阶段失败,如γ分泌酶抑制剂(semagacestat和 avagacestat)的临床试验未显示出疗效,因增加皮肤癌和感染的发生率而被迫停止。抗Aβ疫苗AN1792由于无菌性脑膜炎的严重不良反应而终止。因此,研发人员将注意力转向了tau蛋白,原因在于其介导了 Aβ引发的神经元功能紊乱和死亡。tau是一种参与微管稳定的微管相关蛋白(由MAPT基因编码),主要富集于神经元轴突周围,其主要功能包括调节、维持微管稳定性、辅助神经元轴突的运输功能等。tau蛋白的过度磷酸化会导致其从微管解离,并聚集成具有神经毒性的寡聚体和/或纤维,引发神经元功能障碍和死亡。值得注意的是,除了AD之外,磷酸化tau蛋白的沉积还是进行性核上性麻痹(progressive superanuclear palsy,PSP)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration,CBD)额颞叶痴呆(frontotemporal dementia,FTD)等多种神经退行性疾病的主要病理特征和致病因子,这类疾病又被称为 tau蛋白病。因此靶向tau蛋白的治疗策略可以被用于这一大类神经退行性疾病。目前针对tau蛋白的治疗药物主要包括tau蛋白靶向疫苗、小分子类的tau聚集抑制剂、靶向编码tau蛋白基因的反义寡核苷酸及抗tau蛋白抗体类。tau蛋白是一种细胞内蛋白,但它可以以游离形式或细胞外囊泡的形式排到脑细胞之间的空隙中,进行扩散,导致异常 tau蛋白聚集和不可逆损伤。免疫抗体疗法会结合扩散的tau蛋白从而延缓或防止神经退行性病变。但目前抗tau蛋白抗体大部分靶向N端抗原表位,如AC Immune公司的semorinemab(识别各种形式全长的 tau蛋白)、Biogen公司的gosuranemab和AbbVie的ABBV-8E12(识别N末端附近的一个表位),这些抗体没有特意靶向致病性的tau蛋白 (如磷酸化tau蛋白),未能发挥最大的治疗效果,大多以临床失败告终。因此开发针对致病性tau蛋白抗体对AD或其它tau蛋白病的治疗具有重要的探索意义。
对AD干预过晚是导致AD治疗效果不佳的另一大重要原因,因此对AD的早期诊断显得尤为重要。临床上对于AD的诊断主要基于临床症状、神经心理学测试、神经影像学检查、和脑脊液检测。其中Aβ正电子发射断层扫描(amyoid-PET-CT)是AD诊断的金标准,但受价格、仪器以及场所等限制,不易进行人群筛查。同时神经心理学测试极易受到受试者生活经历、教育程度、种族和性别等因素的影响,通常作为辅助检测手段。早期AD患者的临床症状表现不显著,几乎无法察觉,容易错过最佳诊疗时机。因此,将AD生物标志物检测纳入普通人群常规筛查对于AD的防治至关重要。国际上许多国家已把AD生物标志物筛查列入AD防治指南。其中,脑脊液中AD相关生物标志物 (Aβ40、Aβ42、t-tau以及p-tau等)的含量变化能够较直接反应神经元的损伤情况,并且早于临床症状20年左右。目前181位的苏氨酸磷酸化的tau蛋白(p-tau181)是使用最广泛的p-tau检测靶标,并能够实现血清标本的检测。2020年,Janelidze和Barthélemy等的研究发现,在脑脊液中,与p-tau181相比,p-tau 217与tau-PET、新脑皮层 Aβ斑块负荷表现出更强的相关性,更能准确的区分AD和非AD,同时 p-tau217的灵敏度和特异度大于90%。血浆中p-tau 217区分临床AD 患者和其他神经退行性疾病患者的准确性(AUC=0.96)显著高于p-tau 181、NfL以及MRI检测(AUC为0.50-0.81)。除此之外,血浆p-tau 217联合APOE基因分型以及认知检查还可用于AD的风险评估模型。
研究表明,聚合tau蛋白由于蛋白酶作用,易造成N端截断,因此靶向中段tau蛋白的抗体可能具有更大的优势。由于217位磷酸化tau 蛋白在AD发病早期就可以被检测出来,且在AD或其它tau蛋白病的患者脑组织提取物的不可溶组分中检测到大量217位磷酸化tau蛋白,因此靶向217位点磷酸化tau蛋白可能在AD或其它tau蛋白病的发病早期阶段就能干预疾病进程,具有重要意义。
但迄今为止,以p-tau 217作为AD及其它tau蛋白病的早期诊断标准以及特异性识别病理性tau蛋白217位点磷酸化的单抗治疗药物未见报道。故以病理性p-tau 217为靶点建立高效、高灵敏度、高特异性、操作简便的AD或其它tau蛋白病的早期诊断方法以及制备更多特异性识别、阻断致病性tau 217位点磷酸化的抗体治疗药物,将为AD 等tau蛋白病的治疗提供更多的可能性,同时也为患者带来新的曙光。
发明内容
基于现有技术的不足,本申请的主要目的之一在于,提供一种特异性结合p-tau217蛋白的抗体。本申请还提供了所述抗体的制备方法和用途,本申请的抗p-tau 217蛋白的抗体可以用于检测、预防和/或治疗 tau蛋白病,特别是AD。
因此,在第一方面,本申请提供了一种特异性结合p-tau 217蛋白的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):
(i)VH CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:3,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(ii)VH CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:4,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(iii)VH CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:5,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;
和/或,
(b)包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):
(iv)VL CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:6,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(v)VL CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:7,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(vi)VL CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:8,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中,(i)-(vi)中任一项所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中,(i)-(vi)中任一项所述的CDR根据Kabat、 Chothia或IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中,(i)-(vi)中任一项所述的CDR根据IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含如下3个重链 CDRs:如SEQID NO:3所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:4所示的 VH CDR2、如SEQ ID NO:5所示的VH CDR3;和/或,如下3个轻链 CDRs:如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NO:1所示的序列;
(ii)与SEQ ID NO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(iii)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和/或
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:
(iv)SEQ ID NO:2所示的序列;
(v)与SEQ ID NO:2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(vi)与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列。
在某些实施方案中,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的重链框架区序列和/或轻链框架区序列。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:具有如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:2所示的序列的 VL。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的恒定区或其变体。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体,所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如,至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合;例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合);和/或
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体,所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如,至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合;例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。
在某些实施方案中,所述重链恒定区是IgG重链恒定区,例如 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些实施方案中,所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
