CN117417447A - 特异性结合igf1r的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请属于生物免疫技术领域，具体涉及特异性结合IGF1R的抗体或其抗原结合片段，尤其涉及全人源抗IGF1R单克隆抗体及其应用。本申请还涉及包含所述抗体或其抗原结合片段的双特异性或多特异性分子，免疫缀合物，药物组合物，试剂盒以及它们的用途。

Description

特异性结合IGF1R的抗体及其应用
技术领域
本申请属于生物免疫技术领域，具体涉及特异性结合IGF1R的抗体或其抗原结合片段，尤其涉及全人源抗IGF1R单克隆抗体及其应用。本申请还涉及包含所述抗体或其抗原结合片段的双特异性或多特异性分子，免疫缀合物，药物组合物，试剂盒以及它们的用途。
背景技术
IGF1R是一种跨膜酪氨酸蛋白激酶受体，其编码基因定位于15q25-26，长约100kb，共有21个外显子，与胰岛素受体有60％同源性。IGF1R蛋白为由α、β两个亚单位通过二硫键结合形成的异二聚体(α2β2)，其中，α亚基位于胞膜外，有一个半胱氨酸富集区域(cysteine-richodomain)，可与IGF1特异性结合；而跨膜的β亚基存在酪氨酸激酶催化亚单位，可催化自身磷酸化位点磷酸化，引起细胞内信号转导，产生促进细胞有丝分裂及组织器官的生长发育等生物学作用。
当IGF1R与相应配体结合后，其空间构象发生改变，从而使细胞内信号转导，在IGF1R下游，Ras/Raf/MEK和PI3K/AKT通路可以促进增殖、炎症、脂肪生成、瘢痕组织形成和细胞存活。在发育和代谢中发挥作用，也刺激免疫功能，因此可能成为自身免疫性疾病的治疗靶点。
甲状腺相关性眼病(TAO)，也称为甲状腺眼病(TED)、格雷夫斯(Graves)眼病或眼眶病(GO)等，是与甲状腺功能障碍相关的眼眶病。TED分为两种，即活动性TED和非活动性TED，活动性TED通常持续1-3年，其特征是眼眶软组织中持续存在自身免疫/炎症反应，使眼部软组织的扩张和重塑，待活动性TED的自身免疫/炎症反应自发消退后，病情转变为非活动性TED。
TED通常与Graves眼病的甲状腺功能亢进症有关，但也可能作为其他自身免疫性疾病的一部分发生，这些自身免疫性疾病会影响甲状腺并在眼眶和眶周组织产生病理，由于眼眶软组织的炎症和扩张，眼睛被迫向前凸出，这种现象称为眼球突出。
在活动性的TED中，自身抗体触发结缔组织和脂肪扩张，部分原因是刺激透明质酸的过度合成，膨胀的组织被T细胞和B细胞浸润，发炎；部分由激活促甲状腺激素受体(TSHR)的自身抗体(TSAb)引起。有研究认为胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)是TED发病机制中的另一个重要参与者。研究表明，GO-Igs(immunoglobulins purified from the sera ofGraves'disease(GD)patients with eye disease)通过激活TSHR从而激活了两种信号转导途径，一种独立于IGF1R，另一种依赖于IGF1R。TSHR和IGF1R介导的通路通过串联相结合，导致眼眶内容物体积增大，表现为眼球突出等临床症状。使用抗体拮抗剂阻断IGF1R可能会降低TSHR和IGF1R依赖性信号传导，因此中断作为任一受体激动剂的自身抗体的病理活性。
Horizon Therapeutics公司的teprotumumab是一个治疗TED的抗IGF1R阻断抗体，已在2020年被FDA批准作为TED患者的有效治疗方法，但仍有一些患者对这种治疗没有反应，或者对治疗有反应，但治疗后复发，存在成本较高等问题。因此，有必要进一步研发抗IGF1R的阻断抗体，提高治疗效果，降低用药成本。
虽然目前对治疗甲状腺眼病已有药物上市，但国内仍未有治疗此适应症的抗体药物，仍需改善治疗和/或预防该病的组合物和方法，存在对于能够靶向IGF1R的抗体和治疗的需要。
发明内容
在本申请中，发明人开发了免疫原性低且对IGF1R具有高度特异性的能够特异性识别/结合IGF1R的全人源抗体，其能阻断IGF1/2与IGF1R的结合(例如，能够阻断hIGF1/2与hIGF1R的结合)，从而能够阻断由其介导的信号通路。因此，本申请的抗体具有预防和/或治疗IGF1R的表达相关的疾病(例如，可得益于对IGF1R信号传导的拮抗作用的疾病，如甲状腺眼病)的潜力，具有重大的临床价值。
在第一方面，本发明提供了一种特异性结合IGF1R的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下的互补决定区(CDRs)：
(a)SEQ ID NO:10所示的重链可变区(VH)中含有的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；和/或，SEQ ID NO:11所示的轻链可变区(VL)中含有的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3；
(b)SEQ ID NO:18所示的重链可变区(VH)中含有的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；和/或，SEQ ID NO:19所示的轻链可变区(VL)中含有的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3；
(c)SEQ ID NO:26所示的重链可变区(VH)中含有的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；和/或，SEQ ID NO:27所示的轻链可变区(VL)中含有的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3；或
(d)下述重链可变区(VH)中含有的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，和/或下述轻链可变区(VL)中含有的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3，其中，所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)与(a)至(c)任一所述的重链可变区和/或轻链可变区相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)。在某些实施方案中，所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述CDR根据IMGT、Kabat或Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：4或其变体的CDR-H1；序列为SEQ ID NO：5或其变体的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：6或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：7或其变体的CDR-L1；序列为SEQ IDNO：8或其变体的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：9或其变体的CDR-L3；
(2)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：12或其变体的CDR-H1；序列为SEQ ID NO：13或其变体的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：14或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：15或其变体的CDR-L1；序列为SEQID NO：16或其变体的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：17或其变体的CDR-L3；或，
(3)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：20或其变体的CDR-H1；序列为SEQ ID NO：21或其变体的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：22或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：23或其变体的CDR-L1；序列为SEQID NO：24或其变体的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：25或其变体的CDR-L3；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，(1)-(3)任一项中所述CDR由IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：4的CDR-H1；序列为SEQID NO：5的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：6的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：7的CDR-L1；序列为SEQ ID NO：8的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：9的CDR-L3；
(2)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：12的CDR-H1；序列为SEQ ID NO：13的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：14的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：15的CDR-L1；序列为SEQ ID NO：16的CDR-L2；序列为SEQ IDNO：17的CDR-L3；或，
(3)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：20的CDR-H1；序列为SEQ ID NO：21的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：22的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：23的CDR-L1；序列为SEQ ID NO：24的CDR-L2；序列为SEQ IDNO：25的CDR-L3。
在某些实施方案中，(1)-(3)任一项中所述CDR由IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含，包含如SEQ ID NO:10所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:11所示的序列或其变体的VL；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH和/或如SEQ ID NO:11所示的VL。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含，包含如SEQ ID NO:18所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:19所示的序列或其变体的VL；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:18所示的VH和/或如SEQ ID NO:19所示的VL。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含，包含如SEQ ID NO:26所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:27所示的序列或其变体的VL；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:26所示的VH和/或如SEQ ID NO:27所示的VL。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区。所述来源于人免疫球蛋白的恒定区既包括天然人免疫球蛋白恒定区序列，也包括在其中引入突变或变异的变体序列。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。
