JP2000028926A - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、ビームスプリッタの切り替え時の共
焦点ピンホールへのアライメントを煩わしい作業を必要
とせずに簡単な構成で正確に行う。 【解決手段】照明光Ｌを励起用ダイクロイックミラー２
３を反射して対物レンズにより標本上に照射し、この標
本からの光を再び励起用ダイクロイックミラー２３によ
り透過させて共焦点ピンホール３３を通して光検出器３
４に導く場合、照明光Ｌの角度とこの光を反射して出射
する光の角度とを同一にするアライメント光学系３８を
設け、共焦点ピンホール３３のアライメント時に照明光
Ｌをアライメント光学系３８に導いて共焦点ピンホール
３３を通過する光量が最も大きくなるように共焦点ピン
ホール３３を移動させてアライメントする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標本に照射するレ
ーザ光とこの標本からの光とを分離するビームスプリッ
タを複数備え、これらビームスプリッタを切替え可能に
した走査型レーザ顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】例えば、特開平８−２７１７９２号公報
には、ビームスプリッタで反射させたレーザ光を対物レ
ンズにより集光して標本上にスポット光を結ばせると共
にこのスポット光を標本上に２次元走査し、このときの
標本からの反射光をビームスプリッタを透過させて共焦
点ピンホールを通して光検出器に導く走査型レーザ顕微
鏡が開示されている。

【０００３】図６はかかる走査型レーザ顕微鏡の構成図
であって、レーザ光源１から発振したレーザ光（照明
光）Ｌは、光分離素子としての波長選択用ビームスプリ
ッタ（ここでは励起用ダイクロイックミラー）２ａで反
射し、さらにミラー３で反射して各ガルバノミラー５、
６に入射する。これらガルバノミラー５、６は、照明光
Ｌを標本上に２次元走査するもので、この照明光Ｌは、
ミラー４、瞳投影レンズ７を通って図示しない対物レン
ズの像面に結像し、さらに標本上にスポットを結ぶとと
もに標本上に２次元走査される。

【０００４】このときの標本に発生する蛍光又は反射レ
ーザ光（検出光）は、上記光路と逆の光路を通って再び
波長選択用ダイクロイックミラー２ａに入射し、このミ
ラー２ａを透過し、続く結像レンズ８を透過し、さらに
共焦点絞り（共焦点ピンホール）９を通過して光検出器
１０で検出される。

【０００５】ここで用いている波長選択用ビームスプリ
ッタとしては、波長選択用ダイクロイックミラー２ａの
他に波長特性の異なる例えば２つの波長選択用ダイクロ
イックミラー２ｂ、２ｃを切り替え自在に備えており、
これら波長選択用ダイクロイックミラー２ｂ、２ｃに切
り替えた場合、共焦点ピンホール９上で生じる光軸ずれ
を補正する必要がある。

【０００６】この光軸ずれの補正は、結像レンズ８と共
焦点ピンホール９の間の光路１１上に２枚の平行平面板
１２、１３を配置し、これら平行平面板１２、１３をそ
れぞれ回転軸１２ａ、１３ａを中心として回転させ、共
焦点ピンホール９を通過する光量が最も大きくなるよう
に標本からの光を正確に共焦点ピンホールに導くような
位置調整を行う（以下、アライメントと称する）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ように波長選択用ダイクロイックミラー２ｂ、２ｃの切
り替え作業を行った後に共焦点ピンホール９のアライメ
ント行う場合には、対物レンズによりスポットを結ぶ面
上に標本を配置して実際にレーザ光を照射する必要があ
る。

【０００８】ところが、通常、観察用蛍光標本は、褪色
等の問題があり、アライメント時にレーザ光を標本に対
して長時間照射するのは問題がある。又、アライメント
用の標本を特別にセットすればよいが、そのアライメン
ト用の標本に対するピント合わせを正確に行う必要があ
り、手間がかかる。さらに、アライメント後の観察用蛍
光標本の位置再設定にも手間がかかる。

【０００９】そこで本発明は、ビームスプリッタの切り
替え時の共焦点ピンホールへのアライメントを煩わしい
作業を必要とせずに簡単な構成で正確にできる走査型レ
ーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】請求項１によれば、レー
ザ光を反射又は透過させる切換可能な複数の光分離素子
を用い、分離素子で反射又は透過させたレーザ光は対物
レンズを介して標本上に照射され、この標本からの光は
光分離素子により透過又は反射され、共焦点ピンホール
を通して光検出器に導かれるようにした走査型レーザ顕
微鏡において、光分離素子で反射又は透過したレーザ光
を入射し、この入射したレーザ光の角度とこの入射した
レーザ光を反射して出射する場合のレーザ光の角度とを
同一にするアライメント光学系と、光分離素子を反射又
は透過したレーザ光を共焦点ピンホールと光軸とのアラ
イメント時にはアライメント光学系に導き、かつ標本の
観察時には対物レンズに導くように光路を切り換える光
路切替え手段と、アライメント時に共焦点ピンホールを
通過する光量を光検出器で検出し、この光量に基づいて
共焦点ピンホールを通る光量が最大になるように共焦点
ピンホールと光軸との芯出し調整を行う調整手段と、を
備えた走査型レーザ顕微鏡である。

