JP6153321B2 - 顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡に関し、特に、オートフォーカス装置（以降、ＡＦ装置と記す）を備えた顕微鏡に関する。

生物顕微鏡の分野では、二光子励起顕微鏡の登場により、長時間にわたって生体標本を生きたまま観察するタイムラプス観察が可能となっている。このような観察では、観察期間中にさまざまな要因でフォーカスにずれが生じてしまうため、フォーカスを維持するためのＡＦ装置を備えた顕微鏡が提案されている。例えば、特許文献１には、７７０ｎｍの波長の近赤外光をオートフォーカス光（以降、ＡＦ光と記す）として使用するＡＦ装置を備えた顕微鏡が開示されている。

なお、特許文献１に開示されるＡＦ装置のように、従来のアクティブ方式のＡＦ装置では、７５０から８００ｎｍの波長範囲の光をＡＦ光として用いるのが一般的である。

国際公開第２００８／０８７９９２号パンフレット

ところで、二光子励起顕微鏡では、励起波長は一光子励起の２倍の波長となるため、励起光に、可視光よりも波長の長い赤外光が用いられる。また、アクティブ方式のＡＦ装置を備えた二光子励起顕微鏡では、ＡＦ光とそれ以外の光（励起光や蛍光など）をダイクロイックミラーで波長により分離する必要がある。このため、ＡＦ光に用いられる、赤外域の一部の範囲については、励起光に使用することができない。したがって、励起光に使用することができる波長域が制限されてしまう。

また、二光子励起顕微鏡で、ＡＦ光の波長を避けるために従来のＡＦ光の波長よりも長い波長の光を励起光として用いると、励起光の波長と蛍光の波長の間にＡＦ光の波長が位置することになる。このため、ＡＦ光とそれ以外の光を分離するために、ダイクロイックミラーには、ノッチフィルターのように複雑な光学特性が要求されることになり、ダイクロイックミラーの設計が高度なものとなってしまう。特に、ＡＦ光以外の光に可能な限り広い波長域が割り当てられるようにダイクロイックミラーを設計する場合には、ダイクロイックミラーはＡＦ光の波長を含む極狭い範囲でだけ異なる光学特性を実現する必要があるため、ダイクロイックミラーの設計や製造が難しくなり、ＡＦ光とＡＦ光以外の光の分離が容易ではない。

なお、以上のような技術的な課題は、二光子励起顕微鏡に限られず、従来のＡＦ光よりも長い波長の光を利用する、多光子励起顕微鏡や光ピンセット装置を含む、他の顕微鏡でも同様に生じうる。

以上のような実情を踏まえ、本発明は、ＡＦ光以外の光の波長を制限することなく、ＡＦ光とＡＦ光以外の光を容易に分離することができる顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様は、対物レンズと、前記対物レンズと標本の間での焦点移動を検出するオートフォーカス装置を備え、前記オートフォーカス装置は、レーザ走査顕微鏡で二光子励起用の励起光として用いられる、または、光ピンセット装置で光ピンセット操作に用いられる、赤外域の１３００ｎｍの波長の光よりも長い波長の光を、オートフォーカス光として前記標本に照射するアクティブ方式のオートフォーカス装置である顕微鏡を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の顕微鏡において、さらに、前記対物レンズと前記オートフォーカス装置の間に、可視域から二光子励起顕微鏡で励起光として用いられる赤外域の１３００ｎｍまでの波長の光と前記オートフォーカス光とを合成するダイクロイックミラーを備える顕微鏡を提供する。

本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の顕微鏡において、前記ダイクロイックミラーは、可視域から二光子励起で励起光として用いられる赤外域の１３００ｎｍまでの波長の光を透過させ、前記オートフォーカス光を反射させる顕微鏡を提供する。

本発明の第４の態様は、第２の態様に記載の顕微鏡において、前記ダイクロイックミラーは、可視域から二光子励起で励起光として用いられる赤外域の１３００ｎｍまでの波長の光を反射させ、前記オートフォーカス光を透過させる顕微鏡を提供する。

