JP2010091679A

JP2010091679A - 顕微鏡装置とこれに用いられる蛍光キューブ

Info

Publication number: JP2010091679A
Application number: JP2008259816A
Authority: JP
Inventors: Sadahiro Tomioka; 貞祐冨岡; Yumiko Ouchi; 由美子大内
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2008-10-06
Publication date: 2010-04-22

Abstract

【課題】蛍光顕微鏡に使用されている蛍光キューブを切換えることで、共焦点顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡に切換え可能な顕微鏡装置を提供すること。
【解決手段】レーザ光源からのレーザ光束を標本１２に照射する照明光学系と、標本１２からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、照明光学系内に配設され、レーザ光束を標本１２へ導く複数の蛍光キューブと、対物レンズ１６とを備えた顕微鏡装置１において、蛍光キューブの少なくとも１つ６１は、レーザ光束の主光線を照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつレーザ光束を対物レンズ１６の瞳位置Ｐの光軸から離れた所定の領域内に集光するための光学手段６０を有し、光学手段６０は、少なくとも２つの楔プリズム６２、６３と集光レンズ６４とを有する顕微鏡装置１。
【選択図】図３

Description

本発明は、蛍光観察可能な顕微鏡装置と、これに用いられる蛍光キューブに関する。

共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡は、生体細胞等の観察方法として広く利用されている。両者は共にレーザ光源を使用する点で共通しており、共焦点顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡に使用できる顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特開２００５−１２１７９６号公報

従来の顕微鏡では、共焦点顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡に切換える際に、対物レンズの瞳位置の全反射条件領域にレーザ光を集光させるための光学部材を照明光学系内に挿入する必要があり、切換えの為に大掛かりな切換え機構が必要となり、顕微鏡の大型化やコストが高くなるという問題がある。

上記課題を解決するため、本発明は、レーザ光源からのレーザ光束を標本に照射する照明光学系と、前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記照明光学系内に配設され、前記レーザ光束を前記標本へ導く複数の蛍光キューブと、対物レンズとを備えた顕微鏡装置において、前記蛍光キューブの少なくとも１つは、前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の前記光軸から離れた所定の領域内に集光するための光学手段を有し、当該光学手段は、少なくとも２つの楔プリズムと集光レンズとを有し、当該光学手段を有する前記蛍光キューブを光路に挿入した際、前記レーザ光束の主光線を前記光軸に対して所定量移動するように前記少なくとも２つの楔プリズムの透過光路長を制御する制御手段と、前記少なくとも２つの楔プリズムから射出される光束を前記対物レンズの瞳面内の、前記光軸から離れた所定の領域内に集光するために、前記集光レンズを移動する移動手段とを備えることを特徴とする顕微鏡装置を提供する。

また、本発明は、蛍光顕微鏡の照明光学系の光路中に交換可能に配置される蛍光キューブにおいて、当該蛍光キューブが前記蛍光顕微鏡の光路中に配置されたときに、対物レンズを介して標本に照射されるレーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の前記光軸から離れた所定の領域内に集光するための光学手段を有し、当該光学手段は、前記レーザ光束の主光線を前記光軸に対して所定量移動するように制御手段により透過光路長が制御される少なくとも２つの楔プリズムと、当該少なくとも２つの楔プリズムから射出される光束を前記対物レンズの瞳面内の前記光軸から離れた所定の領域内に集光するための集光レンズと、前記光軸方向および／または前記光軸と垂直な方向に前記集光レンズを移動させる移動手段とを有することを特徴とする蛍光キューブを提供する。

本発明によれば、蛍光顕微鏡に使用されている蛍光キューブを切換えることで、共焦点顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡に切換え可能な顕微鏡装置を提供することができる。また、共焦点顕微鏡から全反射蛍光顕微鏡に切換え可能な蛍光キューブを提供することができる。

以下、発明の実施の形態にかかる顕微鏡装置について図面を参照しつつ説明する。

（第１実施の形態）
図１は第１実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。図２は第１実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。図３は全反射顕微鏡に切換えた際の顕微鏡装置の光学系を示す。図４は光学手段の作用を説明する図であり、全反射照明状態における一組の楔プリズムからなる光学部材の作用を説明する図である。なお、図２、図３では、後述する透過照明光学系を省略している。

