JP4169396B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標本に照射するレーザ光とこの標本からの光とを分離するビームスプリッタを複数備え、これらビームスプリッタを切替え可能にした走査型レーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、特開平８−２７１７９２号公報には、ビームスプリッタで反射させたレーザ光を対物レンズにより集光して標本上にスポット光を結ばせると共にこのスポット光を標本上に２次元走査し、このときの標本からの反射光をビームスプリッタを透過させて共焦点ピンホールを通して光検出器に導く走査型レーザ顕微鏡が開示されている。
【０００３】
図６はかかる走査型レーザ顕微鏡の構成図であって、レーザ光源１から発振したレーザ光（照明光）Ｌは、光分離素子としての波長選択用ビームスプリッタ（ここでは励起用ダイクロイックミラー）２ａで反射し、さらにミラー３で反射して各ガルバノミラー５、６に入射する。これらガルバノミラー５、６は、照明光Ｌを標本上に２次元走査するもので、この照明光Ｌは、ミラー４、瞳投影レンズ７を通って図示しない対物レンズの像面に結像し、さらに標本上にスポットを結ぶとともに標本上に２次元走査される。
【０００４】
このときの標本に発生する蛍光又は反射レーザ光（検出光）は、上記光路と逆の光路を通って再び波長選択用ダイクロイックミラー２ａに入射し、このミラー２ａを透過し、続く結像レンズ８を透過し、さらに共焦点絞り（共焦点ピンホール）９を通過して光検出器１０で検出される。
【０００５】
ここで用いている波長選択用ビームスプリッタとしては、波長選択用ダイクロイックミラー２ａの他に波長特性の異なる例えば２つの波長選択用ダイクロイックミラー２ｂ、２ｃを切り替え自在に備えており、これら波長選択用ダイクロイックミラー２ｂ、２ｃに切り替えた場合、共焦点ピンホール９上で生じる光軸ずれを補正する必要がある。
【０００６】
この光軸ずれの補正は、結像レンズ８と共焦点ピンホール９の間の光路１１上に２枚の平行平面板１２、１３を配置し、これら平行平面板１２、１３をそれぞれ回転軸１２ａ、１３ａを中心として回転させ、共焦点ピンホール９を通過する光量が最も大きくなるように標本からの光を正確に共焦点ピンホールに導くような位置調整を行う（以下、アライメントと称する）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のように波長選択用ダイクロイックミラー２ｂ、２ｃの切り替え作業を行った後に共焦点ピンホール９のアライメント行う場合には、対物レンズによりスポットを結ぶ面上に標本を配置して実際にレーザ光を照射する必要がある。
【０００８】
ところが、通常、観察用蛍光標本は、褪色等の問題があり、アライメント時にレーザ光を標本に対して長時間照射するのは問題がある。又、アライメント用の標本を特別にセットすればよいが、そのアライメント用の標本に対するピント合わせを正確に行う必要があり、手間がかかる。さらに、アライメント後の観察用蛍光標本の位置再設定にも手間がかかる。
【０００９】
そこで本発明は、ビームスプリッタの切り替え時の共焦点ピンホールへのアライメントを煩わしい作業を必要とせずに簡単な構成で正確にできる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１によれば、レーザ光を反射又は透過させる切換可能な複数の光分離素子を用い、分離素子で反射又は透過させたレーザ光は対物レンズを介して標本上に照射され、この標本からの光は光分離素子により透過又は反射され、共焦点ピンホールを通して光検出器に導かれるようにした走査型レーザ顕微鏡において、
光分離素子で反射又は透過したレーザ光を入射し、この入射したレーザ光の角度とこの入射したレーザ光を反射して出射する場合のレーザ光の角度とを同一にするアライメント光学系と、
光分離素子を反射又は透過したレーザ光を共焦点ピンホールと光軸とのアライメント時にはアライメント光学系に導き、かつ標本の観察時には対物レンズに導くように光路を切り換える光路切替え手段と、
アライメント時に共焦点ピンホールを通過する光量を光検出器で検出し、この光量に基づいて共焦点ピンホールを通る光量が最大になるように共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を行う調整手段と、
を備えた走査型レーザ顕微鏡である。
【００１１】
請求項２によれば、請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡において、標本からの光を少なくとも２波長に分離する分光光学系を備えると共に、
共焦点ピンホール及び光検出器を分光光学系で分離される波長の数に応じて設け、
分光光学系を切り替えた時、調整手段は、光路切替え手段を制御して光分離素子で反射又は透過したレーザ光をアライメント光学系に導き、各共焦点ピンホールを通過する各光量に基づいて各共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を行うようにした。
【００１２】
請求項３によれば、請求項１又は２記載の走査型レーザ顕微鏡において、走査型レーザ顕微鏡に、
光分離素子の切り替えを検出する検出器と、
