JP2009025632A - 走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】データ取得前の合焦時等に、無駄な光を試料に照射することがない走査型顕微鏡を提供する。
【解決手段】光源１０からの光をスキャナ１２により２次元走査光に変えて、試料１４を走査光により点照明し、試料１４からの反射光又は蛍光を受光して、受光量とスキャナ１２の駆動量を組み合わせて２次元画像を得る走査型顕微鏡であって、スキャナ１２の水平走査にレゾナント型スキャナを使用しているものにおいて、１画面の画像を取得するのに要する時間をＴとするとき、ｎＴ（ｎは１以上の整数）の時間間隔毎に、１画面の画像を取得するのに必要な時間だけ、スキャナ１２の走査に合わせて光源１２を発光させ、かつ、前記ｎの数が可変であるような光源制御装置を有することを特徴とする走査型顕微鏡。
【選択図】 図１

Description

本発明は走査型顕微鏡に関するものである。

従来のガルバノミラー型スキャナを使用した走査型共焦点顕微鏡では、図６に示すように、スキャナ走査中（スキャナ駆動信号４０がＯＮ（走査）となっているとき）に、垂直同期信号（Vsync）４１に同期してレーザ制御信号４２をＯＮとして、レーザ照射を開始すると共に、画像取得信号４３をＯＮとして画像の取得を開始し、１画面分の画像取得が終了して画像取得信号４３がＯＦＦとなったとき、レーザ制御信号４２をＯＦＦとしてレーザ照射を停止していた。そして、これを繰り返すことにより、複数枚の画像を取得していた。

走査型共焦点顕微鏡の中には、高速化を目的として、スキャナのうち水平方向走査に、ガルバノミラー型スキャナに代えて、レゾナント型スキャナを使用したものがある。例えば、水平方向走査にガルバノミラー型スキャナを使用すると、１画面の画像を得るのに約0.5秒を要するが、これをレゾナント型スキャナに代えることにより、１画面の画像を約１／３０秒で得ることができ、高速化を図ることができる。

しかしながら、このような方式には、以下のような問題点がある。すなわち、実際のデータ取得前の合焦時、レーザパワー設定時、受光素子感度設定等の作業中においても、データ取得時と同様のレーザパワーを照射する必要がある。一方、このように高速なレゾナント型スキャナを使用すると、人間の目で捉えることのできない間隔（約３３msec）で１画面分の画像取得・レーザ照射を行うことになる。よって、不必要な画像が取得されていることになり、その間も試料に対するレーザ光の照射が行われている。

試料に対するレーザ光の照射は、試料にダメージを与えることになるので、できるだけ少ないことが好ましいが、上述のように、不必要なレーザ光の照射が行われることになり好ましくない。

又、個々の試料の細胞の状態の変化速度は、細胞の種類、蛍光試薬の種類等によって異なるため、前述の合焦時等における最適な画像取得間隔が異なるにもかかわらず、スキャナの走査間隔で常に画像取得を行ってしまうという問題点もある。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、データ取得前の合焦時等に、無駄な光を試料に照射することがない走査型顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、光源からの光をスキャナにより２次元走査光に変えて、試料を前記走査光により点照明し、前記試料からの反射光又は蛍光を受光して、受光量と前記スキャナの駆動量を組み合わせて２次元画像を得る走査型顕微鏡であって、前記スキャナの水平走査にレゾナント型スキャナを使用しているものにおいて、１画面の画像を取得するのに要する時間をＴとするとき、ｎＴ（ｎは１以上の整数）の時間間隔毎に、１画面の画像を取得するのに必要な時間だけ、前記スキャナの走査に合わせて前記光源から前記画像取得に必要な光量の光を出射させ、かつ、前記ｎの数が可変であるような光源制御装置を有することを特徴とする走査型顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記ｎＴの時間間隔毎の１画面の画像を取得するのに必要な時間以外の時間においては、前記光源から出射される光の光量を前記画像取得に必要な光量より小さくするかゼロにすることを特微とする物である。

本発明によれば、データ取得前の合焦時等に、無駄な光を試料に照射することがない走査型顕微鏡を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は、本発明の第１の実施の形態であるレーザ走査型共焦点顕微鏡の概要を示す図である。

コントローラ２０内のレーザ制御部２４によって制御されるレーザ１０には高速スイッチング可能なＬＤレーザ、あるいはＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ）等による高速スイッチングを可能にしたレーザが使用される。レーザ１０から照射されたレーザ光はダイクロイックミラー１１で反射され、コントローラ２０内のスキャナ制御部２３によって制御される水平方向を走査するレゾナント型スキャナ、垂直方向を走査するガルバノミラー型スキャナで構成されたスキャナ部１２に導入され、２次元の走査光に変えられる。