在某些实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的变体，所述变体具备降低或消除的ADCP活性、降低或消除的CDC活性、和/或降低或消除的ADCC活性。
在某些实施方案中，所述重链恒定区(CH)的变体是IgG1的突变体。在某些实施方案中，所述IgG1的突变体与IgG1相比，根据EU编号，第234位氨基酸突变为A，第235位氨基酸突变为E，第237位氨基酸突变为A，第330位氨基酸突变为S，和，第331位氨基酸突变为S。
在某些实施方案中，所述重链恒定区(CH)的变体是IgG4的突变体。在某些实施方案中，所述IgG4的突变体与IgG4相比，根据EU编号，第234位氨基酸突变为A，和，第235位氨基酸突变为A。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:39，40或41所示的重链恒定区(CH)。
在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO:38所示的轻链恒定区(CL)。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:39所示的重链恒定区(CH)，和，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO：38所示的轻链恒定区(CL)。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:40所示的重链恒定区(CH)，和，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO：38所示的轻链恒定区(CL)。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:41所示的重链恒定区(CH)，和，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO：38所示的轻链恒定区(CL)。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包括SEQ ID NO:10所示的VH和SEQ ID NO:39所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:11所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(2)包括SEQ ID NO:10所示的VH和SEQ ID NO:40所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:11所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(3)包括SEQ ID NO:10所示的VH和SEQ ID NO:41所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:11所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(4)包括SEQ ID NO:18所示的VH和SEQ ID NO:39所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:19所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(5)包括SEQ ID NO:18所示的VH和SEQ ID NO:40所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:19所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(6)包括SEQ ID NO:18所示的VH和SEQ ID NO:41所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:19所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(7)包括SEQ ID NO:26所示的VH和SEQ ID NO:39所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:27所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(8)包括SEQ ID NO:26所示的VH和SEQ ID NO:40所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:27所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
或，
(9)包括SEQ ID NO:26所示的VH和SEQ ID NO:41所示的CH的重链，和，包括SEQ IDNO:27所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段选自Fd、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv(dsFv)、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、scFv、di-scFv、(scFv)2、双功能抗体(diabody)、二硫键稳定的双功能抗体(ds-diabody)、纳米抗体、单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对IGF1R的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或其抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以带有标记。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
在某些实施方案中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、磁珠、测热标记物或生物素。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。
在另一方面，作为抗体的衍生物之一，本发明提供一种双特异性或多特异性分子，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性分子特异性结合IGF1R，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体)。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性分子是双特异性或多特异性抗体。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体为双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(Reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
因此，本发明第二方面提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区，或其重链和/或轻链。
本发明第三方面提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体。在某些实施方案中，所述载体是表达载体。在某些实施方案中，所述载体是游离型载体。在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。可以通过各种合适的方式将如上所述的载体引入宿主细胞，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、电穿孔、TALEN方法、ZFN方法、非病毒载体介导的转染(例如脂质体)或病毒载体介导的转染(如慢病毒感染，逆转录病毒感染，腺病毒感染)，以及其他用于转移入宿主细胞的物理、化学或生物学手段，如转座子技术，CRISPR-Cas9等技术。
在另一个方面，本发明还涉及制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
本发明第五方面提供了免疫缀合物，其包含如前所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂。
在某些实施方案中，所述治疗剂选自细胞毒剂。
在某些实施方案中，所述治疗剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意组合。
在某些实施方案中，所述免疫缀合物是抗体-药物偶联物(ADC)。
本发明第六方面提供了药物组合物，其包含如前所述的抗体或其抗原结合片段，或如前所述的双特异性或多特异性分子或者如前所述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，药物组合物还包含另外的药学活性剂。
在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。
本发明第七方面提供了嵌合抗原受体，其包含如前所述的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域包含如前所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中，所述抗原结合结构域是scFv。
在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含如前所述的抗体的抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体由免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)所表达。
生成嵌合抗原受体以及包含该嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如T细胞)的方法是本领域已知的，可包括用至少一种编码CAR的多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达多核苷酸。例如，可将编码本发明的CAR的核酸分子包含于表达载体(例如，慢病毒载体)中，所述表达载体能够在宿主细胞例如T细胞中表达，以制造所述CAR。
因此，本发明第八方面提供了一种分离的核酸分子，其包含编码如前所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本领域技术人员理解，由于遗传密码的简并性，编码一种本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列可以具有多种不同的序列。因此，除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
本发明第九方面提供了一种载体，其包含第九方面所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，所述载体可用于制备嵌合抗原受体T细胞。
在某些实施方案中，所述载体选自DNA载体，RNA载体，质粒，转座子载体，CRISPR/Cas9载体，病毒载体。
在某些实施方案中，所述载体是表达载体。
