JP4855007B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

この発明は、走査型レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、試料に光刺激を与えるための光刺激用レーザを備えた走査型レーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特許文献１に開示されている走査型レーザ顕微鏡は、蛍光観察を行うために試料に照射する観察用レーザ光を光軸に垂直な面内で走査させる第１のレーザ走査装置と、刺激用レーザ光を試料平面の任意の位置に照射するために刺激用レーザ光を移動させる第２のレーザ走査装置とを備えている。

このような走査型レーザ顕微鏡を用いて観察を行うには、まず、観察用レーザ光を第１のレーザ走査装置の作動により試料上において走査させて取得した蛍光画像をプレビュー画像としてモニタに表示し、その画像において光刺激を与えたいポイントあるいは領域をマウス等によって指定する。次いで、第２のレーザ走査装置の作動により、プレビュー画面で指定したポイントまたは領域に、刺激用レーザ光のスポット位置を位置決めしたら、刺激用レーザ光と観察用レーザ光とを同時に試料に照射して、試料の経時変化を観察する。これにより、刺激用レーザ光を試料の任意の位置に与えながら、その影響により反応する試料の経時変化を観察することができる。
特開平１０−２０６７４２号公報

この場合において、別々のレーザ走査装置により走査される観察用レーザ光と刺激用レーザ光とを試料に精度よく照射する必要があるが、従来、２つの光走査装置やその他の光学系の組み付け精度を向上させることで光軸のずれを吸収することとしていた。

しかしながら、光路中の観察用レーザ光から蛍光を分離するダイクロイックミラーや、観察用レーザ光と刺激用レーザ光とを合成するダイクロイックミラー等の光学系を交換したり、切り替えたりする場合がある。このような場合には、上記のように２つの光走査装置やその他の光学系の組み付け精度を高くしても、交換や切替の都度に光軸角度がずれる場合がある。また、レーザ光源によっては、出射するレーザ光の波長の切り替えにより、出射角度が微妙に変動する場合がある。

これらの場合に、レーザ光の角度が変動すると、指定した位置に正確に光刺激を与えることができなくなるという不都合がある。しかしながら、ダイクロイックミラー等の光学系を切り替えるたびに、あるいは、レーザ光の波長を切り替えるたびに、走査装置やその他の光学系の組み付け作業をやり直すことは現実的ではない。特に、観察用レーザ光のずれについては、例えば、標本の代わりに正確な格子を有する調整用チャートを配置してその画像を取得することで、光軸の位置ずれや走査装置を構成するガルバノミラーの振り角等を検出することができるが、刺激用レーザ光に関しては、画像を取得する適切な手段を有しないので、その調整は困難である。また、ステージ上の標本を調整用チャートに入れ替えて調整する場合には、調整後に標本に戻して観察を再開する必要があり、標本の同一の観察状態を再現できないという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光学部品の切り替えあるいは交換を行った際に生ずる観察用レーザ光と刺激用レーザ光との位置ずれの補正を容易に行うことを可能として精度の高い観察を行うことができる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、試料を励起する観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、該観察用レーザ光を、対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する第１の光走査装置と、前記観察用レーザ光が照射された試料から発せられる光を検出する検出光学系と、試料に光刺激を与える刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源と、該刺激用レーザ光を、前記対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する、前記第１の光走査装置とは異なる第２の光走査装置と、前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光により形成されるスポット光の位置を検出するスポット位置検出手段と、該スポット位置検出手段により検出された観察用レーザ光および刺激用レーザ光のスポット光の位置に基づいて、前記観察用レーザ光および刺激用レーザ光の位置ずれを補正する補正手段とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、観察用レーザ光源から発せられた観察用レーザ光は、第１の光走査装置により２次元的に振られ、対物レンズを介して試料上に照射されることにより、試料上で２次元的に走査され、試料を励起する。試料から発せられる蛍光等、反射光あるいは透過光のような光は、検出光学系により検出される。検出された光の輝度情報と第１の光走査装置による走査位置情報とを対応づけることにより、試料の画像を取得することができる。

一方、刺激用レーザ光源から発せられた刺激用レーザ光も、第２の光走査装置により２次元的に振られ、対物レンズを介して試料上に照射される。このとき、第２の光走査装置により、走査範囲上の任意の一点を照射したり、試料上の指定領域を走査することにより照射し、試料に光刺激を与えることになる。そして、第２の光走査装置により光刺激を与えながら、第１の光走査装置で画像を時間毎に取得することができる。したがって、例えば、刺激用レーザ光を試料に照射して光刺激を付与したとき、あるいはその後の試料の状態を観察用レーザ光を照射して得られる画像の経時変化を観察することができる。

この場合において、スポット位置検出手段を作動させることにより、観察用レーザ光および刺激用レーザ光のスポット位置のずれを検出することができる。例えば、第１の光走査装置および第２の光走査装置をそれぞれの走査範囲の振り角中心に固定した状態で、観察用レーザ光源および刺激用レーザ光源から観察用レーザ光および刺激用レーザ光を出射させることにより、スポット位置検出手段により２つのレーザ光のスポット位置を検出できる。そして、２つの光スポットの位置が一致していない場合、あるいは所定の位置関係に配されていないは、補正手段の作動により、補正することができる。

その結果、光学部品を切り替えたり、交換したり、あるいは、観察用レーザ光あるいは刺激用レーザ光の波長を切り替えたりすることにより、第１の光走査装置と第２の光走査装置の間に位置ずれが生じても、これを補正して、観察画像上で指定した刺激領域の正確な位置に刺激用レーザ光を照射し、これに精度よく対応する走査範囲の画像を取得することが可能となる。

上記発明においては、前記補正手段が、前記第１の光走査装置または前記第２の光走査装置の少なくとも一方の走査角にオフセットを付与することとしてもよい。
光学部品を切り替えたり交換したり、あるいは観察用レーザ光あるいは刺激用レーザ光の波長を切り替えたりする場合、観察用レーザ光あるいは刺激用レーザ光の角度が一方向にずれる場合が多い。本発明によれば、補正手段の作動により、第１の光走査装置または第２の光走査装置の少なくとも一方の走査角にオフセットを付与することで、レーザ光の角度ずれを簡易に補正して、観察画像上で指定した位置に刺激用レーザ光を正確に照射することが可能となる。

上記発明においては、前記観察用レーザ光の光路と前記刺激用レーザ光の光路とを合成する光路合成手段を備え、前記スポット位置検出手段が、前記光路合成手段と前記対物レンズとの間に配置されていることが好ましい。
このように構成することで、光路合成手段の作動により観察用レーザ光と刺激用レーザ光の光路が合成される。合成されたレーザ光は、光路合成手段と対物レンズとの間に配置されているスポット位置検出手段の作動により、それらのスポット位置が一度に検出され、補正手段の作動により、観察用レーザ光と刺激用レーザ光との位置合わせを容易に行うことができる。この場合に、対物レンズにレーザ光を入射させることなく位置合わせを行うので、試料にレーザ光を照射する必要がなく、位置合わせ作業中の試料の退色等の発生を防止することができる。また、試料に代えて調整用のチャートのような基準サンプルをステージ上に配置する必要がなく、調製前後において同一の観察状態を保持することができる。

また、上記発明においては、前記スポット位置検出手段が、前記光路合成手段と前記対物レンズとの間の光路に挿脱可能に設けられていることが好ましい。
このようにすることで、レーザ光の位置合わせを行う際には、光路合成手段と対物レンズとの間にスポット位置検出手段を挿入し、観察を行う際には、光路合成手段と対物レンズとの間からスポット位置検出手段を抜き出すことにより、試料をステージに配置したままの状態で、観察用レーザ光と刺激用レーザ光との位置合わせと観察とを行うことができる。したがって、試料を移動させずにすむので、調整の前後において、同一の観察状態を保持することができる。また、試料に代えて調整用チャートのような基準サンプルをステージ上に配置する必要がなく、調整作業を容易にすることができる。

