JP4481082B2 - 顕微鏡観察方法および顕微鏡観察装置 - Google Patents

Description

この発明は、蛍光タンパク質やケージド化合物のように、光刺激により機能して蛍光を発し、あるいは、他の蛍光物質を活性化させる物質を利用したオプティカルマーキングに使用される顕微鏡観察方法および顕微鏡観察装置に関するものである。

従来、この種の光刺激装置を備えた顕微鏡観察装置として、例えば、非特許文献１に示される顕微鏡観察装置が知られている。
この顕微鏡観察装置は、倒立型の落射蛍光顕微鏡であって、蛍光観察を行うためのキセノンランプと蛍光フィルタとからなる観察用光源の他に、該観察用光源の光軸の途中位置にダイクロイックミラーによって同軸に入射される光刺激用のスポット紫外光を形成するためのキセノンランプ、励起フィルタおよび視野絞りを備えている。

この顕微鏡観察装置によれば、視野絞り、集光レンズおよび対物レンズ等の光学系を精度よく調節しておくことが可能であり、これにより、スポット紫外光を蛍光観察の視野の中心位置に精度よく設定することができる。したがって、細胞等の観察対象物の内、光刺激を与えたい箇所を視野の中心位置に一致させて、スポット紫外光を照射することにより、目的の細胞を的確に光刺激して、オプティカルマーキングを行うことができる。
宮脇敦史 他１名、「Special Review 新規蛍光タンパク質kaedeを用いた光技術」，細胞工学，vol.22，No.3，2003，p316-326

この場合において、非特許文献１の顕微鏡観察装置では、観察対象物における光刺激箇所は視野の中心の１点に限られるので、その箇所に正確に光刺激を与えたい場合には、対物レンズと観察対象物との光軸に直交する方向に沿う相対的な位置関係をずらす必要がある。
しかしながら、細胞等の観察の場合には、細胞の健全性を維持するために、所定量の培地等の液体内に細胞を配置した状態で観察するのが一般的であり、対物レンズを固定して、観察対象物を移動させたのでは、液体内で細胞が流動して、観察状態が変化してしまう不都合がある。また、観察対象物を固定して対物レンズを移動させる場合には、対物レンズを含む光学系全体を移動させる必要があり、精度よく移動させるためには、装置が大がかりになり、またコストが高くつくという不都合がある。

もう１つの方法として、視野絞りを光軸に直交する方向に移動させることが考えられる。この方法によれば、上記問題点はないが、スポット紫外光の照射位置が、視野内において任意に移動するため、視野の中心位置に固定されている上記各方法とは異なり、その照射位置を正確に特定することが困難になるという問題がある。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、顕微鏡観察を行いながら、その視野内において、光刺激用の光の照射位置を特定し、かつ、特定された照射位置を精度よく光刺激することができる顕微鏡観察方法、光刺激装置および顕微鏡観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、第１の波長の光を照射されることにより構造を変化させる物質を標本に導入するステップと、前記物質を導入された標本を実体顕微鏡により観察しながら、物質の構造を変化させない第２の波長の可視光を標本に照射して、標本における光刺激部位を特定するステップと、特定された光刺激部位に、前記第１の波長の光を照射するステップと、前記第１の波長の光と前記の光軸を一致させる光軸結合手段と、前記第１の波長の光と前記第２の波長の可視光をそれぞれ伝播する各光ファイバとの接続位置において、前記各光ファイバの先端位置を焦点位置調節機構により調節するステップと、前記第１の波長および第２の波長とは異なる第３の波長の励起光を標本に照射して、発生する蛍光を前記実体顕微鏡により観察するステップとを備える顕微鏡観察方法を提供する。

この発明によれば、物質を導入された標本を観察しながら第２の波長の可視光を照射する。第２の波長の可視光が標本に照射されると、第２の波長の可視光が顕微鏡観察装置による観察の視界中に配置されるので、観察画像を見ながら光刺激部位を容易に特定することが可能となる。第２の波長の可視光は、標本に導入された物質の構造を変化させることのない光であるため、オプティカルマーキングを行うことなく、光刺激部位を特定することができる。そして、光刺激部位が特定された後に、特定された光刺激部位に第１の波長の光を照射することにより、精度よく光刺激部位を光刺激してオプティカルマーキングを行うことが可能となる。