在某些实施方案中，所述载体是游离型载体。
在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。
本发明第十方面提供了一种宿主细胞，其包含第八方面所述的分离的核酸分子或第九方面所述的载体。可以通过各种合适的方式将如上所述的载体引入宿主细胞，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、电穿孔、TALEN方法、ZFN方法、非病毒载体介导的转染(例如脂质体)或病毒载体介导的转染(如慢病毒感染，逆转录病毒感染，腺病毒感染)，以及其他用于转移入宿主细胞的物理、化学或生物学手段，如转座子技术，CRISPR-Cas9等技术。
在某些实施方案中，所述宿主细胞是免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在某些实施方案中，所述宿主细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。
本发明第十一方面提供了如前所述的抗体或其抗原结合片段，或第二方面所述的分离的核酸分子，或第三方面所述的载体，或第四方面所述的宿主细胞，或如前所述的双特异性或多特异性分子，或如前所述的免疫缀合物，或如前所述的药物组合物，或如前所述的嵌合抗原受体，或第八方面所述的分离的核酸分子，或第九方面所述的载体，或第十方面所述的宿主细胞，在制备用于预防和/或治疗与IGF1R的表达相关的疾病的药物中的用途。
在某些实施方案中，所述与IGF1R的表达相关的疾病将得益于对IGF1R信号传导的拮抗作用。
在某些实施方案中，所述与IGF1R的表达相关的疾病选自增生性疾病，例如肿瘤。
在某些实施方案中，所述与IGF1R的表达相关的疾病是非肿瘤相关的疾病，例如甲状腺眼病。
在某些实施方案中，所述药物能够抑制炎症因子(例如，IL-6和/或IL-8)的分泌。
在某些实施方案中，所述肿瘤是IGF1R阳性肿瘤。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自实体瘤。在某些实施方案中，所述实体瘤选自肝癌(例如，肝细胞癌)、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、结直肠癌、胃癌、神经胶质瘤和卵巢癌(例如，卵巢透明细胞癌)。
在某些实施方案中，第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或第二方面所述的分离的核酸分子、或第三方面所述的载体、或第四方面所述的宿主细胞、或如前所述的双特异性或多特异性分子、或如前所述的免疫缀合物、或如前所述的药物组合物、或如前所述的嵌合抗原受体、或第八方面所述的分离的核酸分子、或第九方面所述的载体、或十方面所述的宿主细胞与另外的药学活性剂联合施用，例如同时、分开或相继施用。
在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒。
本发明第十二方面提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗与IGF1R的表达相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如前所述的抗体或其抗原结合片段，或第二方面所述的分离的核酸分子，或第三方面所述的载体，或第四方面所述的宿主细胞，或如前所述的双特异性或多特异性分子，或如前所述的免疫缀合物，或如前所述的药物组合物，或如前所述的嵌合抗原受体，或第八方面所述的分离的核酸分子，或第九方面所述的载体，或第十方面所述的宿主细胞。
在某些实施方案中，所述与IGF1R的表达相关的疾病选自增生性疾病，例如肿瘤。
在某些实施方案中，所述与IGF1R的表达相关的疾病是非肿瘤相关的疾病，例如甲状腺眼病。
在某些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段能够抑制炎症因子(例如，IL-6和/或IL-8)的分泌。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自实体瘤。在某些实施方案中，所述实体瘤选自肝癌(例如，肝细胞癌)、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、结直肠癌、胃癌、神经胶质瘤和卵巢癌(例如，卵巢透明细胞癌)。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在某些实施方案中，所述方法还包括施用(例如同时、分开或相继施用)另外的药学活性剂，例如烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒。
本发明第十三方面提供了一种缀合物，其包含如前所述的抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性分子，以及与所述抗体或其抗原结合片段或所述双特异性或多特异性分子连接的可检测的标记。
在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
本发明第十四方面提供了一种试剂盒，其包含如前所述的抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或缀合物。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含如前所述的缀合物。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含如前所述的抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性分子。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别如前所述的抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性分子。在某些实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、磁珠、测热标记物或生物素。
本发明第十五方面提供了一种检测IGF1R在样品中的存在或其量的方法，其包括使用如前所述的抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或缀合物。
在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中，所述方法包括使用如前所述的缀合物。
在某些实施方案中，所述方法包括使用如前所述的抗体或其抗原结合片段或双特异性或多特异性分子，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段或所述双特异性或多特异性分子。
在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)将所述样品与如前所述的抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或缀合物接触；
(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量，所述免疫复合物的形成表明存在IGF1R或表达IGF1R的细胞。
在某些实施方案中，所述方法用于非诊断目的。
本发明第十六方面提供了如前所述的抗体或其抗原结合片段，或第二方面所述的分离的核酸分子，或第三方面所述的载体，或第四方面所述的宿主细胞，或如前所述的双特异性或多特异性分子，或如前所述的缀合物在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测样品中IGF1R的存在或其水平和/或诊断与IGF1R的表达相关的疾病。
在某些实施方案中，所述与IGF1R的表达相关的疾病选自增生性疾病，例如肿瘤。
在某些实施方案中，所述与IGF1R的表达相关的疾病是非肿瘤相关的疾病，例如甲状腺眼病。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自肝癌(例如，肝细胞癌)、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、结直肠癌、胃癌、神经胶质瘤和卵巢癌(例如，卵巢透明细胞癌)。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗体”指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(例如scFv，di-scFv，(scFv)2)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)、以及包括抗体的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。本发明的抗体不受任何特定的产生抗体的方法限制。抗体包括任何类型的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要属于任何特定的类型。取决于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同的类型。有五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。重链恒定区由4个结构域(CH1、hinge region、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。
抗体的VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDRs和4个FRs组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDRs，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中，抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中，除非特殊指明，本文中所涉及的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过IMGT编号系统确定。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fd、Fv、scFv、di-scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDRs赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDRs)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。Fv的VH与VL之间还可以存在二硫键，以形成二硫键连接的Fv(dsFv)。此外，由两个相同dsFv连接可形成(dsFv)2；由两个不同dsFv连接可形成dsFv-dsFv'。
如本文中所使用的，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在某些实施方案中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如，包含NH2-VH-VH-COOH、NH2-VL-VL-COOH的scFv。所述scFv可以形成任何工程上可能的结构，单链抗体(scFv)，串联抗体(tandem di-scFvs)，双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白，骆驼Ig、IgNAR等。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成(scFv)2，其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
