JP5463671B2

JP5463671B2 - 焦点検出装置、顕微鏡

Info

Publication number: JP5463671B2
Application number: JP2008554066A
Authority: JP
Inventors: 一郎佐瀬
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2007-01-19
Filing date: 2008-01-09
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2028-01-09
Also published as: JPWO2008087992A1; US8208202B2; EP2107406A1; WO2008087992A1; CN101583895B; CN101583895A; US20090273830A1; EP2107406A4

Description

本発明は、焦点検出装置、顕微鏡に関する。

従来、生物顕微鏡用の焦点検出装置が多数提案されており、例えば近赤外光の反射を利用して試料近傍のガラス界面を検出して焦点合わせを行いこれを維持する技術（例えば、特開2004-70276号公報を参照。）は、投薬を伴う観察や長時間にわたる観察を行う際、さらには試料の複数箇所を連続的に観察する際に非常に有効である。

特開2004-70276号公報

しかしながら近年の生物顕微鏡では、蛍光観察に際して用いられる蛍光色素の長波長化が進んでおり、さらには光ピンセットや２光子励起法等の観察方法も使用されるようになってきている。したがって、生物顕微鏡において観察光として使用される光の波長は可視光領域に留まらなくなってきており、焦点検出及びその維持のためだけに近赤外光以上の波長帯域の光を使用することができなくなっているという問題がある。
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、焦点検出に利用する光の波長帯域を限定し、それ以外のより広い波長帯域の光を顕微鏡による観察や焦点検出以外に使用可能とした焦点検出装置、及びこれを備えた顕微鏡を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために本発明の第１態様は、
試料から発せられ撮像手段に入射する蛍光と、前記試料に照射する多光子励起観察用の励起光と、前記蛍光の波長帯域と前記多光子励起観察用の励起光の波長帯域とに挟まれる波長帯域の光であって前記試料に照射する焦点検出用の光とが入射し、入射する光から前記焦点検出用の光を分離し、前記試料と前記試料を撮影する撮像手段とを結ぶ観察光路に設置される光学部材と、
前記試料で反射した前記焦点検出用の光を受光する受光手段と、
前記受光手段からの信号に基づいて顕微鏡の対物レンズと前記試料との焦点ずれを検出する制御手段と、
を有することを特徴とする焦点検出装置を提供する。
また、本発明の第１態様によれば、
前記焦点検出装置は、前記多光子励起観察用の励起光を前記試料に入射させる光導入部材を有し、
前記光導入部材は、前記観察光路上であって前記光学部材と前記撮像手段との間に設置されることが望ましい。
また、本発明の第１態様によれば、
前記光学部材は前記焦点検出用の光を前記試料方向に反射し、前記試料から発せられ前記撮像手段に入射する前記蛍光を透過し、前記試料に照射する前記多光子励起観察用の励起光を透過することが望ましい。
また、本発明の第１態様によれば、
前記焦点検出装置は、前記焦点検出用の光の光路上に光軸方向に移動可能なオフセットレンズを有することが望ましい。
本発明の第２態様は、
本発明の第１態様に係る焦点検出装置を有する顕微鏡であって、
前記顕微鏡は試料載置用ステージと、前記焦点検出用の光を発する光源と、前記多光子励起観察用の励起光を発する光源と、
を有することを特徴とする顕微鏡を提供する。
また、本発明の第２態様によれば、
前記焦点検出用の光を発する光源は、波長帯域の異なる複数の光を選択的に発する光源であり、
前記光学部材は、前記光源の発する波長帯域の異なる複数の光にそれぞれ対応した複数のダイクロイックミラーを光路内へ挿脱可能に備えたダイクロイックミラーユニットであることが望ましい。

本発明によれば、焦点検出に利用する光の波長帯域を限定し、それ以外のより広い波長帯域の光を顕微鏡による観察や焦点検出以外に使用可能とした焦点検出装置、及びこれを備えた顕微鏡を提供することができる。

本発明の第１実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成を示す図である。本発明の第１実施形態における焦点検出装置３のダイクロイックミラー１５の反射特性を示す図である。本発明の第２実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成を示す図である。本発明の第２実施形態における焦点検出装置３０の構成を示し、図４ＡはＩＲ光源３１の構成を示し、図４Ｂはダイクロイックミラーユニット３２の構成を示す図である。ダイクロイックミラーユニット３２におけるダイクロイックミラー３２ｂの反射特性を示す図である。本発明の第３実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成を示す図である。本発明の第３実施形態における焦点検出装置４０のパーシャルミラー４１の構成を示し、図７Ａは上面図、図７Ｂは正面図である。

