CN115443153A - Kras表位以及抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与KRAS的某些致癌突变形式结合的抗体，还涉及了KRAS的某些致癌突变形式的表位。本发明还涉及包含所述抗体的免疫偶联物和组合物，还提供了生产所述抗体的方法。本发明进一步提供了所述抗体治疗目的的用途，例如在治疗癌症方面。

Description

KRAS表位以及抗体
技术领域
本发明一般涉及表位和抗体领域，特别是致癌性KRAS突变体蛋白的表位和与致癌性KRAS突变体蛋白结合的抗体。本发明还涉及所述抗体的治疗用途，例如在治疗癌症方面。基于抗体的组合物和方法以及本发明的用途还扩展到偶联物和其他治疗性组合物、试剂盒和方法的使用。
背景技术
KRAS(也被称为K-Ras或Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)是一种小的GTP酶(鸟苷三磷酸酶)，作为双位开关，是调节细胞分化、增殖和生存的关键成分。它是最经常突变的肿瘤基因；在22％所有癌症中发现了突变形式，例如在许多结直肠癌、胰腺癌和肺癌中发现了突变的致癌形式。位于G12、G13和Q61残基的KRAS突变是人类癌症中的主要致癌突变。KRAS的G12和G13残基的常见致癌突变包括G12D、G12V、G12C、G12A、G12S、G12R、G13D和G13C。由于内在的GTP水解减少，这些残基的替换导致KRAS-GTP结合水平的构成性升高。尽管KRAS被认为是癌症研究中的关键，但还没有直接的抑制剂进入临床，而且KRAS经常被描述为一个“无法成药”的靶标。其不成功的主要原因之一是缺乏一个适合小分子的结合口袋。
成功靶向和功能性抑制KRAS的致癌突变形式，可以在癌症治疗领域提供一个长期寻求的解决方案。
发明内容
本发明人通过鉴定在G12或G13位置有突变的KRAS致癌突变形式的特定表位(或区域)来解决这一需求，所述表位既可被抗体接触，又特别有助于靶向，例如用抗体，以结合KRAS的所述致癌突变形式并抑制KRAS的所述致癌突变形式的活性。本发明人已经鉴定并产生了对应于(或基本对应于)这种表位的分离的多肽。本发明人还使用所述分离的多肽来产生与KRAS的所述致癌突变形式结合和抑制的抗体。
因此，一方面，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:17或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:18或与其基本同源的序列。
正如本发明其他地方所讨论的，所述分离的多肽可作为抗原肽，以产生与在G12或G13位置有突变的KRAS的致癌突变形式结合并抑制其活性的抗体。
除非上下文中另有明确说明，在本发明提及“分离的多肽”或“多肽”时，也可视为对"分离的表位"或"分离的抗原表位"的提及。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
所述SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的“X”残基是D(天冬氨酸)残基的实施方案是特别优选的。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:1或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:2或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:17或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:18或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
在一些实施方案中，其中分离的肽包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)(或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)组成)，优选“X”残基选自由D、V、C、A或R组成的组。因此，本文描述的与SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可以加以必要的调整地与SEQID:19的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)有关。
在分离的多肽包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)的一些实施方案中，优选“X”残基选自由D、C、A、S或R组成的组。因此，本文描述的与SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可以参照SEQ ID NO:20的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)进行必要的调整。
在分离的多肽包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)的一些实施方案中，优选“X”残基选自由D、C、A或R组成的组。因此，本文描述的与SEQ ID NO:17的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可以参照SEQ ID NO:21的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)进行必要的调整。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:1或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:2或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，本发明提供了一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在一些实施方案中，分离的多肽可在N-端和/或C-端包括一个或多个额外的氨基酸(即除了所述SEQ ID NO的氨基酸序列之外)。在一些优选的实施方案中，分离的多肽在N端可包括一个或多个额外的氨基酸。在一些优选的实施方案中，分离的多肽在C端可包括一个或多个额外的氨基酸。在一些优选的实施方案中，分离的多肽在N端和C端可包括一个或多个额外的氨基酸。在一些优选的实施方案中，分离的多肽在N端和/或C端可包括一个半胱氨酸(C)残基(或在N端和/或C端包括一个额外的半胱氨酸(C)残基)。在一些实施方案中，分离的多肽在N端可以包括一个半胱氨酸(C)残基。在一些实施方案中，分离的多肽在C端可以包括一个半胱氨酸(C)残基。在分离的多肽的末端配备半胱氨酸残基可以允许将所述多肽方便地连接到多肽载体上，例如本文其他地方所讨论的。
在一些实施方案中，分离的多肽在N端和/或C端可以包括一个或多个额外的修饰。例如，在一些实施方案中，分离的多肽可以是C端酰胺化的。在一些实施方案中，分离的多肽可以是N端乙酰化的。酰胺化和乙酰化多肽的方法是本领域众所周知的。在一些实施方案中，分离的多肽可具有修饰(化学基团或连接物(linker))，该修饰可用于将所述多肽附加(或连接或衔接)到多肽载体。修饰(化学基团或连接物(linker))可用于将所述多肽可在N端和/或C端将附加(或连接或衔接)到多肽载体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3或与其基本同源的序列，SEQ ID NO:4或与其基本同源的序列，SEQ ID NO:5或与其基本同源的序列以及SEQ ID NO:6或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:4或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:5或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:6或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:5或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
序列为SEQ ID NO:3的分离的多肽被用来产生本文中其他地方描述的名为G12DAb1的抗体。序列为SEQ ID NO:4的分离的多肽被用来产生本文中其他地方描述的名为G12DAb2的抗体。序列为SEQ ID NO:5的分离的多肽被用来产生本文中其他地方描述的名为G13DAb1的抗体。序列为SEQ ID NO:6的分离的多肽被用来产生本文中其他地方描述的名为G13DAb2的抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3或与其基本同源的序列，SEQ ID NO:4或与其基本同源的序列，SEQ ID NO:5或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:6或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:4或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:5或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:6或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3或与其基本同源的序列和SEQ ID NO:5或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，由选自以下组的氨基酸序列组成(或包括)：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5。
在一些实施方案中，本发明提供了一种由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了一种由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的分离的多肽。
在本发明的分离的多肽序列的范围内，与给定的氨基酸序列“基本同源”的序列可以是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3(例如1或2)个氨基酸替换或缺失或添加的序列，或与给定的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的序列，或具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。关于与分离的多肽“基本同源”的氨基酸序列，本文其他地方描述了“基本同源”序列的其他实例，并且这些“基本同源”序列的实例也适用于上述特定的多肽序列。
在符合本发明的“基本同源”的分离的多肽序列中，致癌突变(替换)的氨基酸残基不被改变。因此，在包括与SEQ ID NO:1“基本同源”的氨基酸序列(或由其组成)的分离的多肽中，S位于(或对应于)SEQ ID NO:1第3位的D残基没有改变(即保持或存在)。在包含与SEQID NO:2“基本同源”的氨基酸序列(或由其组成)的分离的多肽中，位于(或对应于)SEQ IDNO:2第4位的(或对应的)D残基没有改变(即保持或存在)。在包含与SEQ ID NO:3“基本同源”的氨基酸序列(或由其组成)的分离的多肽中，SEQ ID NO:3的第3位(或对应的)D残基没有改变(即保持或存在)。在包含与SEQ ID NO:4“基本同源”的氨基酸序列(或由其组成)的分离的多肽中，SEQ ID NO:4的第4位(或对应的)D残基没有改变(即保持或存在)。在包含与SEQ ID NO:5“基本同源”的氨基酸序列(或由其组成)的分离的多肽中，SEQ ID NO:5的第5位(或对应的)D残基没有改变(即保持或存在)。在包含与SEQ ID NO:6“基本同源”的氨基酸序列(或由其组成)的分离的多肽中，SEQ ID NO:6的第4位(或对应的)D残基没有改变(即保持或存在)。在包含与SEQ ID NO:17“基本同源”的氨基酸序列(或由其组成)的分离的多肽中，SEQ ID NO:17的第3位(或对应)的X残基没有改变(即保持或存在)。在包含(或由其组成)与SEQ ID NO:18“基本同源”的氨基酸序列的分离的多肽中，SEQ ID NO:18的第4位(或对应的)X残基没有改变(即保持或存在)。在包含与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21“基本同源”的氨基酸序列(或由其组成)的分离的多肽中，SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:21的第3位(或对应的)X残基没有改变(即保持或存在)。
在一些优选的实施方案中，与分离的多肽“基本同源”的氨基酸序列是具有或包括与给定的分离肽的氨基酸序列相比有1、2或3(优选1或2，更优选1)个氨基酸替换或添加或缺失的序列。
与分离的多肽“基本同源”的氨基酸序列包括包含所述分离的多肽的至少5个或至少6个连续氨基酸的序列(或由所述分离的多肽的至少5个或至少6个连续氨基酸组成的序列)(或包含所述分离的多肽的至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少11个连续氨基酸的序列，或由所述分离的多肽的至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少11个连续氨基酸组成的序列)。6个氨基酸是被抗体识别或结合的多肽/蛋白质序列的典型长度。
与分离的多肽“基本同源”的氨基酸序列包括具有或包括与给定的分离肽序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列(或由与给定的分离肽序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列组成)。优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。
氨基酸序列的改变可以是保守的或非保守的氨基酸。优选所述改变是保守的氨基酸替换。
本文所述的“保守的氨基酸替换”是指氨基酸残基被具有类似侧链的另一个氨基酸残基取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族在本领域已被定义，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
术语“基本同源”还包括本发明的氨基酸序列的修饰或化学等价物，它们以基本相同的方式执行与本发明的蛋白质基本相同的功能。例如，任何基本同源的分离的多肽通常应保留作为多肽或表位的能力，根据本发明，可以产生(或生成)结合KRAS的致癌突变形式的抗-抗体。
实施上述氨基酸操作的方法(如产生“基本同源”的序列)是本领域技术人员熟知的。
在一些实施方案中，分离的多肽不包含任何内部半胱氨酸残基。所谓“内部”残基是指在N端和/或C端残基以外的位置的残基。因此，在一些实施方案中，与一个给定的氨基酸序列“基本同源”的序列没有半胱氨酸(C)残基作为替换或额外的氨基酸。
同源性(如序列同一性)可以通过任何方便的方法来评估。然而，为了确定序列之间的同源性(如同一性)程度，对序列进行多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson，Higgins，Gibson，Nucleic Acids Res.，22:4673-4680，1994)。如果需要，Clustal W算法可与BLOSUM 62评分矩阵(Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:10915-10919，1992)以及空位开放罚分为10(gap openingpenalty)和空位扩展罚分为0.1(gap extension penalty)一起使用，以便在两个序列之间获得最高顺序的匹配，其中至少有一条序列的总长度的50％参与比对。其他可用于比对序列的方法是Needleman和Wunsch(Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.，48:443，1970)的比对方法，该方法经Smith和Waterman(Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.，2:482，1981)改进，以便在两个序列之间获得最高顺序的匹配，并且确定两个序列之间相同氨基酸的数量。其他计算两个氨基酸序列之间同一性百分比的方法一般都是本领域公认的，包括例如Carillo和Lipton(Carillo and Lipton，SIAM J.Applied Math.，48:1073，1988)描述的方法，以及计算分子生物学(Computational Molecular Biology)描述的，Lesk，e.d.OxfordUniversity Press，New York，1988，生物计算：信息学和基因组学项目(Biocomputing:Informatics and Genomics Projects)。
一般来说，将采用计算机程序进行这种计算。比较和比对成对序列的程序，如ALIGN(Myers和Miller，CABIOS，4:11-17，1988)，FASTA(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85:2444-2448，1988；Pearson，Methods in Enzymology，183:63-98，1990)和间隙BLAST(gapped BLAST)(Altschul等，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402，1997)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux，Haeberli，Smithies，Nucleic Acids Res.，12:387，1984)也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所(European Bioinformaticsinstitute)的Dali服务器提供基于结构的蛋白质序列的比对(Holm，Trends inBiochemical Sciences，20:478-480，1995；Holm，J.Mol.Biol.，233:123-38，1993；Holm，Nucleic Acid Res.，26:316-9，1998)。
通过提供参考点，根据本发明具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性、序列同一性等的序列，可使用具有默认参数的ALIGN程序(例如可使用互联网上的GENESTREAM网络服务器，IGH，Montpellier，法国)来确定。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，它包括本文公开的分离的多肽序列(或与其基本同源的序列)的延长或缩短或循环版本(或由所述延长的、缩短的或循环的多肽版本组成)。延长的、缩短的和循环的多肽版本在本文其他地方讨论。
本发明的分离的多肽可包括公开的分离肽序列的延长的版本，或与公开的分离肽序列基本同源的氨基酸序列的加长版(或由所述延长的版本组成)。例如，一个或多个额外的氨基酸(例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或9、至少10、至少15或至少20个氨基酸，或1-5或1-10或1-20个氨基酸)可以存在于分离的多肽序列(或基本上与其同源的序列)的一端或两端。
本发明的分离的多肽可以包括本文公开的分离的多肽序列的缩短的版本，或公开的分离的多肽序列的缩短的版本(或由所述缩短的版本组成)。例如，一个或多个氨基酸(例如至少2个或至少3个，例如1-3个或1-2个或1个)可以从分离的多肽序列(或与其基本同源的序列)的一端或两端缺失。
在一些实施方案中，分离的多肽可以是至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10个氨基酸、至少11个氨基酸或至少12个氨基酸的长度，例如6至10、6至12、6至15、6至20、6至25、6至30、6至40、6至50、6至60、或6至75个氨基酸的长度。分离的多肽可以是，例如5至7、5至8、5至9、5至10、5至11、5至12、5至13、5至14、5至15、5至20、5至25、5至30、5至40、5至50、5至60、5至70、5至75氨基酸的长度。分离的多肽可以是，例如12至15、12至20、12至25、12至30、12至40、12至50、12至60、12至70、12至75个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，分离的多肽可以是≤50个氨基酸的长度，例如≤45、≤40、≤35、≤30、≤25、≤20、≤15或≤10个氨基酸的长度(例如5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、6-10、6-15、6-20、6-25、6-30、6-35、6-40、6-45、6-50、8-10、8-15、8-20、8-25、8-30、8-35、8-40、8-45、8-50、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、20-25、20-30、20-35、25-30、25-35或25-40、25-45、25-50、30-35、30-40、30-45、30-50、35-40、35-45、35-50、40-45、40-50或45-50的氨基酸的长度)。
在一些实施方案中，分离的多肽可以是≤20个氨基酸的长度，例如≤15、≤14、≤13、≤12、≤11、≤10个氨基酸的长度(例如5-10、5-15、5-20、6-10、6-15、6-20、8-10、8-15、8-20、10-15、10-20或15-20的氨基酸的长度)。在一些实施方案中，分离的多肽可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸的长度。)。在一些实施方案中，分离的多肽可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸的长度。
在一些实施方案中，分离的多肽可以是12个氨基酸的长度。在一些实施方案中，分离的多肽可以是13个氨基酸的长度。
典型的和优选的是，分离的多肽是线性多肽(或线性表位)。
合成多肽的方法在本领域是众所周知的。用于制备线性多肽(例如用于免疫和抗体生成)的常用技术是Fmoc SPPS(固相多肽合成，Solid Phase Peptide Synthesis)。在SPPS中，小的多孔珠用功能性连接物(linker)处理，在其上可以用反复的洗涤-耦合-洗涤循环建立肽链。然后用化学裂解法将合成的肽从珠子上释放出来。对于环状肽的合成，常见的方法是利用形成二硫桥(其中桥是由肽的两个半胱氨酸形成的，例如一个在N端，一个在C端)，或通过形成“头对尾”桥来环化，其中桥由典型的肽键组成。环状肽可以在固体支持物上形成。
合成多肽的其他方法包括使用其他化学合成方法，体外翻译，或通过将合适的表达载体引入细胞。
按照本发明的分离的多肽当然不包括按照本发明的KRAS的全长致癌突变形式，或KRAS家族中的任何其它全长(例如野生型或原生型)蛋白，或任何其它全长(野生型)蛋白。因此按照本发明的分离的多肽不包括全长的SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
本发明的分离的多肽虽然与按照本发明的KRAS的全长致癌突变形式的区域(或表位)相对应(或基本相对应)(例如如本文其他地方所述)，但它们本身并不在自然界中存在(即它们没有天然存在的对应物或不在自然界中孤立地存在)。因此，本发明的分离的多肽可以被认为是人工肽、合成肽、人造肽或非天然肽。
本发明的另一方面提供了偶联物。通常地，偶联物被配置为用于产生抗体。偶联物可以包含与多肽载体偶联(即链接或连接或结合)或与多肽载体混合的如上所定义的至少一种分离的多肽。
因此，一方面，本发明提供了一种包含本发明的分离的多肽的偶联物。偶联物通常包括本发明的分离的多肽和多肽载体，其中所述分离多肽与所述多肽载体偶联或混合。多肽载体通常会增强免疫原性。这可能是有用的，因为在某些情况下，提供(或展示或对应)抗原表位的短肽本身太小，不能引起免疫反应。
多肽载体通常是大的高分子，如蛋白质、多糖或聚合氨基酸。在一些实施方案中，多肽载体选自由钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白、聚赖氨酸等组成的组。通常优选KLH。
本发明的分离的多肽与多肽载体的偶联，例如可以是共价偶联或二硫桥。在一些实施方案中，本发明的分离的多肽可以在其N端或C端设有一个(额外的)半胱氨酸残基(例如本文其他地方所述)。这样的半胱氨酸残基通常有利于分离的多肽与多肽载体(如KLH)的偶联。在一些实施方案中，分离的多肽可以有一个修饰(例如化学基团，如炔丙基)，允许分离的多肽与多肽载体偶联。在一些实施方案中，分离的多肽通过标准的交联剂(如戊二醛)与多肽载体偶联。将分离的多肽与多肽载体连接的方法在本领域是众所周知的。
在一些实施方案中，根据本发明的分离的多肽(或偶联物)可以存在于溶液中或悬浮液中。因此，在一方面，本发明提供了一种组合物，包括本发明的分离的多肽，和可选的可接受的(如药学上可接受的)稀释剂、缓冲剂、防腐剂和/或赋形剂。
在一些实施方案中，分离的多肽(或偶联物)可以存在于(即附在或结合在)固体支持物(例如珠子或微珠或平板或微滴板)上。因此，在一方面，本发明提供一种固体支持物，其上附着(直接或间接附着)本发明的分离的多肽或偶联物。
本发明的分离的多肽(和偶联物)通常适用于根据本发明鉴定(或产生或生成)与KRAS的致癌突变形式结合的抗体。例如，本发明的分离的多肽通常适合作为抗原表位用于鉴定(或产生或生成)抗体。使用本发明的分离的多肽鉴定(或产生或生成)抗体可以通过任何合适的方法进行，技术人员熟悉合适的技术(例如在本文其他地方讨论的)。例如，本发明的分离的多肽(和偶联物)通常适合用于鉴定(或产生或生成)根据本发明与KRAS的致癌突变形式结合的多克隆抗体(如用本发明的分离的多肽(或偶联物)免疫的兔子等动物体内生成的多克隆抗体)，或用标准杂交瘤技术或噬菌体展示法鉴定(或产生或生成)单克隆抗体。换句话说，本发明的分离的多肽(和偶联物)通常代表(或对应于或基本对应于)根据本发明的KRAS致癌突变形式的有效表位，以根据本发明用抗KRAS抗体靶向。
通常，本发明的分离的多肽(和偶联物)适合用于鉴定(或产生或生成)根据本发明与致癌性突变形式的KRAS结合并抑制其活性的抗体。
本发明的分离的多肽(和偶联物)对应于(或基本对应于)根据本发明的KRAS的致癌突变形式的表位(或区域或部分)，该表位在(或位于)所述KRAS的致癌突变形式的区域(例如SEQ ID NO:8、9、11、12、13、14、15或16)的第10-21位氨基酸残基。
包含编码本文定义的本发明分离的多肽的核苷酸序列(或由所述核苷酸序列组成)的核酸分子，或与其基本同源的核酸分子，构成本发明的另一方面。
本发明与核酸序列相关的术语“基本同源”包括与起始核酸序列具有至少65％、70％或75％，优选至少80％，甚至更优选至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。
本文所用的术语“核酸序列”或“核酸分子”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括由非天然存在的单体或其部分组成的修改或替换序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。这些序列也可以包含修改过的碱基。这种修饰过的碱基的例子包括偶氮、偶氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。核酸分子可以是双链或单链的。核酸分子可以是全部或部分合成的或重组的。
另一方面，本发明提供一种包含本发明的分离的多肽(或偶联物)的组合物。此类组合物可进一步包括(例如混合)合适的稀释剂、载体、赋形剂和/或防腐剂(例如药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂和/或防腐剂)。
如上所述，本发明的分离的多肽(和偶联物)通常适合用于鉴定(或产生或生成)与本发明的KRAS的致癌突变体形式结合并抑制其活性的抗体。
因此，一方面，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，它与KRAS的致癌突变形式结合(或特异性识别或特异性结合)，所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS的G12或G13位置的氨基酸替换。其中，所述抗体与位于所述致癌突变形式的KRAS区域的表位结合，该区域由对应于野生型KRAS的第10-21位氨基酸残基定义，并且所述抗体抑制所述致癌突变形式的KRAS的活性。
在优选的实施方案中，KRAS(或K-Ras)的致癌突变形式是KRAS(或K-Ras)的人类致癌突变形式(即是一种人类蛋白)。
人类KRAS有两种异构体。它们是KRAS异构体2A和KRAS异构体2B。与本发明有关的野生型KRAS可以是KRAS异构体2A或KRAS异构体2B。野生型KRAS异构体2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。野生型KRAS异构体2B的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。因此，在一些实施方案中，与本发明有关的野生型KRAS具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，与本发明有关的野生型KRAS具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。野生型KRAS异构体2A和野生型KRAS异构体2B在第10-21位氨基残基具有相同的序列(实际上SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:10在第1-150位残基是相同的)。
根据本发明，KRAS的致癌突变形式可以是根据本发明的KRAS异构体2A的致癌突变形式或KRAS异构体2B的致癌突变形式。
因此，在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:13、14、15或16的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选地，“X”残基选自由D、V、C、A或R组成的组。因此，本发明描述的与SEQ ID NO:13的氨基酸序列有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可比照SEQ ID:22的氨基酸序列作出必要的调整。本发明描述的与SEQ ID NO:15的氨基酸序列有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可以比照SEQ ID:23的氨基酸序列作出必要的调整。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选“X”残基选自由D、C、A、S或R组成的组。因此，本发明描述的与SEQ ID NO:13的氨基酸序列有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可以比照SEQ ID:24的氨基酸序列作出必要的调整。本发明描述的与SEQ ID NO:15的氨基酸序列有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可以比照SEQ ID:25的氨基酸序列作出必要的调整。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列，优选“X”残基选自由D、C、A或R组成的组。因此，本发明描述的与SEQ ID NO:13的氨基酸序列有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可以比照SEQ ID:26的氨基酸序列作出必要的调整。本发明描述的与SEQ ID NO:15的氨基酸序列有关的实施方案，在一些优选的实施方案中，可以比照SEQ ID:27的氨基酸序列作出必要的调整。
在优选的实施方案中，SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16中的X残基是一个D残基。
因此，在优选的实施方案中，KRAS的致癌突变形式中对应于野生型KRAS的G12位置的氨基酸置换(或突变残基)是G12D替换(即D是优选的突变残基)。在优选的实施方案中，KRAS的致癌突变形式在对应于野生型KRAS的G13位置的氨基酸替换(或突变残基)是G13D突变(即D是优选的突变残基)。
在一些优选的实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:8、9、11或12的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在一些实施例中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列(异构体2A，G12D突变)。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列(异构体2A，G13D突变)。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列(异构体2B，G12D突变)。
在一些实施方案中，KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列(异构体2B，G13D突变)。
KRAS异构体2A(SEQ ID NO:8)和KRAS异构体2B(SEQ ID NO:11)的G12D致癌突变形式在氨基残基10-21处具有相同的序列。KRAS异构体2A的G13D致癌突变形式(SEQ ID NO:9)和KRAS异构体2B(SEQ ID NO:12)在第10-21位氨基酸残基具有相同的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与KRAS的致癌突变形式结合，该突变形式包括在对应于野生型KRAS的G12位置的氨基酸替换(如SEQ ID NO:8、11、13或15)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与KRAS的致癌突变形式结合，该突变形式包括在与野生型KRAS的G13位置相对应的位置上的氨基酸替换(如SEQ ID NO:9、12、14或16)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与包括在野生型KRAS的G12位置对应的氨基酸替换的KRAS致癌突变形式(如SEQ ID NO:8、11、13或15)结合，并与包括在野生型KRAS的G13位置对应的氨基酸替换的KRAS致癌突变形式(如SEQ ID NO:9、12、14或16)结合。
SEQ ID NOs:8、9、11、12、13、14、15和16中列出的每个KRAS致癌突变形式中的第10-21位氨基酸与相应的野生型序列(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10)的氨基酸区对应，但第12位或13位的相关致癌突变氨基酸残基(氨基酸替换)的过程除外。
因此，在KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:8、9、11、12、13、14、15或16的氨基酸序列的实施方案中，本发明的抗体在由一个或多个所述序列的第10-21位氨基酸残基所定义的区域中与所述KRAS的致癌突变形式的一种或多种表位结合。
优选的KRAS致癌突变形式也在本文其他地方讨论。
如本发明其他地方所讨论的，本发明的抗体通常与根据本发明的KRAS的致癌突变形式的表位结合，该表位位于所述KRAS的致癌突变形式的区域，该区域由对应于野生型KRAS的第10-21位氨基酸残基所定义。在一些实施方案中，根据本发明所结合的整个表位位于KRAS致癌突变形式的所述区域内。在一些实施方案中，根据本发明，结合的表位的至少一个氨基酸位于KRAS的致癌突变形式的所述区域内。
在优选的实施方案中，本发明的抗体与本发明的分离的多肽或偶联物结合(或能够与之结合)。优选的分离的多肽和偶联物以及分离的多肽和偶联物的优选组在本文其他地方所定义。在优选的实施方案中，本发明的抗体与本文其他地方所述的优选分离的多肽或偶联物结合。抗体与分离的多肽结合的能力可以通过任何适当的手段和技术人员熟悉合适的方法进行评估(例如ELISA检测，如评估给定的分离的多肽是否能与符合本发明的KRAS的全长致癌突变形式竞争抗体结合的ELISA检测)。
评估抗体与分离的多肽(或偶联物)结合能力的合适的ELISA检测方法在本文的实施例部分有描述。
在一些实施方案中，本发明的抗体与包括(或由)选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的氨基酸序列的分离的多肽结合(或能够结合)，或与包括这种分离的多肽的偶联物结合(或能够结合)。
在一些实施方案中，本发明的抗体与包括(或由)选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的组的氨基酸序列的分离的多肽结合(或能够结合)，或与包括这样的分离的多肽的偶联物结合(或能够结合)。