２次元走査光となったレーザ光は、対物レンズ１３によって試料１４上に結像される。点光源であるレーザ１０と試料１４面とは共役とされている。試料１４上の照射領域から発した蛍光は対物レンズ１３で集められ、励起レーザ光と逆の順路を進み、スキャナ部１２で非走査光に変えられてダイクロイックミラー１１に入射する。蛍光はダイクロイックミラー１１を透過し、ピンホール１５上に集光される。ピンホール１５は、試料１４と共役な位置に置かれている。

ピンホール１５上の開口を通過した光のみが光検出器１６で検出され、キャプチャ制御部２２に送信され輝度データとして使われる。キャプチャ制御部２２には、スキャナ制御部２３の信号が取り込まれており、取り込まれた輝度データとスキャナ部１２の駆動量とを組み合わせて、１画面分の２次元画像データが構成される。また、コンピュータ３０内のソフトウェア３１からの命令はコントローラ２０内のＣＰＵ２１が適切な制御部に振り分ける。

図２は、制御のフローを示すフローチャート、図３は、図１に示したレーザ走査型共焦点顕微鏡の画像取得時のタイムチャートである。以下、図１〜図３を用いて、画像取得とレーザ照射の制御方法を説明する。

図２の処理１において、コンピュータ３０内のソフトウェア３１で、画像取得間隔を設定しコントローラ２０に送信する。画像取得間隔とは、１枚の画像データを取得するのに要する時間をＴとするとき、ｎＴ（ｎは１以上の整数）の時間を示す。すなわち、ｎＴ時間毎に１枚の画像データが取得されることになる。コントローラ２０に送信されるのはｎの値である。

続いて図２の処理２において、コントローラ２０内のＣＰＵ２１ではコンピュータ３０から送信された画像取得間隔を、スキャナ制御部２３に設定する。

次に図２の処理３において、ソフトウェア３１から走査開始の命令が送信されるとＣＰＵ２１はスキャナ制御部２３を介してスキャナ部１２の走査を開始する（開始と同時に、図３に示すスキャナ駆動信号５０は「走査」状態となる）。この時スキャナ制御部２３は図３に示す垂直同期信号VSync信号５１をキャプチャ制御部２２とレーザ制御部２４に出力する。垂直同期信号VSync信号５１の周期が、「１枚の画像データを取得するのに要する時間Ｔ」に相当する。すなわち、装置全体の制御の中で、１枚の画像データを取得するためにかかる時間が、「１枚の画像データを取得するのに要する時間Ｔ」に相当する。言い換えれば、時間Ｔごとに１枚の画像データを得ることが可能とされている。

続いて、図２の処理４において、今までに実際にスキャナが走査した回数（画像取得枚数）と画像取得間隔（ｎ）の比較を行う。なお、走査回数が１にリセットされた後は、１からカウントする。比較結果が等しい場合、又は走査回数が０（初期値）の場合は処理５、処理６へ進み、異なる場合は処理９に進む。又、比較結果が等しい場合には、処理９にて走査回数を１にリセットする。

図２の処理５においては、レーザ制御部２４は、図３に示すレーザ制御信号５２をＯＮにしてレーザ１０の出力を開始する。

図２の処理６においては、キャプチャ制御部２２は検出器３３からの検出信号を受信し、画像取得を開始する。（図３に示すように画像取得状態５３が取得中となる）
図２の処理７においては、フレーム走査が終了と共にキャプチャ制御部２２は画像取得を終了する。（図３に示すように画像取得状態５３が未取得となる。）画像取得信号５３が「取得中」となっている時間が、「１画面の画像を取得するのに必要な時間」に相当し、実際に１枚の画像を取得している時間に相当する。一般に「１画面の画像を取得するのに要する時間Ｔ」より短い。

図２の処理８においては、処理７において、画像取得状態５３が未取得となったことを受け、レーザ制御部２４はレーザ制御信号５２をＯＦＦにしてレーザ１０の出力を停止する。

図２の処理９においては、スキャナ制御部２３は垂直同期信号VSync信号５１の回数をカウントし、垂直同期回数をインクリメントする。従って、レーザの照射と画像の取得を行う信号は出力されない。

図２の処理１０においては、走査終了の場合、処理１１へ進み、引き続き走査する場合は処理４に進む。

図２の処理１１においては、コントローラ２０内のＣＰＵ２１はスキャナ制御部２３を介してスキャナ部１２の停止を行う（スキャナ駆動信号５０が停止状態となる）。画像取得枚数は初期状態である０にリセットされる。