以下、本発明の各実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡を添付図面に基づいて説明する。
（第１実施形態）
はじめに、本実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体的な構成を説明する。
図１は、本発明の第１実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成を示す図である。
図１に示すように本顕微鏡１は、顕微鏡本体２と、焦点検出装置３と、光ピンセット光学系４とからなる。
本実施形態では、焦点検出に用いる光を除く光を非焦点ずれ検出光と称する。この非焦点ずれ検出光には、光ピンセット光や多光子励起光、更には例えば蛍光観察における観察対象物からの蛍光が含まれる。また、光ピンセット光や多光子励起光を発する光源を第２の光源と称する。

顕微鏡本体２は、カバーガラス５ａとスライドガラス５ｂで挟持された試料６を載置したステージ７と、該ステージ７側から順に、対物レンズ８と、結像レンズ９と、カメラ１０とを備えている。また、対物レンズ８側から見てステージ７の裏側には、試料６を照明するための照明光、すなわち後述する波長λ_ＩＲ１の近赤外光よりも波長が短い、波長λ_ＦＬ１、λ_ＦＬ２、λ_ＦＬ３の光を含む照明光を発する不図示の照明光源が備えられている。なお、対物レンズ８は、不図示の対物レンズ駆動部によって電動で上下動可能である。
また、光ピンセット光学系４は、レーザ光源１１と、該レーザ光源１１側から順に、レンズ１２と、ミラー１３ａ、１３ｂと、ハーフミラー１４とを備えている。なお、ハーフミラー１４は、顕微鏡本体２における対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路中に配置されており、これによりレーザ光源１１からのレーザ光を、顕微鏡本体２内の光路へ導き試料６へ照射することができる。また、本実施形態においてレーザ光源１１は、波長λ_ＩＲ３＝１０６４ｎｍの赤外レーザ光を発するものである。

以上の構成の下、顕微鏡本体２において、不図示の照明光源によって照明された試料６からの光は、対物レンズ８を経て、後述するダイクロイックミラー１５及びハーフミラー１４を順に透過し、結像レンズ９によってカメラ１０の撮像面上に結像される。これにより、カメラ１０では試料６の像を撮影することができ、観察者は撮影された試料６の像を不図示のモニタを介して観察することが可能となる（以下、「通常観察」という）。
また、光ピンセット光学系４において、レーザ光源１１から発せられたレーザ光は、レンズ１２を経て、ミラー１３ａ、１３ｂによって反射され、顕微鏡本体２内のハーフミラー１４へ導かれる。そしてこのレーザ光は、該ハーフミラー１４によって反射され、後述するダイクロイックミラー１５を透過した後、対物レンズ８を介して試料６に照射される。これにより、観察者は試料６に光ピンセット操作を行うことが可能となる（以下、「光ピンセット法による観察」という）。

次に、本実施形態において最も特徴的な焦点検出装置３の構成について詳細に説明する。
本焦点検出装置３は、所定の波長帯域の光を発するＩＲ光源１６と、該ＩＲ光源１６側から順に、レンズ１７と、ハーフマスク１８と、ハーフミラー１９と、ダイクロイックミラー１５とを備えており、さらにハーフミラー１９の反射光路上には、結像レンズ２０と、受光素子２１とを備えている。なお、本実施形態においてＩＲ光源１６の発する所定の波長帯域の光とは、波長λ_ＩＲ１＝７７０ｎｍの近赤外光である。
また、ダイクロイックミラー１５は、顕微鏡本体２における対物レンズ８とハーフミラー１４との間の光路中に配置されており、これによりＩＲ光源１６からの光を顕微鏡本体２内の光路へ導くことができる。そして本実施形態におけるダイクロイックミラー１５は、図２に示すようにＩＲ光源１６から発せられた所定の波長帯域の光、すなわち波長λ_ＩＲ１の近赤外光のみを反射する特性を有している。なお、図２は、本発明の第１実施形態における焦点検出装置３のダイクロイックミラー１５の反射特性を示す図である。