在一些实施方案中，本发明的抗体与包括(或由)选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的氨基酸序列的分离的多肽结合(或能够与之结合)，或与包括这种分离的多肽的偶联物结合(或能够与之结合)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与至少一个包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的本发明的分离的多肽和至少一个包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的本发明的分离的多肽结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与至少一个包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的本发明的分离的多肽和至少一个包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的本发明的分离的多肽结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与至少一个由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4(优选SEQ ID NO:3)的氨基酸序列组成的本发明的分离的多肽和至少一个由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6(优选SEQ ID NO:5)氨基酸序列组成的本发明的分离的多肽结合。
尽管优选的本发明抗体与本发明的分离的多肽或偶联物结合(或能与之结合)，当然它们通常也与根据本发明的KRAS的全长(或原生)致癌突变体形式(优选根据本发明的人类致癌突变体形式，例如SEQ ID NO:8、9、11、12、13、14、15或16，优选8、9、11或12)结合。
在一些实施方案中，根据本发明的KRAS的全长(或原生)致癌突变形式(优选根据本发明的人类致癌突变形式)是在细胞，优选在哺乳动物细胞，更优选在人类细胞中表达的KRAS的致癌突变形式。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的KRAS的致癌突变形式是在细胞中(或在细胞中表达)的KRAS的致癌突变形式。在优选的实施方案中，所述细胞是癌细胞或癌细胞系。这样的癌细胞或细胞系可包括但不限于乳腺癌细胞或乳腺癌细胞系(如细胞系MDA-MB-231)、肺癌细胞或肺癌细胞系(如细胞系SK-LU1)、结肠癌细胞或结肠癌细胞系(如细胞系HCT116或细胞系LS174T)、或胰腺癌细胞或胰腺癌细胞系(如MIA-PA-CA-2)。乳腺癌细胞系MDA-MB-231是一种人类细胞系，它携带KRAS的G13D突变。肺癌细胞系SK-LU1是携带KRAS的G12D突变的人类细胞系。结肠癌细胞系HCT116是一个携带KRAS的G13D突变的人类细胞系。结肠癌细胞系LS174T是一个携带KRAS的G12D突变的人类细胞系。结肠癌细胞系SW620是携带KRAS的G13V突变的人类结直肠腺癌细胞系。胰腺癌细胞系MIA-PA-CA-2是一种携带KRAS中G12C突变的人类细胞系。根据本发明所述的抗体与KRAS的致癌突变形式的结合可以通过任何合适的手段进行评估，技术人员将熟悉合适的方法(如ELISA检测或免疫细胞化学或使用功能检测，如本发明其他地方所述)。
本发明的分离的多肽对应于或基本对应于按照本发明的KRAS全长致癌突变形式(优选按照本发明的人致癌突变形式，例如SEQ ID NO:8、9、11、12、13、14、15或16)的某些区域或表位。
序列为SEQ ID NO:17的分离的多肽对应于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15中所述的符合本发明的KRAS的人类致癌突变形式的第10-21位残基。
序列为SEQ ID NO:18的分离肽对应于SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中所述的符合本发明的人类致癌性KRAS突变形式的第10-21位残基。
序列为SEQ ID NO:1的分离肽对应于SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11中所述的符合本发明的人类致癌突变形式的KRAS的第10-21位残基。
序列为SEQ ID NO:2的分离肽对应于SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12中所述的符合本发明的人类致癌突变形式的KRAS的第10-21位残基。
序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的分离肽与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11中所述的符合本发明的人类致癌突变形式的KRAS的第10-21位残基基本对应。
序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的分离肽与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12中所述的符合本发明的人类致癌突变形式的KRAS的第10-21位残基基本对应。
在分离的多肽序列的上下文中，“对应”是指分离的多肽的氨基酸序列(SEQ IDNO:)与根据本发明的人致癌性KRAS突变形式的所述区域或表位的氨基酸序列相匹配。所谓“基本对应”是指分离的多肽(SEQ ID NO:)的氨基酸序列可被识别为基于(或来自或修改自)根据本发明的人致癌突变形式KRAS的所述区域或表位的序列。例如，具有根据本发明“基本对应于”人类致癌突变形式KRAS的所述区域或表位的序列的分离的多肽，与根据本发明对应于(即完全对应于)人类致癌突变形式KRAS的所述区域或表位的序列的分离的多肽相比，通常具有一个或多个(例如1、2或3)氨基酸的替换、添加或删除。因此，根据本发明，具有“基本对应于”人类致癌突变形式KRAS的所述区域或表位的序列的分离的多肽可被认为是本文其他地方定义的“基本同源”的分离的多肽序列。
如上所述，本发明的抗体与至少一种符合本发明的KRAS的致癌突变形式结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体与具有SEQ ID NO:13、14、15或16的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式结合。在一些实施方案中，本发明的抗体与至少一种具有SEQ IDNO:13或15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式结合，并与至少一种具有SEQ ID NO:14或16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体与具有SEQ ID NO:8、9、11或12的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式结合。在一些实施方案中，本发明的抗体与至少一种具有SEQ ID NO:8或11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式结合，并与至少一种具有SEQ ID NO:9或12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体与致癌突变形式的KRAS结合(并优选抑制其活性)，该KRAS在第12位具有给定的致癌突变残基(例如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15中潜在的第12位残基之一，即D或V或C或A或S或R)，并且也与KRAS的致癌突变形式结合(即额外结合或额外能够结合)，该致癌突变形式在第13位而不是第12位具有所述的(即具有相同的)致癌突变残基。
例如，在一些实施方案中，本发明的抗体与在第12位有D(天冬氨酸)残基的KRAS致癌突变形式结合(并优选地抑制其活性)，并且还与在第13位而不是第12位有D(天冬氨酸)残基的KRAS致癌突变形式结合(即额外结合或额外能够结合)。
在一些实施方案中，本发明的抗体与致癌突变形式的KRAS结合(并优选抑制其活性)，该KRAS在第13位有一个特定的致癌突变残基(例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中潜在的第13位残基之一，即D或C)，同时也与KRAS的致癌突变形式结合(即额外结合或额外能够结合)，该致癌突变形式在第12位而不是第13位具有所述的(即具有相同的)致癌突变残基。
在不希望受理论约束的情况下，至少在某些情况下，致癌突变残基的性质(即特征)被认为可能与它的精确位置(即第12位与第13位)一样(或更)重要，因为第12位和第13位之间的距离差异很小。因此，在一些实施方案中，结合(并优选抑制)在第12位具有给定突变残基的KRAS致癌突变形式的抗体也可以与在第13位而不是第12位具有相同的给定突变残基的一个或多个其他的KRAS致癌突变形式结合。同样，在一些实施方案中，结合(并优选抑制)在第13位具有给定突变残基的KRAS致癌突变形式的抗体也可与在第12位而非第13位具有相同的给定突变残基的一个或多个其他的KRAS致癌突变形式结合。在G12D和G13D突变KRAS的情况下，本发明的某些抗体被认为与带负电荷的天冬氨酸(D)残基结合，但由于距离上的微小差异，某些抗体可以容纳第12或第13位的任意一个D残基。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:148或优选SEQ ID NO:149的氨基酸序列，或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:150或优选SEQ ID NO:151的氨基酸序列，或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:34或54或74的氨基酸序列，或与其基本同源的序列的VHCDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:152或优选SEQ ID NO:153的氨基酸序列，或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:154或优选155的氨基酸序列，或与其基本同源的序列的VLCDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本发明的其他地方有描述。优选的，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
在本发明的一些实施方案中，VH CDR1具有或包括SEQ ID NO:148(X1 Y X3 M H)的氨基酸序列。在这些实施方案中，X1或X3可以是任何氨基酸。优选的X1残基是D或R。因此，一个优选的VH CDR1具有或包括SEQ ID NO:149的氨基酸序列。例如，本实施方案的优选VHCDR1序列具有或包括SEQ ID NO:32、52或72。
在本发明的一些实施方案中，VH CDR2具有或包括SEQ ID NO:150的氨基酸序列(X1 I X3 P N X6 G G X9 X10 X11 N X13 X14 F K X17)。在这些实施方案中，X1、X3、X6、X9、X10、X11、X13、X14和X17可以是任何氨基酸。优选的是这些X残基中的一个或多个，最优选的是全部，选自以下组别：X1是Y或R(优选Y)；X3是N或D(优选N)；X6是N或S(优选N)；X9是A或T；X10是S或Y或T；X11是Y或F(优选Y)；X13是Q或E(优选Q)，X14是K或R；X17是G或S(优选G)。因此，一个优选的VH CDR2具有或包括SEQ ID NO:151的氨基酸序列。例如，本实施方案的优选VH CDR2序列具有或包括SEQ ID NO:33、53或73。
在本发明的一些实施方案中，VL CDR1具有或包括SEQ ID NO:152的氨基酸序列(SA X3 S S V X7 Y M H)。在这些实施方案中，X3和X7可以是任何氨基酸。优选的是这些X残基中的一个或两个都选自下组：X3是S或G；X7是S或D。因此，优选的VL CDR1具有或包括SEQ IDNO:153的氨基酸序列。例如，本实施方案的优选VL CDR1序列具有或包括SEQ ID No:35、55或75。
在本发明的一些实施方案中，VL CDR2具有或包括SEQ ID NO:154(D T S K X5 AS)的氨基酸序列。在这些实施方案中，X5可以是任何氨基酸。优选X5是V或L。因此，一个优选的VL CDR1具有或包括SEQ ID NO:155的氨基酸序列。例如，本实施方案中优选的VL CDR1序列具有或包括SEQ ID No:36、56或76。
VH CDR序列和VL CDR序列的某些优选组合在下表H中编号为1-15的每一行中列出：
表H
Figure BDA0003905756260000191
Figure BDA0003905756260000201
在表H所述的本发明的实施方案中，优选如SEQ ID NO:148所述的共有序列是如SEQ ID NO:149所述的序列。在表H中列出的本发明的实施方案中，优选如SEQ ID NO:150所述的共有序列是如SEQ ID NO:151所述的序列。在表H中列出的本发明的实施方案中，优选如SEQ ID NO:152所述的共有序列是如SEQ ID NO:153所述的序列。在表H中列出的本发明的实施方案中，优选如SEQ ID NO:154所述的共有序列是如SEQ ID NO:155所述的序列。在一些实施方案中，可以采用与表H中所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括一个VH CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:148或优选为SEQ ID NO:149，和VH CDR2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:150或优选SEQ ID NO:151和/或(优选“和”)其中所述轻链可变区包括VL CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:152或优选SEQ ID NO:153，和VL CDR2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:154或优选SEQ ID NO:155。
在一些这样的实施方案中，优选轻链可变区包括具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL CDR3，或者轻链可变区包括具有SEQ IDNO:54和具有SEQ ID NO:57氨基酸序列的VL CDR3，或者轻链可变区包括具有SEQ ID NO:74氨基酸序列的VH CDR3和具有SEQ ID NO:77氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，可以采用与本段所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:52的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VHCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括
(d)具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:55的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VLCDR1，
(e)具有SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:56的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VLCDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR3，或与其基本同源的序列。基本同源的序列在本发明的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守的氨基酸替换的序列。
某些优选的VH CDR序列和VL CDR序列的组合在下表I中编号为1-2的每一行中列出：
表I
Figure BDA0003905756260000211
在一些实施方案中，可以采用与表I中所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)的VH CDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，它与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VHCDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VHCDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括
(d)具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL CDR1，或与其基本同源的序列，
(e)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VLCDR3。基本同源的序列在本发明的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守的氨基酸替换的序列。
某些优选的VH CDR序列和VL CDR序列的组合在下表J中编号为1-2的每一行中列出：
表J
Figure BDA0003905756260000221
在一些实施方案中，可以采用与表J中所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)的VL CDR2。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如一种分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括。
(a)具有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1。
(b)具有SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括
(d)具有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:75的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR1。
(e)具有SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，以及
(f)具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本文的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
某些优选的VH CDR序列和VL CDR序列的组合在下表K中编号为1-3的每一行中列出：
表K
Figure BDA0003905756260000231
在一些实施方案中，可以采用与表K中所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)的VL CDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:148(或优选SEQ ID NO:149)氨基酸序列的VH CDR1。在一些这样的实施方案中，优选VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR2和VH CDR3(例如其组合)具有本发明其他地方定义的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:150(或优选SEQ ID NO:151)氨基酸序列的VH CDR2。在一些这样的实施方案中，优选VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3、VH CDR1和VH CDR3(例如其组合)具有本文其他地方定义的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:152(或优选SEQ ID NO:153)氨基酸序列的VL CDR1。在一些这样的实施方案中，优选VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(例如其组合)具有本文其他地方定义的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:154(或优选SEQ ID NO:155)氨基酸序列的VL CDR2。在一些这样的实施方案中，优选VL CDR1、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(例如其组合)具有本文其他地方定义的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:37(或SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:77)的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)的VL CDR3。在一些这样的实施方案中，优选VL CDR1、VL CDR2、VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3(例如其组合)具有本文其他地方定义的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括一个重链可变区(VH)CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:148优选SEQ ID NO:149，和/或具有SEQ ID NO:150优选SEQ ID NO:151的氨基酸序列的VH CDR2，和/或所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:152优选SEQ IDNO:153的氨基酸序列的VL CDR1和/或具有SEQ ID NO:154优选SEQ ID NO:155的氨基酸序列的VL CDR2。在一些这样的实施方案中，该抗体进一步包括VL CDR3，其氨基酸序列为SEQID NO:37(或与其基本同源的序列)，和/或进一步包括VH CDR3，其氨基酸序列为SEQ IDNO:34或74(或与其基本同源的序列)。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:156或优选SEQ ID NO:157的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:158或优选SEQ ID NO:159的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:134的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:135的氨基酸序列或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:136的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本文的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
在本发明的一些实施方案中，VH CDR1具有或包括SEQ ID NO:156的氨基酸序列(TF G X4 G V X7)。在这些实施方案中，X4或X7可以是任何氨基酸。优选的是X4残基是V或M，优选的是X7残基是A或G。因此，优选的VH CDR1具有或包括SEQ ID NO:157的氨基酸序列。例如，本实施方案的优选VH CDR1序列具有或包括SEQ ID NOs:92、112或132。
在本发明的一些实施方案中，VH CDR2具有或包括SEQ ID NO:158的氨基酸序列(HI W W D D K N Y X11 P A L K S)。在这些实施方案中，X11可以是任何氨基酸。优选X11为D或F。因此，一个优选的VH CDR2具有或包括SEQ ID NO:159的氨基酸序列。例如，本实施方案的优选VH CDR2序列具有或包括SEQ ID NOs:93、113或133。
某些优选的VH CDR序列和VL CDR序列的组合在下表M中编号为1-9的每一行中列出：
表M
Figure BDA0003905756260000251
Figure BDA0003905756260000261
在表M中列出的本发明的实施方案中，优选如SEQ ID NO:156所述的共有序列是如SEQ ID NO:157所述的序列。在表M中所列的本发明的实施方案中，优选如SEQ ID NO:158所述的共有序列是如SEQ ID NO:159所述的序列。在一些实施方案中，可以采用与表M中所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:156或优选SEQ ID NO:157的氨基酸序列的VH CDR1和具有SEQ ID NO:158或优选SEQ ID NO:159的氨基酸序列的VH CDR2。在一些这样的实施方案中，优选重链可变区包括具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR3，和/或(优选“和”)轻链可变区包括具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR3；或者重链可变区包括具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的VH CDR3，和/或(优选是“和”)轻链可变区包括具有SEQ ID NO:115氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:116氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:117氨基酸序列的VL CDR3；或者重链可变区包括具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH CDR3，和/或(优选是“和”)轻链可变区包括具有SEQID NO:135氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:136氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ IDNO:137氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，可以采用与本段所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括
(d)具有SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:135的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:136的氨基酸序列，或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:137的氨基酸序列的VL CDR3，或与其基本同源的序列。基本同源的序列在本发明的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守的氨基酸替换的序列。
某些优选的VH CDR序列和VL CDR序列的组合在下表N中编号为1-2的每一行中列出：
表N
Figure BDA0003905756260000271
在一些实施方案中，可以采用与表N中所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括一个VH CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:112(或与其基本相同的序列)，具有SEQ ID NO:113(或与其基本相同的序列)的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:114(或与其基本相同的序列)的氨基酸序列的VH CDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，它与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:113的氨基酸序列，或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的VL CDR1，或与其基本同源的序列。
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本文的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
某些优选的VH CDR序列和VL CDR序列的组合在下面表O中编号为1-2的每一行中列出：
表O
Figure BDA0003905756260000281
在一些实施方案中，可以采用与表O中所述的特定序列基本同源的序列，而不是特定序列本身。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)的VL CDR2。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:156(或优选SEQ ID NO:157)氨基酸序列的VH CDR1。在一些这样的实施方案中，优选VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR2和VH CDR3(例如其组合)具有本文其他地方定义的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:158(或优选SEQ ID NO:159)氨基酸序列的VH CDR2。在一些这样的实施方案中，优选VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1和VH CDR3(例如其组合)具有本文其他地方定义的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中重链可变区包括具有SEQ ID NO:156(优选SEQID NO:157)氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1，和/或具有SEQ ID NO:158(优选SEQ IDNO:159)氨基酸序列的VH CDR2。在一些这样的实施方案中，优选VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3和VH CDR3(例如其组合)具有本文其他地方定义的氨基酸序列。例如，在一些这样的实施方案中，VL CDR2可以具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本文的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
在一些实施方案中，所述抗体包括至少一个重链可变区，其包括序列为SEQ IDNO:32的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:33的VH CDR2和序列为SEQ ID NO:34的VH CDR3，和/或(优选“和”)至少一个轻链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:35的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:36的VL CDR2，和序列为SEQ ID NO:37的VL CDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本文的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
在一些实施方案中，该抗体包括至少一个重链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:52的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:53的VH CDR2和序列为SEQ ID NO:54的VH CDR3，和/或(优选“和”)至少一个轻链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:55的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:56的VL CDR2和序列为SEQ ID NO:57的VL CDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区域包括：
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1。
(b)具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本文的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
在一些实施方案中，该抗体包括至少一个重链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:72的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:73的VH CDR2和序列为SEQ ID NO:74的VH CDR3，和/或(优选“和”)至少一个轻链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:75的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:76的VL CDR2和序列为SEQ ID NO:77的VL CDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本文的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
在一些实施方案中，该抗体包括至少一个重链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:92的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:93的VH CDR2和序列为SEQ ID NO:94的VH CDR3，和/或(优选“和”)至少一个轻链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:95的VL CDR1、序列为SEQ ID NO:96的VL CDR2和序列为SEQ ID NO:97的VL CDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本发明的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
在一些实施方案中，该抗体包括至少一个重链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:112的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:113的VH CDR2和序列为SEQ ID NO:114的VH CDR3，和/或(优选“和”)至少一个轻链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:115的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:116的VL CDR2和序列为SEQ ID NO:117的VL CDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，例如分离的抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区域和至少一个包括三个CDR的轻链可变区域，其中所述重链可变区域包括：
(a)具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3。基本同源的序列在本发明的其他地方有描述。优选的是，所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