検出器で光分離素子の切り替えを検出したときに、光路切替え手段で光路をアライメント光学系に導き、共焦点ピンホールを通過する光量に基づいて共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を自動的に行う制御手段とを備えた。
【００１３】
【発明の実施の形態】
(1) 以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。
図１は走査型レーザ顕微鏡の構成図である。
レーザ光源２０から出力されるレーザ光（照明光）Ｌの光路上には、光分離素子としての励起用ダイクロイックミラー２１が配置されている。励起用ダイクロイックミラー２１は、ダイザ２２上に載置されており、このダイザ２２上には、励起用ダイクロイックミラー２１とは別に波長特性の異なる光分離素子としての励起用ダイクロイックミラー２３、２４が載置されている。これら励起用ダイクロイックミラー２３、２４は、切替え機構２５の駆動によりダイザ２２のスライド移動により、標本の蛍光波長や照明光のレーザ波長に合わせて該励起用ダイクロイックミラー２３、２４を照明光Ｌの光路上に選択配置されるように構成する。
【００１４】
なお、上述したレーザ光源２０とダイクロイックミラー２１、２３、２４との間の光路上には、図示しないがビームエキスパンダが配置されているものとする。
【００１５】
照明光Ｌの光路上に選択配置されたダイクロイックミラー２１、２３、２４の反射光路上には、２つのガルバノミラー２６、２７が配置されている。これらガルバノミラー２６、２７は、照明光Ｌを標本上に２次元走査するもので、それぞれガルバノメータ２８、２９の駆動により所定の角度で振れるものとなっている。
【００１６】
そして、これらガルバノミラー２６、２７により２次元走査された照明光Ｌの光路上には、瞳投影レンズ３０、ミラー３１が配置され、さらに図示しない顕微鏡の対物レンズ、標本が配置されている。なお、各ガルバノミラー２６、２７は、瞳投影レンズ３０により対物レンズの瞳位置と共役関係になっているものとする。
【００１７】
一方、標本からの光（蛍光又は反射光（検出光））の光路上に選択配置されているダイクロイックミラー２１、２３、２４を透過した透過光路上には、コンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を介してホトマルチプライヤ等の光検出器３４が配置されている。
【００１８】
このうち共焦点ピンホール３３は、コンフォーカル結像レンズ３２の結像位置に配置されるもので、ＸＹ微動ステージ３５上に設けられている。このＸＹ微動ステージ３５は、共焦点ピンホール３３を標本からの蛍光又は反射光（検出光）の光軸方向に対して垂直面内に移動自在な構成となっており、共焦点ピンホール３３へのアライメント時に共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４で検出される光量が最も大きくなるように共焦点ピンホール３３と光検出器３４で検出される光の光軸との芯出し調整、ここでは共焦点ピンホール３３を移動してアライメントする調整手段としての機能を有している。
【００１９】
上記ダイクロイックミラー２１（２３、２４）とガルバノミラー２６との間の光路上には、光路切替え手段としての反射ミラー３６が配置されている。この反射ミラー３６は、パルスモータ等のモータ３７の駆動により位置決めされる角度が変更される。この反射ミラー３６によって、共焦点ピンホール３３に対するアライメント時にはダイクロイックミラー２１、２３又は２４で反射した照明光を反射ミラー３６で反射させアライメント光学系３８に導くことができ、反射ミラー３６を照明光路から離間させることにより、標本の観察時には対物レンズ側に導くことができる。
【００２０】
アライメント光学系３８は、入射した照明光Ｌの角度とこの光Ｌを反射して出射する光Ｌの角度とを同一にする機能を有するもので、反射ミラー３６の反射光路上に配置された集光レンズ３９とこの集光レンズ３９の集光面に配置されたミラー部材４０とから構成されている。
【００２１】
次に上記の如く構成された走査型レーザ顕微鏡の作用について説明する。
先ず、通常の観察時、光路切替え手段の反射ミラー３６は、照明光Ｌを対物レンズ側に導く角度に配置（図面上点線の反射ミラー３６ａ）される。
【００２２】
レーザ光源１から発振した照明光Ｌは、ビームエキスパンダにより適切なビーム径に拡大され、励起用ダイクロイックミラー２１で反射されて各ガルバノミラー２６、２７に入射する。これらガルバノミラー２６、２７は、照明光Ｌを標本上に２次元走査するもので、この２次元走査された照明光Ｌは、瞳投影レンズ３０を通ってミラー３１で反射して図示しない対物レンズの像面に結像し、さらに標本上にスポットを結ぶとともに標本上に２次元走査される。
【００２３】
このときの標本からの蛍光又は反射光（検出光）は、上記光路と逆の光路を通って再び励起用ダイクロイックミラー２１に入射し、このミラー２１を透過し、続くコンフォーカル結像レンズ３２を透過し、さらに共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４で検出される。
【００２４】
次に、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に切り替えた場合のアライメント時、光路切替え手段の反射ミラー３６は、照明光Ｌをアライメント光学系３８側に導く角度に配置される（図面上実線の位置）。
【００２５】