上記発明においては、前記顕微鏡観察装置が、第１の波長および第２の波長とは異なる第３の波長の励起光を標本に照射して、発生する蛍光を観察する蛍光顕微鏡からなることが好ましい。蛍光観察用の励起光の波長を第１、第２の波長と異ならせることにより、光刺激する光刺激部位の特定、光刺激および標本の蛍光観察を、それぞれ独立して行うことが可能となる。

また、上記発明においては、前記顕微鏡観察装置が、実体顕微鏡であることが好ましい。実体顕微鏡によれば、視野が広く、光刺激部位の配置の自由度が高いため、光刺激を行う前に、光刺激部位を精度よく特定しておくことが必要となる。本発明によれば、広い視野内において光刺激部位を正確に光刺激することができる。
また、上記発明においては、スポット位置調節機構により前記光軸結合手段をその結合された光軸に直交する方向に移動させるステップを備えることが好ましい。
また、上記発明においては、前記実体顕微鏡に近接して配置され、前記焦点位置調節機構と前記光軸結合手段と光スポットを集光させる集光光学系を含む光刺激装置をマニピュレータにより動作させて、前記第２の波長の可視光の光スポットを前記実体顕微鏡の視野内の所望の光刺激位置に位置決めするステップを備えることが好ましい。

また、本発明は、標本に導入した物質に照射してその構造を変化させる第１の波長の光を発生する第１の光源と、前記第１の波長とは異なり、前記物質の構造を変化させない第２の波長の可視光を発生する第２の光源と、これら第１の光源の光軸と第２の光源の光軸とを一致させる光軸結合手段と、前記第１および第２の光源と前記光軸結合手段とをそれぞれ接続する光ファイバと、前記光軸結合手段と各光ファイバとの接続位置において各光ファイバの先端位置を調節可能な焦点位置調節機構と、前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる第３の波長の励起光を前記標本に照射する第３の光源と、前記標本で発生する蛍光を観察する実体顕微鏡とを備える顕微鏡観察装置を提供する。

本発明によれば、第２の光源を作動させて第２の波長の可視光を照射し、集光光学系の作動により標本上にスポットを形成するように照射すると、標本内に導入されている物質の構造を変化させることなく、標本上に指標を形成することが可能となる。光軸結合手段の作動により、第１の光源からの光の光軸と、第２の光源からの可視光の光軸とが一致させられているので、第２の光源からの可視光により光刺激部位を特定した後に、第１の光源からの光を照射すると、第１の光源からの光が、第２の光源によって特定された光刺激部位に正確に入射されることになる。

上記発明においては、前記第１および第２の光源と前記光軸結合手段とをそれぞれ接続する光ファイバと、前記光軸結合手段と各光ファイバとの接続位置において各光ファイバの先端位置を調節可能な焦点位置調節機構とを備えることが好ましい。
第１の光源と第２の光源とは、発生する光の波長が異なるので、色収差により焦点位置が変動する。そこで、焦点位置調節機構を作動させて各光ファイバの先端位置を調節することにより、いずれかの光源の焦点位置を調節したときは、それに合わせて他の光源の焦点位置を調節することが可能となる。
また、上記発明においては、前記光軸結合手段をその結合された光軸に直交する方向に移動させるスポット位置調節機構を備えることが好ましい。
また、上記発明においては、前記焦点位置調節機構と、前記第１の波長の光および前記第２の波長の可視光の光軸を一致させる光軸結合手段と、前記第１の波長の光および前記第２の波長の可視光を集光する集光光学系とを含んで光刺激装置を構成し、該光刺激装置を前記実体顕微鏡に近接して配置し、マニピュレータにより動作させることが好ましい。

また、上記発明においては、前記集光光学系が、前記光軸結合手段に着脱可能に取り付けられていることが好ましい。
集光光学系と光軸結合手段とを着脱可能として両者をユニット化することにより、光軸結合手段に対して集光光学系を切り離し、他の焦点距離を有する集光光学系に交換可能とすることができる。