【００１１】請求項２によれば、請求項１記載の走査型
レーザ顕微鏡において、標本からの光を少なくとも２波
長に分離する分光光学系を備えると共に、共焦点ピンホ
ール及び光検出器を分光光学系で分離される波長の数に
応じて設け、分光光学系を切り替えた時、調整手段は、
光路切替え手段を制御して光分離素子で反射又は透過し
たレーザ光をアライメント光学系に導き、各共焦点ピン
ホールを通過する各光量に基づいて各共焦点ピンホール
と光軸との芯出し調整を行うようにした。

【００１２】請求項３によれば、請求項１又は２記載の
走査型レーザ顕微鏡において、走査型レーザ顕微鏡に、
光分離素子の切り替えを検出する検出器と、検出器で光
分離素子の切り替えを検出したときに、光路切替え手段
で光路をアライメント光学系に導き、共焦点ピンホール
を通過する光量に基づいて共焦点ピンホールと光軸との
芯出し調整を自動的に行う制御手段とを備えた。

【００１３】

【発明の実施の形態】(1) 以下、本発明の第１の実施の
形態について図面を参照して説明する。図１は走査型レ
ーザ顕微鏡の構成図である。レーザ光源２０から出力さ
れるレーザ光（照明光）Ｌの光路上には、光分離素子と
しての励起用ダイクロイックミラー２１が配置されてい
る。励起用ダイクロイックミラー２１は、ダイザ２２上
に載置されており、このダイザ２２上には、励起用ダイ
クロイックミラー２１とは別に波長特性の異なる光分離
素子としての励起用ダイクロイックミラー２３、２４が
載置されている。これら励起用ダイクロイックミラー２
３、２４は、切替え機構２５の駆動によりダイザ２２の
スライド移動により、標本の蛍光波長や照明光のレーザ
波長に合わせて該励起用ダイクロイックミラー２３、２
４を照明光Ｌの光路上に選択配置されるように構成す
る。

【００１４】なお、上述したレーザ光源２０とダイクロ
イックミラー２１、２３、２４との間の光路上には、図
示しないがビームエキスパンダが配置されているものと
する。

【００１５】照明光Ｌの光路上に選択配置されたダイク
ロイックミラー２１、２３、２４の反射光路上には、２
つのガルバノミラー２６、２７が配置されている。これ
らガルバノミラー２６、２７は、照明光Ｌを標本上に２
次元走査するもので、それぞれガルバノメータ２８、２
９の駆動により所定の角度で振れるものとなっている。

【００１６】そして、これらガルバノミラー２６、２７
により２次元走査された照明光Ｌの光路上には、瞳投影
レンズ３０、ミラー３１が配置され、さらに図示しない
顕微鏡の対物レンズ、標本が配置されている。なお、各
ガルバノミラー２６、２７は、瞳投影レンズ３０により
対物レンズの瞳位置と共役関係になっているものとす
る。

【００１７】一方、標本からの光（蛍光又は反射光（検
出光））の光路上に選択配置されているダイクロイック
ミラー２１、２３、２４を透過した透過光路上には、コ
ンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を
介してホトマルチプライヤ等の光検出器３４が配置され
ている。

【００１８】このうち共焦点ピンホール３３は、コンフ
ォーカル結像レンズ３２の結像位置に配置されるもの
で、ＸＹ微動ステージ３５上に設けられている。このＸ
Ｙ微動ステージ３５は、共焦点ピンホール３３を標本か
らの蛍光又は反射光（検出光）の光軸方向に対して垂直
面内に移動自在な構成となっており、共焦点ピンホール
３３へのアライメント時に共焦点ピンホール３３を通過
して光検出器３４で検出される光量が最も大きくなるよ
うに共焦点ピンホール３３と光検出器３４で検出される
光の光軸との芯出し調整、ここでは共焦点ピンホール３
３を移動してアライメントする調整手段としての機能を
有している。

【００１９】上記ダイクロイックミラー２１（２３、２
４）とガルバノミラー２６との間の光路上には、光路切
替え手段としての反射ミラー３６が配置されている。こ
の反射ミラー３６は、パルスモータ等のモータ３７の駆
動により位置決めされる角度が変更される。この反射ミ
ラー３６によって、共焦点ピンホール３３に対するアラ
イメント時にはダイクロイックミラー２１、２３又は２
４で反射した照明光を反射ミラー３６で反射させアライ
メント光学系３８に導くことができ、反射ミラー３６を
照明光路から離間させることにより、標本の観察時には
対物レンズ側に導くことができる。

【００２０】アライメント光学系３８は、入射した照明
光Ｌの角度とこの光Ｌを反射して出射する光Ｌの角度と
を同一にする機能を有するもので、反射ミラー３６の反
射光路上に配置された集光レンズ３９とこの集光レンズ
３９の集光面に配置されたミラー部材４０とから構成さ
れている。

【００２１】次に上記の如く構成された走査型レーザ顕
微鏡の作用について説明する。先ず、通常の観察時、光
路切替え手段の反射ミラー３６は、照明光Ｌを対物レン
ズ側に導く角度に配置（図面上点線の反射ミラー３６
ａ）される。