本発明の第５の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡において、前記オートフォーカス光は、水を透過しない波長範囲内の１４００から１５００ｎｍの間の波長、または、１８５０から１９００ｎｍの間の波長を有する顕微鏡を提供する。

本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第５の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡において、さらに、標本からの観察光を検出する光検出器を備え、前記オートフォーカス光は、前記光検出器が前記観察光の波長に比べて低い検出効率を示す波長を有する顕微鏡を提供する。

本発明の第７の態様は、第６の態様に記載の顕微鏡において、前記光検出器の前記オートフォーカス光に対する検出効率は、前記光検出器の最大検出効率の１％未満である顕微鏡を提供する。

本発明の第８の態様は、対物レンズと、前記対物レンズと標本の間での焦点移動を検出するオートフォーカス装置を備え、前記オートフォーカス装置は、水を透過しない波長範囲内の１４００から１５００ｎｍの間の波長、または、１８５０から１９００ｎｍの間の波長の光を、オートフォーカス光として前記標本に照射するアクティブ方式のオートフォーカス装置である顕微鏡を提供する。
本発明の第９の態様は、対物レンズと、前記対物レンズと標本の間での焦点移動を検出するオートフォーカス装置を備え、前記オートフォーカス装置は、レーザ走査顕微鏡で励起光として用いられる、または、光ピンセット装置で光ピンセット操作に用いられる、赤外域の波長の光よりも長い波長の光を、オートフォーカス光として前記標本に照射するアクティブ方式のオートフォーカス装置であり、前記オートフォーカス光は、１４００から１５００ｎｍの間の波長を有する顕微鏡を提供する。
本発明の第１０の態様は、対物レンズと、前記対物レンズと標本の間での焦点移動を検出するオートフォーカス装置を備え、前記オートフォーカス装置は、レーザ走査顕微鏡で励起光として用いられる、または、光ピンセット装置で光ピンセット操作に用いられる、赤外域の波長の光よりも長い波長の光を、オートフォーカス光として前記標本に照射するアクティブ方式のオートフォーカス装置であり、前記オートフォーカス光は、１８５０から１９００ｎｍの間の波長を有する顕微鏡を提供する。

本発明によれば、ＡＦ光以外の光の波長を制限することなく、ＡＦ光とＡＦ光以外の光を容易に分離することができる顕微鏡を提供することができる。

本発明の実施例１に係る顕微鏡の構成を示す図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡に含まれるフィルタの特性を示す図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡の対物レンズとその周辺を示す拡大図である。 純水の透過特性を示す図である。 本発明の実施例２に係る顕微鏡の構成を示す図である。

図１は、本実施例に係る顕微鏡の構成を示す図である。図１に示す顕微鏡１００は、対物レンズ６とアクティブ方式のＡＦ装置３０とを備えたレーザ走査顕微鏡であり、標本Ｓ中の蛍光物質の励起に二光子過程を利用する二光子励起顕微鏡である。顕微鏡１００は、レーザ走査顕微鏡、特に、二光子励起顕微鏡で励起光として用いられる赤外域の波長の光よりも長い波長の光をＡＦ装置３０がＡＦ光として標本Ｓに照射することにより、ＡＦ光以外の光の波長を制限することなく、ＡＦ光とＡＦ光以外の光を容易に分離することを可能としている。

顕微鏡１００は、励起光であるレーザ光を出射するレーザ１と対物レンズ６の間の光路上に、レーザ光を反射させて標本Ｓからの蛍光を透過させるダイクロイックミラー２と、標本Ｓを走査するための走査手段であるガルバノミラー３と、結像レンズ４ａと瞳投影レンズ４ｂからなるレーザ走査顕微鏡光学系（以降、ＬＳＭ光学系と記す）４と、ミラー５と、分離合成手段１０を備えている。ここで、対物レンズ６の瞳位置とガルバノミラー３は、ＬＳＭ光学系４により光学的に共役な関係を維持している。

レーザ１は、二光子励起用の光源であり、例えば、高い光子密度を実現するフェムト秒超短パルスレーザである。レーザ１は、６８０から１３００ｎｍの範囲内の波長を有するレーザ光を出射する。