如本文中所使用的，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在同一多肽链(VH-VL)中包含连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个结构域之间不能配对的连接子，迫使结构域与另一链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体可以是二价的或双特异性的。双功能抗体更全面描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,自然医学(Nat.Med.)9:129-134(2003)；和Hollinger等人,PNAS USA 90:6444-6448(1993)中。三功能抗体和四功能抗体也描述于Hudson等人,自然医学9:129-134(2003)中。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，表述“特异性结合”或“特异性针对”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。载体可以包括在细胞中直接自主复制的序列，或可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及病毒载体等。病毒载体的非限制性实例包括，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞，免疫细胞(如T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞等)。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含至少一个细胞外抗原结合结构域，间隔结构域，跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽构建体，其将针对目的抗原的基于抗体的特异性与免疫效应细胞活化胞内结构域组合以展现针对表达该目的抗原细胞的特异性免疫活性。在本发明中，表述“表达CAR的免疫效应细胞”是指表达CAR并且具有由该CAR的靶向结构域决定的抗原特异性的免疫效应细胞。制造CAR(例如，用于癌症治疗)的方法是本领域已知的，可参见例如，Park等人,Trends Biotechnol.,29:550-557,2011；Grupp等人,N Engl J Med.,368:1509-1518,2013；Han等人,J.Hematol.Oncol.,6:47,2013；PCT专利公开文本WO2012/079000、WO2013/059593；和美国专利公开文本2012/0213783，其全部通过引用整体并入本文。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：无菌水，生理盐水，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂，稳定剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤，或者，具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
序列信息
本申请所涉及的部分序列的信息如下面的表1所示。
表1.部分序列的信息
有益效果
本申请的获得的单克隆抗体(尤其是全人源单克隆抗体)能够以高特异性与IGF1R(例如，人IGFIR和/或猴IGF1R)蛋白或表达IGF1R(例如，人IGFIR和/或猴IGF1R)蛋白的细胞结合，并且能阻断IGF1/2与IGF1R的结合(例如，能够阻断hIGF1/2与hIGF1R的结合)，从而能够阻断由其介导的信号通路。此外，本申请的单克隆抗体还具有内化活性，能够抑制活动期和非活动期甲状腺眼病病人眼眶成纤维细胞透明质酸、IL-6和IL-8的分泌，可用于治疗活动期和非活动期甲状腺眼病。并且，本申请的单克隆抗体无CDC活性和ADCC活性，无ADCP活性或ADCP活性较低，降低了潜在副作用的风险。因此，本申请的单克隆抗体(尤其是全人源单克隆抗体)具有较高的临床应用价值。
附图说明
图1显示了抗IGF1R单克隆抗体与hIGF1R ECD-His结合检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为OD450，P01-hIgG1、P01-hIgG1M、P01-hIgG4M为长春金赛药业自制阳性对照抗体及其突变体。
图2显示了抗IGF1R单克隆抗体与猴IGF1R胞外域(简称cIGF1R ECD-His)结合检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为OD450，P01-hIgG1、P01-hIgG1M、P01-hIgG4M为长春金赛药业自制阳性对照抗体及其突变体。
图3显示了抗IGF1R单克隆抗体阻断hIGF1与hIGF1R ECD-His结合检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为OD450，P01-hIgG1为长春金赛药业自制阳性对照抗体。
图4显示了抗IGF1R单克隆抗体阻断hIGF2与hIGF1R ECD-His结合检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为OD450，P01-hIgG1为长春金赛药业自制阳性对照抗体。
图5显示了抗IGF1R单克隆抗体与P01-Biotin表位竞争ELISA检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为OD450。
图6显示了抗IGF1R单克隆抗体抑制IGF-1刺激的MCF-7细胞Phospho-AKT(S473)检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为荧光值，P01-hIgG1为长春金赛药业自制阳性对照抗体。
图7A，图7B，图7C分别显示了抗IGF1R单克隆抗体抑制GO-Igs刺激的活动期病人眼眶成纤维细胞HA，IL-6，IL-8的分泌结果；图7D，图7E，图7F分别显示了抗IGF1R单克隆抗体抑制GO-Igs刺激的非活动期病人眼眶成纤维细胞HA，IL-6，IL-8的分泌结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为HA，IL-6，IL-8浓度，空白细胞作为阴性对照。
图8显示了抗IGF1R单克隆抗体ADCP活性检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为荧光素酶活性，P01-hIgG1、P01-hIgG1M、P01-hIgG4M为长春金赛药业自制阳性对照抗体及其突变体。
图9A，图9B分别显示了在人血清(NHS)、兔血清(NRS)作用下抗IGF1R单克隆抗体的CDC活性检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为细胞裂解率，P01-hIgG1、P01-hIgG1M、P01-hIgG4M为长春金赛药业自制阳性对照抗体及其突变体。
图10显示了抗IGF1R单克隆抗体ADCC活性检测结果；横坐标为不同抗体不同浓度组，纵坐标为细胞裂解率，P01-hIgG1、P01-hIgG1M、P01-hIgG4M为长春金赛药业自制阳性对照及其突变体。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本申请(而非限定本申请)的实施例来描述本申请。
除非特别指明，本申请中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本申请，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。
实施例1：IGF1R抗原及阳性对照抗体的制备
IGF1R胞外域(简称IGF1R ECD)制备方法：
人IGF1R胞外域(简称hIGF1R ECD)氨基酸序列(SEQ ID NO:1，其信号肽序列如SEQID NO:46所示)在uniprot网站(https://www.uniprot.org/uniprot/P08069)查询，ID号为P08069。恒河猴IGF1R胞外域(简称cIGF1R ECD)氨基酸序列(SEQ ID NO:2，其信号肽序列如SEQ ID NO:3所示)在uniprot网站(https://www.uniprot.org/uniprot/I2CWY3)查询，ID号为I2CWY3。
使用ExpiCHO细胞在ExpiCHO表达培养基中分别进行hIGF1R ECD或cIGF1R ECD抗原(为便于纯化和不同用途使用，可将所述抗原与Fc结构域融合表达，使其携带Fc标签，或者，可将所述抗原与His标签融合表达，使其携带His标签)的瞬时转染表达。转染前24小时，在500ml细胞培养瓶中分别接种3×106细胞/ml的ExpiCHO细胞100ml，37℃8％ CO2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取320μl的ExpiFectamine CHO试剂加入到3.7ml的OptiPRO SFM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时分别将hIGF1R ECD抗原的表达质粒100μg使用OptiPRO SFM稀释至4ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育2分钟，然后将混合物分别全部加入细胞中，混匀，37℃8％ CO2温箱中120rpm摇床培养7天。
利用Mabselect PrismA亲和层析柱(购自Cytiva公司)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的融合蛋白。具体步骤为：首先，用1M的NaOH清洗层析柱，用平衡缓冲液(20mM PB-150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱后，将表达上清液过亲和层析柱，用淋洗液(20mM PB-1MNaCl，pH7.2～7.6)洗掉非特异性吸附的杂蛋白后，用洗脱缓冲液(20mM枸橼酸盐，pH3.0～4.3)洗脱目标蛋白，洗脱后的目标蛋白立即用1M的Tris缓冲液调节pH至中性。或者，利用Niexcel层析介质(购自Cytiva公司)从表达上清中捕获hIGF1R ECD-His或者cIGF1R ECD-His蛋白。具体步骤为：首先，用0.5M的NaOH清洗层析柱，用平衡缓冲液(20mM PB-0.5M NaCl，pH7.4)平衡层析柱后上样，用20mM PB-0.5M NaCl-20mM咪唑，pH7.4淋洗去掉杂蛋白，用20mM PB-0.5M NaCl-300mM咪唑，pH7.4洗脱目标蛋白,洗脱后的目标蛋白立即用1M的Tris缓冲液调节pH至中性，即收获纯化的蛋白。
阳性对照抗体表达载体构建
阳性对照抗体(命名为P01或P01-hIgG1，长春金赛药业自制)，氨基酸序列(重链氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示)在KEGG数据库查询，网址(https://www.kegg.jp/entry/D09680)，ID：D09680。
使用Expi293F在Expi293表达培养基中进行P01阳性抗体的瞬时转染表达。利用Mabselect PrismA亲和层析柱(购自Cytiva公司)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，洗脱后的目标蛋白用1M的Tris缓冲液调节pH至中性，即收获纯化的抗体。
实施例2：抗hIGF1R单克隆抗体创制和筛选
抗hIGF1R抗体随机突变文库构建