すなわち、レーザ光源２０から発振した照明光Ｌは、ビームエキスパンダにより適切なビーム径に拡大され、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４で反射された後、さらに反射ミラー３６で反射されアライメント光学系３８に導かれる。
【００２６】
このアライメント光学系３８において照明光Ｌは、集光レンズ３９によりミラー部材４０に結像し、このミラー部材４０で反射され励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に戻る。
【００２７】
なお、励起用ダイクロイックミラー２３、２４は、照明光Ｌを反射して標本からの蛍光を透過させる特性を持っているが、照明光の反射率で通常８０％〜９５％程度である。つまりアライメント光学系３８から励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に戻ってきた光は、照明光Ｌと同じ波長であるが、その５〜２０％は励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過する。そして、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過した光は、コンフォーカル結像レンズ３２を透過して共焦点ピンホール３３の面に結像する。
【００２８】
ここで、アライメント光学系３８の集光レンズ３９に入射する照明光Ｌは、平行光（アフォーカル光）なので、ミラー部材４０で反射して再び集光レンズ３９を通った光（アフォーカル光）は、集光レンズ３９に入射する照明光Ｌと全く同じ角度の平行光となる。
【００２９】
従って、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４で反射した照明光Ｌとミラー部材４０から戻ってくる光（アフォーカル光）も全く同じ角度となる。すなわち、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過してコンフォーカル結像レンズ３２に入射する光の角度は、反射ミラー３６の光軸に垂直面内の位置精度及び角度精度に影響されることなく、波長選択用ダイクロイックミラー２３又は２４の角度誤差を正確に反映したものとなる。
【００３０】
しかるに、ミラー部材４０から戻り、共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４に入射される光量が最も大きくなるように、共焦点ピンホール３３の位置がＸＹ微動ステージ３５の駆動によりＸＹにスライド移動され、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４の角度エラーに応じた共焦点ピンホール３３のアライメントが行われる。
【００３１】
このように上記第１の実施の形態においては、励起用ダイクロイックミラー２１、２３又は２４で反射した照明光Ｌを入射し、この入射した照明光Ｌの角度とこの照明光Ｌを反射して出射する光の角度とを同一にするアライメント光学系３８を設け、アライメント時に照明光Ｌをアライメント光学系３８に導いて共焦点ピンホール３３を通過する光量が最も大きくなるように共焦点ピンホール３３を移動させてアライメントするので、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を切り替えたときの角度エラーにより起こる共焦点ピンホール３３上でのアライメントずれを、観察用の標本面にレーザ光を照射することなく、かつアライメント用の標本のピント合わせ作業等を行うことなく、容易に補正できる。
【００３２】
又、アライメント光学系３８は、集光レンズ３９のミラー部材４０を正確に配置し固定しておけば、反射ミラー３６や集光レンズ３９の位置精度はコンフォーカル結像レンズ３２に入射する光の角度に全く影響を及ぼさないので、極めてラフな精度でよく、安価でかつ簡単な構成で正確なアライメントができる。
【００３３】
なお、上記第１の実施の形態は、次の通り変形してもよい。
例えば、ダイザ２２に３種類の励起用ダイクロイックミラー２１、２３、２４を載置しているが、ダイザ２２に対して各ダイクロイックミラー２１、２３、２４を着脱自在にし、さらに取り外した励起用ダイクロイックミラーの部分に別のダイクロイックミラーを付け替えられる構成にしてもよい。又、ダイザ２２に一枚の励起用ダイクロイックミラーを貼り付け、このダイザ２２ごとに励起用ダイクロイックミラーを外して別のダイクロイックミラーに交換する構成でもよい。これらの場合、ダイザ２２の交換時の角度ずれの可能性があるので、上記の如くアライメントを行うことが望ましい。
(2) 次に、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００３４】
図２は走査型レーザ顕微鏡の構成図である。
この走査型レーザ顕微鏡の上記第１の実施の形態と相違するところは、ガルバノミラー２６を光路切替え手段として機能させ、このガルバノミラー２６の反射光路上にアライメント光学系４１を配置したところである。
【００３５】
すなわち、ガルバノミラー２６は、共焦点ピンホール３３のアライメント時にガルバノメータ２８の駆動によりその配置角度が所定角度に設定されて励起用ダイクロイックミラー２１、２３又は２４を反射した照明光Ｌをアライメント光学系４１に導くことができ、さらにに標本の観察時に所定の角度で振れて照明光Ｌを対物レンズ側に導くことができるようになっている。