分離合成手段１０は、レーザ１からのレーザ光とＡＦ装置３０からのＡＦ光とを合成するとともに、標本Ｓを反射したＡＦ光と標本Ｓからの蛍光とを分離するように構成されている。具体的には、分離合成手段１０は、ダイクロイックミラー１１と、バンドパスフィルタ１２と、バリアフィルタ１３を含んでいる。

なお、ＡＦ装置３０は、レーザ走査顕微鏡で一般的に励起光として用いられる赤外域の励起波長の光よりも長い波長λ_ＡＦの光をＡＦ光として標本Ｓに照射する。このため、ダイクロイックミラー１１及びバリアフィルタ１３は、蛍光及び励起光を含むＡＦ光よりも短い波長の光を透過させ、ＡＦ光を含む長波長域の光を反射させる、図２（ａ）に示すようなショートパスフィルタの特性を有するように設計される。つまり、ダイクロイックミラー１１は、可視域から二光子励起顕微鏡で励起光として用いられる赤外域までの波長の光とＡＦ光とを合成するように構成される。一方、バンドパスフィルタ１２は、蛍光及び励起光を含むＡＦ光よりも短い波長の光を反射させ、ＡＦ光を含む長波長域の光を透過させる、図２（ｂ）に示すようなロングパスフィルタの特性を有するように設計される。

対物レンズ６は、図示しないレボルバに装着されていて、図示しない他の対物レンズとの間で任意に切り換えて使用される。なお、対物レンズ６は、図３に示すように、標本Ｓに接するカバーガラスＣＧと対物レンズ６との間に浸液ＩＭを満たした状態で標本Ｓを観察するための液浸系対物レンズであるが、顕微鏡１００で使用される対物レンズは液浸系対物レンズに限られず、乾燥系対物レンズであってもよい。

顕微鏡１００は、さらに、ダイクロイックミラー２によってレーザ光路から分岐する検出光路上に、標本Ｓからの蛍光を集光するレンズ７と、標本からの観察光である蛍光を検出する光検出器８を備えている。光検出器８は、レンズ７の焦点面またはその近傍に受光面を有する光検出器であり、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサである。なお、検出光路上に、レーザ１からの励起光を遮断するバリアフィルタを設けても良い。

顕微鏡１００は、さらに、標本Ｓを挟んで対物レンズ６の向かい側に、透過検出系２０を備えている。透過検出系２０は、レンズ２１と、バリアフィルタ２２と、光検出器２３を含んでいる。バリアフィルタ２２は、標本Ｓからの蛍光を透過させて、標本Ｓを透過した励起光及びＡＦ光を遮断する特性を有する光学フィルタである。なお、バリアフィルタ２２は、励起光を遮断するフィルタとＡＦ光を遮断するフィルタから構成されていてもよい。光検出器２３は、対物レンズ６の瞳位置と光学的に共役な位置またはその近傍に受光面を有する光検出器であり、例えば、光電子増倍管（Photomultiplier Tube、以降、ＰＭＴと記す）である。

顕微鏡１００に備えられているＡＦ装置３０は、対物レンズ６と標本Ｓの間での焦点移動を検出する装置であり、図１に示すように、顕微鏡本体に装着される筐体３０ａ内に、ＡＦ用光源３１、絞り３２、瞳分割絞り３３、ビームスプリッタ３４、ミラー３５、結像レンズ３６、瞳分割絞り３７、ミラー３８、光検出器３９とを含んでいる。

ＡＦ用光源３１は、レーザ走査顕微鏡で励起光として用いられる赤外域の励起波長の光よりも長い、例えば、１４００ｎｍ以上の波長の光をＡＦ光として出射するレーザである。ＡＦ用光源３１から出射されたＡＦ光は、円形の開口が形成された絞り３２で光束径が調整され、瞳分割絞り３３で円形から半円形の光束に変換される。瞳分割絞り３３を通過したＡＦ光は、その後、ビームスプリッタ３４及びミラー３５を介して入射する結像レンズ３６でコリメートされて、ＡＦ装置３０から出射する。図１では、ＡＦ装置３０から出射される光が出射光ＡＬ１として描かれている。
なお、ＡＦ用光源としては、１４００ｎｍ以上の所定の波長を発する光源であればよく、ＬＤ、ＬＥＤ等が採用可能である。