以上の構成の下、本焦点検出装置３において、ＩＲ光源１６から発せられた所定の波長帯域の光は、レンズ１７、ハーフマスク１８、ハーフミラー１９を順に経た後、ダイクロイックミラー１５によって試料６側へ反射される。この光は、対物レンズ８を経た後、試料６近傍のガラス界面６ａによって反射される。そしてこのガラス界面６ａからのＩＲ光源１６の光の反射光は、再びダイクロイックミラー１５によってＩＲ光源１６方向へ反射され、さらにハーフミラー１９で反射された後、結像レンズ２０を介して受光素子２１の受光面に結像される。
これに伴い、本焦点検出装置３に備えられた制御部２２は、受光素子２１で得られた信号に基づいてレンズ界面６ａの光軸方向位置を検出し、すなわち対物レンズ８とレンズ界面６ａとの焦点ずれを検出し、顕微鏡本体２に備えられた不図示の対物レンズ駆動部を介して対物レンズ８を駆動することで、対物レンズ８の焦点位置にレンズ界面６ａを配置する。これにより、顕微鏡本体２において試料６の合焦が達成される。なお、以上の合焦動作は、試料６の観察中常に実行されるため、試料６の合焦状態は観察中常に維持されることとなる。したがって本顕微鏡１は、投薬を伴う観察や長時間にわたる観察、さらには試料の複数の箇所の連続観察を行う場合に非常に有用である。

以上、本顕微鏡１は、上述のように焦点検出装置３において使用する光（以下、「焦点検出光」という。）を所定の波長帯域に限定することで、焦点検出光よりも波長の長い光を観察に使用可能としている。したがって本顕微鏡１は、焦点検出光よりも波長の短い光を使用する通常観察に加え、焦点検出光よりも長い波長の光を使用する光ピンセット法による観察も行うことができる。

なお、本顕微鏡１は、上述のように光ピンセット光学系４を備えているが、本発明はこれに限られるものでなく、この光ピンセット光学系４の代わりに、例えば波長λ_ＩＲ２＝８５０〜１０００ｎｍの赤外光を発する光源を備えた２光子励起観察を行うための光学系を備える構成とすることもできる。この場合、本顕微鏡１は、試料６の通常観察に加え、焦点検出光よりも波長の長い光を使用する２光子励起観察を行うことが可能となる。
また、本実施形態における合焦動作は、上述のように対物レンズ８の焦点位置にレンズ界面６ａを配置することで達成される。しかしながら本実施形態の構成はこれに限られず、本焦点検出装置３はさらに、ハーフミラー１９とダイクロイックミラー１５との間の光路中に、光軸方向へ移動可能なオフセットレンズを備えた構成とすることが望ましい。このオフセットレンズを移動させることで、レンズ界面６ａを対物レンズ８の焦点位置へ配置する際に、レンズ界面６ａを該焦点位置から任意のオフセット量だけ光軸方向へずらして配置することが可能となる。これにより、レンズ界面６ａ、すなわち試料６の表面だけでなく、試料６の深さ方向の所望の箇所に焦点合わせを行うことが可能となる。なお、斯かるオフセットレンズは、以下の各実施形態の焦点検出装置においても備えられていることが望ましい。
また、本実施形態では、上述のように不図示の対物レンズ駆動部によって対物レンズ８を上下動させて合焦動作を行っているが、本実施形態の構成はこれに限られず、ステージ駆動部を設け、ステージ７を上下動させて合焦動作を行う構成とすることもできる。なお、これは以下の各実施形態の顕微鏡においても同様である。

（第２実施形態）
図３は、本発明の第２実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成を示す図である。
以下、本実施形態及び後述する第３実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡について、上記第１実施形態と同様の構成である部分には同じ符号を付してその説明を省略し、異なる構成の部分について詳細に説明する。
本実施形態の焦点検出装置３０は、上記第１実施形態の焦点検出装置におけるＩＲ光源１６に代えて図４Ａに示す複数の波長の光を選択的に発することが可能なＩＲ光源３１を備え、さらにダイクロイックミラー１５に代えて図４Ｂに示すダイクロイックミラーユニット３２を備えている。
本実施形態においてＩＲ光源３１は、波長λ_ＩＲ１＝７７０ｎｍの近赤外光を発するＬＥＤ３１ａと、波長λ_ＩＲ２＝８７０ｎｍの赤外光を発するＬＥＤ３１ｂと、波長λ_ＩＲ３＝１０６４ｎｍの赤外光を発するＬＥＤ３１ｃとを備えており、観察者はこれらのＬＥＤを選択的に発光させることが可能である。なお、図４Ａは、本発明の第２実施形態における焦点検出装置３０のＩＲ光源３１の構成を示す図である。