また、上記発明においては、前記光路合成手段と対物レンズとの間に、複数のミラーキューブを有するキューブターレットが着脱可能に設けられるとともに、前記スポット位置検出手段が、前記キューブターレットの着脱位置に、着脱可能に設けられていることとしてもよい。

本発明によれば、観察用レーザ光と刺激用レーザ光との位置合わせを行う際に、キューブターレットを取り外して、その着脱位置にスポット位置検出手段を取り付けることで、キューブターレットのスペースを利用することができる。したがって、既存の走査型レーザ顕微鏡に後付けで、スポット位置検出手段を取り付けることが容易になり、また、キューブターレット用のスペースとして既に確保されているスペースを利用することで、装置全体の大型化を防止することができる。

また、上記発明においては、前記スポット位置検出手段が、撮像素子または多分割センサからなるスポット位置検出器と、光路に挿脱可能に設けられ、光路上に配置されたときに、観察用レーザ光および刺激用レーザ光を前記スポット位置検出器に導くミラーとを備えることとしてもよい。
このようにすることで、観察用レーザ光と刺激用レーザ光の位置合わせと、これらのレーザ光を用いた試料の観察とをミラーの挿脱によって簡易に切り替えることができる。

また、上記発明においては、前記スポット位置検出手段が、撮像素子または多分割センサからなるスポット位置検出器と、観察用レーザ光および刺激用レーザ光の一部を前記スポット位置検出器に導くビームスプリッタとを備えることとしてもよい。
このようにすることで、ビームスプリッタを介して観察用レーザ光と刺激用レーザ光とを常にスポット位置検出器に導くことができ、第１の光走査装置および第２の光走査装置によるレーザ光の走査を行わないときには、ミラーの挿脱等を行わなくても、いつでも観察用レーザ光と刺激用レーザ光の位置合わせ作業を行うことができる。

また、上記発明においては、前記スポット位置検出手段は、前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光が前記対物レンズを介して試料に照射されることにより試料から発せられる光が対物レンズを介して結像する位置に配置された撮像素子を備えることとしてもよい。
このようにすることで、観察用レーザ光および刺激用レーザ光がそれぞれ照射されることにより試料から発せられる反射光のような光が対物レンズによって集光された後、撮像素子に結像される。したがって、撮像素子により取得された観察用レーザ光および刺激用レーザ光の光スポットの位置に基づいて、補正手段の作動により、観察用レーザ光と刺激用レーザ光との位置合わせを行うことができる。

また、上記発明においては、前記撮像素子が、着脱可能に設けられていることとしてもよい。
試料からの光の結像位置には、通常、水銀灯等の照明により試料より発する蛍光等を撮像するための撮像素子が着脱可能に配置されるので、その着脱位置を利用してスポット位置検出用の撮像素子を取り付けることにより、既存の走査型レーザ顕微鏡に後付けで、レーザ光の位置合わせ機能を容易に搭載することが可能となる。また、水銀灯を光源とする蛍光観察用の撮像素子が備えられている場合には、スポット位置検出用の撮像素子として共用するようにしてもよい。

また、上記発明においては、前記スポット位置検出手段は、前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光が前記対物レンズを介して試料に照射されることにより試料から発せられる光を、試料に対して前記対物レンズとは反対側において結像させる結像手段と、該結像手段による結像位置に配置された撮像素子とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、試料を透過する観察用レーザ光および刺激用レーザ光のスポット位置を撮像素子により検出でき、観察時と位置調節時とで、光路を切り替えることなく任意のタイミングで位置調整を行うことができる。また、透過光路にコンデンサユニットが備えられている場合には、該コンデンサユニットの代わりにスポット位置検出手段を装着することができ、装置への後付けが容易である。

また、上記発明においては、前記スポット位置検出手段が、荷電結合素子（ＣＣＤ）または多分割センサであることとしてもよい。
このようにすることで、観察用レーザ光および刺激用レーザ光のスポット位置を簡易に検出することができる。

また、上記発明においては、前記スポット位置検出手段は、前記観察用レーザ光および刺激用レーザ光が略平行光となる位置に配置され、これら観察用レーザ光および刺激用レーザ光の傾斜角度を検出する角度センサを備え、検出された傾斜角度に基づいてスポット位置ずれを検出することとしてもよい。
レーザ光が略平行光となる位置におけるレーザ光の傾斜角度が、観察用レーザ光および刺激用レーザ光の照明位置に影響するので、角度センサの作動によりレーザ光の傾斜角度を検出することによりスポット位置ずれを容易に検出することができる。

また、本発明は、試料を励起する観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、該観察用レーザ光源を対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する第１の光走査装置と、前記観察用レーザ光が照射された試料から発せられる光を検出する検出光学系と、試料に光刺激を与える刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源と、該刺激用レーザ光を前記対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する、前記第１の光走査装置とは異なる第２の光走査装置と、前記観察用レーザ光と刺激用レーザ光の光路を合成する光路合成手段と、前記第２の光走査装置の作動により、刺激用レーザ光を試料上で走査した際に得られる蛍光、反射光または透過光を走査装置を経ることなく検出する非ディスキャン検出器と、該非ディスキャン検出器により取得された刺激用レーザ光に基づく走査画像と、前記検出光学系により取得された観察用レーザ光に基づく走査画像とに基づいて、刺激用レーザ光および観察用レーザ光の位置ずれを求め、この位置ずれを補正する補正手段とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、観察用レーザ光源から発せられた観察用レーザ光が第１の光走査装置により対物レンズを介して標本上で走査され、標本からの戻り光が対物レンズおよび第１の光走査装置を介して検出光学系により検出される。これにより、観察用レーザ光に基づく走査画像が取得される。一方、刺激用レーザ光源から発せられた刺激用レーザ光が第２の光走査装置により対物レンズを介して標本上で走査され、標本からの戻り光が第２の光走査装置を経ることなく非ディスキャン検出器により検出される。これにより、刺激用レーザ光に基づく走査画像が取得される。そして、補正手段の作動により、観察用レーザ光に基づく走査画像と、刺激用レーザ光に基づく走査画像とに基づいて刺激用レーザ光と観察用レーザ光との位置調整が行われる。

その結果、光学部品を切り替えたり、交換したり、あるいは、観察用レーザ光あるいは刺激用レーザ光の波長を切り替えたりすることにより、第１の光走査装置と第２の光走査装置の間に位置ずれが生じても、これを補正して、正確な位置に刺激用レーザ光を照射し、これに精度よく対応する走査範囲の画像を取得することが可能となる。
刺激用レーザ光源として極短パルスレーザ光を発するレーザ光源を使用することにより、非ディスキャン検出器によって、鮮明な蛍光画像を取得することが可能となり、観察用レーザ光に基づく蛍光画像との対比を容易にして精度よく位置調整を行うことができる。

また、本発明は、試料を励起する観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、該観察用レーザ光源を対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する第１の光走査装置と、試料に光刺激を与える刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源と、該刺激用レーザ光を前記対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する、前記第１の光走査装置とは異なる第２の光走査装置と、前記観察用レーザ光と刺激用レーザ光の光路を合成する光路合成手段と、前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光を試料上で走査した際に得られる光を走査装置を経ることなく検出する非ディスキャン検出器と、該非ディスキャン検出器により取得された観察用レーザ光および刺激用レーザ光に基づく走査画像に基づいて、刺激用レーザ光および観察用レーザ光の位置ずれを求め、この位置ずれを補正する補正手段とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。

また、上記発明においては、前記非ディスキャン検出器が、試料に対して前記対物レンズとは反対側の光路上に配置されていることとしてもよい。
このようにすることで、試料を透過する刺激用レーザ光の画像を非ディスキャン検出器により検出できる。