【００２２】レーザ光源１から発振した照明光Ｌは、ビ
ームエキスパンダにより適切なビーム径に拡大され、励
起用ダイクロイックミラー２１で反射されて各ガルバノ
ミラー２６、２７に入射する。これらガルバノミラー２
６、２７は、照明光Ｌを標本上に２次元走査するもの
で、この２次元走査された照明光Ｌは、瞳投影レンズ３
０を通ってミラー３１で反射して図示しない対物レンズ
の像面に結像し、さらに標本上にスポットを結ぶととも
に標本上に２次元走査される。

【００２３】このときの標本からの蛍光又は反射光（検
出光）は、上記光路と逆の光路を通って再び励起用ダイ
クロイックミラー２１に入射し、このミラー２１を透過
し、続くコンフォーカル結像レンズ３２を透過し、さら
に共焦点ピンホール３３を通過して光検出器３４で検出
される。

【００２４】次に、励起用ダイクロイックミラー２３又
は２４に切り替えた場合のアライメント時、光路切替え
手段の反射ミラー３６は、照明光Ｌをアライメント光学
系３８側に導く角度に配置される（図面上実線の位
置）。

【００２５】すなわち、レーザ光源２０から発振した照
明光Ｌは、ビームエキスパンダにより適切なビーム径に
拡大され、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４で
反射された後、さらに反射ミラー３６で反射されアライ
メント光学系３８に導かれる。

【００２６】このアライメント光学系３８において照明
光Ｌは、集光レンズ３９によりミラー部材４０に結像
し、このミラー部材４０で反射され励起用ダイクロイッ
クミラー２３又は２４に戻る。

【００２７】なお、励起用ダイクロイックミラー２３、
２４は、照明光Ｌを反射して標本からの蛍光を透過させ
る特性を持っているが、照明光の反射率で通常８０％〜
９５％程度である。つまりアライメント光学系３８から
励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に戻ってきた
光は、照明光Ｌと同じ波長であるが、その５〜２０％は
励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透過する。
そして、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透
過した光は、コンフォーカル結像レンズ３２を透過して
共焦点ピンホール３３の面に結像する。

【００２８】ここで、アライメント光学系３８の集光レ
ンズ３９に入射する照明光Ｌは、平行光（アフォーカル
光）なので、ミラー部材４０で反射して再び集光レンズ
３９を通った光（アフォーカル光）は、集光レンズ３９
に入射する照明光Ｌと全く同じ角度の平行光となる。

【００２９】従って、励起用ダイクロイックミラー２３
又は２４で反射した照明光Ｌとミラー部材４０から戻っ
てくる光（アフォーカル光）も全く同じ角度となる。す
なわち、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透
過してコンフォーカル結像レンズ３２に入射する光の角
度は、反射ミラー３６の光軸に垂直面内の位置精度及び
角度精度に影響されることなく、波長選択用ダイクロイ
ックミラー２３又は２４の角度誤差を正確に反映したも
のとなる。

【００３０】しかるに、ミラー部材４０から戻り、共焦
点ピンホール３３を通過して光検出器３４に入射される
光量が最も大きくなるように、共焦点ピンホール３３の
位置がＸＹ微動ステージ３５の駆動によりＸＹにスライ
ド移動され、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４
の角度エラーに応じた共焦点ピンホール３３のアライメ
ントが行われる。

【００３１】このように上記第１の実施の形態において
は、励起用ダイクロイックミラー２１、２３又は２４で
反射した照明光Ｌを入射し、この入射した照明光Ｌの角
度とこの照明光Ｌを反射して出射する光の角度とを同一
にするアライメント光学系３８を設け、アライメント時
に照明光Ｌをアライメント光学系３８に導いて共焦点ピ
ンホール３３を通過する光量が最も大きくなるように共
焦点ピンホール３３を移動させてアライメントするの
で、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を切り替
えたときの角度エラーにより起こる共焦点ピンホール３
３上でのアライメントずれを、観察用の標本面にレーザ
光を照射することなく、かつアライメント用の標本のピ
ント合わせ作業等を行うことなく、容易に補正できる。

【００３２】又、アライメント光学系３８は、集光レン
ズ３９のミラー部材４０を正確に配置し固定しておけ
ば、反射ミラー３６や集光レンズ３９の位置精度はコン
フォーカル結像レンズ３２に入射する光の角度に全く影
響を及ぼさないので、極めてラフな精度でよく、安価で
かつ簡単な構成で正確なアライメントができる。

【００３３】なお、上記第１の実施の形態は、次の通り
変形してもよい。例えば、ダイザ２２に３種類の励起用
ダイクロイックミラー２１、２３、２４を載置している
が、ダイザ２２に対して各ダイクロイックミラー２１、
２３、２４を着脱自在にし、さらに取り外した励起用ダ
イクロイックミラーの部分に別のダイクロイックミラー
を付け替えられる構成にしてもよい。又、ダイザ２２に
一枚の励起用ダイクロイックミラーを貼り付け、このダ
イザ２２ごとに励起用ダイクロイックミラーを外して別
のダイクロイックミラーに交換する構成でもよい。これ
らの場合、ダイザ２２の交換時の角度ずれの可能性があ
るので、上記の如くアライメントを行うことが望まし
い。 (2) 次に、本発明の第２の実施の形態について図面を参
照して説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を
付してその詳しい説明は省略する。