また、ダイクロイックミラーユニット３２は、波長λ_ＩＲ１の近赤外光のみを反射する特性を有するダイクロイックミラー３２ａと、図５に示すように波長λ_ＩＲ２の赤外光のみを反射する特性を有するダイクロイックミラー３２ｂと、波長λ_ＩＲ３の赤外光のみを反射する特性を有するダイクロイックミラー３２ｃとを備えている。なお、図４Ｂは、本発明の第２実施形態におけるダイクロイックミラーユニット３２の構成を示す図である。また、図５は、ダイクロイックミラーユニット３２におけるダイクロイックミラー３２ｂの反射特性を示す図である。
また、ダイクロイックミラーユニット３２には不図示のスライド機構が設けられており、このスライド機構を介して該ダイクロイックミラーユニット３２を光路内へスライドさせることでダイクロイックミラー３２ａ、３２ｂ、３２ｃを選択的に光路内へ配置することが可能である。これにより、ＩＲ光源３１において選択したＬＥＤの波長に対応したダイクロイックミラーを光路内に配置することができる。

以上の構成の下、本焦点検出装置３０において、ＩＲ光源３１におけるＬＥＤ３１ａから発せられた波長λ_ＩＲ１の近赤外光は、レンズ１７、ハーフマスク１８、ハーフミラー１９を順に経た後、ダイクロイックミラーユニット３２のダイクロイックミラー３２ａによって試料６側へ反射される。この光は、対物レンズ８を経た後、試料６近傍のガラス界面６ａによって反射される。そしてこのガラス界面６ａからの波長λ_ＩＲ１の近赤外光の反射光は、再びダイクロイックミラーユニット３２のダイクロイックミラー３２ａによって反射され、さらにハーフミラー１９で反射された後、結像レンズ２０を介して受光素子２１の受光面に結像される。
なお、これに伴い本焦点検出装置３０に備えられた制御部２２で行われる合焦動作及びその維持は上記第１実施形態と同様である。
また、以上はＬＥＤ３１ａから発せられた波長λ_ＩＲ１の近赤外光について説明したが、ＬＥＤ３１ｂから発せられる波長λ_ＩＲ２の赤外光、ＬＥＤ３１ｃから発せられる波長λ_ＩＲ３の赤外光についても、それぞれに対応したダイクロイックミラーユニット３２におけるダイクロイックミラー３２ｂ、ダイクロイックミラー３２ｃを光路内へ配置することで同様の合焦動作及びその維持を達成することができる。

以上より、本顕微鏡は上記第１実施形態と同様の効果を奏することができる。
また本顕微鏡は、上述のように焦点検出装置３０においてＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃとこれに対応するダイクロイックミラー３２ａ、３２ｂ、３２ｃとを切り替えることで、通常観察と併用したい観察方法に合わせて焦点検出光の波長帯域を変更することができる。したがって具体的には、例えばダイクロイックミラー３２ｂを光路内へ配置してＬＥＤ３１ｂを発光させる、即ち波長λ_ＩＲ２の赤外光を焦点検出光として使用すれば、図５に示すように通常観察（波長λ_ＦＬ１、λ_ＦＬ２、λ_ＦＬ３）に加えて、長波長の蛍光色素を使用する蛍光観察（波長λ_ＦＬ４）と光ピンセット法による観察（波長λ_ＩＲ３）とを行うことが可能となる。なお、このように焦点検出光の波長帯域を変更した場合でも、受光素子の信号検出条件を電気的に切り替える構成とすれば、試料６の合焦状態を維持することができる。

（第３実施形態）
図６は、本発明の第３実施形態に係る焦点検出装置を備えた顕微鏡の全体構成を示す図である。
本実施形態の焦点検出装置４０は、上記第１実施形態の焦点検出装置３におけるダイクロイックミラー１５に代えて、図７に示すパーシャルミラー４１を備えている。
図７Ａ、７Ｂは、本発明の第３実施形態における焦点検出装置４０のパーシャルミラー４１の構成を示し、図７Ａは上面図を、図７Ｂは正面図を示す。
図７Ｂに示すように、パーシャルミラー４１は、後述するパーシャルミラー部４２と、これを挟持する２つの三角柱プリズム４３ａ、４３ｂとからなる。そしてパーシャルミラー部４２は、図７Ｂに示すようにＩＲ光源１６側から見て顕微鏡本体２における対物レンズ８の光軸方向へ長軸が伸びた楕円形状の透過面４２ａと、該透過面４２ａの長軸側の両端部に設けられた反射面４２ｂとからなる。

