JP2005337729A - 顕微鏡観察方法、光刺激装置および顕微鏡観察装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 第1の波長の光を照射されることにより構造を変化させる物質を標本Aに導入するステップと、前記物質を導入された標本Aを顕微鏡観察装置14により観察しながら、物質の構造を変化させない第2の波長の可視光を標本Aに照射して、標本Aにおける光刺激部位を特定するステップと、特定された光刺激部位に、前記第1の波長の光を照射するステップとを備える顕微鏡観察方法を提供する。
【選択図】 図4
Description
この顕微鏡観察装置は、倒立型の落射蛍光顕微鏡であって、蛍光観察を行うためのキセノンランプと蛍光フィルタとからなる観察用光源の他に、該観察用光源の光軸の途中位置にダイクロイックミラーによって同軸に入射される光刺激用のスポット紫外光を形成するためのキセノンランプ、励起フィルタおよび視野絞りを備えている。
宮脇敦史 他1名、「Special Review 新規蛍光タンパク質kaedeを用いた光技術」,細胞工学,vol.22,No.3,2003,p316-326
しかしながら、細胞等の観察の場合には、細胞の健全性を維持するために、所定量の培地等の液体内に細胞を配置した状態で観察するのが一般的であり、対物レンズを固定して、観察対象物を移動させたのでは、液体内で細胞が流動して、観察状態が変化してしまう不都合がある。また、観察対象物を固定して対物レンズを移動させる場合には、対物レンズを含む光学系全体を移動させる必要があり、精度よく移動させるためには、装置が大がかりになり、またコストが高くつくという不都合がある。
本発明は、第1の波長の光を照射されることにより構造を変化させる物質を標本に導入するステップと、前記物質を導入された標本を顕微鏡観察装置により観察しながら、物質の構造を変化させない第2の波長の可視光を標本に照射して、標本における光刺激部位を特定するステップと、特定された光刺激部位に、前記第1の波長の光を照射するステップとを備える顕微鏡観察方法を提供する。
第1の光源と第2の光源とは、発生する光の波長が異なるので、色収差により焦点位置が変動する。そこで、焦点位置調節機構を作動させて各光ファイバの先端位置を調節することにより、いずれかの光源の焦点位置を調節したときは、それに合わせて他の光源の焦点位置を調節することが可能となる。
集光光学系と光軸結合手段とを着脱可能として両者をユニット化することにより、光軸結合手段に対して集光光学系を切り離し、他の焦点距離を有する集光光学系に交換可能とすることができる。
光軸結合手段により光軸を一致させられた光は光ファイバの一端面に入射される際に一旦結像され、光ファイバにより伝播された後に、他端面から出射される。焦点位置調節機構の作動により、各光源と光ファイバの出射端である他端面との距離が調節されるので、第1、第2の光源からの光は、光ファイバの出射端を発光点として出射される。したがって、第1の波長と第2の波長との相違によりこのままでは色収差が発生して、集光光学系による焦点位置にずれが生ずることになるため色収差補正手段の作動により、これを補正することにより、第1の光源からの光と第2の光源からの光を精度よく一致した位置に結像させることができる。
この発明によれば、同一の光源部から発せられた光がフィルタを通過させられることにより第1の波長の光および第2の波長の光として出射されることになる。したがって、光源を共通にして、光刺激位置の特定と、光刺激とを行うことができる。
本実施形態に係る光刺激装置1は、図1に示されるように、第1の波長の光を発生する第1の光源2と、第2の波長の光を発生する第2の光源3と、これらの光源2,3からの光をそれぞれ伝播する光ファイバ4,5と、各光ファイバ4,5を接続し、両光ファイバ4,5からの光軸を結合する光軸結合部6と、光軸結合部6により結合された光軸に各光ファイバ4,5から出射される光を集光して、光スポットを結像させる集光光学系7とを備えている。
本実施形態の光刺激装置1により、標本Aに対し光刺激を行う場合には、まず、標本Aに、第1の波長の光により構造を変化させる物質を導入する。物質は、例えば、蛍光タンパク質やケージド化合物のように、光刺激により機能して蛍光を発し、あるいは、他の蛍光物質を活性化させる物質である。
すなわち、第2の光源3からの可視光により特定された標本Aの任意の位置に、第1の光源2からの光によって正確にオプティカルマーキングを施すことができる。
本実施形態に係る顕微鏡観察装置30は、図8に示されるように、図4に示したものと同型のガリレオ型の蛍光実体顕微鏡観察装置であって、照明装置31からダイクロイックミラー32に続く光路に光刺激装置33を接続した構造のものである。