図１から図４において、顕微鏡装置１は、倒立型蛍光顕微鏡本体２（以後、単に顕微鏡と記す）と顕微鏡２に搭載されている各種装置を制御するパーソナルコンピュータ等からなる制御装置３（以後、ＰＣと記す）とから構成されている。

顕微鏡２は、ステージ１１に載置された標本１２を、透過照明光源１３からの光で透過照明光学系１４を介して照明し、標本１２を透過した光をリボルバ１５に搭載された対物レンズ１６で集光する。

対物レンズ１６で集光された光は、図２に示すように、結像光学系１７の結像レンズ１８とミラーＭ１を介して一次像面１７ａに結像される。一次像面１７ａに結像された標本１２の像は、リレーレンズ１７ｂ、ミラーＭ２、リレーレンズ１７ｃ、および接眼鏡筒１９のレンズ１９ａとミラーＭ３を介して二次像面１８ｂに結像され、不図示の接眼レンズを介して観察者に観察される。この際、図１に示す蛍光キューブホルダ２０中の蛍光キューブ２１は光路中から外されている。また、プリズム２２は光路中に交換可能に配置されており、標本１２の透過像を観察するときには光路から外されている。このように、顕微鏡装置１は透過型顕微鏡として使用することができる。

また、図２に示すように顕微鏡２には、共焦点走査観察系３１と落射照明系４１とが共通の照明光学系５１を介して配置されている。

以下、顕微鏡装置１を走査型顕微鏡（走査型蛍光顕微鏡、共焦点走査型顕微鏡）として使用する場合について図２を参照しつつ説明する。

走査型顕微鏡として使用する場合、共焦点走査観察系３１は、不図示のレーザ光源からのレーザ光を光ファイバ３２で導き、コレクタレンズ３３で光ファイバ３２の端面から射出された発散光束をほぼ平行な光束にし、標本１２上で二次元に走査する二次元スキャナ３４に入射する。二次元スキャナ３４から射出されたレーザ光は、瞳リレーレンズ３５で像面ＩＰ１に結像される。像面ＩＰ１を射出したレーザ光は、照明光学系５１の結像レンズ５２で光軸に略平行なレーザ光にされ光路中に交換可能に配置された蛍光キューブ２１に入射する。なお、共焦点走査観察系３１を使用する場合、後述する落射照明系４１で使用する照明光学系５１の光路に挿脱可能に配置されているダイクロイックミラー４４は、照明光学系５１の光路から外されている。

蛍光キューブ２１には、波長選択フィルタ２１ａ、ダイクロイックミラー２１ｂ及びエミッションフィルタ２１ｃが内蔵されている。

蛍光キューブ２１に入射したレーザ光は、波長選択フィルタ２１ａとダイクロイックミラー２１ｂで所定の励起波長のレーザ光が選択され、対物レンズ１６方向に反射され、対物レンズ１６に入射して標本１２に集光される。

レーザ光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され蛍光キューブ２１に入射し、蛍光キューブ２１のエミッションフィルタ２１ｃで所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ１８と結像光学系１７に挿脱可能に配置されたプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され、撮像素子２３で蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。このように、顕微鏡装置１は走査型蛍光顕微鏡として使用することができる。

一方、標本１２で反射したレーザ光は、対物レンズ１６で集光され、蛍光キューブ２１のダイクロイックミラー２１ｂで反射され照明光学系５１を逆行し二次元スキャナ３４に入射してデスキャンされ、ビームスプリッタ３６で反射されて結像レンズ３７とピンホール３８を介してＰＭＴ等の受光素子３９に入射し、受光素子３９で受光された各点の強度を基にＰＣ３で二次元像に生成しモニター３ａ等で表示する。このように、顕微鏡装置１は共焦点走査型顕微鏡として使用することができる。