在某些实施方案中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、 Fv、二硫键连接的Fv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、scFv、 scFv二聚体、骆驼化单域抗体(camelizedsingle chain domain antibody)、双抗体(diabody)、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、单域抗体(sdAb)、双价域抗体;和/或,所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或多特异性抗体。
本发明的抗体可以用本领域已知的各种方法来制备,例如通过基因工程重组技术来获得。例如,通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞。然后,在特定条件下培养转染后的宿主细胞,并表达本发明的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见 Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外,这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol. 11:548-557(1999);Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如,Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得;可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外,Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段带有标记。在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶 (例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
在另一方面,本申请提供了分离的核酸分子,其编码如前所述的抗体或其抗原结合片段,或其重链可变区和/或轻链可变区。
在某些实施方案中,所述核酸分子包含如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的核苷酸序列。
在某些实施方案中,所述分离的核酸分子包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的第一核苷酸序列和编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的第二核苷酸序列,其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于相同或不同的分离的核酸分子上。当所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于不同的分离的核酸分子上时,本发明所述的分离的核酸分子包含含有所述第一核苷酸序列的第一核酸分子以及含有所述第二核苷酸序列的第二核酸分子。
在另一方面,本申请提供了一种载体,其包含如前所述的核酸分子。在某些实施方案中,所述载体为克隆载体或表达载体。
在某些实施方案中,所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的第一核苷酸序列和编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的第二核苷酸序列,其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于相同或不同的载体上。当所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于不同的载体上时,本发明所述的载体包含含有所述第一核苷酸序列的第一载体以及含有所述第二核苷酸序列的第二载体。
在另一方面,本申请提供了一种宿主细胞,其包含如前所述的核酸分子或如前所述的载体。
此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞),以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞),昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。
在另一方面,本申请提供了制备如上所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下,培养如上所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中,所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
在另一方面,本申请提供了多特异性分子,其包含如前所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述多特异性分子特异性结合p-tau 217蛋白,并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
在某些实施方案中,所述多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体或其抗原结合片段)。
在某些实施方案中,所述多特异性分子包含如前所述的抗体或其抗原结合片段,以及第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述多特异性分子包含如前所述的抗体或其抗原结合片段,以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体或其抗原结合片段。
在另一方面,本申请提供了药物组合物,其包含如前所述的抗体或其抗原结合片段,或如前所述的多特异性分子,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中,药物组合物还包含另外的药学活性剂。
在某些实施方案中,所述另外的药学活性剂是具有治疗tau蛋白病 (例如,AD)活性的药物。
在某些示例性实施方案中,所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中,此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如 5%葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01%聚山梨醇20)、pH 缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
在另一方面,本申请提供了试剂盒,其含有如前所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
在某些实施方案中,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别如前所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述第二抗体还包括可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
在某些实施方案中,所述试剂盒用于检测样本中p-tau 217的存在或其含量。
在某些实施方案中,所述样本为获自受试者的脑脊液,全血,血清或血浆。
在某些实施方案中,所述试剂盒还包含稀释样本的试剂(例如,马血清)。
在某些实施方案中,所述第二抗体包被于磁珠上。
在某些实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如人。
在另一方面,本申请提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和 /或治疗tau蛋白病的方法,所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如前所述的抗体或其抗原结合片段,或如前所述的多特异性分子,或如前所述的药物组合物。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病包括但不限于阿尔兹海默症 (AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病选自阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病是AD。
在某些实施方案中,所述受试者的脑脊液中含有p-tau 217蛋白。
在某些实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如人。
在某些实施方案中,所述方法还包括施用另外的具有预防和/或治疗AD活性的药物。
在另一方面,本申请提供了一种如前所述的抗体或其抗原结合片段,或如前所述的多特异性分子,或如前所述的药物组合物,在制备药物中的用途,所述药物用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗tau蛋白病;
在某些实施方案中,所述tau蛋白病包括但不限于阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病选自阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病是AD。
在某些实施方案中,药物还包含另外的治疗tau蛋白病(例如, AD)活性的药学活性剂;在某些实施方案中,所述受试者的脑脊液中含有p-tau 217蛋白。
在某些实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如人。
在另一方面,本申请提供了一种如前所述的抗体或其抗原结合片段,或如前所述的多特异性分子,或如前所述的药物组合物,用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗tau蛋白病。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病包括但不限于阿尔兹海默症 (AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病选自阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病是AD。