まず、ステージ21上に標本Aを載置する前に、焦点位置調節機構47を作動させて、各光ファイバ40,41の出射端40a,41aを光軸に沿って移動させることにより、対物レンズ18の前方に形成されている焦点位置を相互に一致するように調節しておく。また、標本Aに、第1の波長の光により構造を変化させる物質、例えば、蛍光タンパク質やケージド化合物を導入しておく。
次いで、第2の光源39を停止し、第1の光源38を作動させる。第1の光源38からは第1の波長の光が照射される。第1の光源38による光スポット位置と、第2の光源39による光スポット位置とは、焦点位置調節機構47およびスポット位置調節機構48の作動により、一致させられているので、第1の波長の光は、第2の波長の可視光により特定された箇所に正確に照射されて標本Aに光刺激を与えることができる。
すなわち、本実施形態に係る顕微鏡観察装置30によれば、光刺激を与えた状態から標本Aを移動させることなく、その光刺激箇所またはその周囲の観察を行うことができるという利点がある。
1,33 光刺激装置
2,38 第1の光源
3,39 第2の光源
4,5;40,41 光ファイバと、
4a,5a;23a;40a,41a 出射端(先端)
6,44 光軸結合部(光軸結合手段)
7 集光光学系
9A,9B,47 焦点位置調節機構
14,30 実体顕微鏡(顕微鏡観察装置)
17 接眼光学系
18;53 対物レンズ(対物光学系、集光光学系)
19 ズーム機構(集光光学系)
20,32 ダイクロイックミラー(光入射手段)
22 対物ユニット(集光光学系)
23 光ファイバ
26,27 色収差補正手段(焦点位置調節機構)
28 光源部
30′ 倒立顕微鏡観察装置(顕微鏡観察装置)
31 照明装置(照明光学系)
48 スポット位置調節機構(絞り移動手段)
49 絞り部材(絞り)
55 フィルタ
Claims (9)
- 第1の波長の光を照射されることにより構造を変化させる物質を標本に導入するステップと、
前記物質を導入された標本を顕微鏡観察装置により観察しながら、物質の構造を変化させない第2の波長の可視光を標本に照射して、標本における光刺激部位を特定するステップと、
特定された光刺激部位に、前記第1の波長の光を照射するステップとを備える顕微鏡観察方法。 - 前記顕微鏡観察装置が、第1の波長および第2の波長とは異なる第3の波長の励起光を標本に照射して、発生する蛍光を観察する蛍光顕微鏡からなる請求項1に記載の顕微鏡観察方法。
- 前記顕微鏡観察装置が、実体顕微鏡である請求項1または請求項2に記載の顕微鏡観察方法。
- 標本に導入した物質に照射してその構造を変化させる第1の波長の光を発生する第1の光源と、
前記第1の波長とは異なり、前記物質の構造を変化させない第2の波長の可視光を発生する第2の光源と、
これら第1の光源の光軸と第2の光源の光軸とを一致させる光軸結合手段と、
前記第1および第2の光源からの光を集光する集光光学系とを備える光刺激装置。 - 前記第1および第2の光源と前記光軸結合手段とをそれぞれ接続する光ファイバと、
前記光軸結合手段と各光ファイバとの接続位置において各光ファイバの先端位置を調節可能な焦点位置調節機構とを備える請求項4に記載の光刺激装置。 - 前記集光光学系が、前記光軸結合手段に着脱可能に取り付けられている請求項4または請求項5に記載の光刺激装置。
- 前記光軸結合手段により光軸を一致させられた光を集光光学系に導く光ファイバと、
該光ファイバの出射端と各光源との距離を調節可能な焦点位置調節機構と、
前記集光光学系に設けられ、第1の波長および第2の波長の光の収差を補正する色収差補正手段とを備える請求項4に記載の光刺激装置。 - 標本に導入した物質に照射してその構造を変化させる第1の波長の光を発生する第1の光源と、
前記第1の波長とは異なり、前記物質の構造を変化させない第2の波長の光を発生する第2の光源と、
これら第1および第2の光源からの光を集光する集光光学系とを備え、
前記第1および第2の光源が、光源部と、該光源部からの光の内、第1の波長の光または第2の波長の光を選択的に透過させるフィルタとから構成されている光刺激装置。 - 請求項4から請求項6のいずれかに記載の光刺激装置を備える顕微鏡観察装置であって、
標本に近接配置される対物光学系と、
該対物光学系に、照明光を入射させる照明光学系と、
標本からの戻り光を観察可能な接眼光学系とを備えるとともに、
該対物光学系に、光軸を一致させられた第1および第2の光源からの光を入射させる光入射手段と、
標本上に形成される第1および第2の光源の像を制限する絞りと、
該絞りを光軸に直交する方向に移動させる絞り移動手段とを備える顕微鏡観察装置。
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