【００３６】
アライメント光学系４１は、上記同様に入射した照明光Ｌの角度とこの光Ｌを反射して出射する光Ｌの角度とを同一にする機能を有するもので、ガルバノミラー２６の反射光路上に配置された集光レンズ３９とこの集光レンズ３９の集光面に配置されたミラー部材４０とから構成されている。
【００３７】
次に上記の如く構成された走査型レーザ顕微鏡の作用について説明する。
先ず、通常の観察時、上記第１の実施の形態と同様に照明光Ｌは、各ガルバノミラー２６、２７の駆動により標本上に２次元走査され、このときの標本に発生する蛍光又は反射光（検出光）は、励起用ダイクロイックミラー２１に戻り、コンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４で検出される。
【００３８】
次に、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に切り替えた際のアライメント時、光路切替え手段のガルバノミラー２６は、ガルバノメータ２８の駆動により照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導く角度に位置決めされる。
【００３９】
従って、照明光Ｌは、ビームエキスパンダにより適切なビーム径に拡大され、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４で反射された後、さらにガルバノミラー２６で反射してアライメント光学系４１に導かれる。
【００４０】
このアライメント光学系４１において照明光Ｌは、集光レンズ３９によりミラー部材４０に結像し、このミラー部材４０で反射して励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に戻る。
【００４１】
なお、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４は、照明光Ｌを反射して標本からの蛍光又は反射光である検出光を透過させる特性を持っており、反射率で８０％〜９５％程度である。つまりアライメント光学系４１から励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に戻ってきた光は、照明光Ｌと同じ波長であり、かつその５〜２０％は励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過する。そして、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過した光は、コンフォーカル結像レンズ３２を透過して共焦点ピンホール３３の面に結像する。
【００４２】
ここで、アライメント光学系４１の集光レンズ３９に入射する照明光Ｌは、平行光（アフォーカル光）なので、ミラー部材４０で反射して再び集光レンズ３９を通った光は、集光レンズ３９に入射する照明光Ｌと全く同じ角度の平行光となる。
【００４３】
従って、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４で反射した照明光Ｌとミラー部材４０から戻ってくる光（アフォーカル光）も全く同じ角度となる。すなわち、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過してコンフォーカル結像レンズ３２に入射する光の角度は、ガルバノミラー２６の角度精度に影響されることなく、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４の角度誤差を正確に反映したものとなる。
【００４４】
しかるに、ミラー部材４０から戻り、共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４に入射される光量が最も大きくなるように、共焦点ピンホール３３の位置がＸＹ微動ステージ３５の駆動によりＸＹにスライド移動され、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４の角度エラーに応じた共焦点ピンホール３３のアライメントが行われる。
【００４５】
このように上記第２の実施の形態においては、ガルバノミラー２６をアライメント光学系４１への切り替え用に兼用し、アライメント時に照明光Ｌをガルバノミラー２６からアライメント光学系４１に導くようにしたので、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を切り替えたときの角度エラーにより起こる共焦点ピンホール３３上でのアライメントずれを、観察用の標本面にレーザ光を照射することなく、且つアライメント用の標本のピント合わせ作業等を行うことなく、容易に補正できる。
【００４６】
又、アライメント光学系４１は、集光レンズ３９の焦点位置にミラー部材４０を正確に配置し固定しておけば、ガルバノミラー２６の停止位置精度及び集光レンズ３９の位置精度はコンフォーカル結像レンズ３２に入射する光の角度に全く影響を及ぼさないので、極めてラフな精度でよく、安価でかつ簡単な構成で正確なアライメントができる。
【００４７】
さらに、ガルバノミラー２６をアライメント光学系４１への切り替え用に兼用したので、反射ミラー等の光学部材及びその駆動機構を新たに設ける必要がなく、上記第１の実施の形態よりもさらに簡単な構成にできる。
【００４８】