また、上記発明においては、前記光軸結合手段により光軸を一致させられた光を集光光学系に導く光ファイバと、該光ファイバの出射端と各光源との距離を調節可能な焦点位置調節機構と、前記集光光学系に設けられ、第１の波長および第２の波長の光の収差を補正する色収差補正手段とを備えることが好ましい。
光軸結合手段により光軸を一致させられた光は光ファイバの一端面に入射される際に一旦結像され、光ファイバにより伝播された後に、他端面から出射される。焦点位置調節機構の作動により、各光源と光ファイバの出射端である他端面との距離が調節されるので、第１、第２の光源からの光は、光ファイバの出射端を発光点として出射される。したがって、第１の波長と第２の波長との相違によりこのままでは色収差が発生して、集光光学系による焦点位置にずれが生ずることになるため色収差補正手段の作動により、これを補正することにより、第１の光源からの光と第２の光源からの光を精度よく一致した位置に結像させることができる。

また、本発明は、標本に導入した物質に照射してその構造を変化させる第１の波長の光を発生する第１の光源と、前記第１の波長とは異なり、前記物質の構造を変化させない第２の波長の光を発生する第２の光源と、これら第１および第２の光源からの光を集光する集光光学系とを備え、前記第１および第２の光源が、光源部と、該光源部からの光の内、第１の波長の光または第２の波長の光を選択的に透過させるフィルタとから構成されている光刺激装置を提供する。
この発明によれば、同一の光源部から発せられた光がフィルタを通過させられることにより第１の波長の光および第２の波長の光として出射されることになる。したがって、光源を共通にして、光刺激位置の特定と、光刺激とを行うことができる。

また、本発明は、標本に近接配置される対物光学系と、該対物光学系に、照明光を入射させる照明光学系と、標本からの戻り光を観察可能な接眼光学系とを備えるとともに、該対物光学系に、光軸を一致させられた第１および第２の光源からの光を入射させる光入射手段と、標本上に形成される第１および第２の光源の像を制限する絞りと、該絞りを光軸に直交する方向に移動させる絞り移動手段とを備える顕微鏡観察装置を提供する。

照明光学系から発せられた照明光が、対物光学系に入射されると、対物光学系によって標本上に結像される。その戻り光は、対物光学系を介して戻り、接眼光学系により観察することができる。一方、対物光学系には、光軸を一致させられた第１および第２の光源からの光が光入射手段によって入射させられ、標本上に第１および第２の光源の像が形成される。これらの光源の像は、絞りによって制限されて光スポットとなる。また、絞り移動手段の作動により、絞りを光軸に直交する方向に移動することにより、光スポット位置を標本上において任意の位置に移動させることができる。

この場合において、第２の光源からは、物質の構造を変化させない可視光が発せられるので、標本からの戻り光とともに可視光による光スポットの反射光が接眼光学系により観察されることになる。したがって、光スポットの位置を目視により確認しながら絞り移動手段により、所望の光刺激位置に光スポットを移動させることができる。そして、光スポット位置が設定されたところで、第１の光源から物質の構造を変化させる第１の波長の光を入射させることにより、光スポットによって特定された光刺激位置に正確に光刺激用の光を照射して、精度よく観察を行うことができる。

この発明によれば、標本に導入した物質の構造を変化させることなく、光刺激位置を特定するとともに、特定された光刺激位置に光刺激用の光を正確に照射することができる光刺激装置を提供することを目的としている。

以下、本発明の一実施形態に係る光刺激装置について、図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係る光刺激装置１は、図１に示されるように、第１の波長の光を発生する第１の光源２と、第２の波長の光を発生する第２の光源３と、これらの光源２，３からの光をそれぞれ伝播する光ファイバ４，５と、各光ファイバ４，５を接続し、両光ファイバ４，５からの光軸を結合する光軸結合部６と、光軸結合部６により結合された光軸に各光ファイバ４，５から出射される光を集光して、光スポットを結像させる集光光学系７とを備えている。

第１の光源２は、標本Ａに導入する物質、すなわち、蛍光タンパク質やケージド化合物のように、光刺激により機能して蛍光を発し、あるいは、他の蛍光物質を活性化させる物質の構造を変化させる波長の光を発生するようになっている。一方、第２の光源３は、これらの物質の構造を変化させない波長の光を発生するようになっている。