在某些实施方案中,如前所述的抗体或其抗原结合片段,或如前所述的多特异性分子,或如前所述的药物组合物与另外的治疗tau蛋白病 (例如,AD)活性的药学活性剂联用。
在某些实施方案中,所述受试者的脑脊液中含有p-tau 217蛋白。
在某些实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如人。
在另一方面,本申请提供了一种检测p-tau 217蛋白在样品中的存在或其量的方法,其包括以下步骤:
(1)将所述样品与如前所述的抗体或其抗原结合片段接触;
(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与p-tau 217蛋白之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
在某些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
在某些实施方案中,所述方法在受试者体内或体外进行。
在另一方面,本申请提供了如前所述的抗体或其抗原结合片段,或如前所述的多特异性分子,在制备试剂中的用途,所述试剂用于检测受试者是否患tau蛋白病,或者用于区分患阿尔兹海默症(AD)的患者或患其它tau蛋白病的患者。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病包括但不限于阿尔兹海默症 (AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病选自阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病是AD。
在某些实施方案中,所述试剂通过如前所述的方法检测p-tau 217 蛋白在样品中的量,以检测受试者是否患tau蛋白病,或者以区分患阿尔兹海默症(AD)的患者或患其它tau蛋白病的患者,且所述样品获自所述受试者或患者。
在某些实施方案中,所述样品为血液样品(例如,全血,血清,血浆)。
在另一方面,本申请提供了一种检测受试者是否患tau蛋白病,或者区分患阿尔兹海默症(AD)的患者或患其它tau蛋白病的患者的方法,所述方法包括:
通过如前所述的抗体或其抗原结合片段检测p-tau 217蛋白在样品中的量,且所述样品获自所述受试者或患者;
任选地,所述方法还包括将不同样品中的p-tau 217蛋白的检测量进行比较,以检测受试者是否患阿尔兹海默症(AD),或者以区分患阿尔兹海默症(AD)的患者或患其它tau蛋白病的患者。
在某些实施方案中,所方法包括:
(1)将所述样品与如前所述的抗体或其抗原结合片段接触;
(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与p-tau 217蛋白之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
在某些实施方案中,所述样品为血液样品(例如,全血,血清,血浆)。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病包括但不限于阿尔兹海默症 (AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病选自阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病是AD。
在另一方面,本申请提供了如前所述的抗体或其抗原结合片段,或如前所述的多特异性分子,用于检测受试者是否患tau蛋白病,或者用于区分患阿尔兹海默症(AD)的患者或患其它tau蛋白病的患者。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病包括但不限于阿尔兹海默症 (AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病选自阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性。
在某些实施方案中,所述tau蛋白病是AD。
在某些实施方案中,所述试剂通过检测p-tau 217蛋白在样品中的量,以检测受试者是否患阿尔兹海默症(AD),或者以区分患阿尔兹海默症(AD)的患者或患其它tau蛋白病的患者,且所述样品获自所述受试者或患者。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“p-tau 217蛋白”是指一种磷酸化的tau 蛋白,其在对应于天然tau蛋白的第217位位置上的氨基酸被磷酸化。由于病理性p-tau 217在AD发病早期就可以被检测出来,且在AD患者脑组织提取物的不可溶组分中检测到大量p-tau 217,因此靶向p-tau 217的抗体在AD的预防、检测以及治疗中具有较大的应用潜能。在某些实施方案中,天然tau蛋白具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
如本文中所使用的,术语“天然tau蛋白”是指具有生物学活性的、天然存在的tau蛋白。可方便地从各种公共数据库(例如, GenBank数据库)获得天然tau蛋白的氨基酸序列。在某些实施方案中,天然tau蛋白具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
如本文中所使用的,当提及天然tau蛋白的氨基酸序列时,其使用 SEQ ID NO:10所示的序列来进行描述。例如,表述“天然tau蛋白的第127位位置上的氨基酸”是指,SEQ IDNO:10所示的蛋白的第127位位置上的氨基酸。然而,本领域技术人员理解,天然tau蛋白可具有多种版本,它们具有基本上相同的一级结构(即,氨基酸序列)和高级结构(即,空间结构),以及基本上相同的生物学功能,但是它们彼此之间在氨基酸序列上仍然可以存在微小差异。因此,在本申请中,天然 tau蛋白并不局限于SEQ ID NO:10所示的蛋白,而意欲涵盖所有已知的天然tau蛋白。因此,在本申请中,术语“天然tau蛋白”应包括各种天然存在的、具有生物学功能的tau蛋白,包括例如SEQ ID NO:10所示的tau蛋白以及其天然存在的变体。并且,当描述tau蛋白的氨基酸位置时,其不仅包括SEQ ID NO:10中的特定氨基酸位置,还包括其天然变体中与所述特定氨基酸位置对应的氨基酸位置。例如,表述“天然 tau蛋白的第127位位置上的氨基酸”包括,SEQ ID NO:10的第127位位置上的氨基酸,以及其天然变体中的相应氨基酸位置。根据本申请,表述“相应氨基酸位置”是指,当对序列进行最优比对时,即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时,进行比较的序列中位于等同位置的氨基酸位置。类似地,表述“对应于SEQ ID NO:10的第127位位置”是指,当对某一序列与SEQID NO:10进行最优比对时,即当某一序列与SEQ ID NO:10进行比对以获得最高百分数同一性时,进行比较的该序列中位于与SEQ ID NO:10的第127位等同位置的氨基酸位置。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有 50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman 等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci., 4:11-17(1988))的算法,使用PAM120权重残基表(weightresidue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包(可在 www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol. 48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、 14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的,术语“tau蛋白病(tauopathies)”是指微管相关蛋白tau异常(例如,异常聚集)所导致的疾病。在某些实施方案中,tau蛋白病是由神经元或胶质细胞内病理性tau蛋白异常聚集或沉积所导致的疾病。阿尔茨海默症是最具有代表的tau蛋白病。
如本文中所使用的,术语“磷酸化”是指,在蛋白的氨基酸残基上加入磷酸基团。通常,苏氨酸,丝氨酸、酪氨酸等氨基酸残基具有羟基基团,因此容易被磷酸化。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、 IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL) 和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL) 分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循 Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia& Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR,命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda, Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol. 196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体,本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且,不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如,可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol. 27:55-77,2003)。
在本发明中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT 编号系统确定。