在一些实施方案中，该抗体包括至少一个重链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:132的VH CDR1、序列为SEQ ID NO:133的VH CDR2和序列为SEQ ID NO:134的VH CDR3，和/或(优选“和”)至少一个轻链可变区，其包括序列为SEQ ID NO:135的VL CDR1、序列为SEQ IDNO:136的VL CDR2，和序列为SEQ ID NO:137的VL CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VH结构域(例如，具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL结构域(例如具有至少80％的序列同一性，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中轻链可变区具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列和/或(优选是“和”)其中重链可变区具有SEQID NO:30的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VH结构域(例如，具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其基本相同的序列的VL结构域(例如，具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中轻链可变区具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列和/或(优选是“和”)其中重链可变区具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VH结构域(例如，具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL结构域(例如具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中轻链可变区具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列和/或(优选是“和”)其中重链可变区具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VH结构域(例如，具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL结构域(例如具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中轻链可变区具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列和/或(优选是“和”)其中重链可变区具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VH结构域(例如，具有至少80％序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL结构域(例如具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中轻链可变区具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列和/或(优选是“和”)其中重链可变区具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列或与之基本同源的序列的VH结构域(例如，具有至少80％同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL结构域(例如具有至少80％的序列同一性的序列，例如至少85％、90％、95％或98％的序列同一性)。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中轻链可变区具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列和/或(优选是“和”)其中重链可变区具有SEQID NO:130的氨基酸序列。
其他优选的实施方案是本文所述的Ig(例如IgG)形式的抗体，例如11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2抗体(或基于此的抗体，例如基本同源的抗体)的IgG形式，优选全长IgG形式。在一些实施例中，IgG是IgG1或IgG2。因此，在一些实施方案中，该抗体是一种Ig抗体，包括本文所述的CDR序列和/或重链可变区和/或轻链可变区。完整的IgG抗体通常包括两条基本相同的重链和两条基本相同的轻链。然而，如本文其他地方所述，在某些情况下，抗体(例如完整的IgG抗体)可能包括两个基本相同的重链和两个非相同的(即两个不同的)轻链。
在一些实施方案中，优选基于本文表A、B、C、D、E和F中列出的11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2抗体序列的抗体。
本发明的抗体的一些例子是单克隆抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2，它们的序列在本文表A、B、C、D、E和F中显示。单克隆抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2是用杂交瘤技术鉴定的，以SEQ ID NO:5的肽作为免疫原肽。CDR结构域、VH和VL结构域显示在本文的表A-F中。包含这些CDR结构域或VH和VL结构域(或与之基本同源的序列)的抗体是本发明的优选方面。
在优选的实施方案中，基于11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2抗体(例如包含本文表A-F中所列这些抗体的CDR结构域或VH和VL结构域，或与其基本同源的CDR结构域或VH和VL结构的抗体)与(或能够与)包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列(或由SEQ IDNO:5的氨基酸序列组成)的多肽(例如，分离的多肽)(或包括所述多肽的偶联物)结合。
在优选的实施方案中，基于11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2的抗体(例如包含本文表A-F中所列的这些抗体的CDR结构域或VH和VL结构域，或与之基本同源的CDR结构域或VH和VL结构域的抗体)结合到(或能够结合到)，并优选抑制(或优选能够抑制)包含G13D突变的KRAS的致癌突变形式，例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式。
某些基本同源序列的例子是与所公开的氨基酸序列有至少65％的同一性的序列。在某些实施例中，本发明的抗体包括至少一个轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:31、51、71、91、111或131的氨基酸序列至少约65％、70％或75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％或95％，最优选至少约97％、98％或99％的氨基酸序列一致的氨基酸序列区域；和/或至少一个重链可变区，其包括与SEQ ID NO:30、50、70、90、110或130的氨基酸序列至少约65％、70％或75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％或95％，最优选至少约97％、98％或99％的氨基酸序列一致的氨基酸序列区域。
基本同源序列的其他优选例子是含有所公开的氨基酸序列的保守氨基酸替换的序列。
基本同源序列的其他优选例子是在一个或多个公开的CDR区域中含有1、2或3，优选1或2(更优选1)个改变的氨基酸的序列。这种改变可能是保守的或非保守的氨基酸替换，或其混合。
在一些这样的实施方案中，优选的改变是保守的氨基酸替换。
在所有的实施方案中，根据本发明，含有基本同源序列的抗体保持与KRAS的致癌突变形式结合的能力。优选的是，含有基本同源序列的抗体保留了11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2抗体的一个或多个(优选全部)特性(例如与之有关的描述)。
优选地，11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2的抗体或基于此的抗体与G13D和/或G12D致癌突变形式的KRAS(例如SEQ ID NOs:8、9、11或12中所述的一种或多种致癌突变形式的KRAS)结合(并优选地抑制其活性)。结合和/或抑制可如本文其他部分所述(例如优选的抑制活性和/或优选的抑制水平(或数量或程度)，等等。)
通常和优选的是，11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2抗体(或基于此的抗体)与序列为SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:2的分离的多肽结合。这种结合可以通过任何合适的方法(如ELISA)来评估。
符合本发明的基本同源的氨基酸序列的进一步例子在本文的其他地方描述。
本发明的抗体的CDR优选由适当的框架区分开，如在天然存在的抗体和/或有效的工程抗体中发现的那些。因此，本发明的VH、VL和单个CDR序列优选被提供在适当的框架或支架内或纳入其中，以使之能够与抗原结合。这样的框架序列或区域可以对应于天然存在的框架区、FR1、FR2、FR3和/或FR4，以形成适当的支架，或者可以对应于共有框架区，例如通过比较各种天然存在的框架区来确定。另外，也可以使用非抗体支架或框架，如T细胞受体框架。
可用于框架区的适当序列在本领域中是众所周知的，并且可以使用其中的任何一种。优选的框架区序列是构成本发明的VH和/或VL结构域的一个或多个框架区，即11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2抗体的一个或多个框架区，如本文表A-F所披露的，或与之基本同源的框架区，特别是允许维持抗原特异性的框架区，例如导致抗体基本相同或相同三维结构的框架区。
在某些优选的实施方案中，轻链可变区(SEQ ID NOs:42、43、44和45)和/或重链可变区(SEQ ID NOs:38、39、40和41)中的所有四个框架区(FR)，视情况而定，或与之基本同源的FR区，都能在本发明的抗体中找到。
在其他优选的实施方案中，轻链可变区(SEQ ID NOs:62、63、64和65)和/或重链可变区(SEQ ID NOs:58、59、60和61)中的所有四个框架区(FR)，视情况而定，或与其基本同源的FR区，都能在本发明的抗体中找到。
在其他优选的实施方案中，轻链可变区(SEQ ID NOs:82、83、84和85)和/或重链可变区(SEQ ID NOs:78、79、80和81)中的所有四个框架区(FR)，视情况而定，或与其基本同源的FR区，都能在本发明的抗体中找到。
在其他优选的实施方案中，轻链可变区(SEQ ID NOs:102、103、104和105)和/或重链可变区(SEQ ID NOs:98、99、100和101)中的所有四个框架区(FR)，视情况而定，或与其基本同源的FR区，都能在本发明的抗体中找到。
在其他优选的实施方案中，轻链可变区(SEQ ID NOs:122、123、124和125)和/或重链可变区(SEQ ID NOs:118、119、120和121)中的所有四个框架区(FR)，视情况而定，或与其基本同源的FR区，都能在本发明的抗体中找到。
在其他优选的实施方案中，轻链可变区(SEQ ID NOs:142、143、144和145)和/或重链可变区(SEQ ID NOs:138、139、140和141)中的所有四个框架区(FR)，视情况而定，或与其基本同源的FR区，都能在本发明的抗体中找到。
在一些实施方案中，本发明的VH结构域和/或VL结构域可在其N-末端额外包括一个信号肽(例如相对于VH或VL结构域紧邻N-末端定位)。然而，这种信号肽通常不存在于抗体本身(例如不存在于成熟的抗体或分离的抗体产品中)，因为它们通常被切割掉。
在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:30(或与其基本同源的序列)的VH结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:46的信号肽。在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:31(或与其基本同源的序列)的VL结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:47的信号肽。
在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:50(或与其基本同源的序列)的VH结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:66的信号肽。在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:51(或与其基本同源的序列)的VL结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:67的信号肽。
在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:70(或与其基本同源的序列)的VH结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:86的信号肽。在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:71(或与其基本同源的序列)的VL结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:87的信号肽。
在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:90(或与其基本同源的序列)的VH结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:106的信号肽。在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:91(或与其基本同源的序列)的VL结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:107的信号肽。
在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:110(或与其基本同源的序列)的VH结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:126的信号肽。在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:111(或与其基本同源的序列)的VL结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:127的信号肽。
在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:130(或与其基本同源的序列)的VH结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:146的信号肽。在一些实施方案中，包括SEQ ID NO:131(或与其基本同源的序列)的VL结构域在其N-末端进一步包括序列为SEQ ID NO:147的信号肽。
根据本发明，本发明的抗体与KRAS的致癌突变形式的结合可以通过任何合适的手段进行评估，技术人员将熟悉合适的方法(例如ELISA检测或使用功能检测，如GTP酶检测或磷酸化ERK抑制检测或细胞凋亡检测或细胞坏死检测，例如如本发明其他地方所述)。
如上所述，根据本发明，本发明的抗体通常抑制至少一种KRAS的致癌突变形式的活性。
上面讨论的在抗体结合方面的符合本发明的KRAS的优选致癌突变形式(和其优选组)也可以代表在符合本发明的KRAS抑制方面的符合本发明的优选致癌突变形式(和其优选组)。
根据本发明的KRAS的致癌突变形式的活性抑制(功能活性的抑制)可以通过任何合适的手段测定，技术人员熟悉合适的检测和方法。例如，活性的抑制可按GTP酶检测，或磷酸化ERK抑制检测，或细胞凋亡检测或细胞坏死检测，例如如本发明其他地方所述。
在一些实施方案中，活性的抑制是任何可测量的或显著的抑制，更优选的是统计学上显著的抑制(例如与没有抗体的对照(例如与“溶媒”对照或与不与KRAS结合的抗体的对照或与“无抗体”对照或与同型对照相比)相比。
在一些实施方案中，在对照组中(例如“溶媒”对照组或不与KRAS结合的对照抗体或“无抗体”对照组或同种型对照组)观察到的(或由对照组引起的或由对照组导致的)活性抑制水平(或抑制量)代表(或被设定为)零抑制水平(或零抑制值或0％抑制水平或值)。因此，在一些实施方案中，本文讨论的活性抑制％是与“溶媒”对照(或“仅溶媒”对照)或对照抗体(如不与KRAS结合的对照抗体)或“无抗体”对照或同种型对照观察到的抑制相比(或相对于此)的。
在一些实施方案中，活性抑制是指至少2％、至少5％、至少10％、至少15％，优选至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的抑制。
在一些实施方案中，活性的抑制是高达5％、高达10％、高达15％、高达20％、高达25％、高达30％、高达35％、高达40％、高达45％、高达50％、高达55％、高达60％、高达65％、高达70％、高达75％、高达80％、高达85％、高达90％、高达95％或高达100％的抑制。
因此，在一些实施方案中，对活性的抑制是2％-100％、5％-100％、10％-100％、15％-100％、20％-100％、25％-100％、30％-100％、35％-100％、40％-100％、45％-100％、50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％或95％-100％的抑制。
在一些实施方案中，活性的抑制是2％-75％、5％-75％、10％-75％、15％-75％、20％-75％、25％-75％、30％-75％、35％-75％、40％-75％、45％-75％、50％-75％、55％-75％、60％-75％、65％-75％或70％-75％的抑制。
在一些实施方案中，对活性的抑制是2％-75％、5％-50％、10％-50％、15％-50％、20％-50％、25％-50％、30％-50％、35％-50％、40％-50％或45％-50％的抑制。
在一些实施方案中，对活性的抑制是2％-75％、5％-25％、10％-25％、15％-25％或20％-25％的抑制。
在一些优选的实施方案中，活性的抑制是至少20％，或至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或100％的抑制。
如上所述，根据本发明，本发明的抗体通常抑制至少一种KRAS的致癌突变形式的活性(或能够抑制活性)(例如至少一种具有SEQ ID NO:8、9、11、12、13、14、15或16，优选8、9、11或12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)。
在一些实施方案中，本发明的抗体抑制至少一种具有SEQ ID NO:13或15的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式和至少一种具有SEQ ID NO:14或16的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式的活性(或能够抑制其活性)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可抑制至少一种具有SEQ ID NO:8或11的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式和至少一种具有SEQ ID NO:9或12的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式的活性(或能够抑制其活性)。
在一些实施方案中，本文讨论的抑制作用(例如％抑制作用)是当抗体在微摩尔(μM)或纳摩尔(nM)范围内，优选纳摩尔(nM)范围内的浓度下使用时确定。因此，在一些实施方案中，上述抑制作用是在抗体使用浓度为≤10μM、≤5μM、≤1μM、≤900nM、≤800nM、≤700nM、≤600nM、≤500nM、≤400nM、≤300nM、≤200nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤25nM、≤10nM或≤5nM时确定。因此，在一些实施方案中，抑制作用(例如％抑制作用)是在抗体使用浓度为1nM-≤10μM时确定的，例如1nM-1μM、1nM-500nM、1nM至200nM、1nM-100nM、1nM-50nM。在一些实施方案中，抑制作用(例如％抑制作用)是在抗体使用浓度为20nM-≤10μM时确定的，例如20nM-1μM，20nM-500nM，20nM至200nM，20nM-100nM，20nM-50nM。在一些实施方案中，抑制率(例如％抑制率)是在抗体使用浓度为100nM-≤10μM时确定的，例如100nM-1μM，100nM-500nM，100nM到200nM或100nM到250nM。
在一些实施方案中，本发明讨论的抑制作用(如％抑制作用)是在抗体使用浓度为≤100μg/ml、≤50μg/ml、≤25μg/ml、≤20μg/ml、≤15μg/ml、≤10μg/ml、≤5μg/ml、≤4μg/ml、≤3μg/ml、≤2μg/ml或≤1μg/ml时确定。在一些实施方案中，抑制率(如％抑制率)是在抗体使用浓度为1μg/ml-100μg/ml、5μg/ml-100μg/ml、10μg/ml-100μg/ml、20μg/ml-100μg/ml、25μg/ml-100μg/ml、50μg/ml-100μg/ml时确定。在一些实施方案中，抑制率(如％抑制率)是在抗体使用浓度为1μg/ml-25μg/ml、5μg/ml-25μg/ml、10μg/ml-25μg/ml或15μg/ml-25μg/ml的情况下确定。在一些实施方案中，抑制率(如％抑制率)是在抗体使用浓度为4μg/ml-25μg/ml(如4μg/ml或10μg/ml或25μg/ml)时确定。
在一些实施方案中，当抗体是多克隆抗体(如兔多克隆抗体)时，抑制率(如％抑制率)和浓度适用。在一些实施方案中，当抗体是单克隆抗体时，抑制率(如％抑制率)和浓度适用。
在一些实施方案中，根据本发明对KRAS的致癌突变形式的活性的抑制是对GTP酶活性的抑制(即对根据本发明的KRAS的致癌突变形式将GTP转化(或水解)为GDP的能力的抑制)。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体抑制(或能够抑制)根据本发明的KRAS的致癌突变形式的GTP酶活性。因此，本发明的抗体对活性的抑制可以在GTP酶检测中测定(或评估)，例如如本文其他地方所述。
KRAS是一种小型GTP酶。野生型KRAS通常作为一个分子开关，在活性(GTP结合)形式和非活性(GDP结合)形式之间交替进行。野生型KRAS结合并将GTP水解为GDP，在活性和非活性形式之间切换。根据本发明，KRAS的致癌突变形式(KRAS的G12或G13突变形式)由于循环到非活性形式的能力受损，通常被固定在一个构成性的“活性的”或“开启”状态。在不希望被理论束缚的情况下，这导致了与KRAS效应信号途径(如MAPK途径)中的效应蛋白持续的蛋白质-蛋白质相互作用，促进了肿瘤的发生、癌细胞的存活和增殖。
通过用本发明的抗体抑制符合本发明的KRAS的致癌突变形式的GTP酶活性，下游效应信号途径(如MAPK途径)通常被抑制(如信号传导减少)。从上述讨论中可以看出，在癌症治疗中，减少(或抑制)KRAS致癌突变形式的GTP酶活性将是有益的(如治疗有益)。
如上所述，根据本发明，本发明的抗体可以抑制(或能够抑制)KRAS的致癌突变形式的GTP酶活性(例如与对照组相比，如“仅溶媒”对照组，或如“无抗体”对照组，或如不与KRAS结合的对照抗体)。因此，根据本发明抑制的所述KRAS的致癌突变形式的活性可以是GTP酶活性。
在一些实施方案中，GTP酶活性可被抑制至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，或甚至100％(例如，与对照组相比，如“仅溶媒”对照组，或如“无抗体”对照组，或如不与KRAS结合的对照抗体，或如同种型对照组)。
GTP酶活性(和对GTP酶活性的抑制)可以通过任何适当的方法或检测来评估(或作为评估)，技术人员将熟悉合适的方法和检测。GTP酶测定法在本领域是众所周知的，在本文也有描述。
例如，相关KRAS蛋白的GTP酶活性(以及对GTP酶活性的抑制)可以通过一种检测来评估(或作为评估)，在这种检测中，相关的KRAS蛋白(例如根据本发明的KRAS的致癌突变形式)与磷酸盐传感器(磷酸盐传感器在本领域是众所周知的)、GTP和待检测的抗体接触(或孵育)，并评估GTP向GDP的转化情况。
在一些实施方案中，在GTP酶检测中，KRAS蛋白是一种重组蛋白(如细菌表达和纯化的重组KRAS蛋白)。通常，磷酸盐传感器是一种磷酸盐结合分子(如磷酸盐结合蛋白)，它被修饰(或包括或携带)荧光基团。通常，当磷酸盐传感器与游离无机磷酸盐(例如由GTP(三磷酸鸟苷)转化为GDP(二磷酸鸟苷)所释放的)结合时，其荧光(或荧光强度)会增加。因此，磷酸盐传感器的荧光可以提供GTP酶活性(或其抑制)的报告。一个示范性的磷酸盐传感器是Thermo Fisher Scientific的磷酸盐传感器，Cat No.#PV4407。
通常，KRAS蛋白、GTP、磷酸盐传感器和待测的抗体(或相关的对照)可以一起孵化在微孔板(如384孔板)的孔中，并在一定时间内(如4小时)在酶标仪中测量荧光(如激发波长：430nm；发射波长：450nm)。
在一个优选的GTP酶检测中，将被检测的抗体与1g/l细菌产生和纯化的KRAS蛋白、1μM磷酸盐传感器(优选是Thermo Fisher Scientific的磷酸盐传感器，Cat No.#PV4407)和6μM GTP一起孵育(或与之接触或混合)在微孔板的孔中的合适的缓冲液中(例如，具有50mM Tris、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM EDTA、0.01％ Triton X-100和1mM DTT成分的缓冲液)，在4小时后或在4小时内(或期间)，在酶标仪中测量荧光(即KRAS活性)(例如，激发波长：430nm；发射波长：450nm)。
一个特别优选的GTP酶检测方法在本文的实施例部分有描述。
本发明的抗体降低(或抑制或减少)KRAS GTP酶活性，例如与对照组(如“仅有溶媒”对照组，或如“无抗体”对照组，或如不与KRAS结合的对照抗体，或如同型对照组)相比，通常表明该抗体抑制了相关KRAS蛋白的GTP酶活性。
在一些实施方案中，活性抑制的特点是(或引起，或导致，或被证明，或被报告，或被确定为)根据本发明，在表达的KRAS致癌突变形式的细胞(或细胞系)中，ERK(胞外信号调节激酶，extracellular signal-regulated kinase)的磷酸化被抑制。另外来看，由本发明的抗体引起的表达符合本发明的KRAS的致癌突变形式的细胞(或细胞系)中ERK磷酸化的减少，通常表明所述抗体抑制了符合本发明的KRAS的致癌突变形式(抑制了其活性)。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体抑制或减少(或能够抑制或减少)根据本发明表达致癌突变形式的KRAS的细胞中的ERK磷酸化。因此，本发明的抗体对活性的抑制可以在磷酸化ERK检测中确定(或评估)，例如如本文其他地方所述。
MAPK(MAP激酶)途径是一个调节细胞生长的主要信号转导级联。在癌症中，MAPK途径的活性常常被上调。在正常生理情况下，MAPK途径的激活发生在生长因子与它们的同源受体结合后，以及招募小Ras GTP酶，如KRAS，然后招募丝氨酸苏氨酸激酶RAF。这反过来又激活了MEK，使ERK磷酸化，ERK是该途径的主要效应激酶。然后ERK磷酸化并激活多个细胞质底物和转录因子。当在癌症中被激活时，通过MAPK途径的信号传递有助于肿瘤的进展。例如，当在癌症中被激活时，MAPK途径通过维持激活的细胞周期蛋白D1/CDK4复合物(增加细胞生长)、抑制促凋亡分子如BIM(增加细胞存活)，以及通过直接调节细胞骨架(促进侵袭和转移)来促进肿瘤的发展。
根据本发明，通过用本发明的抗体抑制KRAS的致癌突变形式的活性，ERK的下游磷酸化通常被抑制(即ERK磷酸化的水平或数量，即磷酸化-ERK(phospho-ERK)，可能减少)。从上面的讨论中可以看出，在癌症治疗的背景下，ERK磷酸化的减少(phosphor-ERK的减少)将是有益的(例如，治疗有益)。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体可以抑制或减少(或能够抑制或减少)表达具有G12突变的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中的ERK磷酸化，根据本发明(如具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)或可抑制或减少(或能够抑制或减少)根据本发明表达具有G13突变的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系(例如具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)中ERK的磷酸化。在一些优选的实施方案中，本发明的抗体可以抑制或减少(或能够抑制或减少)表达具有G13突变的KRAS的致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中的ERK磷酸化，根据本发明(例如具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以在表达根据本发明具有G13突变的KRAS的致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中(例如，具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)和表达根据本发明具有G12突变的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中(例如，具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)抑制或减少(或能够抑制或减少)ERK的磷酸化。
在一些实施方案中，本发明的抗体可抑制或减少(或能够抑制或减少)表达根据本发明具有G12D突变的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中的ERK磷酸化，(如具有SEQID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)，或可抑制或减少(或能够抑制或减少)表达根据本发明的具有G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系中ERK的磷酸化。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体可以抑制或减少(或能够抑制或减少)表达根据本发明具有G13D突变的KRAS的致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中的ERK磷酸化，(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可抑制或减少(或能够抑制或减少)表达根据本发明具有G12D突变的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中的ERK磷酸化，(如具有SEQID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)，并抑制或减少(或能够抑制或减少)表达根据本发明具有的G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的ERK磷酸化。
在一些实施方案中，根据本发明，表达致癌突变形式的KRAS的细胞(如癌细胞或癌细胞系)中ERK磷酸化的抑制(或减少)可以是任何可测量的抑制(或减少或降低)，优选是显著或统计学意义上显著的抑制(如与对照组相比(例如与阴性对照组引起的或存在的ERK磷酸化水平相比)，如“仅溶媒”对照组，或如“无抗体”对照组，或如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照组)。在一些实施方案中，优选的对照是同种型对照(例如在本发明的抗体是兔多克隆抗体的实施方案中，同种型对照可以是兔IgG)。技术人员熟悉适当的对照(如同种型对照)，可以使用任何适当的对照。
在一些实施方案中，根据本发明在表达KRAS致癌突变形式的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)中对ERK磷酸化的抑制(或减少或降低)可以是至少5％、至少10％、至少15％、优选至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、或至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％(例如，与对照组相比(例如，与由对照组引起或存在的ERK-磷酸化的抑制水平或量相比)的抑制，如“仅溶媒”对照组，或如“无抗体”对照组，或如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照组)。通常优选同种型对照。
在一些实施方案中，ERK磷酸化的％抑制可以是高达20％，或高达25％，或高达30％，或高达40％，或高达50％，或高达60％，或高达70％，或高达80％，或高达90％，或高达100％的抑制。在一些实施方案中，ERK磷酸化的％抑制可以是5％-100％，5％-90％，5％-80％，5％-70％，5％-60％，5％-50％，5％-40％，5％-30％，5％-20％，10％-100％，10％-90％，10％-80％，10％-70％，10％-60％，10％-50％，10％-40％，10％-30％，10％-20％，30％-100％，30％-90％，30％-80％，30％-70％，30％-60％，30％-50％，30％-40％，40％-100％，40％-90％，40％-80％，40％-70％，40％-60％，40％-50％，50％-100％，50％-90％，50％-80％，50％-70％或50％-60％。
在一些实施方案中，上述ERK磷酸化的抑制率是在所述抗体(例如多克隆抗体，如兔多克隆抗体)的使用浓度为10nM至500nM，例如10nM至200nM或20nM至175nM，例如167nM或67nM或27nM时测定的。
在一些实施方案中，上述ERK磷酸化的抑制率是与同型对照引起的(或由同型对照导致的或观察到的)ERK磷酸化的抑制率相比。
因此，在一些实施方案中，用阴性对照(例如同型对照)观察到的(或为其测量或确定的)ERK磷酸化的量(或水平)可代表(或被认为或被设定为)ERK磷酸化的0％抑制水平(或量或值)。因此，本文讨论的本发明的抗体引起的ERK磷酸化的％抑制可以被认为是相对于这种0％抑制(或ERK磷酸化的对照水平)的％抑制。
如上所述，对表达KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中的ERK磷酸化的抑制是对表达具有G13突变的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系中的ERK磷酸化的抑制(例如G13D突变)，和/或根据本发明抑制表达具有G12突变(如G12D突变)的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系。技术人员对这种细胞系很熟悉。在一些实施方案中，ERK磷酸化的抑制是在癌细胞系MDA-MB-231(表达KRAS的G13D致癌突变形式的乳腺癌细胞系)中抑制ERK磷酸化，在癌细胞系SK-LU-1(表达KRAS的G12D致癌突变形式)中抑制ERK磷酸化，在癌细胞系HCT116(表达KRAS的G13D致癌突变形式)中抑制ERK磷酸化，和/或在癌细胞系LS174T(表达KRAS的G12D致癌突变形式)中抑制ERK磷酸化。在一些优选的实施方案中，对ERK磷酸化的抑制是对癌细胞系MDA-MB-231中ERK磷酸化的抑制。
ERK磷酸化和对ERK磷酸化的抑制可以通过任何适当的方法或检测来评估(或作为评估)，技术人员将会熟悉合适的方法和检测方法。ERK磷酸化(Phospho-ERK)测定和方法在本领域是众所周知的，在本文也有描述。
在一些实施方案中，确定(或测量)对ERK磷酸化的抑制的检测方法涉及确定ERK1/2的残基Thr202和/或Tyr204的磷酸化(或磷酸化状态)。
在一些实施方案中，确定(或测量)ERK磷酸化或ERK磷酸化抑制的检测包括在培养基中培养表达符合本发明的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系，用待测的抗体(如本发明的抗体)处理(或接触)培养的细胞或相关的对照(如同种型对照)，将抗体(或对照)处理过的细胞在含血清的培养基中培养(如14-16小时)，用含有待测抗体(如本发明的抗体)的无血清培养基取代该培养基或相关的对照(例如同型对照)，并培养细胞(例如4小时)，用EGF(表皮生长因子，例如10.9ng/ml，如10分钟)处理细胞(或与细胞接触)，裂解细胞(例如通过应用裂解缓冲液，如10分钟)并检测，并使用与磷酸化ERK结合的试剂(例如抗体或基于抗体的试剂)检测(通常是定量检测或测量)细胞裂解液中磷酸化ERK(phospho-ERK1/2；Thr202/Tyr204上的磷酸化)的数量(或水平)。EGF会刺激ERK的磷酸化。ERK的总水平也可以在这种试验中确定。用本发明的抗体处理后，例如与用阴性对照(如同型对照)处理后相比，磷酸化ERK的数量(或水平)减少，通常表明本发明的抗体抑制了ERK的磷酸化，因此通常表明该抗体抑制了根据本发明KRAS的致癌突变形式。