又、ガルバノミラー２６を集光レンズ３９のバックフォーカス位置に配置し、停止させれば、ガルバノミラー２６で反射された光は、集光レンズ３９を透過する範囲で、ガルバノミラー２６で反射された光の角度と同一の角度で必ずガルバノミラー２６の中心付近に戻すことができる。
【００４９】
なお、上述したバックフォーカス位置にガルバノミラー２６を配置する場合、図３に示すように以下のようにして用いることができる。
ここでは、図３に示すように、各ダイクロイックミラー２１、２２、２３の波長特性に応じて、それぞれ異なった蛍光を発する蛍光ガラス４０ａ、４０ｂ、４０ｃでミラー部材４０を区画分けし、例えばダイクロイックミラー２１を使用するときは、ミラー部材４０の蛍光ガラス４０ａに光が向かう角度、ダイクロイックミラー２３を使用するときは、ミラー部材４０の蛍光ガラス４０ｂに光が向かう角度、ダイクロイックミラー２４を使用するときは、ミラー部材４０の蛍光ガラス４０ｃに光が向かう角度で、ガルバノミラー２６を停止させる。
【００５０】
このガルバノミラー２６は、集光レンズ３９のバックフォーカス位置に配置されているので、ミラー部材４０の各蛍光ガラス４０ａ、４０ｂ、４０ｃに対応する角度でガルバノミラー２６を停止させると、ミラー部材４０の各蛍光ガラス４０ａ、４０ｂ、４０ｃにそれぞれ集光した光はガルバノミラー２６の中心に戻ってくる。
【００５１】
従って、アライメント時に各ダイクロイックミラー２１、２３、２４の波長特性に合う蛍光ガラスを使用できるので、アライメント光学系による検出光量を多くすることができる。
(3) 次に、本発明の第３の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図２と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００５２】
図４は走査型レーザ顕微鏡の構成図である。
この走査型レーザ顕微鏡の上記第２の実施の形態と相違するところは、ダイクロイックミラー切替え認識用の検出器としてのセンサ４２を設け、このセンサ４２により波長特性の異なるダイクロイックミラー２１、２３又は２４の切替えが認識されたときに制御部４３によって共焦点ピンホール３３を自動的にアライメントするようにしたところである。
【００５３】
すなわち、ダイクロイックミラー切替え認識用センサ４２は、ダイザ２２の移動を検出したときにダイクロイックミラー２１、２３又は２４の切替えの認識信号を出力する機能を有している。
【００５４】
制御部４３は、ダイクロイックミラー切替え認識用センサ４２からの切替えの認識信号を受けると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くようなガルバノミラー２６の位置決め角度にする回転、停止の指令をガルバノミラー２６を駆動するガルバノメータ２８に対して発し、かつ光検出器３４から出力される光量信号をモニタしながら共焦点ピンホール３３を備えたＸＹ微動ステージ３５を駆動することで、共焦点ピンホール３３をＸＹにスライド移動させて光検出器３４により検出される光量が最も大きくなるようにアライメント指令を発して自動的にアライメントするようにしている。
【００５５】
次に上記の如く構成された走査型レーザ顕微鏡の作用について説明する。
通常の観察時の作用は、上記第２の実施の形態と同様なので省略する。
次に、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に切り替えるためにダイザ２２が移動すると、ダイクロイックミラー切替え認識用センサ４２は、ダイザ２２の移動を検出してその切替えの認識信号を制御部４３に送出する。
【００５６】
この制御部４３は、上記切替えの認識信号を受けると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くようなガルバノミラー２６の配置角度にする回転、停止の指令をガルバノミラー２６を駆動するガルバノメータ２８に対して発する。これにより、ガルバノミラー２６は、ガルバノメータ２８の駆動により照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導く角度に位置決めされる。
【００５７】
従って、照明光Ｌは、上記第２の実施の形態と同様に、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４で反射された後、さらにガルバノミラー２６で反射されてアライメント光学系４１に導かれる。このアライメント光学系４１において照明光Ｌは、集光レンズ３９によりミラー部材４０に結像し、このミラー部材４０で反射して例えば励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に戻る。そして、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過した光は、コンフォーカル結像レンズ３２を透過して共焦点ピンホール３３の面に結像し、光検出器３４に入射する。
【００５８】
この場合、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過してコンフォーカル結像レンズ３２に入射する光の角度は、ガルバノミラー２６の角度精度に影響されることなく、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４の角度誤差を正確に反映したものとなる。