また、顕微鏡装置１では、撮像素子２３で撮像された蛍光画像と、受光素子３９で受光された共焦点画像をモニター３ａに重ねて表示させるなどして観察することが可能である。

次に、顕微鏡装置１を落射蛍光顕微鏡として使用する場合について図２を参照しつつ説明する。

図２において、落射照明系４１の不図示の光源からの光は、光ファイバ４２で導かれ、コレクタレンズ４３で光ファイバ４２の端面から射出された光がほぼ平行な光にされ、視野絞り４５を介して照明光学系５１に挿脱可能に配置されたダイクロイックミラー４４に入射して反射され、照明光学系５１の結像レンズ５２で集光され、光軸に略平行な光として光路中に交換可能に配置された蛍光キューブ２１に入射する。なお、不図示の光源は、レーザ光源、高圧水銀ランプ、あるいはキセノンランプ等が使用可能である。

この光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され蛍光キューブ２１に入射し、蛍光キューブ２１のエミッションフィルタ２１ｃで所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ１８と結像光学系１７に挿脱可能に配置されたプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。このようにして、顕微鏡装置１は落射蛍光顕微鏡として使用することができる。

次に、顕微鏡装置１を全反射顕微鏡として使用する場合について図３、図４を参照しつつ説明する。

全反射顕微鏡として使用する際の照明は、上述の共焦点走査観察系３１のレーザ光を使用する。また、全反射照明を達成するための後述する光学部材（光学手段）６０を内蔵する蛍光キューブ６１を光路に交換挿入することで全反射顕微鏡を達成している。

図３に示すように、共焦点走査観察系３１は、不図示のレーザ光源からのレーザ光を光ファイバ３２で導き、コレクタレンズ３３で光ファイバ３２の端面から射出されたレーザ光をほぼ平行なレーザ光束にして二次元スキャナ３４に入射する。このレーザ光束の主光線を共焦点走査観察系３１の光軸に一致させるために二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの角度が図１に示すＰＣ３の制御部により制御される。二次元スキャナ３４から射出されたレーザ光は、瞳リレーレンズ３５で像面ＩＰ１に結像され、照明光学系５１の結像レンズ５２で光軸に略平行なレーザ光束にされ光路中に交換可能に配置された蛍光キューブ６１に入射する。

蛍光キューブ６１は、光学部材（光学手段）６０と、ダイクロイックミラー２１ｂ及びエミッションフィルタ２１ｃ（これらは蛍光キューブ２１が備える同様の部材と同じ符号で表す）とから構成され、図１に示す蛍光キューブホルダ２０に内蔵され、光路中に交換可能に構成されている。光学部材（光学手段）６０は、光軸に対して所定の角度傾斜して配置された楔プリズム６２と楔プリズム６３により構成される光学部材と、凸レンズなどの集光レンズ６４とから構成されている。結像レンズ５２から射出したレーザ光束は、光軸に対して傾斜した楔プリズム６２と楔プリズム６３により構成される光学部材で、光軸から距離「ｄ」だけずらされた平行光束に変換される。この距離「ｄ」は、標本面１２において全反射照明を達成するための照明光ＮＡｉに対応したずれ量に相当する。

蛍光キューブ６１の楔プリズム６２と楔プリズム６３により構成される光学部材で光軸からｄだけ移動されたレーザ光束は、連動してｄだけ移動される集光レンズ６４と、ダイクロイックミラー２１ｂとを介して、対物レンズ１６の瞳位置Ｐの全反射条件領域に集光される。この全反射条件領域に集光されたレーザ光は、標本１２と標本１２を支持するガラス基板との境界面で全反射される入射角（臨界角以上の入射角）で対物レンズ１６から標本１２に入射する。

全反射角で標本１２に入射したレーザ光は、境界面にエバネッセント波を発生し、標本１２の境界面近傍でこのエバネッセント波により励起させる蛍光を発生させる。なお、レーザ光の波長は、不図示のレーザ光源で選択されているため、このとき図２に示す波長選択フィルタ２１ａは不要である。

エバネッセント波で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光され蛍光キューブ６１に入射し、蛍光キューブ６１のエミッションフィルタ２１ｃで所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ１８と結像光学系１７の光路に挿脱可能に配置されたプリズム２２を介して撮像素子２３に結像され、撮像素子２３で蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。