在一些实施方案中，确定(或测量)ERK磷酸化，或抑制ERK磷酸化的检测方法包括：
(i)按照本发明将表达KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系的细胞(例如MDA-MB-231细胞或本文所述的其他细胞系的细胞)以10,000个细胞/孔的密度接种在384孔板中，并在37℃/5％CO2下孵育过夜。
(ii)用待测抗体(例如本发明的抗体)(例如27nM、67nM或167nM抗体)或相关对照(例如同型对照，例如167nM)处理(或接触)(i)中的孵化细胞，并将抗体(或对照)处理的细胞在含血清的培养基中在37℃/5％CO2下孵化14-16小时。
(iii)用含有待测抗体(如本发明的抗体)(如27nM、67nM或167nM抗体)或相关对照(如同种型对照，如167nM)的无血清培养基取代(ii)中的培养基，并将细胞培养4小时。
(iv)用10.9ng/ml EGF处理(iii)中的细胞(或接触细胞)10分钟。
(v)用裂解缓冲液(例如Perkin Elmer公司的
Figure BDA0003905756260000463
)p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)检测试剂盒提供的裂解缓冲液，Cat No.TGRESB500)裂解经处理的(iv)中细胞10分钟。
(vi)使用与磷酸化的ERK结合的试剂(如抗体或基于抗体的试剂)定量检测(或测量)磷酸化的ERK(phospho-ERK1/2；Thr202/Tyr204上的磷酸化)的数量(或水平)。ERK的总水平也可以在这种试验中确定(并且磷酸化的ERK可以被量化为ERK总水平的一个比例)。在一些优选的实施方案中，根据制造商的说明，使用Perkin Elmer公司的
Figure BDA0003905756260000461
)p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)检测试剂盒，Cat No.TGRESB500，定量检测磷酸化的ERK。磷酸化的ERK可以用酶标仪定量检测。
与阴性对照(如同型对照)相比，用本发明的抗体处理(或在处理后)，磷酸化的ERK数量(或水平)减少，通常表明本发明的抗体抑制了ERK的磷酸化，因此通常表明该抗体抑制了根据本发明KRAS的致癌突变形式。
用于确定(或测量)ERK磷酸化的试剂盒和试剂在本领域是众所周知的，并且可以通过商业途径上买到。如上所述，一个示范性的和优选的试剂盒是Perkin Elmer公司的“
Figure BDA0003905756260000462
)p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)检测试剂盒”，Cat No.TGRESB500。优选是按照制造商的说明来使用该试剂盒。
确定ERK磷酸化(及其抑制)的特别优选的检测方法在本文的实施例部分描述。
在一些实施方案中，测定(或测量)ERK磷酸化或本发明抗体对ERK磷酸化的抑制的检测方法还可包括阳性对照(已知可抑制KRAS活性的阳性对照化合物)。在一些实施方案中，阳性对照化合物是SAH-SOS1(son of sevenless 1的稳定的α螺旋，例如在5μM浓度下)。SAH-SOS1是一种多肽，是一种已知的KRAS抑制剂。在一些实施方案中，本发明的抗体对ERK磷酸化的抑制水平(或量)可以是SAH-SOS1引起的(或赋予的)ERK磷酸化抑制水平(或量)的至少20％，优选至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少100％或以上，例如至少125％或至少150％。
在一些实施方案中，根据本发明对KRAS致癌突变形式活性的抑制的特点是(或引起，或导致，或被证明，或被报告，或被确定为)表达根据本发明的KRAS致癌突变形式的细胞(或细胞系)中凋亡的增加或诱发。另一种观点是，由本发明的抗体引起的表达符合本发明的KRAS致癌突变形式的细胞(或细胞系)中凋亡的增加或诱导，通常表明所述抗体抑制了符合本发明的KRAS致癌突变形式(抑制了其活性)。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体诱导或增加(或促进或提升)表达符合本发明的KRAS的致癌突变形式的细胞(或细胞系)的凋亡(当此类细胞与本发明的抗体接触时)。因此，本发明的抗体对KRAS活性的抑制可以在细胞凋亡试验中确定(或评估)，例如，如本文其他地方所述。
如上所述，在癌症中，由KRAS的致癌突变形式(如根据本发明的KRAS的G12或G13突变形式)激活MAPK途径有助于抑制促凋亡分子，如BIM(增加细胞生存)。因此，根据本发明，通过抑制KRAS的致癌突变形式，可以减少或抑制MAPK途径的激活，这可以导致缓解(或减少)对促凋亡分子的抑制，也就是说，凋亡被提升(或增加)。从以上讨论中可以看出，在癌症治疗的背景下，增加表达KRAS致癌突变形式的癌细胞的凋亡将是有益的(例如治疗有益)。
在一些实施方案中，根据本发明，本发明的抗体诱导或增加(或能够诱导或增加)表达致癌突变形式KRAS的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的凋亡。通常，这种诱导或增加细胞凋亡将与对照组相比，如“仅溶媒”对照，或如“无抗体”对照，或如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体可增加或诱导(或能够增加或诱导)根据本发明表达具有G12突变的KRAS致癌突变形式(如具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的凋亡或可增加或诱导(或能够增加或诱导)根据本发明表达具有G13突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:14或SEQID NO:16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的凋亡。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体增加或诱导(或能够增加或诱导)根据本发明表达具有G12突变的KRAS致癌突变形式(如具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的凋亡，并增加或诱导(或能够增加或诱导)根据本发明表达具有G13突变的KRAS致癌突变形式(如具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的凋亡。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体可增加或诱导(或能够增加或诱导)根据本发明表达具有G12D突变的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系(例如具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的凋亡或可增加或诱导(或能够增加或诱导)根据本发明表达具有G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQID NO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的凋亡。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体增加或诱导(或能够增加或诱导)根据本发明表达具有G12D突变的KRAS致癌突变形式(如具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的凋亡，并增加或诱导(或能够增加或诱导)根据本发明表达具有G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的细胞凋亡。
在一些实施方案中，根据本发明表达KRAS致癌突变形式的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的凋亡增加可以是任何可测量的增加，优选是显著或统计学上显著的增加(例如与对照组相比(例如与由对照组引起的或在有对照组存在的情况下引起的细胞凋亡水平或数量相比)，如“仅溶媒”对照组，或如“无抗体”对照组，或如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照组)。技术人员会熟悉适当的对照，可以使用任何适当的对照。
在一些实施方案中，根据本发明表达KRAS致癌突变形式的细胞(如癌细胞或癌细胞系)的凋亡增加可以是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％，优选是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％或至少200％(例如与对照组相比(例如与由对照组引起的或在对照组存在的情况下引起的细胞凋亡水平或数量相比)，例如“仅溶媒”对照组，或例如“无抗体”对照组，或例如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照组)。在一些实施方案中，细胞凋亡的％增加可以是高达20％，或高达50％，或高达100％，或高达200％或高达500％的增加。在一些实施方案中，细胞凋亡的％增加可以是5％-500％、5％-250％、5％-200％、5％-100％、5％-50％、5％-30％、5％-20％、10％-500％、10％-250％、10％-200％、10％-100％。10％-50％，10％-30％，10％-20％，20％-500％，20％-250％，20％-200％，20％-100％，20％-50％，20％-30％，30％-500％，30％-250％，30％-200％，30％-100％，30％-50％，50％-500％，50％-250％，50％-200％或50％-100％。
在一些实施方案中，上述细胞凋亡的％增加是在所述抗体(例如多克隆抗体，如兔多克隆抗体)以50nM至500nM，例如100nM至300nM，或约200nM(例如220nM)的浓度使用时测定的。
在一些实施方案中，上述的细胞凋亡的％增加是与同型对照引起的(或观察到的)细胞凋亡相比。在一些实施方案中，上述细胞凋亡的％增加是与“仅溶媒”对照引起的(或观察到的)细胞凋亡相比的。
如上所述，凋亡是表达根据本发明具有G12突变(如G12D突变)的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系的凋亡，和/或表达根据本发明具有G13突变(如G13D突变)的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系的凋亡。技术人员对这种细胞系很熟悉。在一些实施方案中，凋亡是癌细胞系SK-LU-1(表达KRAS的G12D致癌突变形式)的凋亡，细胞系HCT116(表达KRAS的G13D致癌突变形式)的凋亡和/或细胞系LS174T(表达KRAS的G12D致癌突变形式)的凋亡。在一些实施方案中，该凋亡是癌细胞系SK-LU-1的凋亡或细胞系HCT116的凋亡。在一些实施方案中，凋亡是癌细胞系SK-LU-1的凋亡和细胞系HCT116的凋亡。
细胞凋亡(以及细胞凋亡的增加或诱导)可以通过任何适当的方法或检测来评估(或作为评估)，技术人员将熟悉合适的方法和检测。细胞凋亡检测在本领域是众所周知的，在本文也有描述。
例如，在一些实施方案中，细胞凋亡检测涉及在细胞与待测抗体(如本发明的抗体)接触(或处理)后，或在细胞与待测抗体(如本发明的抗体)接触(或处理)期间，测定磷脂酰丝氨酸(PS)对细胞膜外叶的暴露。PS是质膜的一个组成部分，在健康细胞中被活跃地限制在膜内叶，但在细胞凋亡过程中PS会转移到可以被检测到的质膜的外叶。转移的PS可以通过基于膜联蛋白V(Annexin V)的分子(例如荧光标记的Annexin V偶联物)来测量。基于Annexin V的分子通常是检测(或确定或测量)PS暴露于外叶的优选探针，因为它们对脂质具有高度的、依赖钙的亲和力和选择性。
因此，在一些实施方案中，抗体引起的细胞凋亡可以通过(或由)测定(或测量)磷脂酰丝氨酸(PS)暴露(或转移)到细胞膜外叶的方法来确定，通常是通过使用基于AnnexinV的试剂(例如荧光标记的Annexin V偶联物)检测(或测量)暴露或转移的PS。
在一些实施方案中，凋亡(或凋亡水平或数量)是指在与待测抗体接触(或用所述抗体处理或暴露于所述抗体)的设定时间段内(或期间)(如10小时、24小时、48小时、52小时、72小时)发生的凋亡。在一些实施方案中，凋亡(或凋亡的水平或数量)是在52小时内(或期间)发生的凋亡。在一些实施方案中，凋亡(或凋亡水平或数量)是在与待测抗体接触(或用所述抗体处理或暴露于所述抗体)24小时或48小时内(或期间)发生的凋亡。
由本发明的抗体引起的暴露的(或转移的)PS数量(或水平)的增加(例如使用Annexin V试剂测定或测量)通常表明该抗体引起(或诱导或增加)细胞凋亡，因此通常表明该抗体抑制了根据本发明KRAS的致癌突变形式。
在一些实施方案中，细胞凋亡测定是在微孔板中进行的，在酶标仪中测定细胞凋亡(例如基于荧光标记的Annexin V偶联物与暴露的PS的结合)。这样的检测可以是实时检测。
在其他一些实施方案中，细胞凋亡检测是基于流式细胞仪(如FACS)的检测，其中培养基中的细胞用待测抗体(如3ng/ml)处理(或与所述抗体接触或暴露于所述抗体)(如24小时、48小时或72小时)，清洗后用荧光标记的Annexin V分子(如Annex V Pacific Blue，ThermoFisher Cat.No.A35122)染色，然后用流式细胞仪(如FACS)来定量细胞相关的荧光。由本发明的抗体引起的(或用本发明的抗体处理后的)细胞相关荧光量的增加(例如与对照组相比(例如与对照组引起的或在对照组存在的情况下引起的细胞相关荧光相比)，如“仅溶媒”对照，或如“无抗体”对照，或如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照)通常表明该抗体引起(或诱导或增加)细胞凋亡，因此通常表明该抗体抑制了根据本发明KRAS的致癌突变形式。
在一些实施方案中，细胞凋亡测定可以是实时测定。
用于测定(或测量)细胞凋亡的试剂盒和试剂在本领域是众所周知的，并且可以通过商业途径获得。一个示例性的和优选的试剂盒是“RealTime-GloTM Annexin V Apoptosisand Necrosis Kit”(Promega，Cat.No.JA1011)。优选的是按照制造商的说明使用该试剂盒。
特别优选的细胞凋亡检测方法在本文的实施例部分进行了描述。
在一些实施方案中，根据本发明对KRAS的致癌突变形式的活性的抑制的特点是(或引起，或导致，或被证明，或被报告，或被确定为)表达根据本发明的KRAS的致癌突变形式的细胞(或细胞系)坏死的增加或诱导。另一种观点是，由本发明的抗体引起的表达根据本发明的KRAS致癌突变形式的细胞(或细胞系)坏死的增加或诱导，通常表明所述抗体抑制根据本发明的KRAS致癌突变形式(的活性)。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体诱导或增加(或促进或提高)表达根据本发明的KRAS的致癌突变形式的细胞(或细胞系)的坏死(当这种细胞与本发明的抗体接触时)。因此，本发明的抗体对KRAS活性的抑制可以在坏死检测中确定(或评估)，例如本文其他地方所述。
显然，在癌症治疗的背景下，增加表达KRAS致癌突变形式的癌细胞的坏死可能是有益的(例如治疗有益)。
在一些实施方案中，本发明的抗体增加或诱导(或能够增加或诱导)表达根据本发明致癌突变形式KRAS的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的坏死。通常，这种坏死的增加或诱导将与对照组相比，如“仅溶媒”对照，或如“无抗体”对照，或如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体可增加或诱导(或能够增加或诱导)表达具有根据本发明G12突变的KRAS致癌突变形式(如具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的坏死，或可能增加或诱导(或能够增加或诱导)表达具有根据本发明G13突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的坏死。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体增加或诱导(或能够增加或诱导)表达具有根据本发明的G12突变的KRAS致癌突变形式(例如，具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的坏死，并增加或诱导(或能够增加或诱导)表达具有根据本发明G13突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:14或SEQID NO:16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的坏死。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体可增加或诱导(或能够增加或诱导)表达具有根据本发明G12D突变的KRAS致癌突变形式(如具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的坏死，或可增加或诱导(或能够增加或诱导)表达具有根据本发明G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQID NO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的坏死。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体可增加或诱导(或能够增加或诱导)表达具有根据本发明G12D突变的KRAS致癌突变形式(如具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的坏死，并增加或诱导(或能够增加或诱导)表达具有根据本发明G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的癌细胞或癌细胞系的坏死。
在一些实施方案中，根据本发明表达KRAS致癌突变形式的细胞(如癌细胞或癌细胞系)的坏死增加可以是任何可测量的增加，优选是显著或统计学上显著的增加(如与对照组相比(例如与由对照组引起的或在有对照组存在的情况下引起的坏死水平或数量相比)，如“仅溶媒”对照组，或如“无抗体”对照组，或如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照组)。技术人员会熟悉适当的对照，任何适当的对照都可以使用。
在一些实施方案中，表达根据本发明KRAS致癌突变形式的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的坏死增加可以是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、优选是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％或至少200％的增加(如与对照组相比(例如与由对照组引起的或在有对照组存在的情况下引起的坏死水平或数量相比)，例如“仅溶媒”对照组，或例如“无抗体”对照组，或例如不与KRAS结合的对照抗体或同种型对照组)。在一些实施方案中，坏死率的增加可以是高达20％，或高达50％，或高达100％，或高达200％或高达500％的增加。在一些实施方案中，坏死的百分比增加可以是5％-500％、5％-250％、5％-200％、5％-100％、5％-50％、5％-30％、5％-20％、10％-500％、10％-250％、10％-200％、10％-100％。10％-50％，10％-30％，10％-20％，20％-500％，20％-250％，20％-200％，20％-100％，20％-50％，20％-30％，30％-500％，30％-250％，30％-200％，30％-100％，30％-50％，50％-500％，50％-250％，50％-200％或50％-100％。
在一些实施方案中，上述坏死的％增加是在所述抗体(例如多克隆抗体，如兔多克隆抗体)以50nM至500nM，例如100nM至300nM，或约200nM(例如220nM)的浓度使用时测定。
在一些实施方案中，上述坏死的％增加是与“仅溶媒”对照所引起的(或观察到的)坏死相比的。
如上所述，坏死是根据本发明表达具有G12突变(如G12D突变)的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系的坏死，和/或根据本发明表达具有G13突变(如G13D突变)的KRAS致癌突变形式的癌细胞或癌细胞系的坏死。技术人员对这种细胞系很熟悉。在一些实施方案中，坏死是癌细胞系SK-LU-1(表达KRAS的G12D致癌突变形式)的坏死或细胞系HCT116(表达KRAS的G13D致癌突变形式)的坏死。在一些实施方案中，坏死是指癌细胞系SK-LU-1的坏死和细胞系HCT116的坏死。
坏死(和坏死的增加)可以通过任何适当的方法或检测进行评估(或作为评估)，技术人员将熟悉合适的方法和检测。坏死检测在本领域是众所周知的，在本文也有描述。
例如，在一些实施方案中，由抗体引起的坏死可以通过(或由)一种测定(或测量)细胞渗透性荧光染料前体(pro-fluorescent dye)进入细胞的能力的方法来确定。在坏死过程中，细胞膜会瓦解，从而使这种细胞渗透性荧光染料前体进入细胞。
在一些实施方案中，坏死(或坏死的水平或数量)是指在与待测抗体接触(或用所述抗体处理或暴露于所述抗体)的设定时间段内(或期间)(如24小时、48小时、52小时、72小时)发生的坏死。在一些实施方案中，坏死(或细胞凋亡的水平或数量)是在52小时内(或期间)发生的坏死。
由本发明的抗体引起的进入细胞的细胞渗透性荧光染料前体量的增加，通常表明该抗体引起(或诱导或增加)坏死，因此通常表明该抗体抑制了根据本发明KRAS的致癌突变形式。
在一些实施方案中，坏死检测是在微孔板中进行的，在酶标仪中确定坏死(例如基于细胞渗透性荧光染料前体进入细胞)。这样的检测可以是实时检测。
在一些实施例中，坏死检测可以是实时检测。
用于测定(或测量)坏死的试剂盒和试剂在本领域是众所周知的，并且可以通过商业途径获得。一个示例性的和优选的试剂盒是“RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis andNecrosis Kit”(Promega，Cat.No.JA1011)。优选是按照制造商的说明使用该试剂盒。
一个特别优选的坏死检测在本文的实施例部分进行了描述。
在一些实施方案中，本发明的抗体可额外与野生型KRAS(如具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10氨基酸序列的KRAS)结合。在其他实施方案中，本发明的抗体不与野生型KRAS额外结合(或不与野生型KRAS显著结合)。
在一些实施方案中，与野生型KRAS相比，根据本发明的抗体优先与KRAS的致癌突变形式结合。换句话说，在一些实施方案中，与野生型KRAS相比，抗体可选择性地与根据本发明的KRAS的致癌突变形式结合。例如，在一些实施方案中，相比于(或相对于)野生型KRAS(例如具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10所述氨基酸序列的野生型KRAS)，抗体可优先结合(或选择性结合)包括G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12所述氨基酸序列的致癌突变形式)。例如，在一些实施方案中，相比于(或相对于)野生型KRAS(例如具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10所述氨基酸序列的野生型KRAS)，基于抗体11D6-1、4B8-1或7D11-1的抗体(例如包括这些抗体的CDR序列、VH结构域序列或VL结构域序列或具有基本同源序列的抗体)可优先结合(或选择性结合)包括G13D突变的KRAS的致癌突变形式(例如，具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12所述氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式)。
在一些优选的实施方案中，与野生型KRAS相比，根据本发明的抗体优先抑制至少一种KRAS的致癌突变形式的活性。在一些优选的实施方案中，本与野生型KRAS相比，发明的抗体选择性地抑制根据本发明的至少一种KRAS的致癌突变形式的活性。例如，在一些实施方案中，相比于(或相对于)野生型KRAS(例如具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10所述氨基酸序列的野生型KRAS)，抗体可优先抑制(或选择性抑制)包括G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12所述的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)。在一些实施方案中，相比于(或相对于)与野生型KRAS(例如，具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10所述氨基酸序列的野生型KRAS)，基于11D6-1、4B8-1、7D11-1、6B2-1-1、6B2-1-2或7G2-1(优选11D6-1、4B8-1或7D11-1)的抗体(例如包括这些抗体的CDR序列、VH结构域序列或VL结构域序列或具有基本同源序列的抗体)可优先抑制(或选择性地抑制)包括G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如，具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12所述氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式，。
在一些实施方案中，本发明的抗体不(或不显著)抑制野生型KRAS的活性。
活性可以是本文其他地方描述的活性(如GTP酶活性、诱导细胞凋亡活性、诱导坏死活性或ERK磷酸化抑制活性)。因此，这种活性可以如本文其他地方所述(例如在GTP酶检测、细胞凋亡检测、坏死检测和/或磷酸化ERK抑制检测中)来测定(或由其测定)。
因此，在优选的实施方案中，根据本发明的抗体优先抑制一种或多种KRAS的致癌突变形式的活性，而不是野生型KRAS的活性。换句话说，在一些优选的实施方案中，本发明的抗体抑制(或能够抑制)一种或多种根据本发明的KRAS的致癌突变形式的活性，其程度比抑制野生型KRAS的活性大。因此，例如，在一些实施方案中，如果一个给定的抗体对根据本发明的一种或多种KRAS致癌突变形式的活性的抑制程度为X％，则该抗体对野生型KRAS活性的抑制程度为<X％。
在一些实施方案中，对一种或多种KRAS致癌突变形式的抑制率比野生型KRAS的抑制率至少高5％，但通常至少高10％，优选至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高60％，至少高70％，至少高80％，至少高90％，至少高100％，至少高150％或至少高200％。
举例来说，在一些实施方案中，本发明的抗体引起(或诱发)表达具有根据本发明G12突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(如癌细胞或癌细胞系)或表达具有根据本发明G13突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(例如，癌细胞或癌细胞系)的凋亡和/或(优选是“和”)坏死的水平(或数量)(正如本文其他地方所讨论的，这表明KRAS的抑制)高于(优选显著高于)所述抗体在表达野生型KRAS(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10)的细胞中引起(或诱发)的凋亡和/或(优选“和”)坏死的水平(或数量)。
在一些实施方案中，本发明的抗体引起(或诱发)表达具有根据本发明G12突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(如癌细胞或癌细胞系)和表达具有根据本发明G13突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(例如，癌细胞或癌细胞系)的凋亡和/或(优选是“和”)坏死的水平(或数量)高于(优选显著高于)所述抗体在表达野生型KRAS(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10)的细胞中引起(或诱发)的凋亡和/或(优选“和”)坏死的水平(或数量)。
在一些实施方案中，本发明的抗体引起(或诱发)表达具有根据本发明G12D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(如癌细胞或癌细胞系)或表达具有根据本发明G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(例如，癌细胞或癌细胞系)的凋亡和/或(优选是“和”)坏死的水平(或数量)高于(优选显著高于)所述抗体在表达野生型KRAS(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10)的细胞中引起(或诱发)的凋亡和/或(优选“和”)坏死的水平(或数量)。
在一些实施方案中，本发明的抗体引起(或诱发)表达具有根据本发明G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(例如，癌细胞或癌细胞系)的凋亡和/或(优选是“和”)坏死的水平(或数量)高于(优选显著高于)所述抗体在表达野生型KRAS(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10)的细胞中引起(或诱发)的凋亡和/或(优选“和”)坏死的水平(或数量)。
在一些实施方案中，本发明的抗体引起(或诱发)表达具有根据本发明G12D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(如癌细胞或癌细胞系)和表达具有根据本发明G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式)的细胞(例如，癌细胞或癌细胞系)的凋亡和/或(优选是“和”)坏死的水平(或数量)高于(优选显著高于)所述抗体在表达野生型KRAS(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10)的细胞中引起(或诱发)的凋亡和/或(优选“和”)坏死的水平(或数量)。
在一些实施方案中，表达KRAS的致癌突变形式的细胞中引起的较高水平的凋亡和/或坏死比表达野生型KRAS的细胞中引起的凋亡和/或坏死水平至少高5％，但通常至少高10％，优选至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高60％，至少高70％，至少高80％，至少高90％，至少高100％，至少高150％或至少高200％。在一些实施方案中，表达KRAS致癌突变形式的细胞中的较高凋亡和/或坏死水平比表达野生型KRAS的细胞中的凋亡和/或坏死的水平高达500％、高达400％、高达300％、高达200％、高达100％或高达50％。在一些实施方案中，表达KRAS致癌突变形式的细胞中的较高凋亡和/或坏死水平比表达野生型KRAS的细胞的凋亡和/或坏死水平高5-500％，高5-400％，高5-300％，高5-200％，高5-100％，高5-50％，高5-20％，高10-500％，高10-400％，高10-300％，高10-200％，高10-100％，高10-50％，高10-20％，高20-500％，高20-400％，高20-300％，高20-200％，高20-100％，高20-50％，高50-500％，高50-400％，高50-300％，高50-200％，或高50-100％。
如本文其他地方所讨论的，在一些实施方案中，表达KRAS的致癌G12突变形式的癌细胞系可以是癌细胞系SK-LU-1(其表达KRAS的G12D致癌突变形式)。在一些实施方案中，表达KRAS的致癌G13突变形式的癌细胞系可以是癌细胞系HCT116(其表达KRAS的G13D致癌突变形式)。在一些实施方案中，表达野生型KRAS的细胞为非恶性细胞，例如细胞系CRL-1831(非恶性结肠上皮细胞)。在一些实施方案中，表达野生型KRAS的细胞是表达野生型KRAS的癌细胞(或癌细胞系)，例如，细胞系NCI-H1975(肺腺癌细胞)。
在一些实施方案中，根据本发明，在表达KRAS致癌突变形式的细胞(或细胞系)中引起的较高水平的凋亡和/或坏死，高(或相比之下更高)于表达野生型KRAS的同一组织或器官(或组织型或器官型)的细胞(或细胞系)中引起的凋亡和/或坏死水平。
在一些实施方案中，抗体优先(或选择性地)结合根据本发明在KRAS的给定位置(第12或第13位)具有给定的致癌突变残基(例如本文别处描述的给定突变残基)的KRAS的给定致癌突变形式，而不是在KRAS中的相应位置(第12或第13位)具有不同致癌突变残基的KRAS的不同(即另一种)致癌突变形式(例如本文别处所述的不同的突变氨基酸残基)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可优先(或选择性)结合在第12或13位具有D(天冬氨酸)残基的KRAS的致癌突变形式，而不是在KRAS中相应位置(第12或13位)具有不同致癌突变残基的KRAS的致癌突变形式。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体可优先结合在第12位具有D(天冬氨酸)残基的KRAS的致癌突变形式，而不是在KRAS中相应位置(第12位)具有V(缬氨酸)残基或C(半胱氨酸)残基的KRAS的致癌突变形式。
在一些实施方案中，本发明的抗体可优先(或选择性地)结合表达具有根据本发明的特定G12突变(第12位突变)的KRAS致癌突变形式(例如，具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一的KRAS致癌突变形式)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS，而不结合在G12位(第12位突变)表达具有不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(例如，具有不同于在SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列中的潜在突变残基之一)的细胞上(或其中)的KRAS。例如，本发明的抗体可以优先(或选择性地)结合表达具有G12D突变的KRAS的致癌突变形式(如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS，而不结合在G12位表达具有不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(不同的，即非D，第12位突变，(例如与在SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一具有不同的，即非D的突变)的细胞上(或其中)的KRAS。例如，本发明的抗体可以与表达具有G12D突变的KRAS的致癌突变形式(例如SEQID NO:8或SEQ ID NO:11)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS结合，而不与表达具有G12V或G12C突变的KRAS的致癌突变形式的细胞上(或其中)的KRAS结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体可优先(或选择性地)结合表达具有根据本发明的特定G13突变(第13位突变)的KRAS致癌突变形式(例如，具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一的KRAS的致癌突变形式)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS，而不结合在G13位(第13位突变)表达具有不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(例如，具有不同于在SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列中的潜在突变残基之一)的细胞上(或其中)的KRAS。例如，本发明的抗体可以优先(或选择性地)结合表达具有G13D突变的KRAS的致癌突变形式(如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS，而不结合在G13位表达具有不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(不同的，即非D，第13位突变，(例如与在SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:12的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一具有不同的，即非D的突变)的细胞上(或其中)的KRAS。例如，本发明的抗体可以与表达具有G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如SEQID NO:9或SEQ ID NO:12)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS结合，而不与表达具有G13C突变的KRAS致癌突变形式的细胞上的KRAS结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体可优先(或选择性地)结合表达具有根据本发明的特定G12突变(第12位的突变)的KRAS致癌突变形式(例如，具有SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一的KRAS致癌突变形式的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS，而不结合在G13位(第13位突变)表达具有不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(例如，具有不同于在SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列中的潜在突变残基之一)的细胞上(或其中)的KRAS。例如，本发明的抗体可以优先(或选择性地)结合表达具有G12D突变的KRAS的致癌突变形式(如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS，而不结合在G13位表达具有不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(不同的，即非D，第13位突变，(例如与在SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:11的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一具有不同的，即非D的突变)的细胞上(或其中)的KRAS。例如，本发明的抗体可以与表达具有G12D突变的KRAS的致癌突变形式(例如SEQID NO:8或SEQ ID NO:11)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS结合，而不与表达具有G13X突变(其中X是D以外的致癌突变残基，例如X是C)的KRAS致癌突变形式的细胞上(或其中)的KRAS结合。