以P01phagemid(P01噬菌粒载体)为模板，经随机突变和组合获得突变基因。随机突变第一轮PCR分别以引物RmutSF-F1(5’-ATGAAATACCTATTGCCTAC-3’，SEQ ID NO：42)和RmutSF-R1(5’-ATCCTCTTCTGAGATGAGTT-3’，SEQ ID NO：43)，使用随机突变试剂盒(II Random Muagenesis Kit，Agilent，200550)中的试剂配制PCR体系，反应条件为，95℃2min；95℃30S，45℃30S，72℃1min，30个循环；72℃10min。
将第一轮PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，回收约750bp的DNA片段，作为第二轮PCR的模板，用与第一轮相同的引物进行扩增，反应条件为，95℃2min；95℃30s，45℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；72℃延伸2min。经Omega胶回收试剂盒回收、定量，作为第三轮PCR的模板，第三轮PCR所用引物和反应条件与第二轮相同，经Omega胶回收试剂盒回收、定量，于-20℃保存备用。将噬菌粒载体pGS249-1和PCR回收产物用NcoⅠ-HF和NotⅠ-HF双酶切，噬菌粒载体pGS249-1经NcoⅠ-HF和NotⅠ-HF双酶切后，再用BamHⅠ-HF酶切，避免载体自连，经胶回收试剂盒过柱回收、定量后，以1：3摩尔比，22℃连接1小时，获得连接产物。
连接产物经胶回收试剂盒回收后，溶于50μl超纯水，取500ng纯化的连接产物电转至大肠杆菌TG1电转感受态细胞中，共电转16支，电转后，立即加入37℃预热的SOC培养基，混匀后，37℃摇床复苏1小时，复苏后，每支取50μl菌液混合，梯度稀释，涂布2×YT平板(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，其余菌液全部涂布于150×20mm的2×YT平板(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃，倒置培养过夜。第二天进行菌落PCR鉴定，计算库容量和文库阳性率。用2×YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)将平板上的菌苔刮洗后，加入终浓度为15％(V/V)的甘油，分装，-80℃保存备用。
抗hIGF1R抗体的淘选与鉴定
取100倍库容量的上述抗IGF1R抗体文库菌液接种880ml 2YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、200rpm培养至OD600＝0.5～0.6，加入细胞密度100倍的辅助噬菌体，37℃，静置孵育15min，然后200rpm振荡培养1h，离心收集菌体，用400ml 2YT-AK培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素)重悬菌体，30℃、200rpm培养过夜。
将上一步培养物4100rpm，4℃离心30min，收集上清加入1/4体积的PEG/NaCl，混匀，冰上静置1h；4100rpm，4℃离心30min，弃上清，离心管倒扣在纸上，使液体除尽；用2ml预冷1×PBS重悬噬菌体沉淀，12000g4℃离心10min；转移上清到新的15ml离心管中，即获得第一轮起始噬菌体。首先取适量PBS稀释的文库噬菌体溶液1013pfu 1ml，放在已封闭的SA免疫管中，室温孵育1h；取出去除非特异性结合的文库噬菌体，加入1ml 5％ Milk，平分至两个已封闭的2ml离心管中，一个管中加入1.5μg-生物素化的hIGF1R ECD-His，另一对照管加入等体积的PBS，室温孵育1h；然后用PBST洗去未结合的噬菌体，用1ml Glycine-HCl(pH 2.2)洗脱噬菌体，将洗脱下来的噬菌体重新感染TG1，进行洗脱产物的扩增，PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行4轮噬菌体库的富集筛选，抗原量依次降低，洗涤强度依次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。
单克隆的诱导表达及ELISA筛选
将第1～4轮淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜后；挑取单克隆于分装有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10(V/V)转接至含有0.5ml/孔2YT-AG(G为0.05％葡萄糖溶液)培养基的96孔深孔板中，培养至OD600＝0.5～0.6，用2YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG)，30℃诱导过夜，第二天离心转移上清至洁净的96孔深孔板。以hIGF1R ECD-hFc为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆上清样品，25℃孵育1h；然后向每孔中加入250μl PBST，振荡5～10s，弃溶液，重复3次；之后向每孔中加入抗anti-His-HRP抗体(Sino Biological)PBS 1:20000(V/V)稀释液50μl，25℃孵育1h；然后向每孔中加入250μl PBST，振荡5～10s，弃溶液，重复3次；向每孔中加入50μl TMB显色液，显色5min，之后向每孔中加入50μl 2M H2SO4终止显色；使用酶标仪测定OD450值。选定与hIGF1R ECD-hFc特异性结合单克隆进行测序，选取3个scFv单克隆抗体进行全人源全长真核表达载体构建及抗体制备。
综上，共筛选得到3个scFv单克隆抗体，将它们分别命名为P77，P08，P94。对上述单克隆抗体进行测序和分析后，获得VH、VL的序列，并根据IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)获得CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3的序列(具体序列参见表1和表2)。
表2.单克隆抗体的序列
进一步的，根据人源的抗体恒定区序列(轻链恒定区-hIgKCL如SEQ ID NO:38所示，重链恒定区-hIgG1如SEQ ID NO:39所示，重链恒定区-hIgG1M(L234A/L235E/G237A/A330S/P331S)如SEQ ID NO:40所示，重链恒定区-hIgG4M(F234A/L235A)如SEQ ID NO:41所示)，将上述3个scFv单克隆抗体进行全人源全长真核表达载体构建及抗体制备，并将所述全人源全长抗体分别命名为P77-hIgG1、P77-hIgG1M和P77-hIgG4M；P08-hIgG1、P08-hIgG1M和P08-hIgG4M；P94-hIgG1、P94-hIgG1M和P94-hIgG4M。
实施例3：抗IGF1R单克隆抗体制备
使用Expi293F在Expi293表达培养基中进行3种抗hIGF1R单抗蛋白的瞬时转染表达。利用Mabselect PrismA亲和层析柱(购自Cytiva公司)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，洗脱后的目标蛋白用1M的Tris缓冲液调节pH至中性，即获得纯化后的抗体。
实施例4：抗IGF1R单克隆抗体与hIGF1R ECD、cIGF1R ECD的ELISA检测
长春金赛药业自制hIGF1R ECD、cIGF1R ECD分别用PBS稀释成0.05μg/ml，加至96孔ELISA板中，每孔50μl，4℃下孵育过夜；PBST洗板3次，用1％BSA封闭，每孔250μl，37℃条件下孵育2小时；PBST洗板3次后，加入起始浓度为1μg/mL 3倍梯度稀释8个浓度抗IGF1R单克隆抗体蛋白样品或阳性对照；每孔50μl，25℃条件下孵育1小时；PBST洗板3次后，加入羊抗人二抗(1:5000，V/V)，每孔50μl，25℃条件下孵育1小时，PBST洗板4次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色3-5分钟，直接加入50μl每孔的终止液终止反应，终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值。结果见图1和图2。由实验结果可知，抗IGF1R单克隆抗体P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1与hIGF1R ECD-His和cIGF1R ECD-His的结合能力均优于P01-hIgG1；P77-hIgG1M、P08-hIgG1M、P94-hIgG1M与hIGF1R ECD-His和cIGF1R ECD-His的结合能力均优于P01-hIgG1M；P77-hIgG4M、P08-hIgG4M、P94-hIgG4M与hIGF1R ECD-His的结合能力均优于P01-hIgG4M；P94-hIgG4M与cIGF1R ECD-His的结合能力与P01-hIgG4M相当，P77-hIgG4M、P08-hIgG4M与cIGF1R ECD-His的结合能力均优于P01-hIgG4M。
实施例5：抗IGF1R单克隆抗体阻断hIGF1、hIGF2与hIGF1R ECD ELISA结合检测
长春金赛药业自制hIGF1R ECD用PBS稀释成10μg/ml，加至96孔ELISA板中，每孔100μl，4℃下孵育过夜；PBST洗板3次，用1％BSA封闭，每孔250μl，37℃条件下孵育2小时；加抗体和配体：PBST洗板3次后，抗IGF1R单克隆抗体蛋白和长春金赛药业自制的阳性对照P01-hIgG1以终浓度50μg/ml起始，3倍梯度稀释，与终浓度12.5μg/ml长春金赛药业自制的hIGF1或hIGF2(hIGF1序列来源：https://www.uniprot.org/uniprot/P05019#P05019-1，SEQ ID NO：44；hIGF2序列来源：https://www.uniprot.org/uniprot/P01344，SEQ ID NO：45，hIGF1或hIGF2与小鼠IgG1 Fc片段融合表达)两者1:1(V/V)混合。每孔100μl加入，25℃条件下孵育1小时；PBST洗板3次后，加入羊抗鼠二抗(1:5000，V/V)，每孔100μl，25℃条件下孵育1小时；PBST洗板4次后，加TMB显色液，每孔100μl，室温下避光显色3-5分钟，直接加入100μl每孔的终止液终止反应，终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据整理。结果见图3、图4。由实验结果可知，抗IGF1R单克隆抗体P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1均能阻断hIGF1与hIGF1R ECD-His结合，且其阻断能力均好于P01-hIgG1；抗IGF1R单克隆抗体P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1均能阻断hIGF2与hIGF1RECD-His结合，P08-hIgG1、P94-hIgG1其阻断能力好于P01-hIgG1。
实施例6：抗IGF1R单克隆抗体与P01-Biotin竞争结合hIGF1R ECD ELISA检测
长春金赛药业自制hIGF1R ECD用PBS稀释成1μg/ml，加至96孔ELISA板中，每孔50μl，4℃下孵育过夜；PBST洗板3次，用1％BSA封闭，每孔250μl，37℃条件下孵育2小时；PBST洗板3次后，抗IGF1R单克隆抗体以终浓度50μg/ml起始，3倍梯度稀释，与终浓度0.1μg/ml长春金赛药业自制的P01-Biotin(由P01-hIgG1偶联生物素制成)两者1:1(V/V)混合。每孔50μl加入，25℃条件下孵育1小时；PBST洗板3次后，加入SA-HRP(1:10000，V/V)，每孔50μl，25℃条件下孵育1小时；PBST洗板4次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色3-5分钟，直接加入50μl每孔的终止液终止反应，终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据整理。结果见图5。由实验结果可知，抗IGF1R单克隆抗体P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1均与P01-hIgG1有竞争结合。