このように、顕微鏡装置１は、前述の蛍光キューブ２１を蛍光キューブ６１に交換し、レーザ光束の主光線を共焦点観察系３１の光軸に一致するように二次元スキャナ３４を制御することによって全反射蛍光顕微鏡として使用することができる。

図３、図４を参照して、全反射照明状態における光学手段の作用を詳説する。なお、図４においては、ダイクロイックミラー２１ｂと、それによって反射した光が進む光路は図示を省略している。

図３、図４に示すように、結像レンズ５２から射出したレーザ光束は、光軸に対して所定の角度傾斜された楔プリズム６２と楔プリズム６３で構成される光学部材により光軸から距離「ｄ」だけずらされた平行光束に変換される。この距離「ｄ」は、対物レンズ１６の全反射条件となる対物レンズ１６の瞳上のＮＡの位置に対応している。このとき、全反射照明光の入射角をγとすれば、ずれ量ｄと対物レンズ１６の開口数ＮＡとの関係は次式で表すことができる。ただし、ｆ_０は第一対物レンズ１６の焦点距離である。
（１）ＮＡ＝ｎ_１・sinγ＝ｄ／ｆ_０

また、全反射照明光の入射角γがγ＞γ_Ｃ＝sin^−１（ｎ_２／ｎ_１）（臨界角γ_Ｃ）であるとき、標本面１２からエバネッセント波強度が１／ｅとなる境界面までの距離ｚ、つまりエバネッセント波の沁み出し量ｚは光軸からのずれ量ｄを用いると次式で表すことができる。ここでは、全反射照明光の波長をλ、イマージョンオイルの屈折率をｎ_１、標本内部の屈折率をｎ_２とした。
（２）ｚ＝λ／｛４π（ｎ_１ ^２・sin^２γ−ｎ_２ ^２）^１／２｝＝λ／｛４π（ｄ^２／ｆ_０ ^２−ｎ_２ ^２）^１／２｝

一方、図４に示すように、楔プリズム６２と楔プリズム６３の屈折率をｎ_Ｐ、楔プリズムの頂角をδとすると、屈折角α＝（ｎ_Ｐ−１）δであることから、楔プリズム６２と楔プリズム６３からなる光学部材の透過光路長ｌと光軸からのずれ量ｄとの関係は次式で表すことができる。なお、ここでは楔プリズム６２と楔プリズム６３との向き合う平行面に対し、垂直に光線が通る場合を考えている。
（３）ｄ＝ｌ・sin（ｎ_Ｐ−１）δ

（１）、（３）式より、全反射照明光のＮＡｉと、楔プリズム６２と楔プリズム６３からなる光学部材の透過光路長ｌとの関係は次式で表すことができる。
（４）ＮＡｉ＝（ｌ／ｆ_０）・sin（ｎ_Ｐ−１）δ

以上をまとめると、（２）、（３）式より、エバネッセント波の沁み出し量ｚと、楔プリズム６２と楔プリズム６３からなる平行平面板の透過光路長ｌとの関係は次式で表すことができる。
（５）ｚ＝λ／〔４π［｛（ｌ／ｆ_０）・sin（ｎ_Ｐ−１）δ｝^２−ｎ_２ ^２］^１／２〕

ここで（５）式を、楔プリズム６２と楔プリズム６３からなる光学部材の透過光路長ｌについて解くと次式を得る。
（６）ｌ＝｛ｆ_０／sin（ｎ_Ｐ−１）δ｝・｛（λ／４πｚ）^２＋ｎ_２ ^２｝^１／２

よって（６）式より、高開口数対物レンズを用いた場合、楔プリズム６２と楔プリズム６３との相対位置を制御し、適切な透過光路長ｌを有する光学部材を得ることにより、目的の全反射照明光のＮＡｉを得、目的のエバネッセント波の沁み出し量ｚを達成することが可能となる。