【００３４】図２は走査型レーザ顕微鏡の構成図であ
る。この走査型レーザ顕微鏡の上記第１の実施の形態と
相違するところは、ガルバノミラー２６を光路切替え手
段として機能させ、このガルバノミラー２６の反射光路
上にアライメント光学系４１を配置したところである。

【００３５】すなわち、ガルバノミラー２６は、共焦点
ピンホール３３のアライメント時にガルバノメータ２８
の駆動によりその配置角度が所定角度に設定されて励起
用ダイクロイックミラー２１、２３又は２４を反射した
照明光Ｌをアライメント光学系４１に導くことができ、
さらにに標本の観察時に所定の角度で振れて照明光Ｌを
対物レンズ側に導くことができるようになっている。

【００３６】アライメント光学系４１は、上記同様に入
射した照明光Ｌの角度とこの光Ｌを反射して出射する光
Ｌの角度とを同一にする機能を有するもので、ガルバノ
ミラー２６の反射光路上に配置された集光レンズ３９と
この集光レンズ３９の集光面に配置されたミラー部材４
０とから構成されている。

【００３７】次に上記の如く構成された走査型レーザ顕
微鏡の作用について説明する。先ず、通常の観察時、上
記第１の実施の形態と同様に照明光Ｌは、各ガルバノミ
ラー２６、２７の駆動により標本上に２次元走査され、
このときの標本に発生する蛍光又は反射光（検出光）
は、励起用ダイクロイックミラー２１に戻り、コンフォ
ーカル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を通過し
て光検出器３４で検出される。

【００３８】次に、励起用ダイクロイックミラー２３又
は２４に切り替えた際のアライメント時、光路切替え手
段のガルバノミラー２６は、ガルバノメータ２８の駆動
により照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導く角度
に位置決めされる。

【００３９】従って、照明光Ｌは、ビームエキスパンダ
により適切なビーム径に拡大され、励起用ダイクロイッ
クミラー２３又は２４で反射された後、さらにガルバノ
ミラー２６で反射してアライメント光学系４１に導かれ
る。

【００４０】このアライメント光学系４１において照明
光Ｌは、集光レンズ３９によりミラー部材４０に結像
し、このミラー部材４０で反射して励起用ダイクロイッ
クミラー２３又は２４に戻る。

【００４１】なお、励起用ダイクロイックミラー２３又
は２４は、照明光Ｌを反射して標本からの蛍光又は反射
光である検出光を透過させる特性を持っており、反射率
で８０％〜９５％程度である。つまりアライメント光学
系４１から励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に
戻ってきた光は、照明光Ｌと同じ波長であり、かつその
５〜２０％は励起用ダイクロイックミラー２３又は２４
を透過する。そして、励起用ダイクロイックミラー２３
又は２４を透過した光は、コンフォーカル結像レンズ３
２を透過して共焦点ピンホール３３の面に結像する。

【００４２】ここで、アライメント光学系４１の集光レ
ンズ３９に入射する照明光Ｌは、平行光（アフォーカル
光）なので、ミラー部材４０で反射して再び集光レンズ
３９を通った光は、集光レンズ３９に入射する照明光Ｌ
と全く同じ角度の平行光となる。

【００４３】従って、励起用ダイクロイックミラー２３
又は２４で反射した照明光Ｌとミラー部材４０から戻っ
てくる光（アフォーカル光）も全く同じ角度となる。す
なわち、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４を透
過してコンフォーカル結像レンズ３２に入射する光の角
度は、ガルバノミラー２６の角度精度に影響されること
なく、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４の角度
誤差を正確に反映したものとなる。

【００４４】しかるに、ミラー部材４０から戻り、共焦
点ピンホール３３を通過して光検出器３４に入射される
光量が最も大きくなるように、共焦点ピンホール３３の
位置がＸＹ微動ステージ３５の駆動によりＸＹにスライ
ド移動され、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４
の角度エラーに応じた共焦点ピンホール３３のアライメ
ントが行われる。

【００４５】このように上記第２の実施の形態において
は、ガルバノミラー２６をアライメント光学系４１への
切り替え用に兼用し、アライメント時に照明光Ｌをガル
バノミラー２６からアライメント光学系４１に導くよう
にしたので、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４
を切り替えたときの角度エラーにより起こる共焦点ピン
ホール３３上でのアライメントずれを、観察用の標本面
にレーザ光を照射することなく、且つアライメント用の
標本のピント合わせ作業等を行うことなく、容易に補正
できる。

【００４６】又、アライメント光学系４１は、集光レン
ズ３９の焦点位置にミラー部材４０を正確に配置し固定
しておけば、ガルバノミラー２６の停止位置精度及び集
光レンズ３９の位置精度はコンフォーカル結像レンズ３
２に入射する光の角度に全く影響を及ぼさないので、極
めてラフな精度でよく、安価でかつ簡単な構成で正確な
アライメントができる。