図３に示すフローチャートは、ｎ＝３の場合を示しており、VSync信号５１が３回ＯＮとなる毎に１回のレーザ光の照射と画像取得が行われている。レゾナント型スキャナの画像取得間隔は約３３msecであるが、この例では約100msec間隔でレーザが照射され、試料・試薬へ照射するレーザパワーを約１／３に低下させることが可能となる。ｎの数を試料や試薬の種類に合わせて変えることにより、測定前の調整段階における試料、試薬へのレーザ照射を必要最小限に抑えることができる。

以下、本発明の第２の実施の形態を、図４、図５を用いて、説明する。以下の説明においては、第１の実施形態と同一の部分についてはその説明を省略し、相違する部分のみを説明する。

図４は、第２の実施の形態の制御のフローを示すフローチヤート、図５は、その画像取得時のタイムチャートである。図４の処理１から処理３までは、図２の処理１から処理３までと同じである。図４の処理４において、今までに実際にスキャナが走査した回数（画像取得回数）と画像取得間隔（ｎ）の比較を行う。

なお、走査回数が１にリセットされた後は１からカウントする）。比較結果が等しい場合、又は走査回数が０（初期値）の場合は処置５、処理６へ進み、異なる場合は処理１２に進む。また、比較結果が等しい場合には、処理９にて走査回数を１にリセットする。図４の処理５においては、レーザ制御部２４は、図５に示すレーザ制御信号５２をＯＮにし、かつ図５に示すレーザ強度調整信号５４から１００を出力して、画像取得に必要な光量のレーザ光の出力を開始する。なお、レーザから予め設定した画像取得に必要な光量を出力する場合の、レーザ強度調整信号５４の出力値を１００とする。

図４の処置６、処理７は、図２の処置６、処理７と同じである。図４の処理１２においては、レーザ制御部２４は、図５に示すレーザ制御信号５２をＯＮにし、かつ、図５に示すレーザ強度調整信号５４から１００より小さい予め設定した値（例えぱ、２０）を出力し、その値に比例した光量のレーザ光の出力を開姶する。なお、この値は０に近い方が試料への影響を小さくすることができるので、好ましい。図４の処理８から処理１１は、図２の処理８から処理１１と同じである。

なお、以上の実施の形態においては、蛍光を測定光としている場合について説明したが、本発明は反射光を測定光とする場合においても適用できる。又、共焦点顕微鏡に限らず、一般の走査型顕微鏡にも適用できる。

本発明の第１の実施の形態であるレーザ走査型共焦点顕微鏡の概要を示す図である。 図１に示したレーザ走査型共焦点顕微鏡の画像取得時の制御のフローを示すフローチャートである。 図１に示したレーザ走査型共焦点顕微鏡の画像取得時のタイムチャートである。 図１に示したレーザ走査型共焦点顕微鏡の画像取得時の制御のフローを示すフローチャートである。 図１に示したレーザ走査型共焦点顕微鏡の画像取得時のタイムチャートである。 従来のガルバノミラー型スキャナを使用した走査型共焦点顕微鏡の画像取得時のタイムチャートである。

符号の説明

１０…レーザ、１１…ダイクロイックミラー、１２…スキャナ、１３…対物レンズ、１４…試料、１５…ピンホール、１６…光検出器、２０…コントローラ、２１…ＣＰＵ、２２…キャプチャ制御部、２３…スキャナ制御部、２４…レーザ制御部、３０…コンピュータ、３１…ソフトウェア

Claims (2)

1. 光源からの光をスキャナにより２次元走査光に変えて、試料を前記走査光により点照明し、前記試料からの反射光又は蛍光を受光して、受光量と前記スキャナの駆動量を組み合わせて２次元画像を得る走査型顕微鏡であって、前記スキャナの水平走査にレゾナント型スキャナを使用しているものにおいて、１画面の画像を取得するのに要する時間をＴとするとき、ｎＴ（ｎは１以上の整数）の時間間隔毎に、１画面の画像を取得するのに必要な時間だけ、前記スキャナの走査に合わせて前記光源から前記画像取得に必要な光量の光を出射させ、かつ、前記ｎの数が可変であるような光源制御装置を有することを特徴とする走査型顕微鏡。
2. 前記ｎＴの時間間隔毎の１画面の画像を取得するのに必要な時間以外の時間においては、前記光源から出射される光の光量を前記画像取得に必要な光量より小さくするかゼロにすることを特微とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。

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