【００５９】
これと共に制御部４３は、光検出器３４から出力される光量信号をモニタしながらＸＹ微動ステージ３５をＸＹに駆動し、光検出器３４により検出される光量が最も大きくなるように共焦点ピンホール３３を自動的にアライメントする。
【００６０】
このように上記第３の実施の形態においては、励起用ダイクロイックミラー２１、２３又は２４の切り替えをダイクロイックミラー切替え認識用センサ４２により認識し、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くようなガルバノミラー２６の位置決め角度にするとともに光検出器３４から出力される光量信号をモニタしながら共焦点ピンホール３３を設けたＸＹ微動ステージ３５をＸＹに駆動するようにしたで、励起用ダイクロイックミラー２１、２３、２４が切替えられたときに煩雑な作業が一切なく自動的に共焦点ピンホール３３のアライメントが短時間で確実に行うことができる。
(4) 次に、本発明の第４の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図４と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００６１】
図５は２重染色された蛍光標本を観察して２種類の蛍光を別々に画像取得するときに用いられる走査型レーザ顕微鏡の構成図である。
各ダイクロイックミラー２１、２３又は２４の透過光路上には、反射ミラー４４を介して検出光を２種類の蛍光の波長別に分離する光分離素子としての分光ダイクロイックミラー４５、４６又は反射ミラー４７が配置されている。これら分光ダイクロイックミラー４５、４６及び反射ミラー４７は、例えば図示しないダイザ等に載置され、モータの駆動により移動して透過光路上に切り替わって配置されるものとなっている。
【００６２】
これら分光ダイクロイックミラー４５、４６及び反射ミラー４７の反射光路上には、例えば短波長側としてのコンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を介してホトマルチプライヤ等の光検出器３４が配置されている。
【００６３】
又、分光ダイクロイックミラー４５、４６の透過光路上には、反射ミラー４８を介して例えば長波長側としてのコンフォーカル結像レンズ４９、共焦点ピンホール５０を介してホトマルチプライヤ等の光検出器５１が配置されている。このうち共焦点ピンホール５０は、コンフォーカル結像レンズ４９の結像位置に配置されるもので、ＸＹ微動ステージ５２上に設けられている。このＸＹ微動ステージ５２は、共焦点ピンホール５０を標本からの蛍光又は反射光（検出光）の光軸方向に対して垂直面内に移動自在な構成となっている。
【００６４】
分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ５３は、分光ダイクロイックミラー４５、４６及び反射ミラー４７を載置するダイザの移動を検出したときにこれらダイクロイックミラー４５、４６又は４７の切替えの認識信号を出力する機能を有している。
【００６５】
制御部５４は、励起用ダイクロイックミラー切替え認識用センサ４２又は分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ５３からの切替えの認識信号を受けると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くようなガルバノミラー２６の位置決め角度にする回転、停止の指令をガルバノミラー２６のガルバノメータ２８に対して発する機能を有している。
【００６６】
又、制御部５４は、分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ５３からの切替えの認識信号を受けてアライメントする共焦点ピンホール３３、５０がいずれか一方であるか両方であるかを判断し、この判断の結果に応じてＸＹ微動ステージ３５又は５２のいずれか一方又は両方にアライメント指令を発するようにしている。
【００６７】
又、制御部５４は、アライメント時に、光検出器３４又は５１のいずれか一方又は両方から出力される各光量信号をモニタしながらＸＹ微動ステージ３５又は５２のいずれか一方又は両方を駆動し、光検出器３４又は５１のいずれか一方又は両方により検出される光量が最も大きくなるように共焦点ピンホール３３又は５０のいずれか一方又は両方を自動的にアライメントするようにしている。
【００６８】
次に上記の如く構成された走査型レーザ顕微鏡の作用について説明する。
先ず、２重染色された標本を観察して２種類の蛍光を別々に観測する場合、レーザ光源２０から出力された照明光Ｌは、各ガルバノミラー２６、２７の駆動により標本上に２次元走査され、このときの標本からの蛍光（検出光）は、励起用ダイクロイックミラー２１に戻り、反射ミラー４４で反射して分光ダイクロイックミラー４５に入射する。
【００６９】
この測光分光ダイクロイックミラー４５は、検出光のうち短波長成分を反射し、長波長成分を透過させる。このうち短波長成分の検出光は、コンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４で検出され、これと共に長波長成分の検出光は、反射ミラー４８で反射され、コンフォーカル結像レンズ４９、共焦点ピンホール５０を通過して光検出器５１で検出される。
【００７０】