【００４７】さらに、ガルバノミラー２６をアライメン
ト光学系４１への切り替え用に兼用したので、反射ミラ
ー等の光学部材及びその駆動機構を新たに設ける必要が
なく、上記第１の実施の形態よりもさらに簡単な構成に
できる。

【００４８】又、ガルバノミラー２６を集光レンズ３９
のバックフォーカス位置に配置し、停止させれば、ガル
バノミラー２６で反射された光は、集光レンズ３９を透
過する範囲で、ガルバノミラー２６で反射された光の角
度と同一の角度で必ずガルバノミラー２６の中心付近に
戻すことができる。

【００４９】なお、上述したバックフォーカス位置にガ
ルバノミラー２６を配置する場合、図３に示すように以
下のようにして用いることができる。ここでは、図３に
示すように、各ダイクロイックミラー２１、２２、２３
の波長特性に応じて、それぞれ異なった蛍光を発する蛍
光ガラス４０ａ、４０ｂ、４０ｃでミラー部材４０を区
画分けし、例えばダイクロイックミラー２１を使用する
ときは、ミラー部材４０の蛍光ガラス４０ａに光が向か
う角度、ダイクロイックミラー２３を使用するときは、
ミラー部材４０の蛍光ガラス４０ｂに光が向かう角度、
ダイクロイックミラー２４を使用するときは、ミラー部
材４０の蛍光ガラス４０ｃに光が向かう角度で、ガルバ
ノミラー２６を停止させる。

【００５０】このガルバノミラー２６は、集光レンズ３
９のバックフォーカス位置に配置されているので、ミラ
ー部材４０の各蛍光ガラス４０ａ、４０ｂ、４０ｃに対
応する角度でガルバノミラー２６を停止させると、ミラ
ー部材４０の各蛍光ガラス４０ａ、４０ｂ、４０ｃにそ
れぞれ集光した光はガルバノミラー２６の中心に戻って
くる。

【００５１】従って、アライメント時に各ダイクロイッ
クミラー２１、２３、２４の波長特性に合う蛍光ガラス
を使用できるので、アライメント光学系による検出光量
を多くすることができる。 (3) 次に、本発明の第３の実施の形態について図面を参
照して説明する。なお、図２と同一部分には同一符号を
付してその詳しい説明は省略する。

【００５２】図４は走査型レーザ顕微鏡の構成図であ
る。この走査型レーザ顕微鏡の上記第２の実施の形態と
相違するところは、ダイクロイックミラー切替え認識用
の検出器としてのセンサ４２を設け、このセンサ４２に
より波長特性の異なるダイクロイックミラー２１、２３
又は２４の切替えが認識されたときに制御部４３によっ
て共焦点ピンホール３３を自動的にアライメントするよ
うにしたところである。

【００５３】すなわち、ダイクロイックミラー切替え認
識用センサ４２は、ダイザ２２の移動を検出したときに
ダイクロイックミラー２１、２３又は２４の切替えの認
識信号を出力する機能を有している。

【００５４】制御部４３は、ダイクロイックミラー切替
え認識用センサ４２からの切替えの認識信号を受ける
と、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くような
ガルバノミラー２６の位置決め角度にする回転、停止の
指令をガルバノミラー２６を駆動するガルバノメータ２
８に対して発し、かつ光検出器３４から出力される光量
信号をモニタしながら共焦点ピンホール３３を備えたＸ
Ｙ微動ステージ３５を駆動することで、共焦点ピンホー
ル３３をＸＹにスライド移動させて光検出器３４により
検出される光量が最も大きくなるようにアライメント指
令を発して自動的にアライメントするようにしている。

【００５５】次に上記の如く構成された走査型レーザ顕
微鏡の作用について説明する。通常の観察時の作用は、
上記第２の実施の形態と同様なので省略する。次に、励
起用ダイクロイックミラー２３又は２４に切り替えるた
めにダイザ２２が移動すると、ダイクロイックミラー切
替え認識用センサ４２は、ダイザ２２の移動を検出して
その切替えの認識信号を制御部４３に送出する。

【００５６】この制御部４３は、上記切替えの認識信号
を受けると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導
くようなガルバノミラー２６の配置角度にする回転、停
止の指令をガルバノミラー２６を駆動するガルバノメー
タ２８に対して発する。これにより、ガルバノミラー２
６は、ガルバノメータ２８の駆動により照明光Ｌをアラ
イメント光学系４１側に導く角度に位置決めされる。

【００５７】従って、照明光Ｌは、上記第２の実施の形
態と同様に、励起用ダイクロイックミラー２３又は２４
で反射された後、さらにガルバノミラー２６で反射され
てアライメント光学系４１に導かれる。このアライメン
ト光学系４１において照明光Ｌは、集光レンズ３９によ
りミラー部材４０に結像し、このミラー部材４０で反射
して例えば励起用ダイクロイックミラー２３又は２４に
戻る。そして、励起用ダイクロイックミラー２３又は２
４を透過した光は、コンフォーカル結像レンズ３２を透
過して共焦点ピンホール３３の面に結像し、光検出器３
４に入射する。