具体的には、第１実施の形態にかかる顕微鏡装置１は、図４に破線と実線で図示しているように、図示しない制御手段により、光学部材を構成する楔プリズム６２と楔プリズム６３とをスライド移動させてこれらの合成厚みを変え、透過光路長ｌ、ずれ量ｄを変えることができる。さらに、ずれ量（楔プリズム６２、６３から射出される主光線の光軸からの距離）ｄに応じて集光レンズ６４を光軸と垂直方向に移動する図示しない移動手段を備えている。このような構成により、例えば対物レンズ１６を交換した場合でも、交換した対物レンズに合わせて透過光路長ｌを調整し、全反射照明を達成することができる。なお、上記制御手段、移動手段の形態は特に限定されない。例えば、モータや人工筋肉を使用することが考えられる。

また、上記移動手段は、集光レンズ６４を光軸方向に移動することで、集光レンズ６４による集光位置を光軸方向に制御できる。一方、集光レンズ６４を光軸と垂直な方向に移動することで、当該少なくとも２つのプリズムから射出される主光線と集光レンズ６４の光軸とが一致するように光軸と垂直な方向に制御できる。

例えば、１００倍でＮＡ１．４９の対物レンズと、６０倍でＮＡ１．４９の対物レンズをそれぞれ用いた場合で、エバネッセント波の沁み出し量ｚを両者等しくするために、１００倍のときの透過光路長から更にどれだけ透過光路長を変化させればよいかを考える。

ここでは、カーギル社のタイプＤＦ（蛍光顕微鏡用イマージョンオイル：ｎｄ＝１．５１５（ａｔ２３℃））を例に用いてイマージョンオイルの屈折率ｎ_１を１．５１５、標本を生体細胞として標本内部の屈折率ｎ_２を１．３５、楔プリズム６２及び楔プリズム６３の屈折率ｎ_Ｐ（ｄ）＝１．５１６８、頂角δ＝３０°、全反射照明光の波長λを５８８ｎｍとして計算する。

最初に、（１）式を用いると１００倍でＮＡｉ１．４９を達成するためのｄは２．９８［ｍｍ］。また、（２）式を用いると１００倍でＮＡｉ１．４９の全反射照明を達成したときのエバネッセント波の沁み出し量は７４．２［ｎｍ］。最後に、（３）式を用いると１００倍でＮＡｉ１．４９を達成するための楔プリズム６２と楔プリズム６３からなる平行平面板の透過光路長は１１．１［ｍｍ］と求めることができる。

次に（６）式を用いると、６０倍でＮＡ１．４９の対物レンズに交換した場合、上記で求めた１００倍でＮＡｉ１．４９の全反射照明を達成したときのエバネッセント波の沁み出し量７４．２［ｎｍ］と等しい沁み出し量を達成するために必要な透過光路長は１８．６［ｍｍ］と求めることができる。

上記の計算結果より、１００倍でＮＡ１．４９の対物レンズと、６０倍でＮＡ１．４９の対物レンズで、エバネッセント波の沁み出し量ｚを両者等しくするために必要な透過光路長変化量Δｌは、７．５［ｍｍ］と求まる。つまり、１００倍の対物レンズの全反射条件位置に相当する透過光路長から更に７．５［ｍｍ］だけ延ばせばよいことがわかる。なお、この制御に伴うずれの変化Δｄは２．０［ｍｍ］となる。

なお、上記の例は、楔プリズム６２と楔プリズム６３との向き合う互いに平行な面に対し、垂直に光線が通る場合を考えているが、必ずしも垂直でなくてもよい。

以上述べたように、第１実施の形態にかかる顕微鏡装置１によれば、共焦点走査観察系３１の二次元スキャナ３４をレーザ光が光軸に一致するように制御し、複数の蛍光キューブを光路中に交換可能に構成した蛍光キューブホルダ２０に配置された光学部材（光学手段）６０を内蔵する蛍光キューブ６１を光路中に交換挿入することによって、全反射蛍光観察を可能にすることができる。また、共焦点走査型観察、走査型蛍光観察、落射蛍光観察、透過観察等の顕微鏡としても使用可能な顕微鏡装置１を提供することができる。