前記光軸結合部６には、第１の光源２からの光は透過し、第２の光源３からの光は反射するダイクロイックミラー８が配置され、ダイクロイックミラー８の後段において、第１の光源２からの光の光軸と第２の光源３からの光の光軸とが一致させられるようになっている。また、光軸結合部６には、各光ファイバ４，５の出射端４ａ，５ａの位置調節を可能にする位置調節機構９Ａ，９Ｂが設けられている。

位置調節機構９Ａは、具体的には、図２に示されるように、集光光学系７を構成する円筒状の装置本体１３の外面に長手軸方向に摺動可能に摺動筒部６０を取り付け、該摺動筒部６０に光ファイバ４を接続するコネクタ６１を固定することにより構成されている。また、位置調節機構９Ｂは、前記装置本体１３に固定した中間ベース６２にネジ６３によりブラケット６４を取り付け、該ブラケット６４に光ファイバ５を接続するコネクタ６５を固定することにより構成されている。

第１の位置調節機構９Ａによる光ファイバ４の出射端４ａの光軸方向の位置調節は、摺動筒部６０を装置本体１３に対して摺動させることにより行われるようになっている。また、第２の位置調節機構９Ｂによる光ファイバ５の出射端５ａの光軸方向の位置調節は、ネジ６３を緩めて中間ベース６２とブラケット６４との隙間に所定厚さのシム（図示略）を挿入することにより行われるようになっている。また、光軸を挟んだ両側に配されるシムの厚さを異ならせることにより、光ファイバ５の光軸の傾きを調節することができるようになっている。また、ネジ６３を緩めた状態で、ブラケット６４に設けたネジ６３用の貫通孔（図示略）とネジ６３との隙間の範囲内において中間ベース６２に対してブラケット６４を光軸に直交する方向に位置調節することができるようになっている。

また、コネクタ６１，６５は摺動筒部６０またはブラケット６４に対して傾斜して取り付けられている。その傾斜角度は、図３に示されるように、約４°であり、光ファイバ４，５の出射端４ａ，５ａは、さらに約８°傾斜してカットされている。これにより、光ファイバ４，５内を伝播されてきた光の一部が、出射端４ａ，５ａの内部において反射して戻ることを防止できるようになっている。

光ファイバ４，５の出射端４ａ，５ａと、集光光学系７の焦点位置とは相互に共役な位置に配置されているので、位置調節機構９Ａ，９Ｂの作動により、各光ファイバ４，５の出射端４ａ，５ａを光軸方向に移動させ、集光光学系７の前方に配置されている焦点位置１０を光ファイバ４，５毎に光軸方向に調節することができるようになっている。また、位置調節機構９Ｂの作動により、各光ファイバ５の出射端５ａを光軸に直交する方向に移動させて、各光源３からの光の焦点位置１０を光軸に交差する方向に位置調節することができるようになっている。なお、位置調節機構９Ａに光軸に直交する方向の位置調節を可能とする機構を設けてもよい。

集光光学系７は、前記光軸結合部６において結合された光軸上に各光ファイバ４，５の出射端４ａ，５ａから発せられる光を平行光に変換するコリメートレンズ１１と、その平行光を集光して、所定位置に結像させる対物レンズ１２とを備えている。これらコリメートレンズ１１および対物レンズ１２は円筒状の装置本体１３内に収容されている。

本実施形態に係る光刺激装置１は、例えば、図４に示されるように、実体顕微鏡１４等の顕微鏡観察装置に近接して配置されたマニピュレータ１５に固定されており、マニピュレータ１５の作動によりその位置および姿勢を任意に設定できるようになっている。図２に示す実体顕微鏡１４は、ガリレオ型の実体顕微鏡１４であって、照明装置１６と、双眼の接眼光学系１７と、大きな対物レンズ１８と、ズーム機構１９とを備えている。また、接眼光学系１７からズーム機構１９に向かう光路上には照明装置１６からの励起光を反射し、標本Ａからの蛍光を透過するダイクロイックミラー２０が配置されている。標本Ａはステージ２１上に載置されるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る光刺激装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態の光刺激装置１により、標本Ａに対し光刺激を行う場合には、まず、標本Ａに、第１の波長の光により構造を変化させる物質を導入する。物質は、例えば、蛍光タンパク質やケージド化合物のように、光刺激により機能して蛍光を発し、あるいは、他の蛍光物質を活性化させる物質である。