如本文中所使用的,术语“构架区”或“FR”残基是指,抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用可互换,其是指,来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段,也即,除可能自发出现的自然突变外,一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的,其通常包含至少2种或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外,修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得,不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备,例如杂交瘤技术(参见,例如Kohler等人,Nature,256:495,1975),重组DNA技术(参见,例如美国专利申请4,816,567),或噬菌体抗体库技术(参见,例如Clackson等.Nature352:624-628,1991,或Marks等.J.Mol.Biol.222:581-597,1991)。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W., ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、、probody和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005;Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的,术语“全长抗体”意指,由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中,“全长重链”是指这样的多肽链,其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成;并且,当所述全长抗体为IgE同种型时,任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地,“全长重链”是在N端到C 端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种,例如人;也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位,这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的,术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段 (Ward等人,Nature 341:544 546(1989));术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段;术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段;术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段,由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的,术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是,能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为,六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而,即便是一个可变区(例如Fd片段,其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原,尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的,术语“Fc”意指,由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能,但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的,术语“scFv”是指,包含VL和VH结构域的单个多肽链,其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见,例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988);Huston等人,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);和Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Roseburg和 Moore编,Springer-Verlag,纽约,第269-315页(1994))。此类 scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995), Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94- 106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人 (1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。在一些情况下,scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中,scFv可形成di-scFv,其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中,scFv可形成(scFv)2,其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
如本文中所使用的,术语“单域抗体(single-domain antibody, sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如,上述抗体片段),并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指,这样的抗体,其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类),且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类),但无论如何,其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly et al.;Morrison et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。在某些实施方案中,术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体,其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体,而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体。
如本文中所使用的,术语“变体”,在多肽的情境中(包括多肽) 也指包含已通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加改变的氨基酸序列的多肽或肽。在某些情况下,术语“变体”还指已被修饰(即,通过将任何类型的分子共价连接至多肽或肽)的多肽或肽。例如,但非限制性地,多肽可以被修饰,例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其它蛋白质等。衍生多肽或肽可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来产生,所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外,变体具有与其所源自的多肽或肽相似、相同或改善的功能。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff) 两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990;59:439- 473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中,可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的,本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的,其实例包括但不限于,酶 (例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶,等)、放射性核素(例如,3H、125I、35S、14C或 32P)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质,如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如,)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)的生物素。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如 SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞, BHK细胞,HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见,例如,Brummell等人,Biochem. 32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884 (1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如,Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren, Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其以引用的方式并入本文中。