また、上記発明においては、前記非ディスキャン検出器の前段に刺激用レーザ光を遮断し、蛍光を透過するバリアフィルタを備えることが好ましい。
このようにすることで、非ディスキャン検出器により鮮明な蛍光画像を取得することができ、観察用レーザ光に基づく蛍光画像との対比を容易にし、精度よく位置合わせを行うことができる。

また、本発明は、試料を励起する観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、該観察用レーザ光源を対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する第１の光走査装置と、前記観察用レーザ光が照射された試料から発せられる光を検出する検出光学系と、試料に光刺激を与える刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源と、該刺激用レーザ光を、前記試料に対して対物レンズとは反対側から入射させて試料上で２次元的に走査する、前記第１の光走査装置とは異なる第２の光走査装置と、前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光が試料に照射されることにより試料から発せられる光が対物レンズを介して結像する位置に配置され、スポット光の位置を検出する撮像素子からなるスポット位置検出手段と、該スポット位置検出手段により検出されたスポット光の位置に基づいて、前記観察用レーザ光および刺激用レーザ光の位置ずれを補正する補正手段とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。

この発明によれば、試料を挟んで異なる方向から観察用レーザ光と刺激用レーザ光とを第１の光走査装置および第２の光走査装置により、試料にそれぞれ照射し、観察用レーザ光によるスポット光の位置と刺激用レーザ光によるスポット光の位置を検出することができる。そして、２つの光スポットの位置が一致していない場合、あるいは所定の位置関係に配されていないは、補正手段の作動により、補正することができる。

その結果、光学部品を切り替えたり、交換したり、あるいは、観察用レーザ光あるいは刺激用レーザ光の波長を切り替えたりすることにより、第１の光走査装置と第２の光走査装置の間に位置ずれが生じても、これを補正して、正確な位置に刺激用レーザ光を照射し、これに精度よく対応する走査範囲の画像を取得することが可能となる。

本発明によれば、光学部品の切り替えあるいは交換を行った際に生ずる観察用レーザ光と刺激用レーザ光との位置ずれの補正を容易に行うことを可能として精度の高い観察を行うことができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１について、図１〜図３を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、観察用レーザ光Ｌ_１を発する観察用レーザ光源２と、観察用レーザ光Ｌ_１を２次元的に走査する第１の光走査装置３と、刺激用レーザ光Ｌ_２を発する刺激用レーザ光源４と、刺激用レーザ光Ｌ_２を２次元的に走査する第２の光走査装置５と、これら第１，第２の光走査装置３，５により走査された観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２を結像させる瞳投影レンズ６，７と、これら観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２の光路を合成する光路合成用ダイクロイックミラー８と、合成されたレーザ光Ｌを略平行光にする結像レンズ９と、略平行光にされたレーザ光を試料Ａに集光する対物レンズ１０と、試料Ａを載置するステージ１１と、試料Ａに観察用レーザ光Ｌ_１を照射することにより発生し、対物レンズ１０、結像レンズ９、光路合成用ダイクロイックミラー８、第１の光走査装置５を介して戻る蛍光Ｆを検出する光検出器１２，１３と、前記光路合成用ダイクロイックミラー８と前記対物レンズ１０との間に挿脱可能に配置され、前記観察用レーザ光Ｌ_１および前記刺激用レーザ光Ｌ_２により形成されるスポット光の位置を検出するスポット位置検出装置１４と、各種装置を制御する制御部１５とを備えている。

前記観察用レーザ光源２は、可視レーザ光源２Ａと赤外パルスレーザ光源２Ｂの２種類のレーザ光源を備えている。可視レーザ光源２Ａは、例えば、４５７，４８８，５１４ｎｍの波長の観察用レーザ光Ｌ_１を発振するマルチラインアルゴンレーザのようなレーザ光源であり、該可視レーザ光源２Ａから出射される観察用レーザ光Ｌ_１の波長選択と強度変調とを行うためのＡＯＴＦ（Acousto-Optic Tunable Filter：音響光学可変波長フィルター）１６を備えている。赤外パルスレーザ光源２Ｂは、赤外光からなる観察用レーザ光Ｌ_１を出射するレーザ光源であり、赤外光の波長を切り替える波長切替制御装置１７と、強度変調を行うためのＡＯＭ（Acousto-Optic Modulator：音響光学変調器）１８とを備えている。

前記刺激用レーザ光源４は、例えば、上記マルチラインアルゴンレーザあるいは４０５ｎｍの波長の刺激用レーザ光Ｌ_２を発振する半導体レーザのようなレーザ光源であり、この刺激用レーザ光源４から出射される刺激用レーザ光Ｌ_２の波長選択と強度変調とを行うためのＡＯＴＦ１９を備えている。

観察用レーザ光源２Ａからの観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光源４からの刺激用レーザ光Ｌ_２はそれぞれ、ＡＯＴＦ１６，１９によって波長選択および強度変調された後に、光ファイバ２０，２１を介して伝播され、コリメートレンズ２２によって略平行光にされた状態で、それぞれ第１，第２の光走査装置３，５に入射されるようになっている。図中、符号２３は、反射ミラーであり、符号２４はダイクロイックミラーである。

前記第１、第２の光走査装置３，５は、例えば、相互に直交する２軸回りにそれぞれ揺動可能な２枚のガルバノミラー（図示略）を近接配置させており、観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２をそれぞれ、直交する２方向に走査させて、２次元的な走査範囲に照射することができるようになっている。

前記光路合成用ダイクロイックミラー８は、図３に示されるように、観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２の選択された波長、および光検出器１２，１３で検出する蛍光波長に対する透過率特性の異なる複数のダイクロイックミラー８ａ，８ｂおよび観察用レーザ光Ｌ_１を透過させる空穴８ｃを一方向に配列して構成されている。光路合成用ダイクロイックミラー８には、該光路合成用ダイクロイックミラー８をダイクロイックミラー８ａ，８ｂおよび空穴８ｃの配列方向に移動させるミラー駆動装置２５が備えられている。ミラー駆動装置２５の作動により光路合成用ダイクロイックミラー８を移動させて、任意のダイクロイックミラー８ａ，８ｂあるいは空穴８ｃを選択できるようになっている。

前記光検出器１２，１３は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）であり、試料Ａから戻ってきた蛍光Ｆを検出するようになっている。光検出器１２，１３は、蛍光Ｆの波長帯域毎に複数、例えば、２つ備えられている。これらの光検出器１２，１３の前段には、ダイクロイックミラー２６が配置され、戻ってきた蛍光Ｆを波長毎に分岐して各光検出器１２，１３に入射させるようになっている。各光検出器１２，１３の前段には共焦点ピンホール２７およびバリアフィルタ２８が配置されている。また、前記ダイクロイックミラー２６の前段には、第１の光走査装置３から戻ってきた蛍光Ｆを集光して共焦点ピンホール２７位置に結像させる共焦点レンズ２９が備えられている。共焦点ピンホール２７の位置は、対物レンズ１０の前側焦点位置と互いに共役な位置関係に配置されている。

共焦点レンズ２９と前記第１の光走査装置３との間には、観察用レーザ光源２からの観察用レーザ光Ｌ_１を反射する一方、試料Ａから戻る蛍光Ｆを透過させるダイクロイックミラーターレット３０が配置されている。ダイクロイックミラーターレット３０は、図２に示されるように、駆動装置３１により中心軸線回りに回転可能な円板状のターレット３２に、透過率特性の異なる複数のダイクロイックミラー３３ａ〜３３ｃを備え、観察用レーザ光源２からの観察用レーザ光Ｌ_１の波長に応じて切り替えられるようになっている。

前記スポット位置検出装置１４は、光路合成用ダイクロイックミラー８と対物レンズ１０との間の光路に挿脱可能に配置され、光路内に挿入された状態で、光路合成用ダイクロイックミラー８によって合成された観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２を反射する光路分岐用ミラー３４と、反射されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を集光して光スポットを形成する結像レンズ３５と、該結像レンズ３５によるレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の結像位置に撮像面を配置したＣＣＤのような撮像素子３６とを備えている。前記光路分岐用ミラー３４には、該光路分岐用ミラー３４を光路に挿脱するための切替装置３７が備えられている。光路分岐用ミラー３４は、光路内から抜き出された状態でレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を対物レンズ１０側に通過させるようになっている。