次に、２重染色された標本の蛍光色素を変えた場合、つまり短波長成分の蛍光と長波長成分の蛍光とを分ける波長を切り替えたい場合、分光ダイクロイックミラー４５を分光ダイクロイックミラー４６に切り替える。
【００７１】
このとき分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ５３は、分光ダイクロイックミラー４５、４６及び反射ミラー４７を載置するダイザの移動を検出し、分光ダイクロイックミラー４６への切替えの認識信号を出力する。
【００７２】
このように分光ダイクロイックミラー４６に切り替えた場合、各共焦点ピンホール３３、５０で結像位置にずれが生じるので、これら共焦点ピンホール３３、５０でのアライメントが必要となる。
【００７３】
従って、制御部５４は、分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ５３からの切替えの認識信号を受けると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くようなガルバノミラー２６の配置角度にする回転、停止の指令をガルバノミラー２６を駆動するガルバノメータ２８に対して発する。
【００７４】
これにより照明光Ｌは、上記第２の実施の形態と同様に、励起用ダイクロイックミラー２１で反射後、さらにガルバノミラー２６で反射してアライメント光学系４１に導かれる。このアライメント光学系４１において照明光Ｌは、集光レンズ３９によりミラー部材４０に結像し、このミラー部材４０で反射して再び励起用ダイクロイックミラー２１に戻る。そして、励起用ダイクロイックミラー２１を透過した光は、反射ミラー４４で反射して分光ダイクロイックミラー４６に入射する。
【００７５】
この分光ダイクロイックミラー４６は、入射した光のうち短波長成分を反射し、長波長成分を透過させる。このうち短波長成分の検出光は、コンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４で検出され、長波長成分の検出光は、反射ミラー４８で反射され、コンフォーカル結像レンズ４９、共焦点ピンホール５０を通過して光検出器５１で検出される。
【００７６】
この場合、分光ダイクロイックミラー４６を透過して各コンフォーカル結像レンズ３２、４９に入射する光の角度は、ガルバノミラー２６の角度精度に影響されることなく、分光ダイクロイックミラー４６の角度誤差を正確に反映したものとなる。
【００７７】
しかるに、制御部５４は、光検出器３４、５１の両方から出力される各光量信号をそれぞれモニタしながら各ＸＹ微動ステージ３５、５２の両方に対してアライメント指令を発して各ＸＹ駆動ステージ３５、５２を駆動し、各光検出器３４、５１の両方により検出される各光量がそれぞれ最も大きくなるように各共焦点ピンホール３３、５０の両方を自動的にアライメントする。
【００７８】
次に、単染色標本を観察する場合、ダイザは分光ダイクロイックミラー４５（又は４６）から反射ミラー４７に切り替わる。この場合でも共焦点ピンホール３３で結像位置にずれが生じるので、共焦点ピンホール３３のアライメントが必要となる。
【００７９】
すなわち、上記同様に分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ５３は、反射ミラー４７を載置するダイザの移動を検出し、反射ミラー４７への切替えの認識信号を出力する。
【００８０】
制御部５４は、分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ５３からの切替えの認識信号を受けると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くようなガルバノミラー２６の位置決め角度にする回転、停止の指令をガルバノミラー２６を駆動するガルバノメータ２８に対して発する。これにより照明光Ｌは、上記第２の実施の形態と同様に、励起用ダイクロイックミラー２１で反射後、さらにガルバノミラー２６で反射されてアライメント光学系４１に導かれ、再び励起用ダイクロイックミラー２１に戻り、そして反射ミラー４４、４５で反射しされコンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４で検出される。
【００８１】
制御部５４は、光検出器３４から出力される光量信号をモニタしながらＸＹ微動ステージ３５に対してアライメント指令を発して駆動し、光検出器３４により検出される光量が最も大きくなるように共焦点ピンホール３３を自動的にアライメントする。
【００８２】
このように上記第４の実施の形態においては、分光ダイクロイックミラー４５、４６を配置すると共に、短波長側として共焦点ピンホール３３及び光検出器３４を配置し、長波長側として共焦点ピンホール５０及び光検出器５１を配置したので、上記第３の実施の形態と同様な効果を奏することが出来ると共に、２重染色された標本を分光ダイクロイックミラーを用いて観察して２種類の蛍光を別々に観測する場合においても煩雑な作業が一切なく自動的に各共焦点ピンホール３３、５０の各アライメントが短時間で確実に行うことができる。
【００８３】
なお、上記第４の実施の形態では、２重染色された標本を観察する場合のアライメントについて説明したが、共焦点ピンホール及び光検出器を追加することにより多重染色された標本を観察するときのアライメントについても適用できる。
【００８４】