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995),并且包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂,稀释剂,维持渗透压的试剂,延迟吸收的试剂,防腐剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂,例如对羟苯甲酸酯,三氯叔丁醇,苯酚,山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、 NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水,水性缓冲液(如缓冲盐水),醇和多元醇 (如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂,例如硫柳汞,2-苯氧乙醇,对羟苯甲酸酯,三氯叔丁醇,苯酚,山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义,其能够稳定药物中的活性成分的期望活性,包括但不限于谷氨酸钠,明胶,SPGA,糖类(如山梨醇,甘露醇,淀粉,蔗糖,乳糖,葡聚糖,或葡萄糖),氨基酸(如谷氨酸,甘氨酸),蛋白质(如干燥乳清,白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中,所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中,此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液 (例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01%聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的,术语“预防”是指,为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的,术语“治疗”是指,为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的,有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即,不再恶化)疾病的状态,延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部),无论是可检测或是不可检测的。此外,“治疗”还可以指,与期望的存活期相比(如果未接受治疗),延长存活期。
如本文中所使用的,术语“受试者”是指哺乳动物,例如人、食蟹猴、小鼠。在某些实施方案中,所述受试者(例如人、食蟹猴、小鼠)患有与TIGIT相关的疾病(例如,涉及TIGIT阳性的侵润T细胞和/或NK细胞,和/或涉及TIGIT配体(例如CD155和/或CD112)阳性的肿瘤细胞的肿瘤),或者,具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的,术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如,预防疾病(例如,涉及TIGIT阳性的侵润T 细胞和/或NK细胞,和/或涉及TIGIT配体(例如CD155和/或CD112) 阳性的肿瘤细胞的肿瘤)有效量是指,足以预防,阻止,或延迟所述疾病的发生的量;治疗疾病有效量是指,足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如,对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄,体重和性别,药物的施用方式,以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本申请的单克隆抗体(例如,2A7抗体)能够以高特异性与p-tau 217蛋白结合。同时,本申请的单克隆抗体还能够检测p-tau 217蛋白的含量(例如,受试者脑脊液中p-tau217的含量),因此所述单抗能够用于鉴定或检测AD患者,并区分AD患者与其它tau蛋白病患者。
将所述单抗施用于受试者,能够改善患有tau蛋白病受试者的行为与能力(例如,探索新物体的时间明显增加,对周围光亮感知及空间趋避能力提高,空间学习及记忆能力提高),抑制受试者海马萎缩情况,并改善脑组织病理变化。因此,本申请的单克隆抗体(例如,2A7抗体)在AD的检测、预防、以及AD与其它tau蛋白病的治疗中具有较高的临床应用价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例2.1中抗体2A7和GAPDH(内部参照)对不同蛋白的免疫印迹结果。
图2显示了实施例2.1中抗体2A7对不同蛋白的组织免疫荧光染色结果;其中,2A7和无关单抗结合区域显示绿色,NeuN特异性抗体结合区显示红色,DAPI结合区显示蓝色。
图3显示了实施例2.2中抗体2A7和GAPDH(内部参照)对不同蛋白的免疫印迹结果。
图4显示了实施例3中2A7抗体在AD病人脑脊液和PS19小鼠脑脊液样品中对p-tau217含量的检测结果。
图5显示了经2A7抗体治疗后10.5月龄PS19小鼠的行为学改善结果。其中,图5A显示了新物体识测试中PS19-2A7组与PS19-IgG相比小鼠探索新物体的时间明显增加;图5B显示了旷场实验测试中,经 2A7抗体治疗后,PS19小鼠在箱体中间时间停留明显减少,表明小鼠对周围光亮感知及空间趋避能力提高;图5C和图5D显示了Morris水迷宫实验中,PS19-2A7组小鼠空间学习及记忆能力与PS19-IgG相比有明显提高。
图6显示了经2A7抗体治疗后10.5月龄PS19小鼠海马萎缩的抑制结果。其中,图6A为核磁共振检测WT-IgG、PS19-IgG与PS19-2A7 组小鼠脑轴向位解剖结构(T1)及3D重构的结果;图6B为WT- IgG、PS19-IgG与PS19-2A7组小鼠海马体积统计结果。
图7显示了经2A7抗体治疗后10.5月龄PS19小鼠病理减轻的结果。其中,图7A免疫荧光染色结果显示PS19-2A7组小鼠神经元 (NeuN)丢失明显减少;图7B为WT-IgG、PS19-IgG与PS19-2A7组小鼠NeuN荧光强度统计结果;图7C显示了PS19-2A7组小鼠p-tau 217(2A7)的染色信号明显减少;图7D为WT-IgG、PS19-IgG与 PS19-2A7组小鼠2A7荧光强度统计结果;图7E显示了PS19-2A7组小鼠小胶质细胞(IBA1)增生明显被抑制;图7F为WT-IgG、PS19-IgG 与PS19-2A7组小鼠IBA1荧光强度统计结果。
注:量化结果显示为平均值±SEM。统计分析是用GraphPad Prism软件(9.0版,https://www.graphpad.com/)进行的。在适当情况下,通过非配对t检验或单因素方差分析评估差异。P值<0.05被认为是有统计学意义的。*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1:序列的描述
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如,本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术,可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis),《分子克隆:实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL),第2次编辑(1989);《当代分子生物学实验手册》 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑,(1987));《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司):《PCR 2:实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、 B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995)),以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼 (R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.特异性识别217磷酸化位点的单克隆抗体的制备
本研究采用第217位氨基酸磷酸化的多肽进行免疫,同时用217位点非磷酸化的多肽进行差异筛选进行特异性抗体的筛选。
1.1免疫原的制备
免疫原为KLH-C-RSRTPSLPT(p)PPTREP,其是一段磷酸化的多肽,氨基酸序列对应于天然tau蛋白的第209-223位氨基酸序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)。本研究所使用的多肽均通过化学合同得到,均由南京钟鼎生物技术有限公司合成。
1.2实验小鼠
6周龄SPF级雌性Balb/C小鼠。
1.3杂交瘤的制备
使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得分泌单抗的杂交瘤细胞,详细方法参见Ed Harlow et al.,“Antibodies ALaboratory Manual”,Cold Spring HarborLaboratory 1988。简要过程如下:
1、小鼠免疫:首先将100ug多肽与弗式完全佐剂(CFA)等体积混合并乳化,然后经四肢肌肉多点注射对小鼠进行首次免疫。其次将50 ug多肽与弗式不完全佐剂(IFA)等体积混合并乳化,然后分别于首次免疫后第14天、28天、42天对小鼠进行加强免疫。最后,于首次免疫后第56天对小鼠进行腹腔免疫加强,免疫原为50ug多肽与PBS的等体积混合液。免疫结束后3天,后取小鼠脾脏进行融合实验。
2、细胞融合:取小鼠脾脏,研磨得到脾脏细胞悬液,然后与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合,并在PEG1500作用下进行细胞融合。将融合后的细胞用300mL融合培养基(含HAT和 20%FBS的RPMI-1640培养基)重悬,并分装到15块96孔细胞培养板中进行培养。