实施例7：抗IGF1R单克隆抗体KD值的测定
应用Biacore 8K检测，使用CM5芯片捕获hIGF1R-ECD-His，用不同浓度的抗体流经芯片，根据采集数据进行拟合分析。将抗原样品按2倍浓度梯度稀释法，使用HBS-EP+Buffer(Cytiva BR100826)稀释至2nmol/L、1nmol/L、0.5nmol/L、0.25mol/L、0.125nmol/L、0.0625nmol/L、0.03nmol/L、0.015nmol/L浓度梯度溶液。以0.25nmol/L为重复浓度检测样品。检测条件为：捕获时间30s，流速：30μl/min；结合时间120s；解离时间300s；流速30μl/min，再生条件为20mM NaOH溶液，流速：30μl/min。具体实验结果见表3。由实验结果可知，抗IGF1R单克隆抗体P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1的亲和力均高于P01-hIgG1。
表3.抗IGF1R单克隆抗体KD值检测
注：E+07：×107；E+06：×106；E-05：×10-5；E-04：×10-4；E-11：×10-11；E-12：×10-12。
实施例8：抗IGF1R单克隆抗体抑制IGF-1刺激的MCF-7细胞Phospho-AKT(S473)检测
本实施例使用Phospho-AKT pan(S473)TR-FRET Cell Signaling Assay Kit(bioauxilium公司，货号KIT-AKTS473P-500)进行检测。MCF-7细胞以2E4/孔的密度铺于96孔板，100μl/孔，孵箱37℃过夜培养，培养基为DMEM+10％ FBS；使用实验培养基(无血清DMEM)进行样品稀释，P01-hIgG1起始终浓度为3000nM，前三个浓度点3倍稀释剩余梯度5倍稀释，共11个梯度，增加最高浓度一个点(6μM)使下平台完整，3复孔，50μl/孔；IGF-1(义翘神州)浓度100nM，50μl/孔；单孔设置对照组IGF-1(义翘神州)浓度100nM、0nM；样品加入细胞后，立即放入37℃孵箱中，孵育20min；移除细胞上清，用ddH2O清洗细胞一次，加入50μl/孔细胞裂解液(用ddH2O稀释5×裂解缓冲液(Lysis Buffer)+100×磷酸酶抑制剂(phosphatase inhibitor))。室温400rpm震荡30min，镜下观察细胞已完全裂解；将15μl裂解液转移至HTRF 96well low volume plates(CISBIO)，每孔中加入5μl 4×抗体检测混合物(antibody detection mix)；密封孔板，封边，室温避光孵育18h；酶标仪选择TR-FRET功能读板。具体实验结果见表4，图6。由实验结果可知，从ED50上看，抗IGF1R单克隆抗体P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1抑制IGF-1刺激的MCF-7细胞Phospho-AKT(S473)能力明显好于P01-hIgG1。
表4.抗IGF1R单克隆抗体抑制IGF-1刺激的MCF-7细胞Phospho-AKT(S473)检测
抗体编号 ED50(nM)
P01-hIgG1 15.01
P77-hIgG1 1.557
P08-hIgG1 2.157
P94-hIgG1 0.546
实施例9：抗IGF1R单克隆抗体A549细胞内化活性检测
消化获取A549细胞，用1％BSA重悬至终密度2×105个/样品；将A549细胞加入100nM抗体100μL，4℃孵育1h；加入1％BSA清洗2次，1500rpm，离心5min，去除未结合的抗体；已结合抗体的内化：加入100μL完全培养基，抗体内化组放置于37℃孵育，对照组(0h)放置于4℃孵育，抗体内化组和对照组于对应终点检测1h，加入预冷1％BSA终止内化，1500rpm，离心5min；弃上清，加入100μL羊抗人IgG PE二抗(Goat Anti-Human IgG PE antibody)荧光二抗，1:100(V/V)稀释，4℃避光孵育30min；加入1％BSA清洗2次，1500rpm，离心5min，去除未结合的二抗，预冷DPBS重悬细胞；流式细胞仪进行检测：抗体内化的程度取决于抗体内化组(37℃孵育)相比于对照组(4℃孵育，即设定为0h)MFI的降低程度：a)％MFI＝MFI(37℃孵育)/MFI(4℃孵育)*100，b)抗体内化程度(％)＝100-％MFI，具体实验结果见表5，由实验结果可知，抗IGF1R单克隆抗体P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1内化活性与P01-hIgG1相当或略优，内化率分别为44％、44％、47％。
表5.抗IGF1R单克隆抗体A549细胞内化活性检测结果
抗体名称 100nM时内化率(％)
P01-hIgG1 44％
P77-hIgG1 44％
P08-hIgG1 44％
P94-hIgG1 47％
实施例10：抗IGF1R单克隆抗体抑制甲状腺眼病病人眼眶成纤维细胞HA，IL-6，IL-8分泌实验
(1)细胞铺板：甲状腺眼病病人活动期、非活动期细胞每孔1E4个细胞接种至96孔透明板中，100μl/孔，过夜孵育24h后弃上清，换成无血清培养基饥饿24h；
(2)加入抗体和GO-Igs
HA分泌实验：抗体初始浓度1500nM，前4个点3倍稀释，后7个点6倍稀释，11个梯度，50μl/孔加入至靶细胞中，GO-Igs浓度30μM，50μL/孔加入上述板中，37℃孵育96h；
IL-6、IL-8分泌实验：抗体初始浓度4500nM，前4个点3倍稀释，后7个点6倍稀释，11个梯度，50μl/孔加入至靶细胞中，GO-Igs浓度30μM，50μL/孔加入上述板中，37℃孵育24h；
(3)孵育完成后，收集上清进行ELISA检测，分别使用人透明质酸(HA)试剂盒(ELISA)(ml557801，上海酶联生物科技有限公司)，Human IL-6ELISA试剂盒(CSB-E04638h，Cusabio公司)，Human IL-8ELISA试剂盒(D8000C，R&D公司)检测细胞HA，IL-6，IL-8的含量。其中Anti-HEL-Human IgG1为不结合IGF1R的同种型阴性对照。
抗体抑制活动期病人眼眶成纤维细胞HA，IL-6，IL-8分泌，具体实验结果见表6，图7A，图7B，图7C；抗体抑制非活动期病人HA，IL-6，IL-8分泌，具体实验结果见表7，图7D，图7E，图7F。由实验结果可知，抗IGF1R单克隆抗体P77-hIgG1、P77-hIgG1M、P77-hIgG4M、P08-hIgG1、P08-hIgG1M、P08-hIgG4M、P94-hIgG1、P94-hIgG1M、P94-hIgG4M均能抑制甲状腺眼病活动期和非活动期病人眼眶成纤维细胞HA，IL-6，IL-8分泌，抑制率均≥69％。
表6.抗IGF1R单克隆抗体抑制甲状腺眼病活动期病人眼眶成纤维细胞HA，IL-6，IL-8分泌实验结果
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注：抑制率＝(GO-Igs组-最大浓度组)/(GO-Igs组-空细胞组)*100％；
表7.抗IGF1R单克隆抗体抑制甲状腺眼病非活动期病人眼眶成纤维细胞HA，IL-6，IL-8分泌实验结果
实施例11：抗IGF1R单克隆抗体ADCP活性检测
(1)靶细胞铺板：将MCF-7-IGF1R细胞(过表达IGF1R的MCF-7细胞)以2E4/孔进行铺板，过夜培养；
(2)抗体稀释：抗IGF1R单克隆抗体P01-hIgG1、P01-hIgG1M、P01-hIgG4M、P77-hIgG1、P77-hIgG1M、P77-hIgG4M、P08-hIgG1、P08-hIgG1M、P08-hIgG4M、P94-hIgG1、P94-hIgG1M、P94-hIgG4M用实验培养基(1640空培养基)进行稀释，300μg/ml起，3倍稀释，10个梯度；去上清后，50μL/孔，加入孔板；
(3)效应细胞处理：Jurkat-CD32a-NFAT-Luc，2E5/50μL/孔加入孔板，计数4E6/ml；
(4)孵育：37℃培养6h；
(5)检测：荧光(Luminescent)，每孔加入100μL Bright-GLO，避光孵育5min。
具体实验结果见图8，由实验结果可知，在检测荧光素酶的活率达到平台期时，P01-hIgG1有较强的ADCP活性，P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1比P01-hIgG1 ADCP活性低，P01-hIgG1、P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1从hIgG1突变成IgG1M，IgG4M后，均未检测到ADCP活性，无ADCP活性，降低了潜在副作用的风险。
实施例12：抗IGF1R单克隆抗体CDC检测
(1)细胞准备：消化靶细胞MCF-7，室温离心3min，1000rpm，弃上清后用10ml CDC缓冲液(DMEM)重悬清洗一次，再次室温离心3min，1000rpm，弃上清待用；调整靶细胞密度至1.67×105个/ml，30μl/孔铺到96孔白板中，即5×103个/孔；
(2)抗体稀释
抗体起始浓度为1000μg/ml(终浓度为300μg/ml)，3倍稀释，10个浓度，按照30μl/孔加入到上述96孔白板中，将靶细胞和抗体放入细胞培养箱(37℃、5％CO2)孵育30min；
(3)加入健康血清(NHS、NRS)
按照20％(V/V)比例，每孔加入40μl 50％NHS或40μl 50％NRS(终体积为100μl，NHS或NRS用DMEM进行稀释)，孵育2h；
(4)结果检测
按照每孔加入100μl CellTiter-Glo试剂至实验孔板中，在微孔板震荡器上混合2min诱导细胞裂解，继续将培养板在室温下孵育10min。
数据分析：RLUsample为样品化学发光值，RLUcell+NHS为细胞+健康人血清化学发光值。细胞杀伤百分比计算公式：％Cell lysis＝100％×(1-RLUsample/RLUcell+NHS)，软件Graphpad 6.0先LOG10回归浓度，继而log(agonist)vs.response回归计算得到logistic四参数方程和ED50值。具体实验结果见图9A和图9B，由实验结果可知，P01-hIgG1、P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1未检测到CDC活性，P01-hIgG1、P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1突变成IgG1M，IgG4M后，也未检测到CDC活性。
实施例13：抗IGF1R单克隆抗体ADCC检测
(1)靶细胞准备：5ml离心管收集靶细胞MCF-7，室温离心3min，1000rpm，弃上清后用5ml实验缓冲液(Assay buffer)(MEM Alpha+1％ FBS)重悬清洗一次，再次室温离心3min，1000rpm，弃上清；使用Assay buffer调整靶细胞密度至1×105个/ml，按每孔50μl(即5000个/孔)铺到96孔板中。
(2)抗体稀释：抗体起始浓度为1200μg/ml(终浓度为300μg/ml)，5倍稀释，10个浓度，按照50μl/孔加入到靶细胞中，培养箱(37℃、5％CO2)孵育30min。
(3)效应细胞准备：15ml离心管收集效应细胞PBMC，室温离心3min，1000rpm，加入5ml实验缓冲液(Assay buffer)清洗一次，再次室温离心3min，1000rpm，调整效应细胞密度至1.25×106个/ml(即1.25×105个/孔)，每孔100μl小心加入孵育的实验孔板中，轻轻混匀后放入细胞培养箱中继续孵育6h。
(4)LDH检测