【００５８】この場合、励起用ダイクロイックミラー２
３又は２４を透過してコンフォーカル結像レンズ３２に
入射する光の角度は、ガルバノミラー２６の角度精度に
影響されることなく、励起用ダイクロイックミラー２３
又は２４の角度誤差を正確に反映したものとなる。

【００５９】これと共に制御部４３は、光検出器３４か
ら出力される光量信号をモニタしながらＸＹ微動ステー
ジ３５をＸＹに駆動し、光検出器３４により検出される
光量が最も大きくなるように共焦点ピンホール３３を自
動的にアライメントする。

【００６０】このように上記第３の実施の形態において
は、励起用ダイクロイックミラー２１、２３又は２４の
切り替えをダイクロイックミラー切替え認識用センサ４
２により認識し、照明光Ｌをアライメント光学系４１側
に導くようなガルバノミラー２６の位置決め角度にする
とともに光検出器３４から出力される光量信号をモニタ
しながら共焦点ピンホール３３を設けたＸＹ微動ステー
ジ３５をＸＹに駆動するようにしたで、励起用ダイクロ
イックミラー２１、２３、２４が切替えられたときに煩
雑な作業が一切なく自動的に共焦点ピンホール３３のア
ライメントが短時間で確実に行うことができる。 (4) 次に、本発明の第４の実施の形態について図面を参
照して説明する。なお、図４と同一部分には同一符号を
付してその詳しい説明は省略する。

【００６１】図５は２重染色された蛍光標本を観察して
２種類の蛍光を別々に画像取得するときに用いられる走
査型レーザ顕微鏡の構成図である。各ダイクロイックミ
ラー２１、２３又は２４の透過光路上には、反射ミラー
４４を介して検出光を２種類の蛍光の波長別に分離する
光分離素子としての分光ダイクロイックミラー４５、４
６又は反射ミラー４７が配置されている。これら分光ダ
イクロイックミラー４５、４６及び反射ミラー４７は、
例えば図示しないダイザ等に載置され、モータの駆動に
より移動して透過光路上に切り替わって配置されるもの
となっている。

【００６２】これら分光ダイクロイックミラー４５、４
６及び反射ミラー４７の反射光路上には、例えば短波長
側としてのコンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピン
ホール３３を介してホトマルチプライヤ等の光検出器３
４が配置されている。

【００６３】又、分光ダイクロイックミラー４５、４６
の透過光路上には、反射ミラー４８を介して例えば長波
長側としてのコンフォーカル結像レンズ４９、共焦点ピ
ンホール５０を介してホトマルチプライヤ等の光検出器
５１が配置されている。このうち共焦点ピンホール５０
は、コンフォーカル結像レンズ４９の結像位置に配置さ
れるもので、ＸＹ微動ステージ５２上に設けられてい
る。このＸＹ微動ステージ５２は、共焦点ピンホール５
０を標本からの蛍光又は反射光（検出光）の光軸方向に
対して垂直面内に移動自在な構成となっている。

【００６４】分光ダイクロイックミラー切替え認識用セ
ンサ５３は、分光ダイクロイックミラー４５、４６及び
反射ミラー４７を載置するダイザの移動を検出したとき
にこれらダイクロイックミラー４５、４６又は４７の切
替えの認識信号を出力する機能を有している。

【００６５】制御部５４は、励起用ダイクロイックミラ
ー切替え認識用センサ４２又は分光ダイクロイックミラ
ー切替え認識用センサ５３からの切替えの認識信号を受
けると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くよ
うなガルバノミラー２６の位置決め角度にする回転、停
止の指令をガルバノミラー２６のガルバノメータ２８に
対して発する機能を有している。

【００６６】又、制御部５４は、分光ダイクロイックミ
ラー切替え認識用センサ５３からの切替えの認識信号を
受けてアライメントする共焦点ピンホール３３、５０が
いずれか一方であるか両方であるかを判断し、この判断
の結果に応じてＸＹ微動ステージ３５又は５２のいずれ
か一方又は両方にアライメント指令を発するようにして
いる。

【００６７】又、制御部５４は、アライメント時に、光
検出器３４又は５１のいずれか一方又は両方から出力さ
れる各光量信号をモニタしながらＸＹ微動ステージ３５
又は５２のいずれか一方又は両方を駆動し、光検出器３
４又は５１のいずれか一方又は両方により検出される光
量が最も大きくなるように共焦点ピンホール３３又は５
０のいずれか一方又は両方を自動的にアライメントする
ようにしている。

【００６８】次に上記の如く構成された走査型レーザ顕
微鏡の作用について説明する。先ず、２重染色された標
本を観察して２種類の蛍光を別々に観測する場合、レー
ザ光源２０から出力された照明光Ｌは、各ガルバノミラ
ー２６、２７の駆動により標本上に２次元走査され、こ
のときの標本からの蛍光（検出光）は、励起用ダイクロ
イックミラー２１に戻り、反射ミラー４４で反射して分
光ダイクロイックミラー４５に入射する。

【００６９】この測光分光ダイクロイックミラー４５
は、検出光のうち短波長成分を反射し、長波長成分を透
過させる。このうち短波長成分の検出光は、コンフォー
カル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を通過して
光検出器３４で検出され、これと共に長波長成分の検出
光は、反射ミラー４８で反射され、コンフォーカル結像
レンズ４９、共焦点ピンホール５０を通過して光検出器
５１で検出される。