前記制御部１５は、前記ＡＯＴＦ１６，１９、波長切替制御装置１７、ＡＯＭ１８、第１の光走査装置３、第２の光走査装置５、駆動装置３１、ミラー駆動装置２５、切替装置３７および撮像素子３６に接続されている。制御部１５は、試料Ａに入射させるレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の波長を選択するためにＡＯＴＦ１６，１９および波長切替制御装置１７を作動させるとともに、ターレット駆動装置３１およびミラー駆動装置２５の作動によりダイクロイックミラーターレット３０の回転および光路合成用ダイクロイックミラー８の切替を行い、所望の透過率特性を有するダイクロイックミラー３３ａ〜３３ｃ，８ａ，８ｂを選択することができるようになっている。また、制御部１５は、レーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の強度を変調するためにＡＯＴＦ１６，１９およびＡＯＭ１８を作動させるようになっている。

また、制御部１５は、観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌ_２との光軸合わせを行う場合には、第１の光走査装置３および第２の光走査装置５を、例えば、振り角の中心位置で固定し、切替装置３７を作動させることにより、光路分岐用ミラー３４を光路内に挿入させ、観察用レーザ光源２からの観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光源４からの刺激用レーザ光Ｌ_２を反射させて撮像素子３６により撮像させるようになっている。そして、撮像素子３６により撮像された観察用レーザ光Ｌ_１の光スポットと、刺激用レーザ光Ｌ_２の光スポットとがずれている場合には、これらの光スポットが一致するように、前記第１、第２の光走査装置３，５のガルバノミラーの走査角にオフセットを与えるようになっている。

なお、図中、符号３８は接眼レンズ、符号３９は接眼レンズ３８に入射される蛍光を結像させる結像レンズ、符号４０はプリズムである。また、符号４１は水銀灯、符号４２は、光路に挿脱可能に配置され、水銀灯４１を用いた観察を行う場合に光路内に挿入されるミラー、符号４３は光ファイバ、符号４４は光ファイバ４３から発せられた白色光を集光する投影レンズである。

また、符号４５は、複数のミラーキューブ４６，４７を備え、回転によりミラーキューブ４６，４７を切り替えるキューブターレットである。キューブターレット４５にはキューブ切替装置４８が設けられ、必要に応じて作動させられることによりミラーキューブ４６，４７を切り替えることができるようになっている。

ミラーキューブ４６，４７としては、レーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を試料Ａに照射する際に、光路内に配置される反射ミラー４７ａを備えるミラーキューブ４７と、接眼レンズ３８を介した観察の際に光路内に配置される接眼観察用のミラーキューブ４６とが備えられている。接眼観察用のミラーキューブ４６は、水銀灯４１から発せられた白色光から励起光を選択的に透過させる励起フィルタ４６ａ、励起光を反射し、試料Ａから戻る蛍光を透過する励起ダイクロイックミラー４６ｂ、該励起ダイクロイックミラー４６ｂを透過してしまった励起光を遮断し、接眼観察する蛍光波長を透過するバリアフィルタ４６ｃを備えている。

このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１を用いて試料Ａを観察する場合には、観察用レーザ光源２である可視レーザ光源２Ａまたは赤外パルスレーザ光源２Ｂの少なくとも一方を作動させる。制御部１５は、ＡＯＴＦ１６および波長切替制御装置１７を作動させることにより、観察用レーザ光Ｌ_１の波長を設定するとともに、ＡＯＴＦ１６およびＡＯＭ１８を作動させることにより、観察用レーザ光Ｌ_１の強度を調節する。

制御部１５は、ダイクロイックミラーターレット３０の駆動装置３１を作動させ、選択した観察用レーザ光Ｌ_１の波長に適したダイクロイックミラー３３ａ〜３３ｃが光路内に配置されるようにダイクロイックミラーターレット３０のターレット３２を回転させる。
また、制御部１５は、光路合成用ダイクロイックミラー８のミラー駆動装置２５を作動させ、空穴８ｃが光路内に配置されるように光路合成用ダイクロイックミラー８を移動させる。

このとき、制御部１５は、スポット位置検出装置１４の切替装置３７を作動させ、光路分岐用ミラー３４を光路から退避させておく。
また、このとき、キューブターレット４５のキューブ切替装置４８を作動させ、反射ミラー４７ａを含むミラーキューブ４７を選択しておく。

このようにすることで、観察用レーザ光源２である可視レーザ光源２Ａから発せられた観察用レーザ光Ｌ_１は、ＡＯＴＦ１６によって波長選択および強度調整された後、光ファイバ２０を伝播してコリメートレンズ２２により略平行光とされ、ダイクロイックミラー２４，３３ａ〜３３ｃによって反射されて第１の光走査装置３により２次元的に走査される。

観察用レーザ光Ｌ_１の試料Ａにおける走査範囲は、第１の光走査装置３を構成する各ガルバノミラーの角度、および光路内に配置されている各光学要素に依存して決定される。通常、各ガルバノミラーの振り角の中心位置が接眼観察時の視野の中心と一致するように調節される。

第１の光走査装置３により２次元的に走査された観察用レーザ光Ｌ_１は、瞳投影レンズ６および結像レンズ９によって光路合成用ダイクロイックミラー８の空穴８ｃを介してリレーされ、ミラーキューブ４７の反射ミラー４７ａによって反射されて対物レンズ１０によりステージ１１上の試料Ａに集光される。

試料Ａにおいては、観察用レーザ光Ｌ_１が照射されることにより、試料Ａに含まれている蛍光物質が励起されて蛍光Ｆが発せられる。発生した蛍光Ｆは、対物レンズ１０、ミラーキューブ４７、結像レンズ９、空穴８ｃ、瞳投影レンズ６および第１の光走査装置３を介して観察用レーザ光Ｌ_１の光路を戻る。そして、ダイクロイックミラーターレット３０のダイクロイックミラー３３ａ〜３３ｃを透過して共焦点レンズ２９によって集光され、ダイクロイックミラー２６によって波長毎に分岐された後、それぞれ共焦点ピンホール２７を通過し、バリアフィルタ２８を透過した蛍光Ｆのみが各光検出器１２，１３により検出される。

各共焦点ピンホール２７の位置は、対物レンズ１０の焦点位置と互いに共役な位置関係に配置されているので、対物レンズ１０の焦点位置において発生した蛍光Ｆのみを各光検出器１２，１３により検出することができる。各光検出器１２，１３には、第１の光走査装置３による走査範囲の各位置に観察用レーザ光Ｌ_１を照射したときに発生する蛍光Ｆが検出されるので、検出された蛍光Ｆの光量信号と、第１の光走査装置３による走査位置とを対応づけて記憶しておくことにより、対物レンズ１０の前側焦点位置を含む平面に沿う試料Ａ内部の所定深さに広がる内部組織の画像を蛍光Ｆの波長毎に取得し、表示部４９に表示することができる。

次に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１を用いて、刺激用レーザ光Ｌ_２により試料Ａに光刺激を与えながら観察用レーザ光Ｌ_１により観察を行うには、光路合成用ダイクロイックミラー８のミラー駆動装置２５を作動させ、選択された波長の観察用レーザ光Ｌ_１を透過し、選択された波長の刺激用レーザ光Ｌ_２を反射する透過率特性を有するダイクロイックミラー３３ａまたはダイクロイックミラー３３ｂを光路内に配置しておく。