また、第１実施の形態にかかる顕微鏡装置１によれば、対物レンズ１６を交換した場合でも、同一の蛍光キューブ６１を使用して、全反射照明を達成することができる。また、楔プリズムをずらして透過光路長ｌを変えることによりずれ量ｄを変える構成のため、微調整が可能であり、高性能な全反射蛍光顕微鏡を提供することができる。なお、図４では楔プリズム６３をずらしているが、透過光路長ｌを適切な値にするには楔プリズム６２、６３の相対的な位置を調整すればよいので、どちらを動かしてもよい。

また、ずれ量ｄの制御部が蛍光キューブ６１位置にあり、対物レンズ１６の瞳位置Ｐに対し近傍にあることから、対物レンズ１６の瞳位置Ｐに対し遠方に設置されている二次元スキャナ３４を用いて偏心量ｄを制御する場合よりも、精度の高い制御が期待できる。

また、リボルバ１５に保持された複数の対物レンズ１６の瞳径に応じた、光束ずらしのための楔プリズム６２および楔プリズム６３と焦点距離ｆの集光レンズ６４とからなる光学部材６０を有する蛍光キューブ６１を図１に示す。蛍光キューブホルダ２０内に、このような蛍光キューブを少なくとも１つ配設しておけば、対物レンズ１６を交換した場合でも容易に全反射照明を達成することが可能となる。

（第２実施の形態）
次に、第２実施の形態にかかる顕微鏡装置について図面を参照しつつ説明する。なお、顕微鏡装置の概略構成は第１実施の形態と同様であり図面ならびに説明を省略する。

図５は第２実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。図６は全反射顕微鏡に切換えた際の顕微鏡装置の光学系を示す。なお、第１実施の形態と同様の構成には同じ符号を付して説明する。また、図５、図６では、第１実施の形態と同様に透過照明光学系は省略している。

図５において、顕微鏡装置１０１を透過型顕微鏡として使用する場合の使用法は第１実施の形態と同様であり説明を省略する。

次に、顕微鏡装置１０１を走査型顕微鏡（走査型蛍光顕微鏡、共焦点走査型顕微鏡）として使用する場合について図５を参照しつつ説明する。

走査型顕微鏡として使用する場合、共焦点走査観察系３１は、不図示のレーザ光源からのレーザ光を光ファイバ３２で導き、コレクタレンズ３３で光ファイバ３２の端面から射出されたレーザ光をほぼ平行なレーザ光束にし、標本１２上で二次元に走査する二次元スキャナ３４に入射する。二次元スキャナ３４から射出されたレーザ光は、瞳リレーレンズ３５で像面ＩＰ１に結像される。像面ＩＰ１を射出したレーザ光は、光路に挿脱可能なダイクロイックミラー７１で反射され、結像レンズ１８で集光され略平行なレーザ光として対物レンズ１６に入射して標本１２に集光される。このとき光路中に交換可能に配置された蛍光キューブ２１は光路外に外されている。

レーザ光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光されダイクロイックミラー７２とエミッションフィルタ７３で所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ７４で撮像素子２３に結像され、撮像素子２３で蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。このように、顕微鏡装置１０１は走査型蛍光顕微鏡として使用することができる。

一方、標本１２で反射したレーザ光は、対物レンズ１６で集光され、光路を逆行して結像レンズ１８とダイクロイックミラー７１を介して二次元スキャナ３４に入射してデスキャンされ、ビームスプリッタ３６で反射されて結像レンズ３７とピンホール３８を介してＰＭＴ等の受光素子３９に入射し、受光素子３９で受光された各点の強度を基にＰＣ３で二次元像に生成しモニター３ａ等で表示する。このように、顕微鏡装置１０１は共焦点走査型顕微鏡として使用することができる。なお、前述した透過照明で標本像を接眼鏡筒１９を介して観察するときには、ダイクロイックミラー７１、７２、および蛍光キューブ２１あるいは後述する蛍光キューブ９１は光路から外されている。

また、顕微鏡装置１０１では、撮像素子２３で撮像された蛍光画像と、受光素子３９で受光された共焦点画像を図１に示すモニター３ａに重ねて表示させるなどして観察することが可能である。