又、上述した実施の形態では、反射ミラー３６（又はガルバノミラー２６，２７）、集光レンズ３９及びミラー部材４０によりアライメントを行っていたが、これに限られるものでなく集光レンズ３９及びミラー部材４０をコーナキューブに変更してもアライメント光学系を構成することができる。
【００８５】
又、上述した実施の形態では、共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を行う調整手段として、共焦点ピンホールをＸＹにスライド移動させてアライメントする例を説明したが、これに限られるものでなく、従来の技術で説明した光軸を通る２枚の平行平面板を、それぞれ異なった方向に回転制御させてアライメントするものも調整手段として用いることができる。
【００８６】
【発明の効果】
以上詳記したように本発明の請求項１〜３によれば、ビームスプリッタの切り替え時の共焦点ピンホールへのアライメントを煩わしい作業を必要とせずに簡単な構成で正確にできる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【００８７】
又、本発明の請求項２によれば、多重染色された標本を観察して数種類の蛍光を別々に観測する場合でもこれら蛍光別の各共焦点ピンホールへのアライメントが短時間で確実にできる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
又、本発明の請求項３によれば、自動的に共焦点ピンホールのアライメントが短時間で確実にできる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。
【図３】同走査型レーザ顕微鏡の変形列を示す部分的な構成図。
【図４】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第３の実施の形態を示す構成図。
【図５】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第４の実施の形態を示す構成図。
【図６】従来の走査型レーザ顕微鏡の構成図。
【符号の説明】
２０：レーザ光源、
２１：励起用ダイクロイックミラー、
２３，２４：励起用ダイクロイックミラー、
２５：切替え機構、
２６，２７：ガルバノミラー、
３０：瞳投影レンズ、
３２，４９：コンフォーカル結像レンズ、
３３，５０：共焦点ピンホール、
３４，５１：光検出器、
３５，５２：ＸＹ微動ステージ、
３６：反射ミラー、
３８，４１：アライメント光学系、
３９：集光レンズ、
４０：ミラー部材、
４０ａ，４０ｂ，４０ｃ：蛍光ガラス、
４２：励起用ダイクロイックミラー切替え認識用センサ、
４３，５４：制御部
４５，４６：分光ダイクロイックミラー、
４７：反射ミラー、
５３：分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ。

Claims (3)

1. レーザ光を反射又は透過させる切換可能な複数の光分離素子を用い、前記分離素子で反射又は透過させたレーザ光は対物レンズを介して標本上に照射され、この標本からの光は前記光分離素子により透過又は反射され、共焦点ピンホールを通して光検出器に導かれるようにした走査型レーザ顕微鏡において、
   前記光分離素子で反射又は透過したレーザ光を入射し、この入射したレーザ光の角度とこの入射したレーザ光を反射して出射する場合のレーザ光の角度とを同一にするアライメント光学系と、
   前記光分離素子を反射又は透過した前記レーザ光を前記共焦点ピンホールと光軸とのアライメント時には前記アライメント光学系に導き、かつ前記標本の観察時には前記対物レンズに導くように光路を切り換える光路切替え手段と、
   前記アライメント時に前記共焦点ピンホールを通過する光量を前記光検出器で検出し、この光量に基づいて前記共焦点ピンホールを通る光量が最大になるように前記共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を行う調整手段と、
   を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記標本からの光を少なくとも２波長に分離する分光光学系を備えると共に、
   前記共焦点ピンホール及び前記光検出器を前記分光光学系で分離される波長の数に応じて設け、
   前記分光光学系を切り替えた時、前記調整手段は、前記光路切替え手段を制御して前記光分離素子で反射又は透過した前記レーザ光を前記アライメント光学系に導き、前記各共焦点ピンホールを通過する各光量に基づいて前記各共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を行うようにしたことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記走査型レーザ顕微鏡に、
   前記光分離素子の切り替えを検出する検出器と、
   前記検出器で前記光分離素子の切り替えを検出したときに、前記光路切替え手段で光路をアライメント光学系に導き、前記共焦点ピンホールを通過する光量に基づいて前記共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を自動的に行う制御手段とを備えたことを特徴とする請求項１又は２記載の走査型レーザ顕微鏡。

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