在一些实施方案中，本发明的抗体可优先(或选择性地)结合表达具有根据本发明的特定G13突变(第13位的突变)的KRAS致癌性突变形式(例如，具有SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一的KRAS致癌突变形式的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS，而不结合在G12位(第12位突变)表达具有不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(例如，具有不同于在SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列中的潜在突变残基之一)的细胞上(或其中)的KRAS。例如，本发明的抗体可以优先(或选择性地)结合表达具有G13D突变的KRAS致癌突变形式(如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12)的细胞(如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS，而不结合在G12位表达具有不同(即非D)致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(不同的，即非D，第12位突变，(例如与在SEQ ID NO:9或SEQID NO:12的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一具有不同的，即非D的突变)的细胞上(或其中)的KRAS。例如，本发明的抗体可以与表达具有G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)上(或其中)的KRAS结合，而不与表达具有G12X突变(其中X是D以外的致癌突变残基，例如其中X是V或C或A或S或R)的KRAS致癌突变形式的细胞上(或其中)的KRAS结合。
结合可以通过任何适当的方式测定(例如，如本文其他地方所述)。
在一些实施方案中，本发明的抗体优先抑制在KRAS的特定位置(第12或13位)具有特定的致癌突变残基(例如本文其他地方描述的突变残基)的根据本发明的特定KRAS的致癌突变形式的活性，，而不是在KRAS的相应位置(第12或13位)具有不同的致癌突变残基(如本文其他地方所述的不同的突变氨基酸残基)的不同的(即另一种)KRAS的致癌突变形式的活性。。举例来说，在一些实施方案中，本发明的抗体优先抑制在第12或13位有D(天冬氨酸)残基的KRAS致癌突变形式的活性，而不是在KRAS中相应位置(第12或13位)有不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式的活性。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体优先抑制在第12位有D(天冬氨酸)残基的KRAS致癌突变形式的活性，而不是在KRAS中相应位置(第12位)有V(缬氨酸)残基或C(半胱氨酸)残基的KRAS致癌突变形式的活性。
换句话说，在一些优选的实施方案中，本发明的抗体抑制(或能够抑制)在KRAS的给定位置(第12或13位)具有给定致癌突变残基(例如，本文别处描述的突变残基)的致癌突变形式的活性，其抑制程度大于抑制在KRAS中的相应位置(第12或13位)具有不同致癌突变残基(例如，本文其他地方描述的不同突变氨基酸残基)的不同(即另一种)KRAS的致癌突变形式的活性。因此，例如，在一些实施方案中，如果一个给定的抗体对根据本发明在KRAS的给定位置(第12或13位)有一个给定的致癌突变残基(例如本文其他地方描述的突变残基)的KRAS的致癌突变形式的活性有X％的抑制，则该抗体抑制在相应位置(第12或13位)具有不同的致癌突变残基(例如本文其他地方描述的不同的突变氨基酸残基)的不同(即另一种)KRAS的致癌突变形式的活性为<X％。
在一些实施方案中，所述％抑制与在相应位置(第12或13位)具有不同的致癌性突变残基(例如本文其他地方描述的不同的突变氨基酸残基)的不同的(即另一种)KRAS的致癌突变形式的％抑制相比，该％抑制可高出至少5％，但通常高出至少10％，优选高出至少20％，高出至少30％，高出至少40％，高出至少50％，高出至少60％，高出至少70％，高出至少80％，至少90％，至少100％，至少150％或至少200％。
抑制活性可如本文其他地方所述(例如可通过引起或诱导或增加细胞凋亡来表征，这可如本文其他地方所述确定)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可优先抑制具有根据本发明的在KRAS中的第12位具有特定致癌突变残基(例如本文其他地方描述的突变残基)的KRAS的特定致癌突变形式的活性，而不是在KRAS中的第13位具有不同的致癌突变残基(例如本文其他地方描述的不同的突变氨基酸残基)的不同(即另一种)KRAS的致癌突变形式的活性。举例来说，在一些实施方案中，本发明的抗体可以优先抑制在第12位有D(天冬氨酸)残基的KRAS的致癌突变形式的活性，而不是在KRAS的第13位有不同的(即非D)致癌突变残基(如C)的KRAS的致癌突变形式的活性。该优先抑制可以是至少高5％，但通常是至少高10％，优选至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高60％，至少高70％，至少高80％，至少高90％，至少高100％，至少高150％或至少高200％的抑制水平(或数量)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可优先抑制根据本发明的在KRAS中的第13位具有特定致癌突变残基(例如本文其他地方描述的突变残基)的KRAS的特定致癌突变形式的活性，而不是在KRAS中的第12位具有不同的致癌突变残基(例如本文其他地方描述的不同的突变氨基酸残基)的不同(即另一种)KRAS的致癌突变形式的活性。举例来说，在一些实施方案中，本发明的抗体可以优先抑制在第13位有D(天冬氨酸)残基的KRAS的致癌突变形式的活性，而不是在KRAS的第12位有不同的(即非D)致癌突变残基(如V或C或A或S或R，优选V或C)的活性。该优先抑制可以是至少高5％，但通常是至少高10％，优选至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高60％，至少高70％，至少高80％，至少高90％，至少高100％，至少150％或至少高200％的抑制水平(或数量)。
抑制活性可如本文其他地方所述(例如可通过引起或诱导或增加细胞凋亡来表征，这可如本文其他地方所述确定)。
在一些实施方案中，本发明的抗体导致(或引起)表达具有根据本发明的特定G12突变(第12位突变)的致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一的KRAS致癌突变形式)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的凋亡水平(或数量)(如本文其他地方所讨论的，表明KRAS被抑制)，高于(例如显著高于)所述抗体在G12突变(第12位突变)表达具有不同的致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(例如具有不同于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一)的细胞中导致(或引起)的凋亡水平(或数量)。例如，本发明的抗体可导致(或引起)表达具有G12D突变的KRAS致癌突变形式(例如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的凋亡水平(或数量)高于(例如显著高于)所述抗体在表达具有G12位不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(不同，即第12位突变非D，(例如具有不同于SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:15的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一，即非D)的细胞中引起(或诱发)的凋亡水平(或数量)。例如，本发明的抗体可导致(或引起)表达具有G12D突变的KRAS的致癌突变形式(如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的凋亡水平(或数量)，高于(例如显著高于)所述抗体在表达具有G12V或G12C突变的KRAS致癌突变形式的细胞中导致(或引起)的凋亡水平(或数量)。
通过另一个例子，在一些实施方案中，本发明的抗体导致(或引起)表达具有根据本发明的特定G13突变(位置13的突变)的KRAS致癌突变形式(例如具有SEQ ID NO:14或SEQID NO:16的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一的KRAS致癌突变形式)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的凋亡水平(或数量)(如本文其他地方所讨论的，表明KRAS被抑制)，高于(例如显著高于)所述抗体在G13(第13位突变)表达具有不同的致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(例如具有不同于SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列中列出的潜在突变残基之一)的细胞中导致(或引起)的凋亡水平(或数量)。例如，本发明的抗体可导致(或引起)表达具有G13D突变的KRAS致癌突变形式(例如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的凋亡水平(或数量)高于(例如显著高于)所述抗体在表达具有G13位突变的不同致癌突变残基的KRAS致癌突变形式(不同，即第13位突变非D)的细胞中导致(或引起)的凋亡水平(或数量)。例如，本发明的抗体可导致(或引起)表达具有G13D突变的KRAS的致癌突变形式(如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12)的细胞(例如癌细胞或癌细胞系)的凋亡水平(或数量)，高于(例如显著高于)所述抗体在表达具有G13C突变的KRAS致癌突变形式的细胞中导致(或引起)的凋亡水平(或数量)。
在一些这样的实施方案中，在细胞中引起的较高的凋亡水平是至少高5％，但通常至少高10％，优选至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高60％，至少高70％，至少高80％，至少高90％，至少高100％，至少高150％或至少高200％。在一些实施方案中，较高的细胞凋亡水平是达500％的更高水平，达400％的更高水平，达300％的更高水平，达200％的更高水平，达100％的更高水平或达50％的更高水平。在一些实施方案中，在细胞中引起的较高水平的凋亡达高于5-500％，高于5-400％，高于5-300％的水平，高于5-200％，高于5-100％，高于5-50％的水平，高于5-20％，高于10-500％，高于10-400％，高于10-300％，高于10-200％，高于10-100％，高于10-50％，高于10-20％，高于20-500％，高于20-400％，高于20-300％，高于20-200％，高于20-100％，高于20-50％，高于50-500％，高于50-400％，高于50-300％，高于50-200％或高于50-100％。
如本文其他地方所讨论的，在一些实施方案中，表达KRAS的致癌G12突变形式的癌细胞系可以是癌细胞系SK-LU-1(其表达KRAS的G12D致癌突变形式)。在一些实施方案中，表达KRAS的致癌G13突变形式的癌细胞系可以是癌细胞系HCT116(其表达KRAS的G13D致癌突变形式)。在一些实施方案中，表达KRAS的致癌性G12突变形式的癌细胞系可以是癌细胞系SW620(其表达KRAS的G12V致癌性突变形式)。在一些实施方案中，表达KRAS的致癌G12突变形式的癌细胞系可以是癌细胞系MIA-PA-CA-2(其表达KRAS的G12C致癌突变形式)。
在不希望受理论约束的情况下，认为本发明的抗体能够在通过巨胞饮(macropinocytosis)过程内化到细胞中后抑制根据本发明的一种或多种KRAS的致癌突变形式在细胞中的活性。另一种观点是，在不希望受到理论约束的情况下，认为本发明的抗体能够通过巨胞饮过程内化到表达根据本发明的KRAS致癌突变形式的细胞中。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:13、14、15、16、8、9、11和12组成的组，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:13、14、15、16、8、9、11或12的第10-21位氨基酸残基定义，并且所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:8、9、11和12组成的组，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQID NO:8、9、11或12的氨基酸残基定义，且所述抗体抑制所述KRAS的致癌性突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:11组成的组，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的第10-21位氨基酸残基定义，且所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:12组成的组，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的第10-21位氨基酸残基定义，且所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列选自由对应于野生型KRAS(例如SEQ ID NO:7或SEQID NO:10)的G12或G13位置的氨基酸置换，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由对应于野生型KRAS(例如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10)的第10-21位氨基酸残基定义，且所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:17、18、1和2组成的组，其中所述抗体与位于由SEQ ID NO:17、18、1或2的氨基酸序列定义的所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，且所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1和2组成的组，其中所述抗体与位于由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列定义的所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，且所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:13、14、15、16、8、9、11和12组成的组，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:13、14、15、16、8、9、11或12的第10-21位氨基酸残基定义，且所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，所述抗体在一个表位上与KRAS的致癌突变形式(例如SEQ ID NO:13、14、15、16、8、9、11和12)结合，所述表位包括野生型KRAS的G12或G13位置对应的氨基酸替换(优选G12D或G13D的替换)。优选地，所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的G12或G13位置的氨基酸替换，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由对应于KRAS的第10-21位氨基酸残基定义，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的氨基酸残基定义，且所述抗体抑制(或能够抑制)所述KRAS的致癌突变形式的GTP酶活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的G12或G13位置的氨基酸替换，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式区域的表位结合，所述区域由对应于KRAS的第10-21位氨基酸残基定义，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的氨基酸残基定义，且所述抗体抑制(或能够抑制)表达所述KRAS的致癌突变形式的细胞中的ERK磷酸化。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的G12或G13位置的氨基酸替换，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式区域的表位结合，所述区域由对应于KRAS的第10-21位氨基酸残基定义，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的氨基酸残基定义，且所述抗体诱导或增加(或能够诱导或增加)表达所述KRAS的致癌突变形式的细胞的凋亡。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的G12或G13位置的氨基酸替换，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式区域的表位结合，该区域由对应于KRAS的第10-21位氨基酸残基定义，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的氨基酸残基定义，且所述抗体诱导或增加(或能够诱导或增加)表达所述KRAS致癌突变形式的细胞的坏死。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与野生型KRAS相比，优先(或选择性地)与KRAS的致癌突变形式结合，其中所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS的G12或G13位置的氨基酸替换(SEQ ID NO:7)，其中所述抗体与位于所述致癌突变形式的KRAS区域的表位结合，所述区域由对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的氨基酸残基定义，且所述抗体抑制所述致癌突变形式的KRAS的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体与野生型KRAS相比，优先(或选择性地)与KRAS的致癌突变形式结合，其中所述KRAS的致癌突变形式的氨基酸序列为SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:12，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸残基第10-21位定义，且所述抗体抑制所述KRAS致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与KRAS的致癌突变形式结合，其中所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的G12或G13位置的氨基酸替换，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由对应于野生型KRAS的第10-21位氨基酸残基定义，其中所述抗体与位于所述致癌突变形式的KRAS区域的表位结合，该区域由对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的氨基酸残基定义，且所述抗体与野生型KRAS相比，优先(或选择性地)抑制所述致癌突变形式的KRAS的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与具有SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:12氨基酸序列的KRAS致癌突变形式结合，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸残基定义，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:9或SEQID NO:12的氨基酸残基第10-21位定义，且所述抗体与野生型KRAS相比，优先(或选择性地)抑制所述KRAS致癌突变形式的活性。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体(例如单克隆抗体)，例如分离抗体，其与具有选自由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的KRAS致癌突变形式结合(或能够与之结合)，其中所述抗体与位于所述KRAS致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的第10-21位氨基酸残基定义，并且其中所述抗体具有如本文其他地方与本发明的其他方面相关的描述的CDR结构域氨基酸序列(或其组合)和/或至少一个VH结构域氨基酸序列和/或至少一个VL结构域氨基酸序列(或VH和VL结构域序列的组合)。例如，在一些这样的实施方案中，抗体可以具有如本文其他地方所述的抗体11D6-1,4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2(或与其基本同源的序列，或基于抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2序列的序列)的CDR结构域氨基酸序列(或其组合)和/或至少一个VH结构域氨基酸序列和/或至少一个VL结构域氨基酸序列(或VH和VL结构域序列的组合)。在一些实施方案中，该抗体优选抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性(例如本文其他地方描述的一种或多种活性)。在一些实施方案中，该抗体优先地(或选择性地)结合所述KRAS的致癌突变形式(例如本文其他地方所述)和/或优先地(或选择性地)抑制所述KRAS的致癌突变形式(例如本文其他地方所述)。在一些实施方案中，与野生型KRAS相比，该抗体优先(或选择性)结合所述KRAS的致癌突变形式和/或与野生型KRAS相比，优先(或选择性)抑制所述KRAS的致癌突变形式。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体(例如单克隆抗体)，例如分离抗体，其与具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的分离的多肽结合(或能够与之结合)，并且其中所述抗体具有如本文其他地方与本发明的其他方面相关的描述的CDR域氨基酸序列(或其组合)和/或至少一个VH结构域氨基酸序列和/或至少一个VL结构域氨基酸序列(或VH和VL域序列的组合)。例如，在一些这样的实施方案中，抗体可以具有如本文其他地方所述的抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2(或与其基本同源的序列，或基于抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2序列的序列)的CDR结构域氨基酸序列(或其组合)和/或至少一个VH结构域氨基酸序列和/或至少一个VL结构域氨基酸序列(或VH和VL结构域序列的组合)。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:160的分离肽相比，该抗体优先(或选择性地)结合SEQ ID NO:5的分离的多肽。在本发明这方面的优选实施方案中，抗体结合(或能够结合)具有选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式，其中所述抗体结合到由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸残基定义的所述KRAS的致癌突变形式区域中的表位。在一些实施方案中，所述抗体优选抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性(例如本文其他地方所述的一种或多种活性)。在一些实施方案中，抗体优选地(或选择性地)结合所述KRAS的致癌突变形式(例如本文其他地方所述)和/或优选地(或选择性地)抑制所述KRAS的致癌突变形式(例如本文其他地方所述)。在一些实施方案中，与野生型KRAS相比，所述抗体优先(或选择性地)结合所述KRAS的致癌突变形式和/或与野生型KRAS相比优先(或选择性地)抑制所述KRAS的致癌突变形式。对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。
在整个申请中，术语“一”和“一个”是指“至少一个”、“至少第一个”、“一个或多个”或“多个”所提及的成分或步骤，除非在此后特别说明上限的情况下。因此，本文所用的“抗体”是指“至少一个第一抗体”。本领域的普通技术人员根据本公开内容已知组合的可操作限值和参数，以及任何单一药剂的量。
此外，如果本文使用术语“包括”、“包含”、“具有”或“拥有”，或其他同等术语，那么在一些更具体的实施方案中，这些术语包括术语“由”或“基本上由”，或其他同等术语。
包含编码本文所定义的本发明抗体的核苷酸序列或其部分或片段的核酸分子，或与之基本同源的核酸分子，构成本发明的又一个方面。
优选的核酸分子是那些编码本发明抗体的VH区的核酸分子(例如，那些分别编码SEQ ID NO:30或50或70或90或110或130，例如SEQ ID NO:28或48或68或88或108或128)。其他优选的核酸分子是那些编码本发明抗体的VL区的核酸分子(例如，那些分别编码SEQ IDNO:31或51或71或91或111或131，例如SEQ ID NO:29或49或69或89或109或129)。
因此，优选的核酸分子包括编码重链可变区(VH)的序列，其氨基酸序列为SEQ IDNO:30或50或70或90或110或130(优选分别由28或48或68或88或108或128编码)和/或包括编码轻链可变区(VL)的序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO:31或51或71或91或111或131(优选分别由SEQ ID NO:29或49或69或89或109或129编码)。
同样优选的是编码下列组合的核酸：SEQ ID NO:30和31；或SEQ ID NO:50和51；或SEQ ID NO:70和71或SEQ ID NO:90和91；或SEQ ID NO:110和111；或SEQ ID NO:130和131。同样优选的是由以下组合组成的核酸分子：SEQ ID NO:28和29；或SEQ ID NO:48和49；或SEQ ID NO:68和69；或SEQ ID NO:88和89；或SEQ ID NO:108和109；或SEQ ID NO:128和129。
其他优选的核酸分子包括编码本发明的IgG形式的抗体的序列。
在另一个方面，本发明提供了一组(或多个)核酸分子，每个核酸分子包括一个核苷酸序列，其中所述一组核酸分子一起(或共同)编码符合本发明的抗体。这样一组核酸分子的特点是，当该组核酸分子被表达(即一起表达)时(例如在宿主细胞中)，本发明的整个抗体被表达，优选是被组装起来。
也可以使用与上述序列基本同源的核酸序列。
本文中与氨基酸或核酸序列相关的术语“基本同源”包括与所公开的氨基酸或核酸序列具有至少65％、70％或75％，优选至少80％，甚至更优选至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。因此，本发明的基本同源序列包括对本发明序列的单一或多个碱基或氨基酸的改变(添加、替换、插入或删除)。在氨基酸水平上，优选的基本同源序列在构成本发明序列的一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中包含最多5个，例如只有1、2、3、4或5个，优选1、2或3，更优选1或2的改变的氨基酸。所述改变可以是保守的或非保守的氨基酸。优选的是，所述改变是保守的氨基酸替换。
在某些实施方案中，如果给定的起始序列相对较短(例如长度为5个氨基酸)，那么与在与较长的起始序列基本同源的序列中可能选择性地进行的氨基酸替换数量相比，在与其基本同源的序列中可能存在较少的氨基酸替换。例如，在某些实施方案中，与根据本发明的起始VH CDR1序列基本同源的序列，例如在某些实施方案中可能是5个氨基酸残基的起始VH CDR1序列，与起始序列相比，优选有1或2(更优选1)个改变的氨基酸。因此，在一些实施方案中，基本同源序列(如基本同源的CDR序列)中改变的氨基酸数量可以根据给定的起始CDR序列的长度进行调整。例如，根据给定的起始CDR序列的长度，可以存在不同数量的改变的氨基酸，以便在CDR中实现特定的百分比序列同一性，例如至少75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性。
本领域的常规方法，如丙氨酸扫描诱变和/或分析抗原-抗体复合物的晶体结构，可用于确定CDRs的哪些氨基酸残基对抗原结合没有贡献或贡献不大，因此在涉及基本同源序列的本发明实施方案中是改变或替代的良好候选者。
术语“基本同源”还包括本发明的氨基酸和核苷酸序列的修饰或化学等价物，它们以基本相同的方式执行与本发明的蛋白质或核酸分子基本相同的功能。例如，根据本发明，任何基本同源的抗体应保留与给定的KRAS致癌突变形式结合的能力(例如本文其他地方所述)。优选的是，任何基本同源的抗体应保留起始抗体的一个或多个(或全部)功能能力。
本发明的抗体的基本同源序列还包括，但不限于，例如不影响抗体的VH、VL或CDR结构域的改变，例如添加了对抗原的结合没有贡献的标签序列或其他成分的抗体，或将一种类型或形式的抗体分子或片段转换成另一种类型或形式的抗体分子或片段的改变(例如，从Fab转换为scFv或整个抗体，反之亦然)，或将一个抗体分子转换为一个特定类别或亚类的抗体分子(例如，将一个抗体分子转换为IgG或其亚类，例如IgG2或IgG4)。
优选的是，任何基本同源的抗体应保留与所述抗体识别的特定KRAS的致癌突变形式的相同(或基本相同)表位结合的能力，例如，本发明的CDR结构域或本文所述的本发明的VH和VL结构域识别的相同表位。因此，优选的是，任何基本同源的抗体应保留与本发明的一种或多种抗体(例如一种或多种所述的多克隆抗体或一种或多种所述的单克隆抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2)竞争的能力，以结合特定的KRAS致癌突变形式。与同一表位/抗原的结合可以很容易地通过本领域众所周知和描述的方法进行测试，例如使用结合试验，如竞争试验。其他功能特性的保留也可以通过本领域或本文中众所周知和描述的方法进行测试。
因此，本领域的技术人员会理解，结合试验可用于测试“基本同源”的抗体是否具有与本发明的抗体和抗体片段相同的结合特异性，例如，结合试验，如竞争试验或ELISA试验，如本文其他地方所述。BIAcore检测也可容易地用于确定“基本同源”的抗体是否能与特定的KRAS致癌突变形式结合。技术人员将了解其他合适的方法和变化。
如下所述，竞争性结合试验可用于测试“基本同源”的抗体是否保留了与本发明的抗体所识别的KRAS致癌突变形式的基本相同的表位(或相同的表位)结合的能力(如抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2，或基于这些抗体的抗体)，或有能力与本发明的各种抗体中的一种或多种竞争(如抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2，或基于这些抗体的抗体)。下面描述的方法只是合适的竞争试验的一个例子。技术人员将了解其他合适的方法和变化。
一个示例性的竞争试验包括在不同浓度的测试抗体(如基本同源的抗体)存在下，评估各种有效浓度的本发明抗体与特定的KRAS的致癌突变形式的结合。然后可以评估由测试抗体引起的结合抑制量。在增加浓度时测试抗体显示出与本发明抗体的竞争增加(即增加测试抗体的浓度导致本发明抗体与KRAS的致癌突变形式的结合量相应减少)，证明其与基本相同的表位结合。优选的是，测试抗体显著减少与KRAS的致癌突变形式结合的本发明抗体的数量。优选的是，该测试抗体使与KRAS致癌突变形式结合的本发明抗体的数量至少减少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。酶联免疫吸附试验可用于评估这种竞争试验中的结合抑制，但其他合适的技术对于本领域的技术人员来说是众所周知的。
在一些实施方案中，“基本同源”的抗体保留了与本发明的抗体所识别的特定KRAS的致癌形式的基本相同(或相同)表位结合(或特异性结合)的能力(例如抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2，或基于这些抗体的抗体)或有能力与本发明的一种或多种抗体竞争(如抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2，或基于这些抗体的抗体)的抗体是首选。
本文所使用的术语“竞争抗体”是指与“参考抗体”结合的表位大致上、基本上或实质上相同，甚至相同的抗体。“竞争抗体”包括具有重叠表位特异性的抗体。因此，根据本发明，竞争抗体能够有效地与参考抗体竞争，与KRAS的致癌突变形式结合。优选的是，竞争抗体能与参考抗体结合相同的表位。或者说，竞争抗体优选具有与参考抗体相同的表位特异性。
本文所用的“参考抗体”包括与根据本发明的KRAS的致癌突变形式的与本发明的分离的多肽或表位结合的抗体(例如本文所述的多克隆兔抗体或单克隆抗体)。“参考抗体”还包括优选具有本文定义的VH和VL结构域的抗体，更优选SEQ ID NO:30的VH结构域和SEQID NO:31的VL结构域，或SEQ ID NO:50的VH结构域和SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:70的VH结构域和SEQ ID NO:71的VL结构域，SEQ ID NO:90的VH结构域和SEQ ID NO:91的VL结构域，SEQ ID NO:110的VH结构域和SEQ ID NO:111的VL结构域，或者SEQ ID NO:130的VH结构域和SEQ ID NO:131的VL结构域。某些优选的参考抗体选自抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1或6B2-1-2，或基于这些抗体的抗体。
由于竞争抗体的鉴定是通过与参考抗体的比较来确定的，因此可以理解的是，为了鉴定竞争抗体，实际确定任何一种或两种抗体所结合的表位是不需要的。然而，如果需要的话，可以使用标准技术进行表位定位。
在以下关于根据本发明的组合物、免疫偶联物、药品、混合物、(药用)鸡尾酒、试剂盒、第一和第二医疗用途以及所有方法的描述中，除非另有特别说明或从科学术语中明确，否则术语“抗体”和“免疫偶联物”或其抗原结合区或片段是指根据本发明与KRAS的致癌突变形式结合的一系列抗体，以及本文实施例部分所述的特定抗体。