次いで、標本Ａへの光の照射に先立って、位置調節機構９Ａ，９Ｂを作動させて、第１の光源２から光ファイバ４、光軸結合部６および集光光学系７を介して第１の光源２の像を結像する結像位置と、第２の光源３から光ファイバ５、光軸結合部６および集光光学系７を介して第２の光源３の像を結像する結像位置とを一致させておく。

この状態で、第１の光源２を停止し、第２の光源３のみを作動させて、第２の波長の光を出射させた状態で、マニピュレータ１５を作動させて、第２の光源３の像を実体顕微鏡１４の視野内に配置する。第２の光源３からの光は可視光であるので、作業者は、容易に実体顕微鏡１４の視野内に配置することができる。これにより、実体顕微鏡１４を用いて、標本Ａの状態および標本Ａ上に形成される光スポットの両方が観察される。作業者は、実体顕微鏡１４の視野内において第２の光源３の像が結像するようにマニピュレータ１５を操作するとともに、視野内の所望の光刺激位置に第２の光源３の像からなる光スポットを位置決めする。

第２の光源３からの光は可視光であるので、作業者は容易に所望の光刺激位置にその光スポットを位置決めすることができる。また、第２の光源３からの光は、標本Ａに導入された物質の構造を変化させない波長の光であるから、標本Ａ上に結像させても物質の構造が変化せず、蛍光を発したり、他の物質を活性化させたりすることなく、光刺激位置を特定することが可能となる。

次いで、第２の光源３を停止し、第１の光源２からの光を標本Ａ上に結像させる。第１の光源２からの光の結像位置は、位置調節機構９Ａ，９Ｂの作動によって、第２の光源３からの光の結像位置に予め一致させられており、しかも、光軸結合部６によって、両光源２，３からの光の光軸は一致させられているので、第１の光源２からの光は、第２の光源３からの光の光スポットが配置されていた光刺激位置に正確に一致した位置に結像されることになる。その結果、第２の光源３からの光によって特定した光刺激位置に正確に第１の光源２からの光を照射することができる。

第１の光源２からは、標本Ａ内に導入した物質の構造を変化させる波長の光が出射されているので、第１の光源２から発せられた光によって物質の構造が変化し、その後行われる蛍光顕微鏡による観察において、照射される励起光によってその物質が蛍光を発するようになる。あるいは、他の物質を活性化させて蛍光を発せさせるようになる。

例えば、標本Ａに導入した物質が、蛍光タンパク質カエデの場合には、第１の光源２から発せられた第１の波長の光を照射する時間を調節することにより、その後の蛍光顕微鏡による観察において、発生する蛍光の色を緑色から黄色に、黄色から赤色に変化させることができるようになる。また、標本Ａに導入した物質が蛍光タンパク質ＰＡ−ＧＦＰの場合には、第１の波長の光を照射することにより、その後の蛍光顕微鏡による観察において緑色の蛍光を発するようになる。

さらに、標本Ａに導入した物質がケージドカルシウムである場合には、第１の光源２から発せられた第１の波長の光を照射することにより、ケージド化合物からカルシウムイオンが解除されて放出され、周囲の細胞がカルシウムイオンによって刺激を受けることになる。その結果、その後の蛍光顕微鏡による観察において、周囲の細胞あるいは、同じく導入されていたカルシウム指示薬が蛍光を発するようになる。また、標本Ａに導入した物質がケージドＮＯ化合物である場合には、第１の光源２から発せられた第１の波長の光を照射することにより、ケージドＮＯ化合物からＮＯが放出され、周囲の細胞を刺激することができるようになる。
すなわち、第２の光源３からの可視光により特定された標本Ａの任意の位置に、第１の光源２からの光によって正確にオプティカルマーキングを施すことができる。

なお、上記実施形態においては、集光光学系７として、装置本体１３内にコリメートレンズ１１と対物レンズ１２とを収容配置したが、これに代えて、図５に示されるように、装置本体１３内にコリメートレンズ１１を配置し、対物レンズ１２は、対物レンズユニット２２として装置本体１３に着脱可能に設けることにしてもよい。このようにすることで、焦点距離の異なる対物レンズユニット２２を交換して使用することが可能となる。