3、杂交瘤的筛选:将融合后的细胞在96孔细胞培养板上培养7到 10天,然后吸取细胞上清进行ELISA检测。检测用的多肽为217位点磷酸化的多肽。对于ELISA检测阳性的细胞孔,用217位点非磷酸化的多肽进行ELISA差异检测。对筛选到的对217位点磷酸化的多肽有反应、对217位点非磷酸化的多肽无反应的阳性克隆进行3次克隆化 (每次克隆化检测均进行差异筛选),得到能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。最终获得抗217位点磷酸化多肽的2A7细胞株。
4、杂交瘤的培养:将该稳定的杂交瘤单抗细胞株在二氧化碳培养箱中进行扩增培养,依次从96孔板转至24孔板、6孔板、10cm细胞板中。然后收集细胞板中的细胞,将其注射到小鼠腹腔内,7到10天后从小鼠腹腔中吸取含有单抗的腹水。
1.4单抗的纯化:将含有单抗的小鼠腹水用50%的饱和硫酸铵溶液进行处理。之后将获得沉淀溶解于PBS中,并使用Protein A柱纯化,以获得经纯化的单抗,并通过SDS-PAGE来鉴定所获得的单抗的纯度。
将获得的单抗进行PCR扩增,并将PCR产物送公司测序以获得序列,将获得的抗体命名为2A7,其具体序列如表1所示,其中,抗体的 CDR序列由IMGT编号系统(Lefranc etal.,Dev.Comparat. Immunol.27:55-77,2003)确定。
实施例2.2A7的特异性鉴定
2.1 2A7对天然tau蛋白的反应性及特异性
通过对PS19小鼠的脑组织进行蛋白质免疫印迹实验(Western Blot, WB)验证2A7对天然tau蛋白的反应性及特异性。分别取6月龄的野生型(Wild type,WT)小鼠(含有鼠源tau蛋白)、tau基因KO的野生型小鼠(Tau-KO)(不含有tau蛋白)以及PS19小鼠(过表达P301S突变tau蛋白(人源)的转基因小鼠,表达过度人源磷酸化的 tau蛋白)的脑组织。其中WT和Tau-KO小鼠脑组织分别用TNEN裂解液(20mM Tris-HCl pH=7.4,100mM NaCl,1mMEDTA,0.5% NP40)重悬,添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂后进行裂解。裂解完成后,4℃条件下12000rpm离心10min,取上清保存于-80℃备用。PS19小鼠脑组织同样使用TNEN裂解液重悬,添加蛋白酶抑制剂后进行裂解,离心后上清等分为三份,第一份加入磷酸酶抑制剂,存于 -80℃备用;第二份加入磷酸酶抑制剂,混合均匀取出一部分37℃孵育1h;第三份加入碱性磷酸酶,混合均匀取出一部分37℃孵育1h。分别取15μg以上鼠脑裂解液进行WB,以验证2A7对天然tau的反应性和特异性,以GAPDH作为内参。2A7的使用浓度为1μg/mL,并使用1:1000稀释的HRP标记的马抗鼠IgG(HAM-HRP,CST,7076S)进行显影(上海勤翔,ChemiScope6200)。
结果如图1所示,在图1中,2A7对PS19鼠脑裂解液具有很强的反应性(如图1中泳道3(PS19)和泳道5(PS19,37℃)所示),经碱性磷酸酶处理后,反应性显著降低(如图1中泳道4(PS19+CIP)所示)。同时,对WT小鼠、Tau基因KO的WT小鼠仅有弱反应性(分别如图1中泳道1(WT)、泳道2(Tau-KO)所示)。
通过组织免疫荧光染色对2A7的反应性及特异性进行验证。实验分为6组,分别使用AD无关IgG抗体(对应于图2中第二列IgG)、 2A7抗体(对应于图2中第四列p-tau 217)、217位点磷酸化的多肽阻断后的2A7抗体(对应于图2中第五列217peptide block)对PS19小鼠脑组织切片进行染色;分别使用AD无关IgG抗体(对应于图2中第一列IgG)以及2A7抗体(对应于图2中第三列p-tau 217)对WT小鼠脑组织切片进行染色。其中,以上抗体使用量均为1μg,多肽使用量均为5μg。取13月龄的WT及PS19小鼠脑组织进行冰冻切片。将两片WT小鼠脑组织、四片PS19小鼠脑组织分别用PBST洗3遍,每次洗涤10分钟。之后分别用含有10%的驴血清(Solarbo,SL050)以及 0.3%Triton X-100的PBST封闭,室温孵育1小时。将以上抗体分别加入200μL封闭液中,并加入到对应的小鼠脑组织中,4℃孵育过夜。回收以上抗体,用PBST洗涤脑片3次,每次洗涤10分钟。用封闭液将荧光二抗以及DAPI分别按照1:500、1:1000的比例稀释,并加入到对应的小鼠脑组织切片中,室温避光孵育1小时。之后除去荧光标记的二抗,避光条件下,PBST洗涤脑片3次,每次洗涤10分钟。用抗荧光淬灭剂进行封片,4度避光保存。最后用Zeiss 880进行拍照。
结果如图2所示,与WT小鼠以及无关抗体相比,2A7抗体可以特异性的识别PS19海马区和皮层区的tau蛋白,经与217位点磷酸化的多肽孵育后,2A7抗体对PS19海马区和皮层区tau蛋白的结合能力降低。
2.2 2A7对天然tau蛋白217位点突变体的反应性及特异性
分别构建CTR4-Tau以及217磷酸化位点突变的CTR4-T217A载体,CTR4-Tau载体的插入片段为编码tau蛋白(如SEQ ID NO:10所示)的核苷酸序列,CTR4-T217A载体的插入片段为编码第217位突变的tau蛋白(如SEQ ID NO:11所示)的核苷酸序列。同时转染293T 细胞,48h后收集细胞,以PLCDH-GFP作为对照。利用TNEN(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)进行裂解,裂解完成后在4℃条件下 12000rpm离心10min,取上清测浓度后保存于-80℃备用。
以上上清测定浓度后,分别取15μg进行WB,以验证2A7的特异性,以β-actin作为内参。2A7的使用浓度为1ug/mL,并使用1:1000 稀释的GAM-HRP作为二抗,进行显影。
真核表达的tau蛋白第217位氨基酸会被细胞内的激酶磷酸化,因此可以被2A7抗体所识别;而217位点的突变是将217位的氨基酸T 突变为A,突变后该位点氨基酸不能被磷酸化。结果如图3所示,2A7 对真核表达的tau蛋白(图3中的泳道2)的反应性高于217位点突变后的tau蛋白(图3中的泳道3)。
实施例3.2A7抗体对AD病人及PS19小鼠脑脊液中p-tau 217的检测
本实施例采用tau蛋白病的模型小鼠,即PS19小鼠进行实验。取 13月龄的PS19小鼠的脑脊液(CSF)。对于脑脊液的采集,参考Lim 等优化的采集小鼠脑脊液的方法(具体请参见Lim,N.K.,V.Moestrup, X.Zhang,W.A.Wang,A.Moller and F.D.Huang(2018)."AnImproved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from AnesthetizedMice."J Vis Exp(133)),即麻醉小鼠,通过手术暴露出小鼠枕大池上的硬脑膜,在体视镜下,避开血管,使用玻璃毛细管尖端刺破硬脑膜吸取脑脊液,然后将脑脊液收集于加有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的1.5mL 离心管中,存于-80℃备用。16例AD病人脑脊液,来源于苏州宇测生物有限公司。
使用检测试剂盒(货号:Lite-P64050,苏州宇测),对AD及 PS19小鼠脑脊液中p-tau 217的含量进行检测。其中小鼠脑脊液用马血清稀释5倍,AD脑脊液样本原倍检测,样本反应及分析均在Ast-Dx90 单分子免疫诊断仪进行。
按Sc-lite单分子免疫检测仪的说明书操作步骤完成试剂校准质控流程。将样本、试剂按顺序装载至指定位置,准备就绪后启动测试,设备自动将样本送入上样位置,同时将反应杯载入孵育盘中,取样针从96 孔板中吸取25μL样品加入反应杯,试剂针从试剂盒中吸取25μL包被有捕获抗体的磁珠溶液(试剂1)加入反应杯,混匀孵育6min。
试剂针从试剂盒中吸取10μL修饰有单分子信号标记物的检测抗体 (试剂2)加入反应杯,混匀孵育4min,试剂2中含有修饰检测抗体的单分子信号标记物,能够将靶标分子转化为单分子信号。
检测针将反应体系转移至流通池中,利用磁分离将磁珠吸引至流通池底部并平铺于检测孔的表面,洗涤去除其他组分,然后用集成荧光显微镜拍摄荧光图像,通过机器分析单分子信号,并使用预先准备的标准曲线计算生物标志物浓度。
实验结果如图4所示,图4显示使用2A7抗体可以检测出AD病人脑脊液及PS19小鼠脑脊液等样品中的p-tau 217的含量。
实施例4.PS19小鼠2A7抗体的鼻腔给药
本研究采用鼻腔给药的方式,检测2A7抗体对PS19小鼠(tau蛋白病的模型小鼠)的病理及行为学的改善作用。
4.1抗体准备
将制备好的2A7抗体以及与AD无关IgG抗体用PBS稀释至浓度为0.5μg/μl及1μg/μl,分装后于-80度保存。
4.2实验小鼠及分组
5月龄SPF级雄性PS19小鼠,20~25g。实验分为3组:WT小鼠经鼻腔给IgG抗体组(WT-IgG)、PS19小鼠经鼻腔给IgG抗体组 (PS19-IgG)及PS19小鼠经鼻腔给2A7抗体组(PS19-2A7),每组 13只小鼠。
4.3抗体鼻腔给药、剂量
实验的小鼠均采用鼻腔给药,用异氟烷麻醉后将其仰卧,用微量注射器缓慢将抗体滴入鼻孔,滴入时将嘴闭合,以利于溶液吸收。
每3天给抗体一次,连续给药5个月。每只小鼠给药体积为20μl,前3个月每只给药10μg,后两个月每只给药20μg。
实施例5.PS19小鼠经2A7抗体治疗后行为学变化
实施例4中处理过的所有小鼠的行为学实验均采用Smart Video TrackingSoftware(Panlab,Harvard Apparatus)进行数据采集及分析处理。动物行为学实验于每天9:00a.m.-7:00p.m.之间进行,实验室内的光强度为650lux。
a.测试者于实验开始前三天接触抚摸小鼠,每天一次,每次抚摸一只小鼠,轻柔地抓取小鼠,让小鼠在测试者手上停留30s,并用记号笔在鼠尾上划线标记,标记完小鼠后抓取尾巴,轻柔地将其放回鼠笼;
b.实验当天,在实验前先将待测试小鼠转移至实验间,让小鼠适应周围环境及光线;准备开始实验前,用75%乙醇清洁实验所用的箱体和迷宫。每轮实验结束后使用75%乙醇对箱体和迷宫进行擦拭,清除实验过程中小鼠排泄的粪便和尿液,排除小鼠残留的气味对测试结果的干扰。
5.1旷场
旷场实验用于研究小鼠的自主运动能力以及焦虑行为,主要基于小鼠对于亮光以及开阔空间的趋避性。将旷场箱内部场地(长40cmx宽 40cmx高40cm)分为16小格,周边12格定义为周边区,中间4格定义为中央区(Center);将小鼠放入旷场箱内正中央,每只小鼠放置位置要相同(同一格、同一方向);让小鼠在迷宫里自由探索5min,记录小鼠在迷宫中总的运动距离以及在迷宫中间区域活动的时间(Time in center)。
5.2新物体识