(5)结果计算
ADCC裂解的靶细胞百分比计算公式：％Target cell lysis＝100％×(ODSample data-ODMinimum concentration Sample data)/(ODMaximum release-ODMinimum release)；
其中，ODSample data为样品吸光值，ODMinimum concentration Sample data为样品最小浓度点样品吸光值，ODMaximum release为最大杀伤吸光值，ODMinimum release为最小杀伤吸光值。
具体实验结果见图10，由实验结果可知，P01-hIgG1、P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1未检测到ADCC活性，P01-hIgG1、P77-hIgG1、P08-hIgG1、P94-hIgG1突变成IgG1M，IgG4M后，也未检测到ADCC活性。
实施例14：抗IGF1R单克隆抗体凝血、溶血检测
(1)采血：肝素钠抗凝管静脉采健康人血，配制2％红细胞(体积比，终浓度1％)500μl/流式管；
(2)抗体稀释：抗体终浓度1000nM起，10倍稀释，3个浓度梯度，加入含有血细胞的上述流式管中，500μl/流式管；放入细胞培养箱(37℃、5％CO2)孵育3h；
(3)结果检测：37℃培养箱静置孵育3h后观察凝集及溶血情况。
(4)结果判定
完全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留。
部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留。
无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。
凝聚：溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚。按下法进一步判断是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物振荡后均匀分散，将凝聚物取出置于载玻片上，盖上盖玻片，在盖玻片边缘滴2滴氯化钠注射液，在显微镜下观察，凝聚的红细胞能被冲散者为假凝聚。若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。
无凝聚：轻轻震荡后，沉积的红细胞即可摇散。
抗IGF1R单克隆P01-hIgG1、P01-hIgG1M、P01-hIgG4M、P77-hIgG1、P77-hIgG1M、P77-hIgG4M、P08-hIgG1、P08-hIgG1M、P08-hIgG4M、P94-hIgG1、P94-hIgG1M、P94-hIgG4M在1000nM浓度下，在体外对人红细胞无溶血作用，在管底部红细胞震摇后即可摇散，故不引起红细胞凝聚。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (23)

1.特异性结合IGF1R的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下的互补决定区(CDRs)：
(a)SEQ ID NO:10所示的重链可变区(VH)中含有的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；和/或，SEQ ID NO:11所示的轻链可变区(VL)中含有的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3；
(b)SEQ ID NO:18所示的重链可变区(VH)中含有的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；和/或，SEQ ID NO:19所示的轻链可变区(VL)中含有的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3；
(c)SEQ ID NO:26所示的重链可变区(VH)中含有的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3；和/或，SEQ ID NO:27所示的轻链可变区(VL)中含有的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3；或
(d)下述重链可变区(VH)中含有的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3，和/或下述轻链可变区(VL)中含有的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3，其中，所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)与(a)至(c)任一所述的重链可变区和/或轻链可变区相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换为保守置换；
优选地，所述CDR根据IMGT、Kabat或Chothia编号系统定义。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：4或其变体的CDR-H1；序列为SEQ ID NO：5或其变体的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：6或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：7或其变体的CDR-L1；序列为SEQ ID NO：8或其变体的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：9或其变体的CDR-L3；
(2)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：12或其变体的CDR-H1；序列为SEQ ID NO：13或其变体的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：14或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：15或其变体的CDR-L1；序列为SEQ IDNO：16或其变体的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：17或其变体的CDR-L3；或，
(3)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：20或其变体的CDR-H1；序列为SEQ ID NO：21或其变体的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：22或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：23或其变体的CDR-L1；序列为SEQ IDNO：24或其变体的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：25或其变体的CDR-L3；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，(1)-(3)任一项中所述CDR由IMGT编号系统定义；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：4的CDR-H1；序列为SEQ IDNO：5的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：6的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：7的CDR-L1；序列为SEQ ID NO：8的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：9的CDR-L3；
(2)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：12的CDR-H1；序列为SEQ IDNO：13的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：14的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：15的CDR-L1；序列为SEQ ID NO：16的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：17的CDR-L3；或，
(3)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：20的CDR-H1；序列为SEQ IDNO：21的CDR-H2；序列为SEQ ID NO：22的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：23的CDR-L1；序列为SEQ ID NO：24的CDR-L2；序列为SEQ ID NO：25的CDR-L3；
优选地，(1)-(3)任一项中所述CDR由IMGT编号系统定义。
3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含如SEQ ID NO:10所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:11所示的序列或其变体的VL；
(b)包含如SEQ ID NO:18所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:19所示的序列或其变体的VL；或
(c)包含如SEQ ID NO:26所示的序列或其变体的VH，和/或，包含如SEQ ID NO:27所示的序列或其变体的VL；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH和/或如SEQ IDNO:11所示的VL；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:18所示的VH和/或如SEQ IDNO:19所示的VL；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:26所示的VH和/或如SEQ IDNO:27所示的VL。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区；
优选地，所述重链恒定区(CH)的变体是IgG1的突变体；优选地，所述IgG1的突变体与IgG1相比，根据EU编号，第234位氨基酸突变为A，第235位氨基酸突变为E，第237位氨基酸突变为A，第330位氨基酸突变为S，和，第331位氨基酸突变为S；