次に、顕微鏡装置１０１を落射蛍光顕微鏡として使用する場合について図５を参照しつつ説明する。第２実施の形態では、共焦点走査観察系３１と落射照明系４１の照明光学系は一部を除き独立して配置されている。

図５において、落射照明系４１の不図示の光源からの光は光ファイバ４２で導かれ、コレクタレンズ４３で光ファイバ４２の端面から射出された光がほぼ平行な光束にされ、視野絞り４５を介して結像レンズ５２で集光されて光路中に交換可能に配置された蛍光キューブ２１に入射する。

この光で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光されダイクロイックミラー７２とエミッションフィルタ７３で所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ７４で撮像素子２３に結像され、撮像素子２３で蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。このようにして、顕微鏡装置１０１は落射蛍光顕微鏡として使用することができる。なお、不図示の光源は、レーザ光源、高圧水銀ランプ、あるいはキセノンランプ等が使用可能である。

次に、顕微鏡装置１０１を全反射顕微鏡として使用する場合について図６を参照しつつ説明する。

全反射顕微鏡として使用する際の照明は、上述の共焦点走査観察系３１のレーザ光を使用する。また、全反射照明を達成するための後述する光学部材（光学手段）９０を内蔵する蛍光キューブ９１を光路に交換挿入することで全反射顕微鏡を達成している。

図６に示すように、共焦点走査観察系３１は、不図示のレーザ光源からのレーザ光を光ファイバ３２で導き、コレクタレンズ３３で光ファイバ３２の端面から射出されたレーザ光をほぼ平行なレーザ光束にして二次元スキャナ３４に入射する。このレーザ光束の主光線を共焦点走査観察系３１の光軸に一致させるために二次元スキャナ３４のＸＹ各ミラーの角度が図１に示すＰＣ３の制御部により制御される。二次元スキャナ３４から射出されたレーザ光は、瞳リレーレンズ３５で像面ＩＰ１に結像される。像面ＩＰ１を射出したレーザ光は、ダイクロイックミラー７１で反射され、結像レンズ１８で光軸に略平行なレーザ光束にされ光路中に交換可能に配置された蛍光キューブ９１に入射する。

蛍光キューブ９１は、光軸に対して所定の角度傾斜して配置された楔プリズム９２と楔プリズム９３により構成される光学部材と、凸レンズなどの集光レンズ９４とからなる光学部材（光学手段）９０から構成され、図１に示す蛍光キューブホルダ２０に内蔵され、光路中に交換可能に構成されている。結像レンズ１８から射出したレーザ光は、光軸に対して傾斜した楔プリズム９２と楔プリズム９３により構成される光学部材で、光軸から距離「ｄ」だけずらされた主光線Ｉ１を有する光束に変換される。この距離「ｄ」は、標本面１２において全反射照明を達成するための照明光ＮＡｉに対応したずれ量に相当する。

蛍光キューブ９１の楔プリズム９２と楔プリズム９３により構成される光学部材で光軸からｄだけ移動されたレーザ光束は、連動してｄだけ移動される集光レンズ９４で対物レンズ１６の瞳位置Ｐの全反射条件領域に集光される。この全反射条件領域に集光されたレーザ光は、標本１２と標本１２を支持するガラス基板との境界面で全反射される入射角（臨界角以上の入射角）で対物レンズ１６から標本１２に入射する。

全反射角で標本１２に入射したレーザ光は、境界面にエバネッセント波を発生し、標本１２の境界面近傍でこのエバネッセント波により励起される蛍光を発生させる。なお、レーザ光の波長は、不図示のレーザ光源で選択されているため、このとき図５に示す波長選択フィルタ２１ａは不要である。

エバネッセント波で励起され標本１２で発現した蛍光は、対物レンズ１６で集光されダイクロイックミラー７２とエミッションフィルタ７３で所定の蛍光が選択透過され、結像レンズ７４で撮像素子２３に結像され、撮像素子２３で蛍光像が撮像される。撮像素子２３で撮像された画像は、図１に示すＰＣ３で画像処理されモニター３ａに表示される。このように、顕微鏡装置１０１は、前述の蛍光キューブ２１を蛍光キューブ９１に交換し、レーザ光束の主光線を共焦点観察系３１の光軸に一致するように二次元スキャナ３４を制御することによって全反射蛍光顕微鏡として使用することができる。なお、全反射照明状態における光学手段の作用は第１実施の形態（図４を参照）と同様であり説明を省略する。