新物体识别实验是利用啮齿类动物天性对于新物体有好奇探索的原理而建立的学习记忆测试方法。
第一天,将小鼠放入旷场箱(长40cmx宽40cmx高40cm)内正中央,每只小鼠放置位置相同(同一格、同一方向),让小鼠适应性训练5min;第二天,在旷场箱内一侧放置两个相同的物体A和B,将小鼠面向箱壁轻轻放入旷场箱内,放置位置与两物体间的尽量距离相同,让小鼠自由探索8min;第三天,保持物体位置不变,用新物体C 更换其中一个旧物体(A或B);将小鼠面向箱臂放入旷场箱内,放入位置与两物体间的距离相同,让小鼠自由探索8min小鼠鼻子触及物体或者鼻子在距离物体2cm内指向物体都被视为探索行为;用摄像系统记录小鼠探索熟悉物体和探索新物体的时间。
5.3水迷宫测试
Morris水迷宫实验用于研究评价小鼠的空间学习、记忆能力。
水迷宫在一个圆形的水箱(半径60cmx高100cm)中进行,水箱中注水的高度以超过平台2cm为宜,水箱内水的温度设定为22℃。迷宫臂内四个方向(E、S、W、N)分别贴有四个不同形状的图标作为空间定位参照物。在训练实验中,平台在水面下2cm,然后将小鼠从迷宫的四个入水点放入,让小鼠寻找平台60s,以小鼠停留在平台上10s 为实验停止的标准。若小鼠在60s内没法找不平台,就用尺子引导小鼠到平台所在的位置,并让小鼠在平台上面停留10s。每只小鼠每天测试 2次,2次分别从两个不同的方位入水,每只小鼠两次实验的间隔时间至少要1h。记录小鼠找到平台的潜伏时间(Escape latency),小鼠总的游泳距离和游泳的平均速度,如此连续进行7天的学习训练。
平台实验:第8天,撤掉平台,然后从平台对角线的位置将小鼠轻轻放入水中,让其搜索原来平台所在区域60s,记录小鼠在原来平台所在区域穿梭的次数(Number ofcrossing)以及小鼠在平台所在目标象限以及其他三个不同象限的游泳时间(Time inquadrants)。每天更换迷宫中的水,周围物体和实验人员数量和位置固定不变。
实验结果如图5所示,经2A7抗体治疗后,10.5月龄PS19小鼠行为学有明显改善。具体来说,新物体识测试中PS19-2A7组与PS19-IgG 相比小鼠探索新物体的时间明显增加(图5A);旷场实验测试中,经 2A7抗体治疗后,PS19小鼠在箱体中间时间停留明显减少,表明小鼠对周围光亮感知及空间趋避能力提高(图5B)。Morris水迷宫实验显示,PS19-2A7组小鼠空间学习及记忆能力与PS19-IgG相比有明显提高 (图5C和图5D)。
实施例6.核磁共振检测PS19小鼠经2A7抗体治疗后海马体积变化
行为学结束后,将上述实验的小鼠(10.5月龄)进行磁共振成像 (MRI)。未经治疗或经无效抗体治疗的PS19小鼠海马体积会有明显萎缩,2A7抗体的治疗效果可通过小鼠海马体积萎缩程度来进行评价。
磁共振成像数据采集与分析
所有实验动物MRI实验均在9.4T Bruker小动物成像仪上进行,实验中所使用的线圈为小动物脑线圈。动物成像过程中全程使用1.5%异氟烷/氧气混合气体对小鼠进行麻醉,同时利用呼吸监控传感器实时监测小鼠的呼吸状况。使用扫描仪进行轴状位T1WI-3D解剖结构及 T2WI-3D病理结构成像扫描;磁共振扫描序列及参数如下:(1)T1- weightedMRI:TR(重复时间)=2500ms,TE(回波时间)=33ms, field of view(扫描野)=2×2cm,matrix(矩阵)=256×256,SI(层间距)=0.5mm,FA(反转角)=180°,slices(层数)=15。核磁共振扫描结果使用imageJ对图像进行分析,并对海马区进行3D重构。
实验结果如图6所示,图6A为核磁共振检测WT-IgG、PS19-IgG 与PS19-2A7组小鼠脑轴向位解剖结构(T1)及3D重构的结果;图6B 为WT-IgG、PS19-IgG与PS19-2A7组小鼠海马体积统计结果。上述结果显示,经2A7抗体治疗后,10.5月龄PS19小鼠海马萎缩情况明显被抑制。
实施例7.PS19小鼠经2A7抗体治疗后脑组织病理变化
7.1荧光抗体及使用比例
抗体X=1:200;AT8=1:200(Invitrogen,MN1020);IBA1=1:500 (Wako,019-19741);NeuN=1:400(CST,24307)
7.2组织冰冻切片
1、取上述实验的小鼠,用5%水合氯醛麻醉,分别用预冷的 1×PBS和4%PFA(in 1×PBS,pH7.4)进行灌注,剥离取出大脑,并于4%PFA中继续固定,4℃过夜;
2、第二天,倾去固定液,换为25%蔗糖(in 1×PBS)于4℃进行脱水。
3、第三天,倾去25%蔗糖,换为30%蔗糖(in 1×PBS)于4℃进行脱水。每天更换蔗糖,30%蔗糖持续脱水3天。待组织脱水彻底后,用干净的滤纸吸去大脑组织表面液体,用德国徕卡Leica冰冻包埋剂 (JUNG tissue freezing medium)包埋大脑,进行冰冻切片,切片厚度为40μm;
4、选取完好合适的切片,于1×PBS中,室温漂洗,10minx3 次;
5、弃PBS,用含有10%的驴血清(Solarbio,SL050)以及0.3% Triton X-100的PBS封闭,室温孵育1小时。
6、吸去封闭液,孵育一抗;一抗用封闭液(含10%的驴血清+ 0.3%Triton X-100,in 1×PBS)稀释成所需浓度,4℃孵育过夜;
7、回收一抗,1×PBST(含0.3%Triton X-100的1×PBS)洗10 minx3次;吸去PBST,孵育二抗;用封闭液将荧光二抗以及DAPI分别按照1:500、1:1000的比例稀释,并加入到对应的小鼠脑组织切片中,室温避光孵育1小时。
8、吸去二抗,1×PBST洗10minx3次;吸去PBST,将脑片用毛笔挑取放在1×PBS中,用粘附性玻片捞取脑片,晾干,用索莱宝抗荧光淬灭剂封片,然后用指甲油将盖玻片边缘封闭好,4度避光保存。
9、用倒置激光共聚焦(Zeiss 880)拍照分析。
实验结果如图7所示,其中,图7A、B免疫荧光染色结果显示 PS19-2A7组小鼠神经元丢失明显减少;图7C、D显示了PS19-2A7组小鼠磷酸化p-tau 217信号明显减少;图7E、F显示了PS19-2A7组小鼠小胶质细胞增生明显被抑制。实验结果表明,经2A7抗体治疗后, 10.5月龄PS19小鼠病理明显减轻。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 针对p-tau 217的抗体及其用途
<130> IDC220141
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
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<223> CTR4-T217A
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Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
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Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
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<223> 编码2A7 VH的核苷酸序列
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gaattcgaag ttaagctgca gcagtctggg ggaggcttag tgcagcctgg agggtcccgg 60
aaactctcct gtgaagcctc tggattcact atcagtagct ttggaatgca ctgggttcgt 120
caggctccag agaaggggct ggaatgggtc gcatacatta gtagtggcag taataccatc 180
tactatgcag acacagtgaa gggccgattc accatctcca gagacattcc caagaacacc 240
ctattcctgc aaatgaccag tctaaggtct gaggacacgg ccatgtatta ctgtgcaaga 300
cgactcgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagccaa aacaacaccc 360
ccatcagtct atccactggc ccctagatct 390
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<213> artificial
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<223> 编码2A7 VL的核苷酸序列
<400> 13
gagctcgaca ttgtgctcac acaaactcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 60
gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttcca tgtactggta ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccagact cctgattttt gacacatcca acctggcttc tggagtccct 180
gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag ccgaatggag 240
gctgaagatg ttgccactta ttactgccta cagtggagta gttacccgct cacgttcggt 300
gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc cgcatgc 357
Claims (15)
1.特异性结合p-tau 217蛋白的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)包含下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):