そして、刺激用レーザ光源４から発せられ、ＡＯＴＦ１９により波長選択および強度変調され、光ファイバ２１により伝播された刺激用レーザ光Ｌ_２をコリメートレンズ２２により略平行光として、第２の光走査装置５および瞳投影レンズ７を介した後に光路合成用ダイクロイックミラー８によって反射させる。これにより、刺激用レーザ光Ｌ_２が観察用レーザ光Ｌ_１の光路に沿って入射され、以降、観察用レーザ光Ｌ_１と同一の光路を辿って試料Ａに照射される。刺激用レーザ光Ｌ_２の試料Ａにおける照射位置は、第２の光走査装置５を構成する各ガルバノミラーの角度および光路上の各光学要素によって決定される。通常、各ガルバノミラーの振り角の中心位置が第１の光走査装置３の各ガルバノミラーの振り角の中心位置と一致するように刺激用レーザ光Ｌ_２の第２の光走査装置５が調節される。

これにより、第２の光走査装置５を作動させて、刺激用レーザ光Ｌ_２を試料Ａ上の所望の位置に照射しつつ、観察用レーザ光Ｌ_１の照射により発生する蛍光Ｆを光検出器１２，１３により検出することで、光刺激を与えたときの試料Ａの挙動を観察することができる。

この場合において、本実施形態においては、観察用レーザ光源２および刺激用レーザ光源４から出射するレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の波長を変更し、その波長に合わせて、各種ダイクロイックミラー３３ａ〜３３ｃ，８ａ，８ｂを変更することになるが、ダイクロイックミラー３３ａ〜３３ｃ，８ａ，８ｂのそれぞれの角度誤差や反射面の一誤差により、観察用レーザ光Ｌ_１の走査範囲と刺激用レーザ光Ｌ_２の走査範囲にずれが生じる。

本実施形態においては、観察用レーザ光Ｌ_１あるいは刺激用レーザ光Ｌ_２の波長を変更する場合には、観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２の光軸調整を行う。まず、切替装置３７を作動させ、光路分岐用ミラー３４を光路内に挿入する。そして、第１の光走査装置３および第２の光走査装置５を構成する各ガルバノミラーを所定の位置、例えば、振り角の中心位置で固定する。光路分岐用ミラー３４は、光路合成用ダイクロイックミラー８と対物レンズ１０との間に挿脱可能に配置されているので、光路内に挿入されると、光路合成用ダイクロイックミラー８により光路を合成された観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２がいずれも光路分岐用ミラー３４によって反射される。そして、反射された観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２は、結像レンズ３５によって集光されて撮像素子３６により撮像される。

各レーザ光源２，４におけるレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の波長の切替やダイクロイックミラー８ａ，８ｂ，３３ａ〜３３ｃ等の光学系の変更によって、観察用レーザ光Ｌ_１または刺激用レーザ光Ｌ_２の光路が変化した場合には、撮像素子３６により検出される２つの光スポットの位置にずれが発生する。制御部１５は、撮像素子３６からの信号に基づいて、２つのレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の光スポット位置のずれ量を検出し、そのずれ量がゼロになるように、第１または第２の光走査装置３，５の少なくとも一方のガルバノミラーの走査角度を調節する。具体的には、一方の光走査装置３，５のガルバノミラーの走査角にオフセットを付与する。

これにより、２つのレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の光スポットの位置が一致するように補正される。したがって、試料Ａ上の正確な位置に刺激用レーザ光Ｌ_２を照射し、これに精度よく対応する走査範囲に観察用レーザ光Ｌ_１を照射して画像を取得することが可能となる。

このように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によれば、光路合成用ダイクロイックミラー８と対物レンズ１０との間に挿入した光路分岐用ミラー３４によって、試料Ａに向かうレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を遮って光スポット位置の補正を行うので、補正作業時に試料Ａにレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を照射せずに済み、補正作業中における試料Ａの退色等の不都合の発生を未然に防止することができる。

また、ステージ１１上に基準サンプルを配置して、光スポットの位置を確認する方法とは異なり、光路合成用ダイクロイックミラー８と対物レンズ１０との間から観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２を取り出して検出するので、補正作業時に、試料Ａをステージ１１上から移動させたり交換したりする必要がない。したがって、波長の切替前後において試料Ａの状態を変化させることなく、同一条件で観察を継続することができる。また、試料Ａの付け外し作業が不要となり、観察作業を簡易にすることができる。

なお、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１を用いて、接眼レンズ３８を介した観察を行うには、ミラー４２を光路内に挿入し、光路分岐用ミラー３４を光路から抜き出しておく。また、キューブ切替装置４８を作動させてキューブターレット４５を回転させ、所望のミラーキューブ４６を光路内に配置しておく。この状態で、水銀灯４１を作動させて光ファイバ４３および投影レンズ４４を介して水銀灯４１からの光をミラー４２により光路内に入射させ、ミラーキューブ４６の励起フィルタ４６ａを介して励起光を発生させ、励起ダイクロイックミラー４６ｂによって励起光を反射して対物レンズ１０に入射させ、試料Ａに照射させる。試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ１０、励起ダイクロイックミラー４６ｂを透過してバリアフィルタ４６ｃによって励起光成分を除去された後、結像レンズ３９、プリズム４０および接眼レンズ３８を介して観察されることになる。

また、本実施形態においては、光路合成用ダイクロイックミラー８として、複数のダイクロイックミラー８ａ，８ｂと空穴８ｃとが配列されたものをその配列方向に移動させることで、波長毎に異なるダイクロイックミラー８ａ，８ｂを光路内に配置させることとしたが、これに代えて、図４に示されるように、アリ溝８ｄとアリ?８ｅとを嵌合させる等の位置決め機構により精度よく位置決め状態に固定可能なダイクロイックミラー８ａを波長毎に交換することにしてもよい。この場合に、ダイクロイックミラー８ａに該ダイクロイックミラー８ａの識別符号８ｆを付しておき、ダイクロイックミラー８ａが交換されたときには、その識別符号８ｆをセンサ８ｇによって読み取ることで、制御部１５に交換を認識させ、そのタイミングで位置補正作業を行わせることにしてもよい。

また、本実施形態においては、撮像素子３６に観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２を導くための光路分岐用ミラー３４を光路に挿脱可能に配置したが、これに代えて、数％の反射率を有する透明なガラスを光路上に常時配置しておき、数％の観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２を反射して撮像素子３６により常時撮像可能にすることにしてもよい。

このようにすることで、光路分岐用ミラー３４を移動させる切替機構３７が不要となり、装置を簡易な構造にすることができるとともに、可動部分を少なくして、装置のコンパクト化、低コスト化を図ることができる。
また、数％のレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を常時分岐して検出しているので、例えば、装置の立ち上げ時や画像を取得する直前などに、定期的にあるいは必要に応じて、任意のタイミングで補正作業を容易に行うことが可能となる。

また、本実施形態においては、光スポット位置検出装置１４として、２つの光スポットの２次元的な位置を検出可能なＣＣＤのような２次元の撮像素子３６を有するものを採用したが、これに代えて、４分割センサを用いることにしてもよい。また、光路分岐用ミラー３４により分岐される光束が結像レンズ９後の略平行光となったレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２であるため、結像レンズ３５およびＣＣＤ３６に代えて、光束の角度を検出する角度センサを有するものを採用することにしてもよい。

次に、本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００について、図５を参照して以下に説明する。
なお、以下の各実施形態の説明において、特に言及しない場合には、上述した第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００は、図５に示されるように、第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１のスポット位置検出装置１４に代えて、キューブターレット４５を着脱可能とし、該キューブターレット４５の着脱位置に着脱可能に設けられたスポット位置検出装置１０１を備えている。このスポット位置検出装置１０１は、キューブターレット４５の着脱位置に着脱可能に取り付けられるケース１０２と、該ケース１０２に固定され、略平行光として入射される観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２を集光する結像レンズ１０３と、該結像レンズ１０３によるレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の結像位置に配置される撮像素子１０４とを備えている。

このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００を用いて、観察用レーザ光Ｌ_１の光軸と刺激用レーザ光Ｌ_２の光軸とを位置合わせするには、キューブターレット４５を取り外した状態で、図５に示されるように、該キューブターレット４５の着脱位置に、スポット位置検出装置１０１を取り付ける。このようにすると、光路合成用ダイクロイックミラー８により合波され結像レンズ９によって略平行光とされた観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２がスポット位置検出装置１０１に入射され、結像レンズ１０３によって結像された後に撮像素子１０４により撮像される。

これにより、第１の実施形態と同様に、観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌ_２の光スポットを撮像し、位置ずれが生じている場合には、制御部１５により、その位置ずれを補正するよう各光走査装置３，５を調節することができる。
この場合において、本実施形態においても、観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌ_２との光軸合わせの際に、両レーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を試料Ａに照射させずに済むので、補正作業中における試料Ａの退色等の不都合の発生を未然に防止することができる。

また、補正作業時に、試料Ａをステージ１１上から移動させたり交換したり、あるいは基準サンプルを配置したりする必要がなく、波長の切替前後において試料Ａの状態を変化させることなく、同一条件で観察を継続することができる点も、第１の実施形態と同様である。
また、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００によれば、通常、着脱可能に設けられるキューブターレット４５の着脱位置を利用してスポット位置検出装置１０１を配置するので、キューブターレット４５のスペースをそのまま利用することができる。したがって、既存の走査型レーザ顕微鏡１００に後付けで、スポット位置検出手段１０１を取り付けることが容易になり、また、キューブターレット４５用のスペースとして既に確保されているスペースを利用することで、装置全体の大型化を防止することができる。

なお、キューブターレット４５を着脱可能とし、その着脱位置にスポット位置検出装置１０１を配置することに代えて、キューブターレット４５に備えられたミラーキューブ４６，４７と同様の形状を有するようにスポット位置検出装置１０１を構成し、キューブターレット４５の切替動作によって光路上に配置することとしてもよい。

次に、本発明の第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１１０について、図６を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１１０は、図６に示されるように、第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１の光路合成用ダイクロイックミラー８と対物レンズ１０との間に挿脱可能なスポット位置検出装置１４に代えて、試料Ａを挟んで対物レンズ１０と対向する位置に、結像レンズ１１１と撮像素子１１２とを備えるスポット位置検出装置１１３を備えている。

このスポット位置検出装置１１３は、例えば、透過照明用のコンデンサレンズを装着するアリ溝（図示略）に装着可能な取付アリ１１４を有している。該取付アリ１１４をアリ溝に係合させることで、コンデンサレンズの代わりに取り付けられるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１１０によれば、光路合成用ダイクロイックミラー８によって合波された観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌとは試料Ａを透過してスポット位置検出装置１１３の撮像素子１１２により検出される。これにより、第１，２の実施形態と同様にして、２つのレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の光軸ずれの補正作業を行うことができる。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１１０によれば、スポット位置検出装置１１３が、試料Ａを透過したレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を検出するので、補正作業は、試料Ａを退色等させない程度の光量および照射時間内に実施する必要があるが、観察用レーザ光Ｌ_１による試料Ａの観察を行いながら、所望のタイミングで、いつでも補正作業を行うことができるという利点がある。
また、予め透過照明用のコンデンサレンズの代わりに装着するので、既存の走査型レーザ顕微鏡に後付けで、スポット位置検出装置１１３を取り付けることが容易になり、また、既にコンデンサレンズ用に確保されているスペースを利用することで、装置全体の大型化を防止することができる。

次に、本発明の第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１２０について、図７を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１２０は、図７に示されるように、第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１の光路合成用ダイクロイックミラー８と対物レンズ１０との間に挿脱可能なスポット位置検出装置１４に代えて、接眼レンズ３８用の鏡筒１２１の上部に配置されるスポット位置検出装置１２２を備えている。スポット位置検出装置１２２は、鏡筒１２１内の結像レンズ３９による結像位置に撮像面を配置する撮像素子１２３を備えている。

鏡筒１２１の上部には、対物レンズ１０により集光された試料Ａからの光がプリズム４０を透過して結像レンズ３９により結像される位置にＣＣＤカメラを取り付けるためのＣマウント１２４のような着脱機構が通常設けられているので、該Ｃマウント１２４を利用してスポット位置検出装置１２２を取り付けることができる。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１２０を用いて観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌ_２の光軸補正を行う場合には、キューブターレット４５を作動させてハーフミラー４７ａ′のキューブ４７′を光路上に配置する。このようにすることで、各レーザ光源２Ａ，４から発せられ、光路合成用ダイクロイックミラー８によって合成された観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２は、ハーフミラー４７ａ′によって反射されて試料Ａに照射され、試料Ａにおいて反射して戻る。そして、ハーフミラー４７ａ′を透過して結像レンズ３９により結像され、プリズム４０を透過して撮像素子１２３により光スポットとして検出される。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１２０によれば、接眼レンズ３８用の鏡筒１２１に内蔵されている結像レンズ３９を利用するので、Ｃマウント１２４に装着可能な汎用のＣＣＤカメラをスポット位置検出装置１２２の撮像素子１２３として利用することができるという利点がある。したがって、水銀灯４１による蛍光観察用のＣＣＤカメラをスポット位置検出装置１２２として利用することが可能となる。その結果、既存の走査型レーザ顕微鏡に後付けで、スポット位置検出装置１２２を取り付けることが容易になり、また、既に蛍光観察ＣＣＤカメラ用に確保されているスペースを利用することで、装置全体の大型化を防止することができる。

次に、本発明の第５の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１３０について、図８を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明においては、上述した第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１２０と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１３０は、図８に示されるように、刺激用レーザ光源４、ＡＯＴＦ１９、光ファイバ２１、コリメートレンズ２２、第２の光走査装置５、瞳投影レンズ７および結像レンズ１３１等を含む刺激用レーザ光Ｌ_２を照射する装置が、試料Ａを挟んで対物レンズ１０と対向する側に配置されている点において、第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１２０と相違している。符号１３２は反射ミラーである。

キューブターレット４５をハーフミラー４７ａ′からなるミラーキューブ４７′に切り替え、観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２を出射することにより、観察用レーザ光Ｌ_１はハーフミラーからなるミラーキューブ４７′によって反射されて試料Ａに照射され、試料Ａにおける反射光がミラーキューブ４７′を透過して、接眼観察用の鏡筒１２１上に取り付けられている撮像素子１２３によって撮像される。一方の刺激用レーザ光Ｌ_２は、試料Ａの下方から試料Ａに照射されることで、その一部が試料Ａを透過して対物レンズ１０により集光され、ミラーキューブ４７′を透過して上記撮像素子１２３により撮像される。

したがって、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１３０によっても、撮像素子１２３によって、観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌ_２の光スポットを同時に撮像することが可能となり、そのずれを修正するように走査装置３，５を作動させて、光軸の位置合わせを容易に行うことができる。

次に、本発明の第６の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１４０について、図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１４０は、第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１１０のスポット位置検出ユニット１１３に代えて、試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆ_１，Ｆ_２を集光する結像レンズ１４１と、試料Ａを透過した観察用レーザ光Ｌ_１および刺激用レーザ光Ｌ_２を遮断し、刺激用レーザ光Ｌ_２によって発生した蛍光Ｆ_２のみを透過するバリアフィルタ１４２と、バリアフィルタ１４２を透過した蛍光Ｆ_２を略平行光にするコリメートレンズ１４３と、略平行光にされた蛍光Ｆ_２を検出する非ディスキャン検出器１４４とを備えている。

コリメートレンズ１４３と非ディスキャン検出器１４４との間には、光路内に挿脱可能に配置されたミラー１４５が備えられており、該ミラー１４５が光路内に配された状態で、蛍光Ｆ_２は、反射されて非ディスキャン検出器１４４に入射させられるようになっている。一方、ミラー１４５を挟んでコリメートレンズ１４３と対向する位置には、透過照明用のランプ１４６が配置されており、ミラー１４５が光路内から退避させられた状態で、接眼レンズ３８を介して透過照明による観察を行うための透過照明用のランプ１４６からコリメートレンズ１４３に向けて透過照明光が入射されるようになっている。図中、符号１４７は反射ミラーである。

このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１４０によれば、観察用レーザ光Ｌ_１が試料Ａに照射されると、試料において発生した蛍光Ｆ_１が、観察用レーザ光Ｌ_１の照射光路を戻ってダイクロイックミラーターレット３０により分岐され、光検出器１２，１３により検出されることで、観察用レーザ光Ｌ_１の走査画像を取得することができる。
一方、刺激用レーザ光Ｌ_２が試料Ａに照射されると、試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆ_２が試料Ａを透過して、透過照明光路に入り、結像レンズ１４１、バリアフィルタ１４２、ミラー１４７、コリメートレンズ１４３およびミラー１４５を介して非ディスキャン検出器１４４により検出される。これにより、刺激用レーザ光Ｌ_２の走査画像を取得することができる。

したがって、制御部１５においては、取得された２つの走査画像を画像処理によって比較することにより、観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌ_２との位置ずれを走査画像のずれに基づいて求めることが可能となり、求められた位置ずれに基づいて、観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌ_２との光軸の位置合わせを行うことができる。
一方、観察用レーザ光源Ｌ_１として超短パルスレーザ光を出射する光源を使用する場合には、前記光検出器１４４を多光子蛍光画像を取得するための非ディスキャン検出器として使用することができる。したがって、試料Ａにおいて多光子励起効果を発生させることにより、試料Ａの所定深さ位置における鮮明な蛍光画像を取得することができる。

また、透過照明による接眼レンズ３８を用いた観察を行う場合には、ミラー１４５を光路から退避させ、ミラーキューブ４６として空穴（図示略）を採用することで、透過照明用のランプ１４６からの照明光を試料Ａに照射し、試料Ａを透過する光を結像レンズ３９、プリズム４０および接眼レンズ３８を介して観察することが可能となる。

本実施形態によれば、ノマルスキー観察等、試料細胞の全体像を把握するために、走査型レーザ顕微鏡１４０に通常備えられている透過検出ユニットを利用して刺激用レーザ光Ｌ_２の走査画像を取得するので、新たな撮像素子の追加等、特別なユニットを用いる必要がなく、既存の走査型レーザ顕微鏡を用いて容易にレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の光軸合わせを行うことができる。また、試料Ａを動かしたり、基準サンプルに載せ替えたりする必要がなく、所望のタイミングで光軸合わせを行うことができ、また、試料Ａに対する観察条件を変化させてしまうことを防止できる。

なお、本実施形態においては、観察用レーザ光Ｌ_１については、第１の光走査装置３を介して戻る蛍光Ｆ_１を光検出器１２，１３により検出することで走査画像を取得し、刺激用レーザ光Ｌ_２については、試料Ａを透過する方向に発生する蛍光Ｆ_２を透過検出用の非ディスキャン検出器１４４により検出することで走査画像を取得することとしたが、これに代えて、観察用レーザ光Ｌ_１により励起される蛍光Ｆ_１の波長と、刺激用レーザ光Ｌ_２により励起される蛍光Ｆ_２の波長とが同等の波長域である場合には、観察用レーザ光Ｌ_１により発生する蛍光Ｆ_１についても、非ディスキャン検出器１４４により検出することとしてもよい。この場合に、刺激用レーザ光Ｌ_２による走査画像と、観察用レーザ光Ｌ_１による走査画像は、同時に取得してもよいし、時分割で取得することにしてもよい。

次に、本発明の第７の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１５０について、図１０を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１５０は、上記第６の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１４０と比較して、非ディスキャン検出器１５１の位置が相違している。

本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１５０は、接眼観察用の鏡筒１２１の上に非ディスキャン検出器１５１を備えている。鏡筒１２１と非ディスキャン検出器１５１との間には、刺激用レーザ光Ｌ_２および観察用レーザ光Ｌ_１を遮断し、刺激用レーザ光Ｌ_２により励起される蛍光Ｆ_２のみを透過する特性を有するバリアフィルタ１５２が挿脱可能に備えられている。図中、符号１５３は投影レンズである。

このように構成された本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１５０を用いて試料Ａを観察するには、キューブターレット４５を作動させることにより、観察用レーザ光Ｌ_１、刺激用レーザ光Ｌ_２および観察用レーザ光Ｌ_１により励起される蛍光Ｆ_１を反射し、刺激用レーザ光Ｌ_２により励起される蛍光Ｆ_２を透過させるダイクロイックミラー４７ａ″からなるミラーキューブ４７″を光路内に配置しておく。この状態で、観察用レーザ光源２Ａから観察用レーザ光Ｌ_１を出射する。

第１の光走査装置３の作動により、観察用レーザ光Ｌ_１が試料Ａ上において走査され、試料Ａにおいて蛍光Ｆを発生させる。発生した蛍光Ｆ_１は、対物レンズ１０を介して集光され、ミラーキューブ４７″により反射されて同一光路を戻り、ダイクロイックミラーターレット３０のダイクロイックミラー３３ａ〜３３ｃによって分岐されて光検出器１２，１３により検出される。制御部１５においては、光検出器１２，１３による蛍光Ｆ_１の光量情報と、各瞬間の第１の光走査装置３におけるガルバノミラーの振り角度情報とに基づいて、試料Ａの蛍光画像を取得することができる。

一方、刺激用レーザ光源４から発せられた刺激用レーザ光Ｌ_２は、第２の光走査装置５を介し、光路合成用ダイクロイックミラー８によって観察用レーザ光Ｌ_１と合成された後に、ミラーキューブ４７″によって反射され、試料Ａに照射される。第２の光走査装置５を作動させることにより、試料Ａ上において走査され、試料Ａにおいて蛍光Ｆ_２を発生させる。発生した蛍光Ｆ_２は、対物レンズ１０を介して集光され、ミラーキューブ４７″およびバリアフィルタ１５２を透過して非ディスキャン検出器１５１により検出される。制御部１５においては、非ディスキャン検出器１５１による蛍光Ｆ_２の光量情報と、各瞬間の第２の光走査装置５におけるガルバノミラーの振り角度情報とに基づいて、試料Ａの蛍光画像を取得することができる。

そして、制御部１５においては、取得された観察用レーザ光Ｌ_１に基づく蛍光Ｆ_１の走査画像と、刺激用レーザ光Ｌ_２に基づく蛍光Ｆ_２の走査画像とを画像処理により対比することで、観察用レーザ光Ｌ_１と刺激用レーザ光Ｌ_２との光軸のずれを検出し、そのずれを補正するように第１の光走査装置３および第２の光走査装置５の振り角度を補正することができる。

本実施形態によれば、観察用レーザ光源２として超短パルスレーザ光を出射する赤外パルスレーザ光源２Ｂを使用する場合に、多光子蛍光画像を取得することに使用可能な非ディスキャン検出器１５１を刺激用レーザ光Ｌ_２の走査画像を取得するために使用するので、新たな撮像素子の追加等、特別なユニットを用いる必要がなく、既存の走査型レーザ顕微鏡を用いて容易にレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の光軸合わせを行うことができる。また、試料Ａを動かしたり、基準サンプルに載せ替えたりする必要がなく、所望のタイミングで光軸合わせを行うことができ、また、試料Ａに対する観察条件を変化させてしまうことを防止できる。

なお、本実施形態においては、観察用レーザ光Ｌ_１については、第１の光走査装置３を介して戻る蛍光Ｆ_１を光検出器１２，１３により検出することで走査画像を取得し、刺激用レーザ光Ｌ_２については、試料Ａから戻る方向に発生する蛍光Ｆ_２を非ディスキャン検出器１５１により検出することで走査画像を取得することとしたが、これに代えて、刺激用レーザ光Ｌ_２により励起される蛍光Ｆ_２の波長と、観察用レーザ光Ｌ_１により励起される蛍光Ｆ_１の波長とが同等の波長域である場合には、観察用レーザ光Ｌ_１により発生する蛍光Ｆ_１についても、非ディスキャン検出器１５１により検出することとしてもよい。この場合に、刺激用レーザ光Ｌ_２による走査画像と、観察用レーザ光Ｌ_１による走査画像は、同時に取得してもよいし、時分割で取得することにしてもよい。