优选地，所述重链恒定区(CH)的变体是IgG4的突变体；优选地，所述IgG4的突变体与IgG4相比，根据EU编号，第234位氨基酸突变为A，和，第235位氨基酸突变为A；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:39，40或41所示的重链恒定区(CH)；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO:38所示的轻链恒定区(CL)；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:39，40或41所示的重链恒定区(CH)，和，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO:38所示的轻链恒定区(CL)；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包括SEQ ID NO:10所示的VH和SEQ ID NO:39所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:11所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(2)包括SEQ ID NO:10所示的VH和SEQ ID NO:40所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:11所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(3)包括SEQ ID NO:10所示的VH和SEQ ID NO:41所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:11所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(4)包括SEQ ID NO:18所示的VH和SEQ ID NO:39所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:19所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(5)包括SEQ ID NO:18所示的VH和SEQ ID NO:40所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:19所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(6)包括SEQ ID NO:18所示的VH和SEQ ID NO:41所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:19所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(7)包括SEQ ID NO:26所示的VH和SEQ ID NO:39所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:27所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
(8)包括SEQ ID NO:26所示的VH和SEQ ID NO:40所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:27所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链；
或，
(9)包括SEQ ID NO:26所示的VH和SEQ ID NO:41所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO:27所示的VL和SEQ ID NO:38所示的CL的轻链。
5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fd、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv(dsFv)、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、scFv、di-scFv、(scFv)2、双功能抗体(diabody)、二硫键稳定的双功能抗体(ds-diabody)、纳米抗体、单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、全人源抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
6.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有标记；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、磁珠、测热标记物或生物素。
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区，或其重链和/或轻链。
8.载体，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子或权利要求8所述的载体。
10.制备权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
11.双特异性或多特异性分子，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述双特异性或多特异性分子特异性结合IGF1R，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体)。
12.免疫缀合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂；
优选地，所述治疗剂选自细胞毒剂；
优选地，所述治疗剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意组合；
优选地，所述免疫缀合物是抗体-药物偶联物(ADC)。
13.药物组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子或者权利要求12所述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。
14.嵌合抗原受体，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域；
优选地，所述抗原结合结构域包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区；
优选地，所述抗原结合结构域是scFv；
优选地，所述嵌合抗原受体包含权利要求1-6任一项所述的抗体的抗原结合片段；
优选地，所述嵌合抗原受体由免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)所表达。
15.分离的核酸分子，其编码权利要求14所述的嵌合抗原受体。
16.载体，其包含权利要求15所述的分离的核酸分子；优选地，其用于制备嵌合抗原受体T细胞。
17.宿主细胞，其包含权利要求15所述的分离的核酸分子或权利要求16所述的载体；
优选地，所述宿主细胞是免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)；
优选地，所述宿主细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。
18.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求7所述的分离的核酸分子，或权利要求8所述的载体，或权利要求9所述的宿主细胞，或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子，或权利要求12所述的免疫缀合物，或权利要求13所述的药物组合物，或权利要求14所述的嵌合抗原受体，或权利要求15所述的分离的核酸分子，或权利要求16所述的载体，或权利要求17所述的宿主细胞，在制备用于预防和/或治疗与IGF1R的表达相关的疾病的药物中的用途；
优选地，所述与IGF1R的表达相关的疾病将得益于对IGF1R信号传导的拮抗作用；
优选地，所述与IGF1R的表达相关的疾病选自增生性疾病，例如肿瘤；
优选地，所述与IGF1R的表达相关的疾病是非肿瘤相关的疾病，例如甲状腺眼病；
优选地，所述药物能够抑制炎症因子(例如，IL-6和/或IL-8)的分泌；
优选地，所述肿瘤是IGF1R阳性肿瘤；
优选地，所述肿瘤选自实体瘤；优选地，所述实体瘤选自肝癌(例如，肝细胞癌)、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、结直肠癌、胃癌、神经胶质瘤和卵巢癌(例如，卵巢透明细胞癌)；
优选地，权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求7所述的分离的核酸分子、或权利要求8所述的载体、或权利要求9所述的宿主细胞、或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子、或权利要求12所述的免疫缀合物、或权利要求13所述的药物组合物、或权利要求14所述的嵌合抗原受体、或权利要求15所述的分离的核酸分子、或权利要求16所述的载体、或权利要求17所述的宿主细胞与另外的药学活性剂联合施用，例如同时、分开或相继施用；
优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物；
优选地，所述另外的药学活性剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒。
19.缀合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子，以及与所述抗体或其抗原结合片段或所述双特异性或多特异性分子连接的可检测的标记；
优选地，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
20.试剂盒，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的双特异性或多特异性分子或权利要求19所述的缀合物；
优选地，所述试剂盒包含权利要求19所述的缀合物；
优选地，所述试剂盒包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子；优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子；优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、磁珠、测热标记物或生物素。
21.一种检测IGF1R在样品中的存在或其量的方法，其包括使用权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的双特异性或多特异性分子或权利要求19所述的缀合物；
优选地，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法；
优选地，所述方法包括使用权利要求19所述的缀合物；
优选地，所述方法包括使用权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段或所述双特异性或多特异性分子。
22.权利要求21所述的方法，其包括以下步骤：
(1)将所述样品与权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子或权利要求19所述的缀合物接触；
(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量，所述免疫复合物的形成表明存在IGF1R或表达IGF1R的细胞。
23.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求7所述的分离的核酸分子，或权利要求8所述的载体，或权利要求9所述的宿主细胞，或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子，或权利要求19所述的缀合物在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测样品中IGF1R的存在或其水平和/或诊断与IGF1R的表达相关的疾病；
优选地，所述与IGF1R的表达相关的疾病选自增生性疾病，例如肿瘤；
优选地，所述与IGF1R的表达相关的疾病是非肿瘤相关的疾病，例如甲状腺眼病；
优选地，所述肿瘤选自肝癌(例如，肝细胞癌)、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、结直肠癌、胃癌、神经胶质瘤和卵巢癌(例如，卵巢透明细胞癌)。
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