また、図６に示されるように、コリメートレンズ１１および対物レンズ１２を有する集光光学系７と光軸結合部６とを分離して光ファイバ２３で結合してもよい。光軸結合部６内には、コリメートレンズ２４および集光レンズ２５を配置し、光源２，３からの光が光ファイバ２３の端面２３ｂに集光されるようになっている。この場合には、光ファイバ２３の端面が、第１の光源２および第２の光源３の共通の像面となるため、同一のコリメートレンズ１１および対物レンズ１２では色収差により焦点位置がずれてしまう。このため、集光光学系７には、色収差を補正する色収差補正手段２６，２７が設けられている。色収差補正手段２６は、例えば、照射する光の波長に応じてコリメートレンズ１１または出射端２３ａを光軸方向に移動させる移動機構である。

このようにすることで、色収差補正手段２６という別個の部品が必要となる一方、光源２，３から集光光学系７に接続する光ファイバ２３を１本にすることができる。したがって、集光光学系７のとり回しが容易となり、標本Ａに対して自由な角度および位置から光刺激を行うことが可能となるという利点を有する。

また、図７に示されるように、単一の光源（光源部）２８と、第１の波長の光と第２の波長の光とを選択的に出射可能にするフィルタ５５とを用いることとしてもよい。図中符号２９は集光レンズである。フィルタ５５を選択することにより、光刺激位置の特定を行う場合には第２の波長の光を出射させ、光刺激を行う場合には第１の波長の光を出射させることにより上記と同様の効果を達成することができる。光源を単一にすることができるので装置のコンパクト化を図ることができる。

次に、本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察装置３０について、図８を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０は、図８に示されるように、図４に示したものと同型のガリレオ型の蛍光実体顕微鏡観察装置であって、照明装置３１からダイクロイックミラー３２に続く光路に光刺激装置３３を接続した構造のものである。

照明装置３１は、図８に示されるように、キセノンランプ３４と、集光レンズ３５と、励起フィルタターレット３６とコリメートレンズ３７とを備えている。キセノンランプ３４から発せられた光は、励起フィルタターレット３６を通過させられることにより、所望の波長を有する励起光としてコリメートレンズ３７に入射させられるようになっている。励起光の波長は、後述する光刺激装置３３の第１の波長および第２の波長とは異なる波長であり、いずれも物質の構造を変化させない波長である。また、励起フィルタターレット３６には、キセノンランプ３４からの光をそのまま、可視光としてコリメートレンズ３７に入射させる貫通孔（図示略）も含まれている。

本実施形態における光刺激装置３３は、第１の波長の光を発生する第１の光源３８と、第２の波長の光を発生する第２の光源３９と、これらの光源３８，３９からの光をそれぞれ伝播する光ファイバ４０，４１と、各光ファイバ４０，４１を接続し、両光ファイバ４０，４１からの光軸を結合するダイクロイックミラー４２および該ダイクロイックミラー４２により結合された光軸に各光ファイバ４０，４１から出射される光を集光する集光レンズ４３を備える光軸結合部４４と、集光レンズ４３により集光された光を平行光にするコリメートレンズ４５と、平行光を照明装置３１の光軸に入射させるダイクロイックミラー４６とを備えている。

第１の光源３８は、標本Ａに導入する物質、すなわち、蛍光タンパク質やケージド化合物のように、光刺激により機能して蛍光を発し、あるいは、他の蛍光物質を活性化させる物質の構造を変化させる波長の光を発生するようになっている。一方、第２の光源３９は、これらの物質の構造を変化させない波長の光を発生するようになっている。

前記光軸結合部４４は、各光ファイバ４０，４１の出射端４０ａ，４１ａの位置をそれぞれの光軸方向および該光軸方向に直交する方向に調整可能な焦点位置調節機構４７と、光軸結合部４４をその結合された光軸に直交する方向に移動させるスポット位置調節機構４８とを備えている。スポット位置調節機構４８は、集光レンズ４３とコリメートレンズ４５との間に配置された絞り部材４９を光軸に直交する方向に２次元的に移動させるための、直交する２軸の直線移動機構であり、ボールネジやリニアガイドのような任意の機構により構成すればよい。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０による顕微鏡観察方法について、以下に説明する。
まず、ステージ２１上に標本Ａを載置する前に、焦点位置調節機構４７を作動させて、各光ファイバ４０，４１の出射端４０ａ，４１ａを光軸に沿って移動させることにより、対物レンズ１８の前方に形成されている焦点位置を相互に一致するように調節しておく。また、標本Ａに、第１の波長の光により構造を変化させる物質、例えば、蛍光タンパク質やケージド化合物を導入しておく。