本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 図１の走査型レーザ顕微鏡のダイクロイックミラーターレットを示す正面図である。 図１の走査型レーザ顕微鏡の光路合成用ダイクロイックミラーの一例を示す斜視図である。 図３の光路合成用ダイクロイックミラーの変形例を示す斜視図である。 本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 本発明の第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 本発明の第４の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 本発明の第５の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 本発明の第６の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。 本発明の第７の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ 試料
Ｌ_１ 観察用レーザ光
Ｌ_２ 刺激用レーザ光
Ｆ，Ｆ_１，Ｆ_２ 蛍光（光）
１，１００，１１０，１２０，１３０，１４０，１５０ 走査型レーザ顕微鏡
２，２Ａ，２Ｂ 観察用レーザ光源
３ 第１の光走査装置
４ 刺激用レーザ光源
５ 第２の光走査装置
８ 光路合成用ダイクロイックミラー（光路合成手段）
１０ 対物レンズ
１２，１３ 検出光学系
１４，１０１，１１３，１２２ スポット位置検出手段
１５ 制御部（補正手段）
３４ ミラー
３６，１０４，１１２，１２３ 撮像素子（スポット位置検出器）
４５ キューブターレット
４６，４７，４７′，４７″ ミラーキューブ
１１１，１４１ 結像レンズ（結像手段）
１４２，１５２ バリアフィルタ
１４４，１５１ 非ディスキャン検出器

Claims (17)

1. 試料を励起する観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、
   該観察用レーザ光を、対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する第１の光走査装置と、
   前記観察用レーザ光が照射された試料から発せられる光を検出する検出光学系と、
   試料に光刺激を与える刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源と、
   該刺激用レーザ光を、前記対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する、前記第１の光走査装置とは異なる第２の光走査装置と、
   前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光により形成されるスポット光の位置を検出するスポット位置検出手段と、
   該スポット位置検出手段により検出された観察用レーザ光および刺激用レーザ光のスポット光の位置に基づいて、前記観察用レーザ光および刺激用レーザ光の位置ずれを補正する補正手段とを備える走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記補正手段が、前記第１の光走査装置または前記第２の光走査装置の少なくとも一方の走査角にオフセットを付与する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記観察用レーザ光の光路と前記刺激用レーザ光の光路とを合成する光路合成手段を備え、
   前記スポット位置検出手段が、前記光路合成手段と前記対物レンズとの間に配置されている請求項１または請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 前記スポット位置検出手段が、前記光路合成手段と前記対物レンズとの間の光路に挿脱可能に設けられている請求項３に記載の走査型レーザ顕微鏡。
5. 前記光路合成手段と対物レンズとの間に、複数のミラーキューブを有するキューブターレットが着脱可能に設けられるとともに、
   前記スポット位置検出手段が、前記キューブターレットの着脱位置に、着脱可能に設けられている請求項４に記載の走査型レーザ顕微鏡。
6. 前記スポット位置検出手段が、撮像素子または多分割センサからなるスポット位置検出器と、光路に挿脱可能に設けられ、光路上に配置されたときに、観察用レーザ光および刺激用レーザ光を前記スポット位置検出器に導くミラーとを備える請求項３に記載の走査型レーザ顕微鏡。
7. 前記スポット位置検出手段が、撮像素子または多分割センサからなるスポット位置検出器と、観察用レーザ光および刺激用レーザ光の一部を前記スポット位置検出器に導くビームスプリッタとを備える請求項３または請求項４に記載の走査型レーザ顕微鏡。
8. 前記スポット位置検出手段は、前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光が前記対物レンズを介して試料に照射されることにより試料から発せられる光が対物レンズを介して結像する位置に配置された撮像素子を備える請求項１または請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
9. 前記撮像素子が、着脱可能に設けられている請求項８に記載の走査型レーザ顕微鏡。
10. 前記スポット位置検出手段は、前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光が前記対物レンズを介して試料に照射されることにより試料から発せられる光を、試料に対して前記対物レンズとは反対側において結像させる結像手段と、該結像手段による結像位置に配置された撮像素子とを備える請求項１または請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
11. 前記スポット位置検出手段が、荷電結合素子または多分割センサである請求項１から請求項５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
12. 前記スポット位置検出手段は、前記観察用レーザ光および刺激用レーザ光が略平行光となる位置に配置され、これら観察用レーザ光および刺激用レーザ光の傾斜角度を検出する角度センサを備え、検出された傾斜角度に基づいてスポット位置のずれを検出する請求項１から請求項５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
13. 試料を励起する観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、
    該観察用レーザ光源を対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する第１の光走査装置と、
    前記観察用レーザ光が照射された試料から発せられる光を検出する検出光学系と、
    試料に光刺激を与える刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源と、
    該刺激用レーザ光を前記対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する、前記第１の光走査装置とは異なる第２の光走査装置と、
    前記観察用レーザ光と刺激用レーザ光の光路を合成する光路合成手段と、
    前記第２の光走査装置の作動により、刺激用レーザ光を試料上で走査した際に得られる蛍光、反射光または透過光を走査装置を経ることなく検出する非ディスキャン検出器と、
    該非ディスキャン検出器により取得された刺激用レーザ光に基づく走査画像と、前記検出光学系により取得された観察用レーザ光に基づく走査画像とに基づいて、刺激用レーザ光および観察用レーザ光の位置ずれを求め、この位置ずれを補正する補正手段とを備える走査型レーザ顕微鏡。
14. 試料を励起する観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、
    該観察用レーザ光源を対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する第１の光走査装置と、
    試料に光刺激を与える刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源と、
    該刺激用レーザ光を前記対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する、前記第１の光走査装置とは異なる第２の光走査装置と、
    前記観察用レーザ光と刺激用レーザ光の光路を合成する光路合成手段と、
    前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光を試料上で走査した際に得られる光を走査装置を経ることなく検出する非ディスキャン検出器と、
    該非ディスキャン検出器により取得された観察用レーザ光および刺激用レーザ光に基づく走査画像に基づいて、刺激用レーザ光および観察用レーザ光の位置ずれを求め、この位置ずれを補正する補正手段とを備える走査型レーザ顕微鏡。
15. 前記非ディスキャン検出器が、試料に対して前記対物レンズとは反対側の光路上に配置されている請求項１３または請求項１４に記載の走査型レーザ顕微鏡。
16. 前記非ディスキャン検出器の前段に刺激用レーザ光を遮断し、蛍光を透過するバリアフィルタを備える請求項１３から請求項１５のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
17. 試料を励起する観察用レーザ光を発する観察用レーザ光源と、
    該観察用レーザ光源を対物レンズを介して試料上で２次元的に走査する第１の光走査装置と、
    前記観察用レーザ光が照射された試料から発せられる光を検出する検出光学系と、
    試料に光刺激を与える刺激用レーザ光を発する刺激用レーザ光源と、
    該刺激用レーザ光を、前記試料に対して対物レンズとは反対側から入射させて試料上で２次元的に走査する、前記第１の光走査装置とは異なる第２の光走査装置と、
    前記観察用レーザ光および前記刺激用レーザ光が試料に照射されることにより試料から発せられる光が対物レンズを介して結像する位置に配置され、スポット光の位置を検出する撮像素子からなるスポット位置検出手段と、
    該スポット位置検出手段により検出されたスポット光の位置に基づいて、前記観察用レーザ光および刺激用レーザ光の位置ずれを補正する補正手段とを備える走査型レーザ顕微鏡。

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