第２実施の形態にかかる顕微鏡装置１０１においても、第１実施の形態と同様の効果を得ることができる。特に第２実施の形態によれば、全反射蛍光観察用の蛍光キューブ９１内にダイクロイックミラーやエミッションフィルタがないため、蛍光キューブ９１を蛍光キューブホルダ２０に配置して光路中に交換可能に構成する際、第１実施の形態に比べてスペースの制約を受けないという利点がある。

なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。

第１実施の形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。第１実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。第１実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を全反射顕微鏡に切換えた際の顕微鏡装置の光学系を示す。第１実施の形態にかかる顕微鏡装置における光学手段の作用を説明する図であり、全反射照明状態における一組の楔プリズムからなる光学部材の作用を説明する図である。第２実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を示す。第２実施の形態にかかる顕微鏡装置の光学系を全反射顕微鏡に切換えた際の顕微鏡装置の光学系を示す。

符号の説明

１、１０１顕微鏡装置
２倒立型蛍光顕微鏡（顕微鏡）
３制御装置（ＰＣ）
１１ステージ
１２標本
１３透過照明光源
１４透過照明光学系
１５リボルバ
１６対物レンズ
１７結像光学系
１８結像レンズ
１９接眼鏡筒
２０蛍光キューブホルダ
２１蛍光キューブ
２２プリズム
２３撮像素子
３１共焦点走査観察系
３２光ファイバ
３３コレクタレンズ
３４二次元スキャナ
３５瞳リレーレンズ
４１落射照明系
４２光ファイバ
４３コレクタレンズ
４４ダイクロイックミラー
５１照明光学系
５２結像レンズ
６０、９０光学部材（光学手段）
６１、９１蛍光キューブ
６２、９２楔プリズム
６３、９３楔プリズム
６４、９４集光レンズ

Claims

レーザ光源からのレーザ光束を標本に照射する照明光学系と、
前記標本からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記照明光学系内に配設され、前記レーザ光束を前記標本へ導く複数の蛍光キューブと、対物レンズとを備えた顕微鏡装置において、
前記蛍光キューブの少なくとも１つは、前記レーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の前記光軸から離れた所定の領域内に集光するための光学手段を有し、
当該光学手段は、少なくとも２つの楔プリズムと集光レンズとを有し、
当該光学手段を有する前記蛍光キューブを光路に挿入した際、前記レーザ光束の主光線を前記光軸に対して所定量移動するように前記少なくとも２つの楔プリズムの透過光路長を制御する制御手段と、前記少なくとも２つの楔プリズムから射出される光束を前記対物レンズの瞳面内の、前記光軸から離れた所定の領域内に集光するために、前記集光レンズを移動する移動手段とを備えることを特徴とする顕微鏡装置。
前記所定の領域内に集光された前記レーザ光束は、前記標本に対する入射角が全反射臨界角以上で前記対物レンズから射出することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記照明光学系は、落射照明光学系を更に有することを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡装置。
蛍光顕微鏡の照明光学系の光路中に交換可能に配置される蛍光キューブにおいて、
当該蛍光キューブが前記蛍光顕微鏡の光路中に配置されたときに、対物レンズを介して標本に照射されるレーザ光束の主光線を前記照明光学系の光軸に対して略平行になるようにし、かつ前記レーザ光束を前記対物レンズの瞳位置の前記光軸から離れた所定の領域内に集光するための光学手段を有し、
当該光学手段は、前記レーザ光束の主光線を前記光軸に対して所定量移動するように制御手段により透過光路長が制御される少なくとも２つの楔プリズムと、当該少なくとも２つの楔プリズムから射出される光束を前記対物レンズの瞳面内の前記光軸から離れた所定の領域内に集光するための集光レンズと、前記光軸方向および／または前記光軸と垂直な方向に前記集光レンズを移動させる移動手段とを有することを特徴とする蛍光キューブ。