本文所使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”泛指任何包括抗原结合域的免疫学结合剂，包括多克隆和单克隆抗体。
因此，术语“抗体”包括免疫学结合剂，其包括从抗体(或基于抗体的抗原结合域)获得或衍生的抗原结合域，例如从Ig(如IgG)抗体(或基于Ig(如IgG)抗体的抗原结合域)获得或衍生。
在一些实施方案中，优选多克隆抗体(例如在用本发明的分离的多肽或偶联物(优选偶联物)免疫的动物(例如兔子，如无特定病原体(SPF)的兔子)中产生(或在其中生成或分离出)的多克隆抗体。优选的分离的多肽和偶联物在本文的其他地方描述。
在一些实施方案中，优选单克隆抗体(例如，小鼠单克隆或人单克隆抗体或人源化单克隆抗体或兔单克隆抗体)。
根据重链中恒定结构域的类型，整个抗体被分配为五个主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，本发明的抗体可以属于这些类别中的任何一个。其中的几个类别又进一步分为亚类或同型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维结构是众所周知的。
一般来说，在本发明中使用整个抗体而不是抗原结合域时，首选IgG(如IgG2或IgG4)和/或IgM，因为它们是生理情况下最常见的抗体，也因为它们在实验室环境中最容易制成。
基于哺乳动物抗体的“轻链”的恒定结构的氨基酸序列和其可变结构框架区的一些氨基酸，将其分为两个明显不同的类型之一：kappa(κ)和lambda(λ)。
正如本领域技术人员所理解的那样，术语“抗体”所包含的免疫学结合试剂包括或扩充至所有抗体及其抗原结合片段，包括整个抗体、二聚体、三聚体和多聚体抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；重组和工程抗体，以及其片段。
因此，术语“抗体”是指任何具有抗原结合域的抗体样分子，该术语包括由抗原结合域组成的抗体片段，如Fab'，Fab，F(ab')2，单域抗体(DABs)，TandAbs二聚体，Fv，scFv(单链Fv)，dsFv，ds-scFv，Fd，线性抗体，微型抗体(minibody)，双价抗体(diabody)，双特异性抗体片段，bibody，tribody(scFv-Fab融合，分别为双特异性或三特异性)；sc-双价抗体(sc-diabody)；kappa(lamda)抗体(scFv-CL融合体)；BiTE(双特异性T细胞衔接子，scFv-scFv串联吸引T细胞)；DVD-Ig(双可变区抗体，双特异性形式)；SIP(小型免疫蛋白，一种微型抗体)。SMIP(“小型模块化免疫药物”scFv-Fc二聚体；DART(ds-稳定二价抗体“双亲和重定向”)；包括一个或多个CDR的小型抗体模拟物等等。
制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域是众所周知的。特别是二价抗体，在EP 404 097和WO 93/11161中进一步描述；而线性抗体在本领域中进一步描述。
在一些实施方案中，本发明的抗体为非人类抗体(例如，兔或大鼠或小鼠抗体)。在一些实施例中，本发明的抗体是兔抗体。在一些实施方案中，抗体是小鼠抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体是人类抗体，更优选是完全人类抗体。在这方面，人的抗体通常至少有两个潜在的优势用于人类治疗。首先，人体免疫系统不应将该抗体识别为外来抗体。其次，其在人体循环中的半衰期将类似于自然产生的人类抗体，以便给予更小、更少频率的剂量。天然存在本文中与抗体分子和结合蛋白相关的术语“人类”首先是指具有可变区(如VH、VL、CDR或FR区)和可选的恒定抗体区的抗体和结合蛋白分离或来自于人类基因库的序列，或来自于或对应于在人类或人类基因库中发现的序列，例如在人类生殖系或体细胞中发现的序列。
“人类”抗体和结合蛋白进一步包括非人类序列编码的氨基酸残基，例如，通过体外随机或位点定向突变引入的突变，例如通过体外克隆或PCR引入的突变。这种突变的特别例子是涉及保守替换的突变，或在抗体或结合蛋白的少数残基中的其他突变，例如，在抗体或结合蛋白中多达5、4、3、2或1个残基，优选是例如在构成抗体或结合蛋白的一个或多个CDR中多达5、4、3、2或1个残基。这种“人类”抗体的某些例子包括经过标准修饰技术以减少潜在免疫原性位点的抗体和可变区。
因此，“人类”抗体包括衍生自在人类中发现的序列并与之相关的序列，但是其可能不天然存在于人体内的抗体种系库中。此外，人类抗体和结合蛋白包括包含从人类序列鉴定的人类共有序列或与人类序列基本同源的序列的蛋白质。
此外，人类抗体和结合蛋白不限于本身在人类抗体分子中发现的VH、VL、CDR或FR区域的组合。因此，人类抗体和结合蛋白可以包括或对应于不一定在人类中自然存在的这种区域的组合(例如是非天然存在的抗体)。
在一些实施方案中，人类抗体是完全人类抗体。这里所说的“完全人类”抗体是指由“人类”可变区结构和/或CDRs组成的抗体，没有大量的非人类抗体序列或没有任何非人类抗体序列。例如，由人类可变区域结构域和/或CDR组成的抗体“没有大量的非人类抗体序列”是指其中只有多达5、4、3、2或1个氨基酸是人类抗体序列所没有编码的氨基酸的抗体、结构域和/或CDR。因此，“完全人类”抗体与“人源化”抗体是有区别的，后者是基于实质上非人类的可变区，例如小鼠可变区，其中某些氨基酸被改变以更好地对应人类抗体中通常存在的氨基酸。
本发明的“完全人类”抗体可以是没有任何其他实质性抗体序列的人类可变区和/或CDRs，例如是单链抗体。另外，本发明的“完全人类”抗体可以是人类可变区和/或CDR，与一个或多个人类抗体恒定区构成整体，或与之有效连接。某些优选的全人类抗体是具有完整的IgG恒定区的IgG抗体。
在其他实施方案中，本发明的“人类”抗体将是部分人源嵌合抗体。本文所用的“部分人源嵌合”抗体是指由“人类”的可变区和/或CDRs有效地连接到或嫁接到非人类物种，如大鼠或小鼠的恒定区的抗体。这种部分为人源的嵌合抗体可用于例如临床前研究，其中恒定区最好是临床前测试中使用的同一物种的动物。这些部分人源嵌合抗体也可用于例如体外诊断，其中非人源物种的恒定区可提供额外的抗体检测选择。
在一些实施方案中，本发明的抗体将是人源化抗体。“人源化”抗体，是基于基本上非人类的可变区的抗体，其中某些氨基酸被改变以更好地对应人类抗体中通常存在的氨基酸。产生人源化抗体的方法在本领域是众所周知的。例如，人源化抗体可以通过将适当的CDRs(如鼠类CDRs)插入到人类抗体“支架”中来完成。在某些情况下，一个或多个CDR残基可以被改变，以更好地对应人类抗体中通常存在的氨基酸。
本文所用的术语“重链互补决定区”(“重链CDR”)是指抗体分子的重链可变区(VH结构域)中的高变区。重链可变区从氨基端到羧基端有三个CDR，称为重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。重链可变区也有四个框架区(从氨基端到羧基端为FR1、FR2、FR3和FR4)。这些框架区将CDRs分开。
本文所用的术语“重链可变区”(VH结构域)是指抗体分子重链的可变区。
本文所用的术语“轻链互补决定区”(“轻链CDR”)是指抗体分子的轻链可变区(VL结构域)中的高变区。轻链可变区从氨基端到羧基端有三个CDR，称为轻链CDR1，轻链CDR2和轻链CDR3。轻链可变区也有四个框架区(从氨基端到羧基端为FR1、FR2、FR3和FR4)。这些框架区将CDRs分开。
本文所用的术语“轻链可变区”(VL结构域)是指抗体分子轻链的可变区。
本发明的抗体的CDR优选被适当的框架区分开，如在天然存在的抗体和/或有效的工程抗体中发现的那些。因此，优选在适当的框架或支架内提供VH，VL和单个CDR序列或将其掺入适当的框架或支架中以使抗原结合。这样的框架序列或区域可以对应于天然存在的框架区FR1、FR2、FR3和/或FR4，以形成适当的支架，或者可以对应于共有框架区，例如通过比较各种天然存在的框架区来确定。另外，也可以使用非抗体支架或框架，如T细胞受体框架。可用于框架区的适当序列在本领域中是众所周知的，并且可以使用其中的任何一种。特别是，允许维持抗原特异性的框架区，例如导致抗体基本相同或相同三维结构的框架区。
本发明某些抗体的CDR序列在表A-F中列出。在其他一些实施方案中，本发明抗体的CDR序列可以是使用任何合适的方法(或工具)鉴定的本发明抗体的VH结构域和VL结构域的CDR序列，例如根据Kabat(例如Kabat等，"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest"，5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,647-669,1991)或Chothia(例如Chothia C,et al.(1989)Nature,342:877-883,或Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948)。
抗体可以用常规技术进行片段化。例如，F(ab')2片段可以通过用胃蛋白酶处理抗体来产生。产生的F(ab')2片段可以被处理以减少二硫桥，产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以导致Fab片段的形成。Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAbs、TandAbs、ds-scFv、二聚体、微型抗体、二价抗体、双特异性抗体片段和其他片段也可以通过重组技术合成，或者可以通过化学合成。生产抗体片段的技术是众所周知的，并在本领域中描述。
在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包括全部或部分重链恒定区，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG2或IgG4重链恒定区，或其一部分。此外，该抗体或抗体片段可以包括全部或部分kappa轻链恒定区或lambda轻链恒定区，或其中一部分。所述恒定区的全部或部分可以是自然产生的，也可以是全部或部分合成的。所述恒定区的适当序列在本领域中是众所周知的，也是有记载的。当来自重链和轻链的全部恒定区被包括在本发明的抗体中时，这种抗体在此通常被称为“全长”抗体或“完整”抗体。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体是Ig(如IgG)抗体。
优选地，在一些实施方案中，本发明的抗体(例如Ig抗体)包括两个相同的VH结构域和两个相同的VL结构域。因此，以Ig(如IgG)抗体为例，Ig抗体通常包括两个相同的重链和两个相同的轻链(或由其组成)，它们共同构成Ig抗体。然而，在一些实施方案中，本发明的抗体(例如IgG抗体)可以包括两个相同的VH结构域和两个非相同的VL结构域(即两个不同的VL结构域)。因此，在一些实施方案中，每个抗体(如IgG)分子可以包括两个相同的VH结构域和两个非相同的VL结构域(即两个不同的VL结构域，每个具有不同的氨基酸序列)。例如，一个Ig(如IgG)抗体可以包括两个相同的重链和两个轻链(或由其组成)，其中两个轻链的序列彼此不完全相同(即它们是不同的)。
举例来说，在一些实施方案中。抗体可以包括至少一个(优选两个)重链可变区(VH结构域)，包括6B2-1-1(或6B2-1-2)抗体的三个VH CDR的氨基酸序列(或与其基本同源的CDR序列)和至少一个(优选一个)轻链可变区(VL结构域)，包括6B2-1-1的三个VL CDR的氨基酸序列(或与之基本同源的CDR序列)和至少一个(优选一个)轻链可变区(VL结构域)，包括6B2-1-2抗体的三个VL CDR的氨基酸序列与之基本同源的CDR序列。因此，在一些实施方案中，抗体可以包括至少一个(优选两个)重链可变区(VH域)，包括SEQ ID NO:110的氨基酸序列(或与其基本同源的序列)和至少一个(优选一个)轻链可变区(VL结构域)，包括SEQ IDNO:111(或与其基本相同的序列)和至少一个(优选一个)轻链可变区(VL结构域)，包括SEQID NO:131(或与其基本相同的序列)的氨基酸序列。在一些实施方案中，这种抗体可以是Ig(例如IgG)抗体。
抗体或抗体片段可以是自然产生的，也可以是全部或部分合成的。因此，抗体可以来自任何适当的来源，例如重组来源和/或在转基因动物或转基因植物中产生，或使用IgY技术在鸡蛋中产生。因此，抗体分子可以在体外或在体内产生。
优选地，该抗体或抗体片段包括一个由三个CDR结构域组成的抗体轻链可变区(VL)和一个由三个CDR结构域组成的抗体重链可变区(VH)。所述的VL和VH通常形成抗原结合位点。
“Fv”片段是包含一个完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域有一个重链和一个轻链可变区的二聚体，处于紧密的非共价结合状态。正是在这种结构下，每个可变域的三个高变区(CDRs)相互作用，在VH-VL二聚体的表面界定了抗原结合位点。总的来说，六个高变区(CDRs)赋予抗体以抗原结合的特异性。
然而，本领域有充分的文件证明，抗体的轻链可变区的三个CDR和重链可变区的三个CDR的存在并不总是抗原结合所必需的。因此，比上述经典抗体片段小的构建体是已知的有效的。
例如，骆驼科动物的抗体具有广泛的抗原结合谱系，但没有轻链。另外，由单独的VH结构域或单独的VL结构域组成的单结构域抗体的结果表明，这些结构域能以可接受的高亲和力与抗原结合。因此，三个CDR可以有效地与抗原结合。
因此，尽管本发明的优选抗体可能包括六个CDR区(三个来自轻链，三个来自重链)，但本发明也包括少于六个CDR区的抗体(例如三个CDR区)。本发明也考虑到了只有重链或轻链的CDR的抗体。
本发明的又一个方面提供了一种抗体，优选一种分离的抗体，它与根据本发明的KRAS的致癌突变形式结合，并且具有与本发明的抗体竞争(即与相同或基本相同的表位结合)以与所述KRAS的致癌突变形式结合的能力。例如，能与针对本发明的分离的多肽(或偶联物)产生的抗体(例如多克隆抗体，如本文实施例部分所述的抗体)竞争，以结合到根据本发明KRAS的致癌突变形式的抗体代表本发明的另一个方面。本发明其他方面的其他特征和特性适用对本发明该方面作出必要的调整。
与同一表位/抗原的结合可以很容易地通过本领域众所周知和描述的方法来测试，例如使用结合试验，如竞争试验。
一个示例性的竞争试验涉及在不同浓度的测试抗体(如基本同源的抗体)存在下，评估各种有效浓度的本发明抗体与根据本发明的KRAS致癌突变形式的结合(如与根据本发明的KRAS致癌突变形式的分离的多肽或表位结合的兔多克隆抗体)。然后可以评估由测试抗体引起的抑制结合的量。在增加浓度时测试抗体显示出与本发明抗体的竞争增加(即增加测试抗体的浓度导致本发明抗体与符合本发明的KRAS的致癌突变形式的结合量相应减少)，证明与基本相同的表位结合。优选的是，试验抗体显著减少与根据本发明的KRAS致癌突变形式结合的本发明抗体的数量。优选的是，该测试抗体使与KRAS致癌突变形式结合的本发明抗体的数量至少减少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。例如，ELISA可用于评估这种竞争试验中的结合抑制，但其他合适的技术对于本领域的技术人员来说是众所周知的。
本文所使用的术语“竞争抗体”是指与“参考抗体”结合的表位大致上、基本上或实质上相同，甚至相同的抗体。“竞争抗体”包括具有重叠表位特异性的抗体。因此，根据本发明，竞争抗体能够有效地与参考抗体竞争，与KRAS的致癌突变形式结合。优选的是，竞争抗体能与参考抗体结合相同的表位。或者说，竞争抗体最好具有与参考抗体相同的表位特异性。
本文所用的“参考抗体”是指根据本发明与KRAS致癌突变形式的分离的多肽或表位结合的抗体(例如本文所述的多克隆兔抗体)。
由于竞争抗体的鉴定是通过与参考抗体的比较来确定的，因此可以理解的是，为了鉴定竞争抗体，实际确定任何一种或两种抗体所结合的表位是不需要的。然而，如果需要的话，可以使用标准技术进行表位定位。
在以下关于根据本发明的组合物、免疫偶联物、药品、混合物、(药用)鸡尾酒、试剂盒、第一和第二医疗用途以及所有方法的描述中，除非另有特别说明或从科学术语中明确，否则术语“抗体”和“免疫偶联物”或其抗原结合区或片段是指根据本发明与KRAS的致癌突变形式结合的一系列抗体，以及本文实施例部分所述的特定抗体。
优选的是，当与合适的对照水平相比，上述能力和特性是在可测量的或显著水平上观察到的，更优选的是在统计学上的显著水平上观察到的。适当的显著性水平在本文的其他地方讨论。更优选的是，当与现有技术抗体所观察到的能力相比，上述一种或多种能力和特性被观察到的水平是可测量更好的，或更优选显著更好的。
在本文提及的任何统计分析中，优选地，与相关对照或其他比较的个体或测量相比，统计学上的显著差异的概率值为<0.1，优选地<0.05或<0.01或<0.001或<0.0001。确定统计学意义的适当方法在本领域中是众所周知的，并且可以使用这些方法中的任何一种。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与其基本同源的序列的(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3；
其中所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守性氨基酸替换的序列。
本发明这方面的优选实施方案包括包含一个或多个抗体序列(例如CDR序列和/或VH结构域和/或VL结构域序列)的抗体，这些抗体序列在本文其他地方与本发明的其他方面相关联描述。因此，对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。在本发明这方面的一些优选实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VH结构域，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列或与其基本同源的序列的(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3；
其中所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守性氨基酸替换的序列。
本发明这方面的优选实施方案包括包含一个或多个抗体序列(例如CDR序列和/或VH结构域和/或VL结构域序列)的抗体，这些抗体序列在本文其他地方与本发明的其他方面相关联描述。因此，对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。在本发明这方面的一些优选实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VH结构域，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列或与其基本同源的序列的(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3；
其中所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守性氨基酸替换的序列。
本发明这方面的优选实施方案包括包含一个或多个抗体序列(例如CDR序列和/或VH结构域和/或VL结构域序列)的抗体，这些抗体序列在本文其他地方与本发明的其他方面相关联描述。因此，对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。在本发明这方面的一些优选实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VH结构域，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与其基本同源的序列的(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3；
其中所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守性氨基酸替换的序列。
本发明这方面的优选实施方案包括包含一个或多个抗体序列(例如CDR序列和/或VH结构域和/或VL结构域序列)的抗体，这些抗体序列在本文其他地方与本发明的其他方面相关联描述。因此，对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。在本发明这方面的一些优选实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VH结构域，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列或与其基本同源的序列的(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3；
其中所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守性氨基酸替换的序列。
本发明这方面的优选实施方案包括包含一个或多个抗体序列(例如CDR序列和/或VH结构域和/或VL结构域序列)的抗体，这些抗体序列在本文其他地方与本发明的其他方面相关联描述。因此，对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。在本发明这方面的一些优选实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VH结构域，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，例如一种分离抗体，该抗体与KRAS的致癌突变形式结合，并且包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列或与其基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR1，
(b)具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR2，和
(c)具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VH CDR3；和/或(优选是“和”)
其中，所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列或与其基本同源的序列的(VL)CDR1，
(e)具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR2，和
(f)具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其基本同源的序列的VL CDR3；
其中所述基本同源序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源序列是含有给定CDR序列的保守性氨基酸替换的序列。
本发明这方面的优选实施方案包括包含一个或多个抗体序列(例如CDR序列和/或VH结构域和/或VL结构域序列)的抗体，这些抗体序列在本文其他地方与本发明的其他方面相关联描述。因此，对本发明其他方面的抗体和优选实施方案的各种特征的讨论适用对本发明该方面作出必要的调整。在本发明这方面的一些优选实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VH结构域，和/或(优选是“和”)具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列或基本与其同源的序列的VL结构域。
本发明的抗体、肽、结合蛋白和核酸分子通常是“分离的”或“纯化的”分子，因为它们与可能存在于人类或动物体内或来自人类或动物体内的组织样本中的任何此类成分相区别。然而，这些序列可能与在人类或动物体内发现的序列相对应或基本同源。因此，本文在提到核酸分子或序列和蛋白质、肽或多肽(如抗体)时使用的术语“分离的”或“纯化的”是指从自然环境中分离、纯化或基本不存在的此类分子，如从人体或动物体内分离或纯化的分子(如果它们确实是自然存在的)，或指通过技术过程产生的此类分子，即包括重组和合成的分子。
因此，当与蛋白质或多肽分子如分离的多肽、轻链CDR 1、2和3、重链CDR 1、2和3、轻链可变区、重链可变区和结合蛋白或本发明的抗体，包括全长抗体一起使用时，术语“分离的”或“纯化的”通常指基本上不含细胞物质或来自其来源的其他蛋白质。在一些实施方案中，特别是当蛋白质将被施用于人类或动物时，这种分离的或纯化的蛋白质在通过重组技术生产时基本上不含培养基，或在化学合成时不含化学前体或其他化学品。
本文所用的术语“片段”是指具有生物学意义的片段，例如有助于抗原结合的片段，例如形成抗原结合位点的一部分，和/或有助于根据本发明的KRAS抗体的功能特性。某些优选片段包括本发明抗体的重链可变区(VH结构域)和/或轻链可变区(VL结构域)。
本领域的技术人员会理解，本发明的抗体、抗体片段和免疫偶联物可以用本领域众所周知和描述的几种方法中的任何一种制备。例如，多克隆抗体可以通过用本发明的分离的多肽或偶联物免疫动物(非人类动物，如兔子)，并分离(和可选地纯化)由动物产生的分离的多肽或偶联物的抗体来制备。在其他实施方案中，本发明的抗体、抗体片段和免疫偶联物可以通过重组方法制备。
编码本发明抗体的轻链和重链可变区的核酸片段可以通过任何适当的方法，例如通过克隆或合成来获得或生产。
一旦获得编码本发明抗体轻链和重链可变区的核酸片段，可以通过标准的重组DNA技术进一步处理这些片段，例如将可变区片段转化为具有适当恒定区结构的全长抗体分子，或转化为本文其他地方讨论的特定格式的抗体片段，例如Fab片段、scFv片段等。通常，或作为该进一步操作程序的一部分，编码本发明抗体分子的核酸片段通常被纳入一个或多个适当的表达载体，以促进本发明抗体的生产。
可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒或修饰的病毒(如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体与所用的宿主细胞相匹配。表达载体“适于转化宿主细胞”，这意味着表达载体含有本发明的核酸分子和根据用于表达的根据宿主细胞选择的调控序列，所述调控序列与核酸分子有效地连接。有效地连接是指核酸以允许核酸表达的方式与调控序列连接。
因此，本发明构建了一种重组表达载体，它含有本发明的核酸分子或其片段，以及必要的调控序列，用于本发明核酸分子编码的蛋白质序列的转录和翻译。
合适的调控序列可以来自各种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫的基因，并且是本领域内众所周知的。适当的调控序列的选择取决于所选择的宿主细胞，如下文所述，本领域的普通技术人员可以很容易地完成。这种调控序列的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信号。此外，根据所选择的宿主细胞和所使用的载体，其他序列，如复制原点、额外的DNA限制位点、增强子和赋予转录诱导性的序列可以包含在表达载体中。
本发明的重组表达载体还可以包含一个可选择的标记基因，有利于选择用本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。
重组表达载体还可包含编码融合分子的基因，该融合分子可增加重组蛋白的表达；增加重组蛋白的溶解度；并通过在亲和纯化中充当配体来帮助目标重组蛋白的纯化(例如可存在适当的“标签”以实现纯化和/或识别，例如His标签或myc标签)。
重组表达载体可以被引入到宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语“转化的”、“转染的”、“转化”和“转染”是指通过本领域已知的许多可能的技术之一将核酸(如载体)引入细胞。转化和转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等人，1989(Sambrook,Fritsch andManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY,1989)和其他实验室教科书中找到。
合适的宿主细胞包括各种各样的真核宿主细胞和原核细胞。例如，本发明的蛋白质(如抗体)可以在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。此外，本发明的蛋白质可以在原核细胞中表达，如大肠杆菌。
鉴于本文提供的教导，将适当类型的表达载体引入植物、禽类和昆虫细胞的启动子、终止子和方法也可轻易完成。
另外，本发明的蛋白质(如抗体)也可以在非人类的转基因动物中表达，如大鼠、兔子、绵羊和猪。
本发明的蛋白质也可以通过化学合成来制备，使用蛋白质化学中众所周知的技术，如固相合成。
由本发明的抗体和蛋白质(如分离的多肽)与其他分子(如蛋白质)连接组成的N端或C端融合蛋白，可通过重组技术融合制备。所得的融合蛋白包含本发明的抗体或蛋白与本文所述的选定蛋白或标记蛋白、或标签蛋白融合。本发明的抗体和蛋白也可以通过已知技术与其他蛋白偶联。例如，可以使用WO 90/10457中描述的异源双功能的含硫醇的连接剂(heterobifunctional thiol-containing linker)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基-丙氨酸)(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio-proprionate))或N-琥珀酰亚胺-5硫代乙酸酯(N-succinimidyl-5thioacetate)将蛋白质连接起来。
另一个方面提供了一种表达构建体或表达载体，包括一个或多个本发明的核酸片段或片段或分子。优选地，表达构建体或载体是重组的。还提供了一组表达载体(或一组表达构建体)，它们一起(共同)编码本发明的抗体。所述一组表达载体的特点是，当该套表达载体被表达(即一起表达)时(例如在宿主细胞中)，本发明的抗体(完整抗体)被表达，并且优选地被组装起来。
优选地，所述构建体或载体进一步包括必要的调控序列，用于本发明的核酸分子所编码的蛋白质序列的转录和翻译。
本发明的又一个方面提供了包含一个或多个的表达构建体或表达载体的宿主细胞或病毒。还提供了包含一个或多个本发明的核酸分子的宿主细胞或病毒。表达本发明抗体的宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)或病毒构成了又一个方面。
本发明的又一个方面提供了一种生产(或制造或分离或鉴定或生成)本发明抗体的方法，所述方法采用了本发明的分离的多肽或偶联物。另外来看，本发明提供了使用本发明的分离的多肽或偶联物来鉴定(或分离或生成或生产)本发明的抗体。
本发明的又一个方面提供了一种生产(或制造或分离或鉴定或生成)本发明抗体的方法，包括用本发明的分离的多肽(或偶联物)免疫动物(非人类动物，例如兔子)的步骤。优选的方法包括从所述动物身上获得针对本发明的分离的多肽(或偶联物)产生(或生成)的抗体的步骤，以及可选的纯化抗体产品和/或将抗体或产品配制成包括至少一种额外成分的组合物，如药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的又一个方面提供了一种通过在杂交瘤技术(例如常规杂交瘤技术)中采用本发明的分离的多肽或偶联物来生产(或制造或分离或鉴定或生成)本发明抗体的方法。另外来看，本发明提供了利用杂交瘤技术鉴定(或分离或产生或生产)本发明的抗体的分离的多肽或偶联物的用途。在一些实施方案中，用本发明的分离的多肽或偶联物免疫非人类动物(如小鼠)，从所述免疫动物(如小鼠)中分离出脾脏细胞并与骨髓瘤细胞(如小鼠骨髓瘤细胞)融合，该细胞缺乏HGPRT表达(这种骨髓瘤细胞不能在含有HAT的培养基中生长)，使用含有次黄嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶(HAT)的培养基选择杂交(即融合或杂交瘤)细胞。只有融合的细胞在含有HAT的培养基中生长。
本发明的又一个方面提供了一种鉴定(或分离或产生)本发明抗体的方法，该方法采用噬菌体显示技术(与噬菌体显示抗体库)。另外看，本发明提供了利用噬菌体展示技术(与噬菌体展示抗体库)鉴定(或分离或产生或生产)本发明的抗体的分离的多肽或偶联物的用途。在一些实施方案中，本发明的分离的多肽或偶联物(通常固定在固体支持物上，如珠子或微珠或板或微滴板)与噬菌体库(噬菌体库通常是丝状噬菌体库，如fd噬菌体库的M13)接触，后者在噬菌体表面显示(或呈现或表达)抗体或抗体片段如scFv或Fab片段的库。任何合适的噬菌体显示抗体库都可以使用，技术人员对这些抗体库很熟悉(例如，有商业上可用的噬菌体显示抗体库)。然后，结合的噬菌体被洗脱，通过分离和测序噬菌体的核酸(或至少编码显示抗体的核酸部分)，可以很容易地确定显示的抗体的特性。在一些实施方案中，在结合的噬菌体洗脱后，在鉴定结合的噬菌体的显示抗体之前，还要进行一轮或多轮(如1、2、3、4、5或更多)的接触和洗脱。这样的附加轮次通常会进一步丰富库的内容。在一些典型的实施方案中，当本发明的多肽或偶联物被固定在固体支持物上时，固体支持物通常在接触步骤后(和洗脱步骤前)被清洗，那些与固定的分离的的肽或偶联物结合的噬菌体显示的抗体或抗体片段仍被结合(而其他的被洗掉)。
本发明的又一个方面提供了一种生产(或制造)本发明抗体的方法，包括培养本发明的宿主细胞的步骤。优选的方法包括以下步骤：(i)在适合于表达编码的抗体的条件下，培养包含本发明的一个或多个重组表达载体(或一组表达载体)或一个或多个核酸序列或分子(或一组核酸分子)的宿主细胞；以及可选地(ii)从宿主细胞或从培养基/上清液中分离或获得抗体。
在本发明的抗体或蛋白质由一个以上的多肽链(例如某些片段，如Fab片段或整个抗体)组成的实施方案中，那么所有的多肽最好在宿主细胞中表达，可以来自同一个或不同的表达载体，以便完整的蛋白质，例如本发明的抗体蛋白质，可以在宿主细胞中组装，并从中分离或纯化出来。
在一些实施方案中，根据本发明生产(或制造或分离或鉴定或产生)抗体的方法还可以包括纯化抗体或蛋白产品的步骤和/或将抗体或产品配制成包括至少一种额外成分的组合物，如药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一个方面，本发明提供了一种根据本发明结合KRAS的致癌突变形式的方法，包括将包括根据本发明的KRAS的致癌突变形式的组合物与本发明的抗体或其免疫偶联物接触。
在另一个方面，本发明提供了一种检测根据本发明KRAS致癌突变形式的方法，包括将疑似含有根据本发明的KRAS致癌突变形式的组合物与本发明的抗体或其免疫偶联物在有效允许形成KRAS/抗体复合物的条件下接触并检测如此形成的复合物。
测试一种或多种抗体与KRAS的致癌突变形式结合的能力可以通过任何适当的方法进行，这些方法在本领域是众所周知的。合适的方法在实施例部分也有描述。
本发明还提供了一系列的偶联的抗体及其片段，其中根据本发明的抗KRAS抗体与至少一种其他治疗剂有效地连接。术语“免疫偶联物”广泛用于定义抗体与另一种有效制剂(如治疗剂)的有效联合，并仅意指任何类型的有效联合，尤其不限于化学“偶联”。重组融合蛋白是特别考虑到的。只要递送剂或靶向剂能够与靶点结合，并且治疗剂或诊断剂在递送时有足够的功能，那么连接方式就会是合适的。
在一些实施方案中，本发明的抗体以其“裸露”未偶联的形式被使用(例如用于治疗)。
至少包括本发明的第一抗体或其免疫偶联物的组合物构成本发明的另一个方面。由一个或多个本发明的抗体与合适的稀释剂、载体或赋形剂混合而成的制剂(组合物)构成本发明的一个优选实施方案。此类制剂可用于制药，因此本发明的组合物最好是药学上可接受的。合适的稀释剂、赋形剂和载体是技术人员已知的。
在一些实施方案中，本发明的组合物可包括一个以上不同的本发明的抗体(例如2或3个或更多)。例如，在一些实施方案中，组合物可包括本文所述的一种以上的单克隆抗体。
根据本发明的组合物可以以适合口服、鼻腔、肠外、腹膜内、静脉内、局部或直肠给药的形式呈现，例如在一些实施方案中，优选适用于静脉内给药的形式。
此处定义的活性化合物可以以常规的药理学给药形式呈现，如片剂、包衣片、鼻腔喷雾剂、溶液、乳剂、脂质体、粉末、胶囊或缓释形式。传统的药用辅料以及通常的生产方法可用于制备这些形式。
例如，注射液可按常规方式生产，如加入防腐剂，如对羟基苯甲酸酯，或稳定剂，如EDTA。然后可将这些溶液装入注射瓶或安瓿瓶。
鼻腔喷雾剂可以类似地配制成水溶液，并装入喷雾容器中，可以使用气溶胶推进剂，也可以提供人工压缩的手段。
本发明的药物组合物(制剂)优选为肠外给药。在一些实施方案中，静脉给药是首选。肠外给药可通过注射器的皮下注射、肌肉注射或静脉注射进行。另外，肠外给药可以通过输液泵进行。另一个选择是一种组合物，可以是粉末或液体，以鼻腔或肺部喷雾的形式给药。作为进一步的选择，本发明的抗体也可以经皮给药，例如从贴片，可选的是离子透入式贴片，或经粘膜，例如粘膜。
适当的剂量单位可由本领域的技术人员确定。
在共同给药方案或联合方案的背景下，药物组合物可额外包括进一步的活性成分。
本发明的另一个方面提供了一种用于治疗的本发明的抗体。
特别是，根据本发明，本发明提供的抗体用于治疗与KRAS的致癌突变形式的表达有关(或由其引起，或以其为特征)的疾病或状况。
在优选的实施方案中，本发明提供的本发明的抗体特别是用于癌症治疗的抗体。
通常，根据本发明要治疗(或预防)的癌症是与根据本发明的KRAS的致癌突变形式的表达有关(或由其引起，或以其为特征)的癌症。
在一些实施方案中，癌症是一种实体瘤。在一些实施方案中，该癌症是一种恶性肿瘤。
根据本发明要治疗的癌症类型包括但不限于结直肠癌(如结肠癌)、肺癌(如非小细胞肺癌)和胰腺癌(如胰腺导管腺癌)。
“治疗”包括治疗和预防，即在包括治疗和预防的用途。因此，“癌症治疗”包括癌症的治疗和癌症的预防。
因此，在一些实施方案中，本发明提供的本发明的抗体用于治疗癌症。在一些实施方案中，本发明提供了本发明的抗KRAS抗体，用于预防癌症。