(i)VH CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:3,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(ii)VH CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:4,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(iii)VH CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:5,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;
和/或,
(b)包含下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):
(iv)VL CDR1,其由下述序列组成:SEQ ID NO:6,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(v)VL CDR2,其由下述序列组成:SEQ ID NO:7,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和
(vi)VL CDR3,其由下述序列组成:SEQ ID NO:8,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;
优选地,(i)-(vi)中任一项所述的置换为保守置换;
优选地,(i)-(vi)中任一项所述的CDR根据Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义;
优选地,(i)-(vi)中任一项所述的CDR根据IMGT编号系统定义;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段包含如下3个重链CDRs:如SEQ ID NO:3所示的VHCDR1、如SEQ ID NO:4所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:5所示的VH CDR3;和/或,如下3个轻链CDRs:如SEQ ID NO:6所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:8所示的VL CDR3。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NO:1所示的序列;
(ii)与SEQ ID NO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(iii)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和/或
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:
(iv)SEQ ID NO:2所示的序列;
(v)与SEQ ID NO:2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或
(vi)与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
优选地,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的重链框架区序列和/或轻链框架区序列;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段包含:具有如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。
3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的恒定区或其变体;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体,所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如,至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合;例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合);和/或
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体,所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如,至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合;例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合);
优选地,所述重链恒定区是IgG重链恒定区,例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区;
优选地,所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、scFv、scFv二聚体、骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双抗体(diabody)、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、单域抗体(sdAb)、双价域抗体;和/或,所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或多特异性抗体。
5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体或其抗原结合片段带有标记;优选地,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
6.分离的核酸分子,其编码权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或其重链可变区和/或轻链可变区;
优选地,所述核酸分子包含如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示的核苷酸序列。
7.载体,其包含权利要求6所述的核酸分子;优选地,所述载体为克隆载体或表达载体。
8.宿主细胞,其包含权利要求6的核酸分子或权利要求7的载体。
9.制备权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下,培养权利要求8所述的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
10.多特异性分子,其包含权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述多特异性分子特异性结合p-tau 217蛋白,并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标;
优选地,所述多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体或其抗原结合片段)。
11.药物组合物,其包含权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求10所述的多特异性分子,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂;
优选地,药物组合物还包含另外的药学活性剂;
优选地,所述另外的药学活性剂是具有治疗tau蛋白病(例如,AD)活性的药物。
12.试剂盒,其含有权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素;
优选地,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述第二抗体还包括可检测的标记,例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素;
优选地,所述试剂盒用于检测样本中p-tau 217的存在或其含量;
优选地,所述样本为获自受试者的脑脊液,全血,血清或血浆;
优选地,所述试剂盒还包含稀释样本的试剂(例如,马血清);
优选地,所述第二抗体包被于磁珠上。
13.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求10所述的多特异性分子,或权利要求11所述的药物组合物,在制备药物中的用途,所述药物用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗tau蛋白病;
优选地,所述tau蛋白病选自阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性;
优选地,所述tau蛋白病是AD;
优选地,药物还包含另外的治疗tau蛋白病(例如,AD)活性的药学活性剂;
优选地,所述受试者的脑脊液中含有p-tau 217蛋白;
优选地,所述受试者为哺乳动物,例如人。
14.一种检测p-tau 217蛋白在样品中的存在或其量的方法,其包括以下步骤:
(1)将所述样品与权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触;
(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与p-tau 217蛋白之间复合物的形成或检测所述复合物的量;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
15.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求10所述的多特异性分子,在制备试剂中的用途,所述试剂用于检测受试者是否患tau蛋白病,或者用于区分患阿尔兹海默症(AD)的患者或患其它tau蛋白病的患者;
优选地,所述tau蛋白病选自阿尔兹海默症(AD)、原发性年龄相关的tau蛋白病、慢性创伤性脑病、Pick病和皮质基底节变性;
优选地,所述tau蛋白病是AD;
优选地,所述试剂通过检测p-tau 217蛋白在样品中的量,以检测受试者是否患tau蛋白病,或者以区分患阿尔兹海默症(AD)的患者或患其它tau蛋白病的患者,且所述样品获自所述受试者或患者;
优选地,所述样品为获自受试者或患者的血液样品(例如,全血,血清,血浆)。
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