次いで、本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０により観察を行うには、照明装置３１の励起フィルタターレット３６の貫通孔を選択して、キセノンランプ３４からの光をそのままコリメートレンズ３７に入射させ、ダイクロイックミラー３２、ズーム機構１９および対物レンズ１２を介して標本Ａに照射し、標本Ａからの反射光を接眼光学系１７において観察する。

この状態で、第１の光源３８を停止したままで、第２の光源３９のみから第２の波長の可視光を出射させる。これにより、接眼光学系１７により観察している作業者には、標本Ａの実体像とともに、第２の光源３９による光スポットが、観察されることになる。作業者は、接眼光学系１７により観察しながら、スポット位置調節機構４８を作動させ、光軸結合部４４をその結合後の光軸に対して直交する方向に移動させる。これにより、接眼光学系１７の視野内の光スポットが、標本Ａの実体像上で移動させられるので、作業者は、実体像上の光刺激を与えたい箇所に光スポットを配置でき、その位置でスポット位置調節機構４８を停止しておく。

第２の波長の可視光は、標本Ａに導入されている物質の構造を変化させることのない光であるので、物質にオプティカルマーキングを生じさせることなく、光刺激を与えたい箇所を特定することができる。
次いで、第２の光源３９を停止し、第１の光源３８を作動させる。第１の光源３８からは第１の波長の光が照射される。第１の光源３８による光スポット位置と、第２の光源３９による光スポット位置とは、焦点位置調節機構４７およびスポット位置調節機構４８の作動により、一致させられているので、第１の波長の光は、第２の波長の可視光により特定された箇所に正確に照射されて標本Ａに光刺激を与えることができる。

標本Ａに導入した物質の種類に応じて、所定時間にわたり光刺激を与えた後に、第１の光源３８および第２の光源３９を停止状態として、照明装置３１において蛍光フィルタターレット３６の蛍光フィルタを選択し、照明装置３１から励起光を標本Ａに照射する。これにより、光刺激を与えた箇所から蛍光を発生させることができる。
すなわち、本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０によれば、光刺激を与えた状態から標本Ａを移動させることなく、その光刺激箇所またはその周囲の観察を行うことができるという利点がある。

なお、本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０においては、実体顕微鏡観察装置を採用し、その照明装置３１と対物レンズ１２との間に光刺激装置３３を接続することとしたが、これに代えて、図９に示されるように、倒立顕微鏡観察装置３０′に、同様の光刺激装置３３を備えたものとすることもできる。図中符号５０は集光レンズ、符号５１は蛍光フィルタ、符号５２はＣＣＤカメラ、符号５３は対物レンズ、符号５４はスライドガラスを示している。

本発明の一実施形態に係る光刺激装置を示す模式図である。 図１の光刺激装置の位置調節機構を説明する部分的な縦断面図である。 図１の光刺激装置における各光ファイバの出射端の傾斜を示す図である。 図１の光刺激装置を適用する顕微鏡観察装置を示す模式図である。 図１の光刺激装置の変形例を示す模式図である。 図１の光刺激装置の他の変形例を示す模式図である。 図１の光刺激装置の他の変形例を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察装置を示す模式図である。 図８の顕微鏡観察装置の変形例を示す模式図である。

符号の説明

Ａ 標本
１，３３ 光刺激装置
２，３８ 第１の光源
３，３９ 第２の光源
４，５；４０，４１ 光ファイバと、
４ａ，５ａ；２３ａ；４０ａ，４１ａ 出射端（先端）
６，４４ 光軸結合部（光軸結合手段）
７ 集光光学系
９Ａ，９Ｂ，４７ 焦点位置調節機構
１４，３０ 実体顕微鏡（顕微鏡観察装置）
１７ 接眼光学系
１８；５３ 対物レンズ（対物光学系、集光光学系）
１９ ズーム機構（集光光学系）
２０，３２ ダイクロイックミラー（光入射手段）
２２ 対物ユニット（集光光学系）
２３ 光ファイバ
２６，２７ 色収差補正手段（焦点位置調節機構）
２８ 光源部
３０′ 倒立顕微鏡観察装置（顕微鏡観察装置）
３１ 照明装置（照明光学系）
４８ スポット位置調節機構（絞り移動手段）
４９ 絞り部材（絞り）
５５ フィルタ