【００７０】次に、２重染色された標本の蛍光色素を変
えた場合、つまり短波長成分の蛍光と長波長成分の蛍光
とを分ける波長を切り替えたい場合、分光ダイクロイッ
クミラー４５を分光ダイクロイックミラー４６に切り替
える。

【００７１】このとき分光ダイクロイックミラー切替え
認識用センサ５３は、分光ダイクロイックミラー４５、
４６及び反射ミラー４７を載置するダイザの移動を検出
し、分光ダイクロイックミラー４６への切替えの認識信
号を出力する。

【００７２】このように分光ダイクロイックミラー４６
に切り替えた場合、各共焦点ピンホール３３、５０で結
像位置にずれが生じるので、これら共焦点ピンホール３
３、５０でのアライメントが必要となる。

【００７３】従って、制御部５４は、分光ダイクロイッ
クミラー切替え認識用センサ５３からの切替えの認識信
号を受けると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に
導くようなガルバノミラー２６の配置角度にする回転、
停止の指令をガルバノミラー２６を駆動するガルバノメ
ータ２８に対して発する。

【００７４】これにより照明光Ｌは、上記第２の実施の
形態と同様に、励起用ダイクロイックミラー２１で反射
後、さらにガルバノミラー２６で反射してアライメント
光学系４１に導かれる。このアライメント光学系４１に
おいて照明光Ｌは、集光レンズ３９によりミラー部材４
０に結像し、このミラー部材４０で反射して再び励起用
ダイクロイックミラー２１に戻る。そして、励起用ダイ
クロイックミラー２１を透過した光は、反射ミラー４４
で反射して分光ダイクロイックミラー４６に入射する。

【００７５】この分光ダイクロイックミラー４６は、入
射した光のうち短波長成分を反射し、長波長成分を透過
させる。このうち短波長成分の検出光は、コンフォーカ
ル結像レンズ３２、共焦点ピンホール３３を通過して光
検出器３４で検出され、長波長成分の検出光は、反射ミ
ラー４８で反射され、コンフォーカル結像レンズ４９、
共焦点ピンホール５０を通過して光検出器５１で検出さ
れる。

【００７６】この場合、分光ダイクロイックミラー４６
を透過して各コンフォーカル結像レンズ３２、４９に入
射する光の角度は、ガルバノミラー２６の角度精度に影
響されることなく、分光ダイクロイックミラー４６の角
度誤差を正確に反映したものとなる。

【００７７】しかるに、制御部５４は、光検出器３４、
５１の両方から出力される各光量信号をそれぞれモニタ
しながら各ＸＹ微動ステージ３５、５２の両方に対して
アライメント指令を発して各ＸＹ駆動ステージ３５、５
２を駆動し、各光検出器３４、５１の両方により検出さ
れる各光量がそれぞれ最も大きくなるように各共焦点ピ
ンホール３３、５０の両方を自動的にアライメントす
る。

【００７８】次に、単染色標本を観察する場合、ダイザ
は分光ダイクロイックミラー４５（又は４６）から反射
ミラー４７に切り替わる。この場合でも共焦点ピンホー
ル３３で結像位置にずれが生じるので、共焦点ピンホー
ル３３のアライメントが必要となる。

【００７９】すなわち、上記同様に分光ダイクロイック
ミラー切替え認識用センサ５３は、反射ミラー４７を載
置するダイザの移動を検出し、反射ミラー４７への切替
えの認識信号を出力する。

【００８０】制御部５４は、分光ダイクロイックミラー
切替え認識用センサ５３からの切替えの認識信号を受け
ると、照明光Ｌをアライメント光学系４１側に導くよう
なガルバノミラー２６の位置決め角度にする回転、停止
の指令をガルバノミラー２６を駆動するガルバノメータ
２８に対して発する。これにより照明光Ｌは、上記第２
の実施の形態と同様に、励起用ダイクロイックミラー２
１で反射後、さらにガルバノミラー２６で反射されてア
ライメント光学系４１に導かれ、再び励起用ダイクロイ
ックミラー２１に戻り、そして反射ミラー４４、４５で
反射しされコンフォーカル結像レンズ３２、共焦点ピン
ホール３３を通過して光検出器３４で検出される。

【００８１】制御部５４は、光検出器３４から出力され
る光量信号をモニタしながらＸＹ微動ステージ３５に対
してアライメント指令を発して駆動し、光検出器３４に
より検出される光量が最も大きくなるように共焦点ピン
ホール３３を自動的にアライメントする。

【００８２】このように上記第４の実施の形態において
は、分光ダイクロイックミラー４５、４６を配置すると
共に、短波長側として共焦点ピンホール３３及び光検出
器３４を配置し、長波長側として共焦点ピンホール５０
及び光検出器５１を配置したので、上記第３の実施の形
態と同様な効果を奏することが出来ると共に、２重染色
された標本を分光ダイクロイックミラーを用いて観察し
て２種類の蛍光を別々に観測する場合においても煩雑な
作業が一切なく自動的に各共焦点ピンホール３３、５０
の各アライメントが短時間で確実に行うことができる。