本发明的另一个方面提供了本发明的抗体用于抑制根据本发明的KRAS的致癌突变形式的活性(例如在受试者中)。活性可如本文其他地方所述。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗的本发明的免疫偶联物，特别是用于治疗癌症的免疫偶联物。
本文所述的体内方法和用途一般是在哺乳动物体内进行的。任何哺乳动物都可以被用于治疗，例如人类和任何牲畜、家畜或实验室动物。具体例子包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔子、牛和猴子。然而，优选的是，该哺乳动物是人。
因此，本文所用的术语“动物”或“病人”包括任何哺乳动物，例如人类和任何牲畜、家畜或实验室动物。具体例子包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔子、牛和猴子。然而，优选的是，该动物或病人是人类受试者。因此，根据本发明治疗的受试者或病人优选人类。
在一些实施方案中，受试者或病人将是那些患有癌症的人，或那些有可能患有或发展为癌症的人，或那些疑似患有癌症的人。
另外来看，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的抗体，如本文所定义。本文所述的本发明的治疗用途的实施方案适用对本发明该方面作出必要的调整。
本发明还提供了一种根据本发明治疗与KRAS的致癌突变形式的表达有关(或由其引起，或以其为特征)的疾病或病症(例如癌症)的方法，该方法包括向需要的患者施用治疗有效量的如本文定义的本发明的抗体。本文所述的本发明的治疗用途的实施方案比照适用于本发明的这一方面。
治疗有效量将根据临床评估来确定，并可随时监测。
进一步替代地看，本发明提供了如本文定义的本发明的抗体在制造用于治疗的药物中的用途。优选的疗法是根据本发明治疗与KRAS的致癌突变形式的表达有关(或由其引起，或以其为特征)的疾病。特别优选的疗法是癌症治疗(典型的是与根据本发明的KRAS的致癌突变形式的表达有关(或由其引起，或以其为特征)的癌症)。本文所述的本发明的治疗用途的实施方案比照适用于本发明的这一方面。
本发明的抗体和组合物以及方法和用途可与其他治疗剂和诊断剂联合使用。就与本发明的抗体“联合”使用的生物制剂，最好是诊断或治疗制剂而言，术语“联合”被简洁地用于涵盖一系列的实施方案。因此，“联合”的术语，除非另有特别说明或从科学术语中明确，适用于各种形式的组合物、药品、(药用)鸡尾酒、试剂盒、方法以及第一和第二医疗用途。
因此，本发明的“联合”实施方案包括，例如，本发明的抗体是一个裸露的抗体，并与不与之有效连接的药剂或治疗剂联合使用。在本发明的其他“联合”实施方案中，本发明的抗体是一种免疫偶联物，其中抗体本身与制剂或治疗剂有效连接或联合。有效连接包括本文所述和本领域已知的所有形式的直接和间接连接。
“联合”用途，特别是就本发明的抗KRAS抗体与治疗剂的联合而言，还包括联合组合物、药品、(药用)鸡尾酒、试剂盒、方法以及第一和第二医疗用途，其中治疗剂是以前体药物的形式存在。在这样的实施方案中，能够将前体药物转化为药物的功能形式的激活成分可以再次与本发明的抗KRAS抗体有效地连接起来。
因此，在描述组合物、药品、(药用)鸡尾酒、试剂盒、方法以及第一和第二医疗用途时，优选诊断剂，更优选治疗剂，组合物包括本发明的抗KRAS抗体，这些抗体是裸露抗体和免疫偶联物，并且其中本发明的体内实施方案的实施涉及裸露抗体或免疫偶联物和生物、诊断或治疗剂的事先、同时或随后施用。只要以某种偶联或不偶联的形式，实现某种形式的抗体和某种形式的生物、诊断或治疗剂的整体提供。
为了简单起见，对本发明的效果作了上述和其他的解释，以说明联合的操作方式、固着剂的类型和类似的情况。这种描述方法不应该被解释为对本发明的抗KRAS抗体的有益特性的轻描淡写或过度简化。因此，可以理解的是，根据本发明，这种抗体本身具有抗KRAS的特性，而且这种抗体的免疫偶联物将保持这些特性，并与固着剂的特性相结合；此外，抗体和任何固着剂的结合效果可能得到加强和/或放大。
因此，本发明提供了组合物、药物组合物、治疗试剂盒和药用鸡尾酒，其中包括，可选地在至少第一组合物或容器中，生物有效量的至少本发明的第一抗体，或这种本发明抗体的抗原结合片段或免疫偶联物；和生物有效量的至少第二生物制剂、成分或系统。
“至少第二种生物制剂、成分或系统”通常是治疗或诊断性制剂、成分或系统，但不是必须的。例如，至少第二种生物制剂、成分或系统可以包括用于修饰抗体和/或将其他制剂附在抗体上的成分。
当治疗剂或诊断剂被包括在至少第二种生物制剂、组件或系统中时，这种治疗剂和/或诊断剂通常是那些用于治疗或诊断一种或多种上述定义的疾病的治疗剂。
因此，在某些实施方案中，“至少第二种治疗剂”将被包括在治疗试剂盒或(药用)鸡尾酒中。该术语是参照本发明的抗KRAS抗体作为第一治疗剂而选择的。
在本发明的某些实施方案中，第二治疗剂可以是进一步的癌症治疗剂或用于治疗与癌症相关(或以癌症为特征)的疾病的药剂。
就本发明的组合物、试剂盒和/或药品而言，组合的有效量的治疗剂可包含在单一容器或容器手段中，或包含在不同的容器或容器手段中。(药用)鸡尾酒一般会被混合在一起，以便联合使用。为静脉注射而配制的药剂通常是首选。也可包括成像成分。试剂盒还可以包括使用至少一个第一抗体和一个或多个其他生物制剂的说明。
一般说来，至少第二种治疗剂可以与本发明的抗KRAS抗体基本上同时施用于动物或病人；如从单一药物组合物中或从两个药物组合物中密切配合施用。
或者，至少第二种治疗剂可以在与施用本发明的抗KRAS抗体相继的时间内施用于动物或病人。这里所说的“相继的时间内”是指“错开”，即至少第二种治疗剂在与本发明的抗KRAS抗体施用不同的时间对动物或病人施用。一般来说，这两种药剂的施用时间是有效间隔的，以使这两种药剂发挥各自的治疗效果，即以“生物有效时间间隔”施用。至少第二种治疗剂可以在本发明的抗KRAS抗体之前的生物有效时间，或在该治疗剂之后的生物有效时间给动物或病人用药。
另一个方面是对受试者或样品进行成像的方法，包括向受试者或样品施用适量的本发明的抗体或其他蛋白，并检测受试者或样品中本发明的抗体或其他蛋白的存在和/或数量和/或位置。
在成像应用中，本发明的抗体可以用可检测的标记，如放射性不透明或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；放射性辐射源(例如α，β或γ辐射源)荧光(荧光基团)或化学发光化合物(发色团)，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子；或化学基团，如生物素，可通过与特定的同源检测基团结合来检测，例如，标记的抗生物素蛋白/链霉亲和素。将标签附着在结合蛋白上的方法，如抗体或抗体片段，在本领域是已知的。这种可检测的标记允许检查测试样品中结合蛋白-抗原复合物的存在、数量或位置。
本发明还包括成像剂，它包括连接到直接或间接产生可检测信号的标签的本发明抗体。适当的标签在本文的其他地方有描述。
本发明进一步包括包含一种或多种分离的多肽(分离的表位)、抗体、免疫偶联物或组合物的试剂盒，或一种或多种编码本发明抗体的核酸分子，或一种或多种包含本发明核酸序列的重组表达载体，或一种或多种包含重组表达载体或本发明核酸序列的宿主细胞或病毒。优选地，所述试剂盒用于本文所述的方法和用途，例如本文所述的治疗、方法，或用于本文所述的体外检测或方法。这种试剂盒中的抗体可以是“裸露”抗体，也可以是本文其他地方所述的抗体结合物，例如可以是免疫偶联物。优选地，所述试剂盒包括试剂盒成分的使用说明。优选地，所述试剂盒用于治疗本文其他地方所述的疾病，并可选地包括用于治疗此类疾病的试剂盒成分的使用说明。
本发明定义的抗体也可作为分子工具用于体外或体内的应用和检测。由于抗体具有抗原结合位点，这些抗体可以作为特定结合对的成员发挥作用，这些分子可以用于需要特定结合对成员的任何试验中。
因此，本发明的另一个方面提供了一种试剂，它包括本文定义的本发明的抗体，以及将这种抗体作为分子工具使用，例如在体外或体内检测中。
在此披露的氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列及其序列标识符(SEQ ID:NO)的序列表 和表格
分离的G12D Ab1和G12D Ab2多肽的氨基酸序列，不包括为产生抗体而存在的额外 修饰(SEQ ID NO:1)
GADGVGKSALTI
分离的G13D Ab1和G13D Ab2多肽的氨基酸序列，不包括为产生抗体而存在的额外 修饰(SEQ ID NO:2)
GAGDVGKSALTI
分离的G12D Ab1多肽的氨基酸序列，包括为产生抗体而存在的额外修饰(SEQ ID NO:3)
Ac-GADGVGKSALTIC-CONH2
与SEQ ID NO:1相比，所述多肽在C端有一个额外的半胱氨酸残基，在C端被酰胺化(-CONH2)，在N端被乙酰化(Ac-)。
分离的G12D Ab2多肽的氨基酸序列，包括为产生抗体而存在的额外修饰(SEQ ID NO:4)
CGADGVGKSALTI-CONH2
与SEQ ID NO:1相比，所述多肽在N端有一个额外的半胱氨酸残基，在C端被酰胺化(-CONH2)。
分离的G13D Ab1多肽的氨基酸序列，包括为产生抗体而存在的额外修饰(SEQ ID NO:5)
CGAGDVGKSALTI-CONH2
与SEQ ID NO:2相比，所述多肽在N端有一个额外的半胱氨酸残基，在C端被酰胺化(-CONH2)。
分离的G13D Ab2多肽的氨基酸序列，包括为产生抗体而存在的额外修饰(SEQ ID NO:6)
Ac-GAGDVGKSALTIC-CONH2
与SEQ ID NO:2相比，所述多肽在C端有一个额外的半胱氨酸残基，在C端被酰胺化(-CONH2)，在N端被乙酰化(Ac-)。
人野生型KRAS(异构体2A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
人G12D突变体KRAS(异构体2A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGC
VKIKKCIIM
人G13D突变体KRAS(异构体2A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
人野生型KRAS(异构体2B)的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
人G12D突变体KRAS(异构体2B)的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)
MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
人G13D突变体KRAS(异构体2B)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)
MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
人G12X突变体KRAS(异构体2A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
MTEYKLVVVGAXGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
其中残基“X”为D，V，C，A，S或R
人G13X突变体KRAS(异构体2A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)
MTEYKLVVVGAGXVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
其中残基“X”为D或C
人G12X突变体KRAS(异构体2B)的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
MTEYKLVVVGAXGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
其中残基“X”为D，V，C，A，S或R
人G13X突变体KRAS(异构体2B)的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)
MTEYKLVVVGAGXVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
其中残基“X”为D或C
分离的G12X多肽的氨基酸序列，(SEQ ID NO:17)
GAXGVGKSALTI
其中残基“X”为D，V，C，A，S或R
分离的G13X多肽的氨基酸序列，(SEQ ID NO:18)
GAGXVGKSALTI
其中残基“X”为D或C
分离的G12X多肽的氨基酸序列，(SEQ ID NO:19)
GAXGVGKSALTI
其中残基“X”为D，V，C，A或R
分离的G12X多肽的氨基酸序列，(SEQ ID NO:20)
GAXGVGKSALTI
其中残基“X”为D，C，A，S或R
分离的G12X多肽的氨基酸序列，(SEQ ID NO:21)
GAXGVGKSALTI
其中残基“X”为D，C，A或R
人G12X突变体KRAS(异构体2A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
MTEYKLVVVGAXGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
其中残基“X”为D，V，C，A或R
人G12X突变体KRAS(异构体2B)的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
MTEYKLVVVGAXGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
其中残基“X”为D，V，C，A或R
人G12X突变体KRAS(异构体2A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
MTEYKLVVVGAXGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
其中残基“X”为D，C，A，S或R
人G12X突变体KRAS(异构体2B)的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
MTEYKLVVVGAXGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
其中残基“X”为D，C，A，S或R
人G12X突变体KRAS(异构体2A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
MTEYKLVVVGAXGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
其中残基“X”为D，C，A或R
人G12X突变体KRAS(异构体2B)的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)
MTEYKLVVVGAXGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQGVDDAFYTLVREIRKHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM
其中残基“X”为D，C，A或R
表A-抗体11D6-1的序列
Figure BDA0003905756260000951
Figure BDA0003905756260000961
表B-抗体4B8-1的序列
Figure BDA0003905756260000971
Figure BDA0003905756260000981
表C-抗体7D11-1的序列
Figure BDA0003905756260000991
Figure BDA0003905756260001001
表D-抗体7G2-1的序列
Figure BDA0003905756260001011
Figure BDA0003905756260001021
表E–抗体6B2-1-1的序列
Figure BDA0003905756260001031
Figure BDA0003905756260001041
表F–抗体6B2-1-2的序列
Figure BDA0003905756260001051
Figure BDA0003905756260001061
表G–共有氨基酸序列
Figure BDA0003905756260001071
本发明的4B8-1、11D6-1和7D11-1抗体的所述VH(即重链可变区)CDR1和CDR2氨基酸序列及所述VL(轻链可变区)CDR1和CDR2序列都在如上表G所示的共有序列中。
表L–共有氨基酸序列s
Figure BDA0003905756260001081
本发明的7G2-1、6B2-1-1和6B2-1-2抗体的所述VH(即重链可变区)CDR1和CDR2氨基酸序列都在如上表L所示的共有序列中。
附图说明
将在以下非限制性实例中参照以下附图进一步描述本发明：
图1：四种抗KRAS抗体，G13D Ab1、G13D Ab2、G12D Ab1和G12D Ab2诱导的MDA-MB-231(G13D)细胞中ERK的磷酸化的抑制。将抗体加入到细胞培养基中(培养14-16小时)，用Perkin Elmer p-ERK 1/2AlphaScreen Surefire检测试剂盒对ERK的细胞内磷酸化进行定量。SAH-SOS1(稳定的son of sevenless 1的α螺旋)被用作阳性对照，兔IgG作为阴性对照(同型对照)。统计学意义表示如下：*P<0.05，**P<0.01。数据以平均值±SEM表示。除G12DAb2 27nM和67nM n＝2外，每个处理组n＝3。
图2：通过四种抗KRAS抗体，G13D Ab1、G13D Ab2、G12D Ab1和G12D Ab2测定G12D突变的SK-LU-1(肺腺癌)细胞的凋亡。用抗体或对照处理细胞，用RealTime-GloTM Annexin VApoptosis and Necrosis Assay kit(Promega)实时定量细胞凋亡。同型对照是兔IgG。该图表示在向细胞添加抗体/对照后52小时的细胞凋亡状态。发光与细胞凋亡水平成正比。数据是在一天内收集的，每个处理n＝4。统计学意义表示如下：*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。数据以平均值±SEM表示。
图3：测定由G12D Ab1诱导的G12D突变LS174T(结肠腺癌)细胞在24、48和72小时内的凋亡情况。用抗体或对照组处理细胞，用荧光标记的Annexin V作为细胞凋亡的标志，通过FACS对细胞凋亡进行定量。数据显示为对照组的％，其中对照组包括用溶媒(培养基)处理的细胞。
图4：由四种抗KRAS抗体，G13D Ab1、G13D Ab2、G12D Ab1和G12D Ab2诱导，测定G13D突变的HCT116(结肠癌)细胞的凋亡。用抗体或对照处理细胞，用RealTime-GloTMAnnexin V Apoptosis and Necrosis Assay kit(Promega)实时定量细胞凋亡。同型对照是兔IgG。该图表示在向细胞添加抗体/对照后52小时的细胞凋亡状态。发光与细胞凋亡的水平成正比。统计学意义表示如下：**p<0.01.数据以平均值±SEM表示，n＝3。
图5：测定抗体G13D Ab1和G12D Ab2在(A)G13D突变的HCT116(结肠癌)细胞；(B)G12D突变的SK-LU-1(肺腺癌)细胞；和(C)非癌症的wtKRAS CRL-1831(结肠上皮)细胞中诱导的凋亡。用抗体或对照组处理细胞，用RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis andNecrosis Assay kit(Promega)实时定量细胞凋亡。溶媒为PBS/Tween。该图表示在向细胞添加抗体/对照组后52小时的细胞凋亡状态。对于HCT116的数据，数据是在3天内收集的，每天n＝4。对于SK-LU-1的数据，是在2天内收集的，每天n＝4。对于CRL-1831，数据是在1天内收集的，n＝4。统计学意义表示如下：**p<0.01,****p<0.0001。数据以平均值±SEM表示。
图6：测定抗体G13D Ab1和G12D Ab2在(A)G13D突变的HCT116(结肠癌)细胞；(B)G12D突变的SK-LU-1(肺腺癌)细胞；和(C)非癌症的wtKRAS CRL-1831(结肠上皮)细胞中诱发的坏死。用抗体或对照处理细胞，用RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis andNecrosis Assay kit(Promega)对细胞凋亡进行实时定量。溶媒为PBS/Tween。该图表示在向细胞添加抗体/对照组后52小时的坏死状态。对于HCT116的数据，数据是在3天内收集的，每天n＝4。SK-LU-1的数据是在2天内收集的，每天n＝4。对于CRL-1831，数据是在1天内收集的，n＝4。统计学意义表示如下：*p<0.05,****p<0.0001。数据以平均值±SEM表示。
图7：使用荧光标记的抗体，通过FACS对癌细胞对抗体的吸收进行定量。用标记的抗体处理G12D突变的LS174T(结肠腺癌)细胞和G13D突变的HCT116(结肠癌)细胞24小时，对细胞相关的荧光进行定量。FITC-A＝荧光信号，在488nm处测量发射波长。曲线下的面积与细胞相关的荧光量成正比。来自非抗体处理的LS174T细胞的荧光信号作为对照。n＝1。
图8：通过四种抗KRAS抗体，G13D Ab1、G13D Ab2、G12D Ab1和G12D Ab2测定wtKRASNCI-H1975(肺腺癌)细胞的凋亡情况。细胞用抗体或溶媒处理。使用RealTime-GloTMAnnexin V Apoptosis and Necrosis Assay kit(Promega)对细胞凋亡(A)和细胞坏死(B)进行实时定量。(A)代表向细胞添加抗体/溶媒后10小时的细胞凋亡状态。(B)代表向细胞添加抗体/溶媒后52小时的细胞坏死状态。数据是在一天内收集的，每个处理方法n＝4。数据以平均值±SEM表示。
图9：流式细胞仪显示了抗体G13D Ab1和G12D Ab1在突变型和野生型KRAS细胞中的吸收。(A)流式细胞仪数据显示在G13D突变的KRAS细胞系HCT-116、G12D突变的KRAS细胞系SK-LU-1和两个野生型KRAS细胞系A431和NCI-H1975中，用220nM ALEXA 488结合的G13DAb1抗体处理后在不同时间点的抗体内化(n＝4)。(B)流式细胞仪数据显示在G13D突变的KRAS细胞系HCT-116、G12D突变的KRAS细胞系SK-LU-1和两个野生型KRAS细胞系A431和NCI-H1975中，用220nM ALEXA 488结合的G12D Ab1抗体处理后在不同时间点的抗体内化(n＝4)。统计学意义采用单因素方差分析，结合Dunnett多重比较检验来确定。统计学意义表示如下：**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。数据以平均值±SEM表示。
图10：评估突变选择性的G13D Ab1和G12D Ab1抗体在24小时内对KRAS突变、wtKRAS和非癌细胞系的诱导凋亡能力。检测的不同细胞系包括：G13D突变的HCT116(结肠癌)细胞，G12D突变的SK-LU-1(肺腺癌)细胞，G12V突变的SW 620(结直肠腺癌)细胞，G12C突变的MIA-PA-CA-2(胰腺癌)细胞。癌变的wtKRAS A431(表皮癌)细胞，癌变的wtKRAS NCI-H1975(非小细胞肺癌)细胞和非癌变的wtKRAS CRL-1831(结肠上皮)细胞。用220nM抗体或溶媒处理细胞，用RealTime-GloTM Annexin V凋亡和坏死检测试剂盒(Promega)实时定量细胞凋亡。图中表示在向细胞培养物中加入抗体或溶媒24小时后，归一化为溶媒的细胞凋亡水平。对于HCT116细胞，n＝10(G13D Ab1)和n＝12(溶媒和G12D Ab1)。对于SK-LU-1细胞n＝8。对于SW 620细胞n＝8。对于MIA-PA-CA-2细胞n＝4。对于A431细胞n＝8。对于NCI-H1975细胞n＝4。对于CRL-1831细胞，n＝6(溶媒)和n＝8(G13D Ab1和G12D Ab1)。除了SK-LU-1细胞使用Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较检验确定统计学意义外，其他的都是使用单因素方差分析结合Dunnett多重比较检验确定统计学意义。**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。数据以平均值±SEM表示。
图11：评估突变选择性的G13D Ab1和G12D Ab1抗体在48小时内对KRAS突变、wtKRAS和非癌细胞系的诱导凋亡能力。检测的不同细胞系包括：G13D突变的HCT116(结肠癌)细胞，G12D突变的SK-LU-1(肺腺癌)细胞，G12V突变的SW 620(结直肠腺癌)细胞，G12C突变的MIA-PA-CA-2(胰腺癌)细胞，癌变的wtKRAS A431(表皮癌)细胞，以及非癌变的wtKRASCRL-1831(结肠上皮)细胞。用220nM的抗体或溶媒处理细胞，用RealTime-GloTM Annexin VApoptosis and Necrosis Assay试剂盒(Promega)实时定量细胞凋亡。由于凋亡开始得很快，所以无法用上述试剂盒在48小时内对癌变的wtKRAS NCI-H1975细胞进行评估。图中表示在向细胞培养物中加入抗体或溶媒48小时后，归一化为溶媒的细胞凋亡水平。对于HCT116细胞，n＝10(G13D Ab1)和n＝12(溶媒和G12D Ab1)。对于SK-LU-1细胞n＝8。对于SW620细胞n＝8。对于MIA-PA-CA-2细胞n＝4。对于A431细胞n＝8。对于CRL-1831细胞，n＝6(溶媒)和n＝8(G13D Ab1和G12D Ab1)。除了CRL-183和MIA-PA-CA-2细胞使用Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较检验确定统计学意义外，其他的都是使用单因素方差分析结合Dunnett多重比较检验确定统计学意义。**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。数据以平均值±SEM表示。
图12：使用ELISA测试杂交瘤单细胞克隆上清液中的单克隆抗体与具有SEQ IDNO:5(包括G13D KRAS突变)氨基酸序列的多肽的结合。克隆11D6-1、4B81-1、6B2-1、7D11-1和7G2-1在多肽的不同稀释度下被测试。在405nm处测量吸光度。更高的吸光度表示更强的结合。
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具体实施方式
实施例1
抗体研发
对于用于产生抗体的每个表位(线性多肽)，合成并纯化了包括一个额外半胱氨酸残基的合成多肽。这些合成多肽的序列如SEQ ID NO:3，4，5和6所示。
所述多肽(表位)通过末端的半胱氨酸残基与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)连接。注射KLH连接的多肽(表位)后，通过对无特定病原体(SPF)的兔子进行免疫产生多克隆抗体。
所述多肽是通过带有封端步骤的固相肽合成(SPPS)生产的。通过将半胱氨酸上的SH基团与KLH上的NH2基团偶联，将线性多肽与KLH偶联。使用蛋白G柱纯化抗体，然后对多肽进行亲和纯化。
这些抗体被亲和纯化并进行ELISA测试。ELISA测试显示，抗体能够与各自的肽(即用于免疫兔子产生相关抗体的各自的肽)结合。ELISA测试还表明，这些抗体能够与相应的全长致癌性KRAS蛋白(异构体2B版本)结合。
合成多肽和多克隆抗体的产生都是由Innovagen AB(Lund，瑞典)完成的。
用序列为SEQ ID NO:3的多肽免疫产生的多克隆抗体被命名为G12D Ab1。
用序列为SEQ ID NO:4的多肽免疫产生的多克隆抗体被命名为G12D Ab2。
用序列为SEQ ID NO:5的多肽免疫产生的多克隆抗体被命名为G13D Ab1。
用序列为SEQ ID NO:6的多肽免疫产生的多克隆抗体被命名为G13D Ab2。
抑制KRAS的功能活性
抑制KRAS GTP酶的活性
材料和方法
通过细菌表达产生重组的野生型、G12D和G13D形式的KRAS，并进行纯化。纯化标签被去除。KRAS储存在50mM Tris，100mM NaCl，10mM MgCl2，1mM EDTA，0.01％ Triton-X-100，1mM DTT，pH7.5中。批次纯度通过凝胶过滤和SDS-PAGE评估。
KRAS的活性用酶标仪(Clariostar,BMG Labtech,激发波长/发射波长＝430/450)评估。在缓冲液H(50mM Tris，100mM NaCl，10mM MgCl2，1mM EDTA，0.01％ Triton X-100和1mM DTT)中制备1g/L KRAS、1μM磷酸盐传感器(Thermo Fisher Scientific#PV4407)、6μMGTP和抗体，并加入384孔板，在4h内测量荧光。4小时后比较各处理的荧光值。
测试了G13D Ab2、G12D Ab1和G12D Ab2抗体抑制野生型KRAS、G12D突变型KRAS和G13D突变型KRAS的GTP向GDP转化(GTP酶活性)的能力。与野生型KRAS相比，这些抗体优先抑制了KRAS的致癌形式(G12D或G13D)。没有观察到对野生型KRAS GTP酶活性的显著抑制。
抑制ERK的磷酸化
材料和方法
将MDA-MB-231细胞(来自American Type Culture Collection)以10000个细胞/孔的密度装入384孔板，在37℃的5％ CO2培养箱中培养过夜。第二天，在含有血清的培养基中用化合物(抗体)或对照(兔IgG)处理细胞，并在37℃的5％ CO2培养箱中培养14-16小时。化合物(抗体)的最终工作浓度为25μg/ml(167nM)，10μg/ml(67nM)和4μg/ml(27nM)。兔IgG(-ve对照)的最终浓度为25μg/ml(167nM)。第二天，用含有化合物或对照的无血清培养基替换每个孔中的培养基。在这4小时的血清饥饿期，将K-Ras抑制剂SAH-SOS1(稳定的son ofsevenless1的α螺旋，+ve对照，5μM)加入到各自的孔内。血清饥饿后，用10.9ng/ml EGF(表皮生长因子)处理细胞10分钟。在EGF处理后，用试剂盒(
Figure BDA0003905756260001131
p-ERK 1/2(Thr202/Tyr204)检测试剂盒，Perkin Elmer cat no.TGRESB500)中提供的裂解缓冲液裂解细胞10分钟，这是一种夹心免疫测定，用于定量检测细胞裂解液中的磷酸化-ERK1/2(Thr202/Tyr204上的磷酸化)。ERK是细胞外信号调节的激酶。裂解液被分离并用于测量总的和磷酸化的ERK。磷酸化的ERK是按照
Figure BDA0003905756260001132
试剂盒说明书(PerkinElmer，cat no.TGRESB500)估计的。ERK总量是按照试剂盒说明书(
Figure BDA0003905756260001133
ERK 1/2Total Assay Kit,Perkin Elmer cat no.TGRTESB500)，这是一种夹心免疫测定，用于定量检测细胞裂解液中的ERK(包括磷酸化和非磷酸化的)。在Envision读板仪(PerkinElmer)上使用标准的AlphaScreen设置进行读取。AlphaScreen是一种基于珠子的、非放射性的放大发光邻近均相测定。统计学显著性表示如下：*P<0.05，**P<0.01。数据以平均值±SEM表示。
结果和讨论
要使抗体抑制KRAS，它们必须进入细胞并呈现在KRAS所在的细胞膜上。MAPK途径中ERK的磷酸化水平在许多癌细胞中取决于KRAS的活性，其中ERK是KRAS的下游(MAPK/ERK途径)。在测试抗KRAS化合物时，ERK磷酸化常被用作衡量KRAS活性的标准，ERK磷酸化的抑制是KRAS抑制的结果。我们测量了四种抗KRAS抗体G13D Ab1、G13D Ab2、G12D Ab1和G12DAb2对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的ERK磷酸化的抑制作用(以磷酸化-ERK的抑制率％计)。我们使用SAH-SOS1作为阳性对照，一种已知的与KRAS结合的多肽KRAS抑制剂，我们使用兔子IgG作为阴性对照，其不与KRAS结合。不希望被理论所束缚，抗体被添加到细胞外的培养基中，可以通过巨胞饮过程进入细胞中。MDA-MB-231细胞带有G13D KRAS突变。我们证实，在细胞外浓度低至27nM时，抗体已经抑制了ERK的磷酸化(图1)。
细胞凋亡
材料和方法
对于评估HCT116细胞、SK-LU1细胞和CRL-1831细胞的凋亡的实验(即产生图2、4和5中描述的数据的实验)，其材料和方法如下：
RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay kit(Promega,catno.JA1011)被用来实时测量细胞凋亡和坏死。这是一种活细胞实时(动力学)检测，通过细胞膜外叶的磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露来确定细胞凋亡，并通过细胞渗透性的荧光前体DNA染料来确定坏死，这种染料在坏死过程中随着细胞膜的瓦解能够进入细胞。
细胞的制备方法如下：HCT-116、SK-LU-1和CRL-1831细胞(来自American TypeCulture Collection)在T型烧瓶中培养。HCT-116细胞在补充有10％胎牛血清的McCoy's5a改良培养基中生长。SK-LU-1细胞在补充有10％胎牛血清的Eagle's最小必需培养基中生长。CRL-1831细胞在DMEM:F12培养基中生长，辅以10％胎牛血清、10ng/ml霍乱毒素、0.005mg/ml胰岛素、0.005mg/ml转铁蛋白、100ng/ml氢化可的松和20ng/ml人重组的EGF。使用预热的胰蛋白酶溶液(37℃)收获细胞并培养15分钟。将细胞转移到L-15检测培养基中，该培养基由Leibovitz's L-15培养基(ThermoFisher cat.no.21083027)、10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素组成。对细胞进行计数，并用L-15检测培养基稀释到200.000细胞/ml。在96孔板中每孔加入50μL细胞溶液(每孔10.000个细胞，Costar，白色，透明底部，catno.3903)。为了测量背景，在同一板上的孔中加入50μL L-15检测培养基。板子用胶膜密封，在37℃下孵育过夜。
抗体的制备方法如下：首先将抗体混合到总共300μL的含0.02％吐温的磷酸盐缓冲盐水(PBS/Tween)中。所有抗体的最终浓度为0.87μM。工作溶液的制备是将抗体溶液与L-15检测培养基和试剂盒检测试剂混合(210μL检测培养基+210μL抗体溶液+420μL检测试剂)。检测试剂按照试剂盒的说明准备。一种对照是用210μL PBS/Tween代替210μL抗体溶液(溶媒对照)。另一种对照是用210μL L-15检测培养基代替210μL抗体溶液(培养基对照)。
测定按以下方法进行。将每个板孔中的200μL培养基用200μL的工作溶液代替。用光学薄膜密封平板，并将其置于
Figure BDA0003905756260001151
(BMG LABTECH)读板仪中。根据试剂盒的说明，通过读取发光信号进行细胞凋亡的测量，通过读取荧光信号进行细胞坏死的测量。数据分析和解读按照试剂盒的说明进行。
数据以平均值±SEM表示。统计学意义采用单因素方差分析结合Dunnett多重比较检验来确定，其中每个Ab(抗体)与同型对照(兔IgG)或溶媒对照进行比较。统计学意义表示如下：*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。数据以平均值±SEM表示。
对于评估LS174T细胞凋亡的实验(即产生图3中描述的数据的实验)，其材料和方法如下：
LS174T细胞在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Eagle's最小必需培养基中培养至70％细胞覆盖。用对照组(无抗体的培养基)或3ng/ml抗体的培养基处理细胞24、48或72小时。然后清洗细胞，用荧光标记的Annexin V Pacific Blue(ThermoFisher,cat no.A35122)染色，其与暴露在正在发生凋亡的细胞的外叶上的磷脂酰丝氨酸(PS)结合。FACS用于定量细胞相关的荧光，凋亡水平(占对照组的％)被计算为抗体处理过的细胞和对照组细胞之间的荧光比率。
结果和讨论
在一些实验中，使用Promega公司的实时凋亡/坏死试剂盒对凋亡进行定量，该试剂盒测量细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸(PS)的量。PS的量在凋亡过程中增加。我们已经确定本文的抗KRAS抗体G13D Ab1、G13D Ab2、G12D Ab1和G12D Ab2能诱导G12D突变的SK-LU-1(肺腺癌)细胞和/或G13D突变的HCT116(结肠癌)细胞的凋亡(图2、4和5)。通过向细胞培养基中添加抗体来处理细胞。图3的数据显示，抗体G12D Ab1也能够诱导LS174T(G12D)细胞的凋亡。
与同型抗体对照相比，或与溶媒PBS/Tween相比，G13D Ab1和G12D Ab1在SK-LU-1细胞(图2)和HCT116细胞(图4)中均引起高水平的细胞凋亡(图5A，B)。该数据表明，这两种抗体对两种突变(即KRAS的G12D和G13D突变形式)都有活性。在不希望被理论束缚的情况下，我们认为这些抗体可能与带负电荷的天冬氨酸(D)残基结合，但由于距离上的微小差异，抗体可以在12或13位上容纳D残基。在具有野生型KRAS的CRL-1831结肠上皮细胞中观察到一些细胞凋亡，虽然与携带突变型KRAS的细胞相比，所测试的两种抗体对其引起的细胞凋亡都要少得多(图5C)。