斯かるパーシャルミラー部４２の構成により、ＩＲ光源１６からの近赤外光のうちの大部分を透過させて光路外へ廃棄し、高ＮＡ領域を進行する外縁光束のみをガラス界面６ａ側へ反射し、さらにガラス界面６ａで反射された前記外縁光束を再びハーフミラー１９側へ反射することができる。
なお、パーシャルミラー部４２の透過面４２ａは、顕微鏡本体２において不図示の照明光源によって照明された試料６からの光、及び光ピンセット光学系４からのレーザ光を遮らない大きさに形成されているため、通常観察及び光ピンセット法による観察にパーシャルミラー４１が支障をきたすことはない。さらに、遮る場合でも、その遮光量は小さいため、許容できるものである。

以上の構成の下、本焦点検出装置４０において、ＩＲ光源１６から発せられた所定の波長帯域の光（波長λ_ＩＲ１の近赤外光）は、レンズ１７、ハーフマスク１８、ハーフミラー１９を順に経た後、パーシャルミラー４１の反射面４２ａ、４２ｂによって試料６側へ反射される。この光は、対物レンズ８を経た後、試料６近傍のガラス界面６ａによって反射される。そしてこのガラス界面６ａからの反射光は、再びパーシャルミラー４１の反射面４２ａ、４２ｂによって反射され、さらにハーフミラー１９で反射された後、結像レンズ２０を介して受光素子２１の受光面に結像される。
なお、これに伴い本焦点検出装置４０に備えられた制御部２２で行われる合焦動作及びその維持は上記第１実施形態と同様である。

以上より、本顕微鏡は上記第１実施形態と同様の効果を奏することができる。
また、本実施形態の焦点検出装置４０は、ＩＲ光源１６に代えて上記第２実施形態におけるＩＲ光源３１を備える構成とすることもできる。これにより、上記第２実施形態と同様の効果を奏することができる。また、パーシャルミラー４１は焦点検出光の波長帯域に関わらず使用可能であるため、第２実施形態のようにダイクロイックミラーユニット３２を光路内へスライドさせるような作業を必要としないため、よりスムーズな焦点検出光の切り替えを実現することができる。

以上の各実施形態によれば、焦点検出に利用する光の波長帯域を限定し、それ以外の波長帯域の光を顕微鏡による観察、例えば通常観察及びこれに併用される応用技術に使用可能とした焦点検出装置、及びこれを備えた顕微鏡を実現することができる。

Claims

試料から発せられ撮像手段に入射する蛍光と、前記試料に照射する多光子励起観察用の励起光と、前記蛍光の波長帯域と前記多光子励起観察用の励起光の波長帯域とに挟まれる波長帯域の光であって前記試料に照射する焦点検出用の光とが入射し、入射する光から前記焦点検出用の光を分離し、前記試料と前記試料を撮影する撮像手段とを結ぶ観察光路に設置される光学部材と、
前記試料で反射した前記焦点検出用の光を受光する受光手段と、
前記受光手段からの信号に基づいて顕微鏡の対物レンズと前記試料との焦点ずれを検出する制御手段と、
を有することを特徴とする焦点検出装置。
前記焦点検出装置は、前記多光子励起観察用の励起光を前記試料に入射させる光導入部材を有し、
前記光導入部材は、前記観察光路上であって前記光学部材と前記撮像手段との間に設置されることを特徴とする請求項１に記載の焦点検出装置。
前記光学部材は前記焦点検出用の光を前記試料方向に反射し、前記試料から発せられ前記撮像手段に入射する前記蛍光を透過し、前記試料に照射する前記多光子励起観察用の励起光を透過することを特徴とする請求項１または２に記載の焦点検出装置。
前記焦点検出装置は、前記焦点検出用の光の光路上に光軸方向に移動可能なオフセットレンズを有することを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の焦点検出装置。
請求項１から４の何れか１項に記載の焦点検出装置を有する顕微鏡であって、
前記顕微鏡は試料載置用ステージと、前記焦点検出用の光を発する光源と、前記多光子励起観察用の励起光を発する光源と、
を有することを特徴とする顕微鏡。
前記焦点検出用の光を発する光源は、波長帯域の異なる複数の光を選択的に発する光源であり、
前記光学部材は、前記光源の発する波長帯域の異なる複数の光にそれぞれ対応した複数のダイクロイックミラーを光路内へ挿脱可能に備えたダイクロイックミラーユニットであることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。