【００８３】なお、上記第４の実施の形態では、２重染
色された標本を観察する場合のアライメントについて説
明したが、共焦点ピンホール及び光検出器を追加するこ
とにより多重染色された標本を観察するときのアライメ
ントについても適用できる。

【００８４】又、上述した実施の形態では、反射ミラー
３６（又はガルバノミラー２６，２７）、集光レンズ３
９及びミラー部材４０によりアライメントを行っていた
が、これに限られるものでなく集光レンズ３９及びミラ
ー部材４０をコーナキューブに変更してもアライメント
光学系を構成することができる。

【００８５】又、上述した実施の形態では、共焦点ピン
ホールと光軸との芯出し調整を行う調整手段として、共
焦点ピンホールをＸＹにスライド移動させてアライメン
トする例を説明したが、これに限られるものでなく、従
来の技術で説明した光軸を通る２枚の平行平面板を、そ
れぞれ異なった方向に回転制御させてアライメントする
ものも調整手段として用いることができる。

【００８６】

【発明の効果】以上詳記したように本発明の請求項１〜
３によれば、ビームスプリッタの切り替え時の共焦点ピ
ンホールへのアライメントを煩わしい作業を必要とせず
に簡単な構成で正確にできる走査型レーザ顕微鏡を提供
できる。

【００８７】又、本発明の請求項２によれば、多重染色
された標本を観察して数種類の蛍光を別々に観測する場
合でもこれら蛍光別の各共焦点ピンホールへのアライメ
ントが短時間で確実にできる走査型レーザ顕微鏡を提供
できる。又、本発明の請求項３によれば、自動的に共焦
点ピンホールのアライメントが短時間で確実にできる走
査型レーザ顕微鏡を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第１の実
施の形態を示す構成図。

【図２】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第２の実
施の形態を示す構成図。

【図３】同走査型レーザ顕微鏡の変形列を示す部分的な
構成図。

【図４】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第３の実
施の形態を示す構成図。

【図５】本発明に係わる走査型レーザ顕微鏡の第４の実
施の形態を示す構成図。

【図６】従来の走査型レーザ顕微鏡の構成図。

【符号の説明】

２０：レーザ光源、 ２１：励起用ダイクロイックミラー、 ２３，２４：励起用ダイクロイックミラー、 ２５：切替え機構、 ２６，２７：ガルバノミラー、 ３０：瞳投影レンズ、 ３２，４９：コンフォーカル結像レンズ、 ３３，５０：共焦点ピンホール、 ３４，５１：光検出器、 ３５，５２：ＸＹ微動ステージ、 ３６：反射ミラー、 ３８，４１：アライメント光学系、 ３９：集光レンズ、 ４０：ミラー部材、 ４０ａ，４０ｂ，４０ｃ：蛍光ガラス、 ４２：励起用ダイクロイックミラー切替え認識用セン
サ、 ４３，５４：制御部 ４５，４６：分光ダイクロイックミラー、 ４７：反射ミラー、 ５３：分光ダイクロイックミラー切替え認識用センサ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レーザ光を反射又は透過させる切換可能
   な複数の光分離素子を用い、前記分離素子で反射又は透
   過させたレーザ光は対物レンズを介して標本上に照射さ
   れ、この標本からの光は前記光分離素子により透過又は
   反射され、共焦点ピンホールを通して光検出器に導かれ
   るようにした走査型レーザ顕微鏡において、 前記光分離素子で反射又は透過したレーザ光を入射し、
   この入射したレーザ光の角度とこの入射したレーザ光を
   反射して出射する場合のレーザ光の角度とを同一にする
   アライメント光学系と、 前記光分離素子を反射又は透過した前記レーザ光を前記
   共焦点ピンホールと光軸とのアライメント時には前記ア
   ライメント光学系に導き、かつ前記標本の観察時には前
   記対物レンズに導くように光路を切り換える光路切替え
   手段と、 前記アライメント時に前記共焦点ピンホールを通過する
   光量を前記光検出器で検出し、この光量に基づいて前記
   共焦点ピンホールを通る光量が最大になるように前記共
   焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を行う調整手段
   と、を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記標本からの光を少なくとも２波長に
   分離する分光光学系を備えると共に、 前記共焦点ピンホール及び前記光検出器を前記分光光学
   系で分離される波長の数に応じて設け、 前記分光光学系を切り替えた時、前記調整手段は、前記
   光路切替え手段を制御して前記光分離素子で反射又は透
   過した前記レーザ光を前記アライメント光学系に導き、
   前記各共焦点ピンホールを通過する各光量に基づいて前
   記各共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を行うよう
   にしたことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕
   微鏡。
3. 【請求項３】 前記走査型レーザ顕微鏡に、 前記光分離素子の切り替えを検出する検出器と、 前記検出器で前記光分離素子の切り替えを検出したとき
   に、前記光路切替え手段で光路をアライメント光学系に
   導き、前記共焦点ピンホールを通過する光量に基づいて
   前記共焦点ピンホールと光軸との芯出し調整を自動的に
   行う制御手段とを備えたことを特徴とする請求項１又は
   ２記載の走査型レーザ顕微鏡。