Claims (9)

1. 第１の波長の光を照射されることにより構造を変化させる物質を標本に導入するステップと、
   前記物質を導入された標本を実体顕微鏡により観察しながら、物質の構造を変化させない第２の波長の可視光を標本に照射して、標本における光刺激部位を特定するステップと、
   特定された光刺激部位に、前記第１の波長の光を照射するステップと、
   前記第１の波長の光と前記第２の波長の可視光の光軸を一致させる光軸結合手段と、前記第１の波長の光と前記第２の波長の可視光をそれぞれ伝播する各光ファイバとの接続位置において、前記各光ファイバの先端位置を焦点位置調節機構により調節するステップと、
   前記第１の波長および第２の波長とは異なる第３の波長の励起光を標本に照射して、発生する蛍光を前記実体顕微鏡により観察するステップと
   を備える顕微鏡観察方法。
2. スポット位置調節機構により前記光軸結合手段をその結合された光軸に直交する方向に移動させるステップを備える請求項１に記載の顕微鏡観察方法。
3. 前記実体顕微鏡に近接して配置され、前記焦点位置調節機構と前記光軸結合手段と光スポットを集光させる集光光学系を含む光刺激装置をマニピュレータにより動作させて、前記第２の波長の可視光の光スポットを前記実体顕微鏡の視野内の所望の光刺激位置に位置決めするステップを備える請求項１に記載の顕微鏡観察方法。
4. 標本に導入した物質に照射してその構造を変化させる第１の波長の光を発生する第１の光源と、
   前記第１の波長とは異なり、前記物質の構造を変化させない第２の波長の可視光を発生する第２の光源と、
   これら第１の光源の光軸と第２の光源の光軸とを一致させる光軸結合手段と、
   前記第１および第２の光源と前記光軸結合手段とをそれぞれ接続する光ファイバと、
   前記光軸結合手段と各光ファイバとの接続位置において各光ファイバの先端位置を調節可能な焦点位置調節機構と、
   前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる第３の波長の励起光を前記標本に照射する第３の光源と、
   前記標本で発生する蛍光を観察する実体顕微鏡と
   を備える顕微鏡観察装置。
5. 前記光軸結合手段をその結合された光軸に直交する方向に移動させるスポット位置調節機構を備える請求項４に記載の顕微鏡観察装置。
6. 前記焦点位置調節機構と、前記第１の波長の光および前記第２の波長の可視光の光軸を一致させる光軸結合手段と、前記第１の波長の光および前記第２の波長の可視光を集光する集光光学系とを含んで光刺激装置を構成し、該光刺激装置を前記実体顕微鏡に近接して配置し、マニピュレータにより動作させる請求項４に記載の顕微鏡観察装置。
7. 前記集光光学系が、前記光軸結合手段に着脱可能に取り付けられている請求項６に記載の顕微鏡観察装置。
8. 前記光軸結合手段により光軸を一致させられた光を集光光学系に導く光ファイバと、
   該光ファイバの出射端と各光源との距離を調節可能な焦点位置調節機構と、
   前記集光光学系に設けられ、前記第１の波長の光および前記第２の波長の可視光の収差を補正する色収差補正手段と
   を備える請求項４から７のいずれかに記載の顕微鏡観察装置。
9. 標本に近接配置される対物光学系と、
   該対物光学系に、照明光を入射させる照明光学系と、
   標本からの戻り光を観察可能な接眼光学系とを備えるとともに、
   該対物光学系に、光軸を一致させられた第１および第２の光源からの光を入射させる光入射手段と、
   標本上に形成される第１および第２の光源の像を制限する絞りと、
   該絞りを光軸に直交する方向に移動させる絞り移動手段と
   を備える請求項４から８のいずれかに記載の顕微鏡観察装置。

Images