本研究的KRAS抗体诱导的细胞凋亡表明，用于免疫和抗体生产的合成抗原(基本对应于本文其他地方所述的KRAS致癌突变形式的第10-21位氨基酸残基)可用于研制抑制性KRAS抗体。此外，数据显示，可以产生既能抑制G12D又能抑制G13D突变形式的KRAS的抗体。
细胞坏死
材料和方法
使用RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay kit检测试剂盒记录细胞坏死，与细胞凋亡的检测同时进行，如其他地方所述。
结果和讨论
此处已表明，除了细胞凋亡外，抗KRAS抗体G13D Ab1和G12D Ab1在SK-LU-1细胞(图6A)和HCT116细胞(图6B)中引起明显的坏死，但不引起野生型KRAS细胞CRL-1831的坏死(图6C)。
进一步的细胞凋亡和坏死实验
测试了抗体G12D Ab1、G12D Ab2、G13D Ab1和G13D Ab2对肺腺癌细胞系NCI-H1975的凋亡和坏死的影响。NCI-H1975细胞系表达的是野生型KRAS。该实验的材料和方法基本与上述的细胞凋亡和坏死检测相同(使用RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis andNecrosis Assay kit(Promega))。
在该实验中，用G12D Ab1、G12D Ab2、G13D Ab1和G13D Ab2各抗体处理的NCI-H1975细胞的凋亡和坏死水平类似于或低于仅含溶媒对照观察到的凋亡和坏死水平(图8)。
抗体内化
材料和方法
细胞(LS174T细胞或HCT116细胞)在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Eagle's最小必需培养基中培养至70％细胞覆盖。用16ng/ml的兔抗山羊IgG(H+L)二抗，Alexa Fluor 488(ThermoFisher，cat no.A-11078)溶解在同一培养基中处理细胞24小时。洗涤细胞，并用FACS对细胞相关的荧光进行定量。
结果和讨论
为了评估癌细胞是否能内化胞外培养基中的抗体，我们使用了荧光标记的抗体，并通过FACS定量了摄取量。G12D突变的LS174T(结肠腺癌)细胞和G13D突变的HCT116(结肠癌)细胞用标记的抗体处理一段时间，并对细胞的荧光进行定量。根据处理过的细胞中累积的荧光信号的曲线下面积，与未处理过的细胞的信号相比，我们得出结论，在这些癌症细胞类型中存在一种摄取抗体的机制。
实施例2
本实施例表明，本发明的抗体被癌细胞内化，包括表达KRAS致癌突变形式的癌细胞。本实施例还包含进一步的数据，显示本发明的抗体在表达致癌突变形式的KRAS的细胞中引起细胞凋亡。
材料和方法
流式细胞仪测量G13D Ab1抗体和G12D Ab1抗体摄取
使用Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒(Cat#A10235，ThermoFisher Scientific)中的Alexa Fluor 488标记抗体G13D Ab1和抗体G12D Ab1(实施例1)。将HCT 116、SK-LU-1、A431和NCI-H1975细胞培养在12孔微孔板(Invitrogen)中。在测量前，用220nM标记的G13DAb1抗体或G12D Ab1抗体处理细胞4或24小时。未染色的细胞作为t(0)时间点进行测量。在测量之前，细胞被清洗和收获。在BDTMLSR II流式细胞仪(BD Biosciences inc.)上进行测量。在FlowJo v.10(BD Biosciences)中进行分析。每个细胞系和时间点n＝4。n等于包含平均4000个HCT116细胞、平均8000个SK-LU-1细胞、平均7000个A431细胞和平均4000个NCI-H1975细胞的一次测量。
aKRAS抗体(G13D Ab1抗体和G12D Ab1抗体)的抗体诱导的细胞凋亡
RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay kit(Promega,catno.JA1011)被用来实时检测细胞凋亡。培养的细胞用胰蛋白酶收获，并转移到L-15检测培养基中，该培养基由Leibovitz'sL-15培养基(ThermoFisher cat.no.21083027)、10％胎牛血清和1％青霉素/链霉菌素组成。对细胞进行计数，并用L-15检测培养基稀释到20万个细胞/mL。将细胞加入96孔板(每孔10,000个细胞，Costar，白色，透明底部，cat no.3903)并孵育过夜。
将抗体在L-15检测培养基和检测试剂中稀释后加入到孔中，最终浓度为220nM。用光学薄膜密封平板，并将其置于
Figure BDA0003905756260001181
(BMG LABTECH)酶标仪中。通过读取发光信号进行细胞凋亡的测定。
对以下细胞系进行了2-3次生物学重复：HCT 116、SK LU 1、SW 620、CRL-1831和A431。NCI-H1975和MIA-PA-CA-2细胞系被测试一次。
结果和讨论
G13D Ab1和G12D Ab1抗体的体外抗癌功效是通过评估它们在四种不同的KRAS突变细胞系中导致细胞凋亡的能力来确定的，即G12D突变的SK-LU-1肺腺癌细胞，G13D突变的HCT116结肠癌细胞，G12V突变的SW 620结肠癌细胞，G12C突变的MIA-PA-CA胰腺癌细胞，以及野生型KRAS细胞系，即A431表皮癌细胞和NCI-H1975非小细胞肺癌细胞。一个非癌细胞系CRL-1831结肠上皮细胞也被包括在凋亡实验中作为对照细胞系。虽然KRAS是一个细胞内靶点，但我们利用了许多癌症细胞系，包括KRAS突变的细胞，都有上调的巨胞饮作用。这种摄取系统有充分的证据表明它有能力内化大分子，包括蛋白质。我们使用流式细胞仪和共聚焦显微镜实验来评估Alexa Fluor 488标记的G13D Ab1和G12D Ab1抗体在带有G12D突变的细胞系(SK-LU-1)和带有G13D突变的细胞系(HCT116)以及两个野生型KRAS细胞系A431和NCI-H1975的内化。共聚焦显微镜图像显示G13D Ab1和G12D Ab1抗体在所有被检测的不同细胞系中被摄取(数据未显示)。流式细胞仪实验进一步证实了这些观察结果，如图9所示，在所有测试的KRAS突变型和所有测试的野生型KRAS细胞系中都观察到有统计学意义的抗体摄取。在细胞凋亡实验中，G13D Ab1和G12D Ab1抗体在处理24小时后只对G12D-和G13D-突变的细胞系有活性(图10)。这些抗体在其他测试的细胞系中没有引起细胞凋亡，这些细胞系包括G12C和G12V KRAS突变的细胞、野生型KRAS癌细胞和非癌性结肠上皮细胞(图10)。经过48小时的处理(图11)，我们观察到与24小时的处理相比，G13D Ab1和G12D Ab1抗体在G12D-和G13D-突变的细胞系中引起的细胞凋亡水平增加。我们还观察到48小时后，G12V突变的细胞的凋亡程度有小幅度但有统计学意义的增加(图11)。其他细胞系在接触抗体48小时后都没有显示出细胞凋亡的增加(图11)。综上所述，数据显示，与野生型KRAS细胞相比，G12D和G13D突变细胞的细胞凋亡诱导作用，不是因为有利于KRAS突变细胞的有数量级差异的抗体摄取，而是G13D Ab1和G12D Ab1抗体对G12D和G13D突变KRAS细胞的选择性抑制的结果。
抗体对G12D和G13D突变体的选择性作用，而不是对G12C突变体的选择性作用，以及对G12V突变体更小程度的的选择性作用，这可能是由于在表位区G12和G13位置的带负电荷的天冬氨酸残基(D)在抗体的结合中起重要作用。然而，由于距离上的微小差异，第12或13位的等位基因位置对结合的相互作用似乎并不重要。
这项研究证明了两种抗KRAS抗体能够抑制G12D和G13D突变的KRAS，对其他KRAS突变(G12V和G12C)以及野生型KRAS具有选择性。
实施例3
材料和方法
利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(小鼠IgG)
用与钥孔戚血蓝蛋白连接的序列为SEQ ID NO:5的线性肽对小鼠进行免疫(KLH连接的肽如上述实施例1所述)。SEQ ID NO:5的残基编号(位点)5的“D”残基对应于致癌突变体G13D KRAS蛋白(例如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的致癌突变体G13D KRAS蛋白)。免疫反应用ELISA进行评估。免疫过程结束后，根据血清的ELISA筛选选择小鼠，提取小鼠的脾脏细胞并与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞。通过ELISA筛选杂交瘤以获得阳性克隆(即产生与目标结合的抗体)。筛选之后，对选定的杂交瘤进行亚克隆，并使用ELISA进行进一步的筛选。然后用亚克隆的杂交瘤来生产单克隆抗体。用ELISA测试上清液中的抗体的结合特性。确定了五个单克隆抗体(杂交瘤)，11D6-1、4B8-1、6B2-1、7D11-1和7G2-1。用于产生11D6-1、4B8-1、6B2-1、7D11-1和7G2-1抗体的多肽(免疫原)是序列为SEQ ID NO:5的多肽，如上所述，其与钥孔戚血蓝蛋白相连。每个抗体名称中的后缀“-1”只是表明这些抗体中的每一个都是各自亲代杂交瘤的子代克隆(亲代杂交瘤有相同的名称，但没有“-1”后缀，例如11D6是11D6-1抗体的亲代杂交瘤(子代克隆))。
小鼠杂交瘤IgG的克隆和测序
从小鼠杂交瘤(11D6-1、4B8-1、6B2-1、7D11-1和7G2-1)中制备RNA，并从中合成cDNA。cDNA的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)被扩增并分别克隆到标准克隆载体中。鉴定阳性克隆的方法是通过菌落PCR，然后进行凝胶电泳。从阳性克隆中获得VL和VH的DNA和氨基酸序列。
6B2-1的测序确定了一个VH区(域)序列，但有两个不同的VL区(域)序列(即确定了两个不同的VL区序列)。这将在下面的结果部分进一步讨论。
对编码其他四种抗体(即11D6-1、4B8-1、7D11-1和7G2-1)的VH和VL结构域的cDNA进行测序，发现每个抗体(即每个杂交瘤)有一个VH区(域)序列和一个VL区(域)序列。
结果和讨论
通过ELISA测试来自杂交瘤克隆11D6-1、4B8-1、6B2-1、7D11-1和7G2-1的杂交瘤上清液制剂中的单克隆抗体与具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽(这是用于产生11D6-1、4B8-1、6B2-1、7D11-1和7G2-1抗体的多肽(免疫原))的不同稀释度结合。与多肽结合的抗体的定量是通过在405nm处的吸光度测量的。吸光率与结合强度成正比。所有上清液都含有与SEQ ID NO:5的多肽结合的抗体(图12)。使用来自克隆11D6-1、4B8-1和7D11-1的抗体并使用“野生型”(WT)多肽(具有氨基酸序列CGAGGVGKSALTI(SEQ ID NO:160))，所述多肽在第5位有一个G残基而不是“突变”的D残基(与SEQ ID NO:5相比)的进一步ELISA显示，与WT多肽相比，来自克隆11D6-1、4B8-1和7D11-1的抗体显然更强烈地与突变的G13D肽(SEQ ID NO:5)结合(数据未显示)。如果一个抗体对含有突变的多肽的结合比对WT多肽的结合更强，这表明该抗体对KRAS的突变形式有选择性，它对突变的序列有偏好。在不希望被理论束缚的情况下，这种选择性的抗体更倾向于与KRAS蛋白的致病突变形式结合。当一个细胞或组织不仅表达突变形式，而且还表达KRAS蛋白的野生型形式时，这种偏好可能很重要。
如上所述，对6B2-1杂交瘤的VH和VL区(域)的测序发现了一个VH区(域)序列，但有两个不同(即不同)的VL区(域)序列。这可能意味着杂交瘤克隆6B2-1有一个重链基因和两个轻链基因产生抗体。这种现象(即一个杂交瘤编码两个不同的VL区序列)是已知的，并在文献中讨论过(例如Bradbury,A.R.M.et al.MAbs 10,539-546(2018))。有一个VH区(域)序列，但有两个不同的VL区(域)序列的情况可能会导致三个不同种类的单克隆抗体((i)有两个相同的重链和两个相同的轻链序列X的种类；(ii)有两个相同的重链和两个相同的轻链序列Y的种类；(iii)有两个相同的重链，一个轻链序列X和一个轻链序列Y的种类)。这个杂交瘤(6B2-1)的上清液(或纯化的抗体)可能含有一个或多个这些类型的种类的混合物。在正常情况下只有一个重链基因和一个轻链基因在产生抗体。在杂交瘤的产生和培养过程中可能会出现含有一个以上轻链的杂交瘤。可以有很多原因。例如，一个骨髓瘤细胞可能融合了两个B细胞，而不是只有一个。本例中测试的6B2-1上清液可能含有三种潜在抗体中的一种或多种。
在本文的其他地方，分别列出了来自6B2-1杂交瘤的两个潜在单克隆抗体(两个潜在单克隆抗体种类)的序列。这些是(a)具有已确定的VH结构域序列和仅有第一个已确定的VL结构域序列的抗体，和(b)具有已确定的VH结构域序列和仅有第二个(或其他)已确定的VL结构域序列的抗体。这些不同的单克隆抗体(不同的单克隆抗体种类)已被命名为6B2-1-1和6B2-1-2。
抗体11D6-1、4B8-1、7D11-1、7G2-1、6B2-1-1和6B2-1-2的序列，在本文表A-F中列出。

Claims (55)

1.一种与KRAS的致癌突变形式结合的抗体，所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的G13或G12位置的氨基酸替换，其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的第10-21位氨基酸残基定义，并且其中所述抗体抑制所述KRAS的致癌突变形式的活性。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述KRAS的致癌突变形式具有SEQ ID NO:14、16、13或15的氨基酸序列，并且其中所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:14、16、13或15的第10-21位氨基酸残基定义。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中在对应于野生型KRAS的G13或G12位置的所述氨基酸替换是G13D或G12D替换。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述KRAS的致癌突变形式包括在对应于野生型KRAS(SEQ ID NO:7)的G13位置的氨基酸替换，所述氨基酸替换为G13D替换。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述KRAS的致癌突变形式具有SEQ IDNO:9、12、8或11的氨基酸序列，并且所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:9、12、8或11的第10-21位氨基酸残基定义。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述KRAS的致癌突变形式具有SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的第10-21位氨基酸残基定义。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述KRAS的致癌突变形式具有SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且所述抗体与位于所述KRAS的致癌突变形式的区域的表位结合，所述区域由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的第10-21位氨基酸残基定义。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体与至少一种具有SEQ ID NO:8或11的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式以及与至少一种具有SEQ ID NO:9或12的氨基酸序列的KRAS的致癌突变形式结合并加以抑制。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽包括
(i)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:17的氨基酸序列；或
(ii)与(i)的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，其中所述基本同源的序列与所述氨基酸序列相比有1或2个氨基酸的替换或添加或缺失，并且在与SEQ ID NO:17基本同源的序列中对应于SEQ ID NO:17的第3位的X残基没有改变，并且在与SEQ ID NO:18基本同源的序列中对应于SEQ ID NO:18第4位的X残基没有改变。
10.如权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
11.如权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽包括
(i)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的氨基酸序列；或
(ii)与(i)的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，其中所述基本同源的序列与所述氨基酸序列相比有1或2个氨基酸的替换或添加或缺失，并且在与SEQ ID NO:1基本同源的序列中对应于SEQ ID NO:1的第3位的D残基没有改变，并且在与SEQ ID NO:2基本同源的序列中对应于SEQ ID NO:2第4位的D残基没有改变。
12.如权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽包括
(i)SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
(ii)与(i)的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，其中所述基本同源的序列与所述氨基酸序列相比有1或2个氨基酸的替换或添加或缺失，并且在与SEQ ID NO:3基本同源的序列中对应于SEQ ID NO:3的第3位的D残基没有改变，并且在与SEQ ID NO:4基本同源的序列中对应于SEQ ID NO:4第4位的D残基没有改变，且在与SEQ ID NO:5基本同源的序列中对应于SEQ ID NO:5第5位的D残基没有改变，且在与SEQ ID NO:6基本同源的序列中对应于SEQID NO:6第4位的D残基没有改变。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
15.如权利要求1至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽的氨基酸序列选自由：SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组。
16.如权利要求1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽的氨基酸序列选自由：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3组成的组。
17.如权利要求1至16中任一项所述的抗体，其中所述抗体与分离的多肽结合，所述分离的多肽由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成。
18.如权利要求1至17中任一项所述的抗体，其中所述抗体与偶联物结合，所述偶联物包括权利要求9至17中任一项定义的分离的多肽和多肽载体，所述多肽载体优选为钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。
19.如权利要求1至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区域和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区域，其中所述重链可变区域包括具有SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1，优选SEQ ID NO:149，和/或具有SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VH CDR2，优选SEQ ID NO:151，和/或所述轻链可变区域包括具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的VL CDR1，优选SEQ ID NO:153，和/或具有SEQ IDNO:154的氨基酸序列的VL CDR2，优选SEQ ID NO:155。
20.如权利要求1至19中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其基本同源的序列的轻链可变区(VL)CDR3，
其中，所述基本同源的序列是与给定CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
21.如权利要求1至20中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:74的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:74基本同源的序列的重链可变区(VH)CDR3，
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定的CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
22.如权利要求1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH CDR3，或分别与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34基本同源的序列，和/或其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQID NO:37的氨基酸序列的VL CDR3，或分别与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37基本同源的序列，
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
23.如权利要求1至22中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH CDR3，且其中所述轻链可变区包括具有SEQID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1、具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL CDR3。
24.如权利要求1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH CDR3，或分别与SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54基本同源的序列，和/或其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1、具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQID NO:57的氨基酸序列的VL CDR3，或分别与SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57基本同源的序列，
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
25.如权利要求1至21或权利要求24中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH CDR3，其中且所述轻链可变区域包括具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR3。
26.如权利要求1至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VH CDR3，或分别与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74基本同源的序列，和/或其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQID NO:77的氨基酸序列的VL CDR3，或分别与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77基本同源的序列,
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
27.如权利要求1至21或权利要求26中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VH CDR3，其中且所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL CDR3。
28.如权利要求1至27中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中
(i)所述轻链可变区具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列，和/或其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)所述轻链可变区具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列，和/或其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列；
(iii)所述轻链可变区具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列，和/或其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列。
29.如权利要求1至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中重链可变区包括具有SEQID NO:156优选SEQ ID NO:157的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1，和/或具有SEQ IDNO:158优选SEQ ID NO:159的氨基酸序列的VH CDR2。
30.如权利要求1至18或权利要求29中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(a)具有SEQ ID NO:156或优选SEQ ID NO:157的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1，或与SEQ ID NO:156或SEQ ID NO:157基本同源的序列，
(b)具有SEQ ID NO:158或优选SEQ ID NO:159的氨基酸序列的VH CDR2，或与SEQ IDNO:158或SEQ ID NO:159基本同源的序列，和
(c)具有SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH CDR3，或分别与SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:134基本同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包括：
(d)具有SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:115或SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，或分别与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:135基本同源的序列，
(e)具有SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VL CDR2，或分别与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:136基本同源的序列，和
(f)具有SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:137的氨基酸序列的VL CDR3，或分别与SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:137基本同源的序列，
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
31.如权利要求1至18、29或30中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR2，或与其基本同源的序列，
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
32.如权利要求1至18、29、30或31中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR3，或分别与SEQ ID NO:92、SEQID NO:93和SEQ ID NO:94基本同源的序列，和/或其中所述轻链可变区包括具有SEQ IDNO:95的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR3，或分别与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQID NO:97基本同源的序列，
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
33.如权利要求1至18、29、30、31或32中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR3和其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR3。
34.如权利要求1至18、29、30或31中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的VH CDR3，或分别与SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:114基本同源的序列，和/或其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的VL CDR3，或分别与SEQ ID NO:115、SEQID NO:116和SEQ ID NO:117基本同源的序列，
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
35.如权利要求1至18、29、30、31或34中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的VH CDR3和其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的VL CDR3。
36.如权利要求1至18、29或30中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH CDR3，或分别与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:134基本同源的序列，和/或其中所述轻链可变区包括具有SEQID NO:135的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的VL CDR3，或分别与SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137基本同源的序列，
其中所述基本同源的序列是与给定的CDR序列相比含有1、2或3个氨基酸替换的序列，或者所述基本同源的序列是含有给定CDR序列的保守氨基酸替换的序列。
37.如权利要求1至18、29、30或36中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的重链可变区(VH)CDR1、具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH CDR3和其中所述轻链可变区包括具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1，具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的VL CDR3。
38.如权利要求29所述的抗体，其中所述抗体包含具有如权利要求30或32至37中任一项共同定义的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3和VH CDR3。
39.如权利要求1至18或29至38中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括至少一个由三个CDR组成的重链可变区和至少一个由三个CDR组成的轻链可变区，其中
(i)所述轻链可变区具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列，和/或其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)所述轻链可变区具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列，和/或其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列；
(iii)所述轻链可变区具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列，和/或其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列。
40.如权利要求1至39中任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
41.如权利要求1至40中任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
42.如权利要求1至41中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含抗体恒定区的完整抗体。
43.如权利要求1至42中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG抗体。
44.如权利要求1至41中任一项所述的抗体，其中所述抗体是抗体的抗原结合片段。
45.如权利要求1至44中任一项所述的抗体，其中所述活性的抑制是GTP酶活性的抑制和/或所述活性的抑制的特征在于抑制表达所述KRAS的致癌突变形式的细胞中的ERK磷酸化和/或所述活性的抑制的特征在于表达所述KRAS的致癌突变形式的细胞中的细胞凋亡增加和/或所述活性的抑制的特征在于表达所述KRAS的致癌突变形式的细胞中的坏死增加。
46.一种组合物，其包含如权利要求1至45中任一项所述的抗体和稀释剂、载体或赋形剂，优选药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
47.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1至45中任一项所述的抗体的核苷酸序列，或各自包含一条核苷酸序列的一组核酸分子，其中所述一组核酸分子共同编码如权利要求1至45中任一项所述的抗体。
48.如权利要求1至45中任一项所述的抗体的生产方法，包括以下步骤：
(i)在适合于表达所编码抗体的条件下培养包含(i)一个或多个编码如权利要求1至45中任一项所述的抗体的核酸分子或(ii)各自包含一条核苷酸序列的一组核酸分子，其中所述一组核酸分子共同编码如权利要求1至45中任一项所述的抗体，或(iii)一种或多种包含一种或多种所述核酸分子的重组表达载体的宿主细胞；和
(ii)从所述宿主细胞或从生长培养基/上清液中分离或获得所述抗体。
49.如权利要求1至45中任一项所定义的抗体在治疗中的用途。
50.如权利要求1至45中任一项所定义的抗体在治疗癌症中的用途。
51.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如权利要求1至45中任一项所定义的抗体。
52.如权利要求1至45中任一项所定义的抗体在制备用于治疗的药物中的用途。
53.如权利要求52所述的用途，其中所述治疗是癌症的治疗。
54.一种分离的多肽，其中所述分离的多肽如权利要求9至17中任一项所定义。
55.一种偶联物，其包含如权利要求9至17中任一项所定义的分离的多肽和多肽载体，优选地，所述多肽载体是钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。
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