ＡＦ装置３０から出射した出射光ＡＬ１は、ダイクロイックミラー１１で反射し、対物レンズ６を通過した後に、図３に示すように、カバーガラスＣＧの表面で反射する。カバーガラスＣＧで反射した反射光ＡＬ２は、光軸を中心として出射光ＡＬ１とは反対側に半円形の光束を有するＡＦ光であり、出射光ＡＬ１と同じ光路を反対方向に進行してＡＦ装置３０に入射する。つまり、対物レンズ６を通過し、ダイクロイックミラー１１で反射して、ＡＦ装置３０に入射する。
なお、図３では、浸液を用いた場合が例示しているが、対物レンズが乾燥系の場合はカバーガラスＣＧの試料側の裏面で反射する光を用いてもよい。

ＡＦ装置３０に入射した反射光ＡＬ２は、図１に示すように、結像レンズ３６で集光されて、ミラー３５、ビームスプリッタ３４を反射し、さらに、瞳分割絞り３７を介して入射するミラー３８を反射して、光検出器３９に入射する。なお、光検出器３９は、対物レンズ６の焦点面と光学的に共役な位置に受光面を有する光検出器であり、例えば、二分割フォトダイオードである。

ＡＦ光の反射面（つまり、カバーガラスＣＧの表面）が対物レンズ６の焦点面である場合には、二分割フォトダイオードである光検出器３９に入射するＡＦ光は、２つのフォトダイオードに均等に入射することになるが、反射面が焦点面からずれている場合には、２つのフォトダイオードに入射する光量に差異が生じる。このため、ＡＦ装置３０は、２つのフォトダイオードに入射する光量を監視することで、対物レンズ６と標本Ｓの間での焦点移動を検出することが可能であり、顕微鏡１００は、ＡＦ装置３０からの情報に基づいて、対物レンズ６や図示しないステージを光軸方向に移動させることで、ＡＦ装置の合焦位置から予め設定されたオフセット量の標本Ｓの所望の位置に合焦することができる。

上述したように、顕微鏡１００では、ＡＦ装置３０がレーザ走査顕微鏡で励起光として用いられる赤外域の励起波長の光よりも長い波長λ_ＡＦの光を、ＡＦ光として標本Ｓに照射するように構成されている。この様な構成では、顕微鏡１００で使用するＡＦ光以外の光（励起光及び蛍光）は、ＡＦ光の波長よりも短い波長を有する。このため、顕微鏡１００によれば、ＡＦ光によってＡＦ光以外の光の波長が制限されることが防止することができる。

また、顕微鏡１００では、励起光の波長と蛍光の波長の両方が、ＡＦ光の波長よりも短波長側に位置する。このため、図２に示すように、ＡＦ光とそれ以外の光を分離または合成するための光学フィルタ（ダイクロイックミラー１１、バンドパスフィルタ１２、バリアフィルタ１３）は、ロングパスまたはショートパスフィルタとして設計されればよいため、ＡＦ光の波長を含むごく狭い波長域のみ透過率を異ならせた従来のフィルタに比べて、設計や製造の難易度を大幅に下げることができる。このため、顕微鏡１００によれば、ＡＦ光とＡＦ光以外の光を容易に分離することができる。

また、ＡＦ光の波長は、例えば、１４００ｎｍ以上の波長であるとしたが、ＡＦ光は、水を透過しない波長範囲内の波長を有することが望ましい。具体的には、図４に示すように、ＡＦ光は、１４００から１５００ｎｍの間の波長、または、１８５０から１９００ｎｍの間の波長を有することが望ましい。なお、図４は、純水１ｍｍに対する光の透過特性を示している。蛍光観察の観察対象である生体標本の大部分は水であるので、蛍光観察では、水を透過しない波長範囲内の波長の光は励起光としても蛍光としても適当ではなく、そのような波長の光が励起光または蛍光として使用される可能性は極めて低い。このため、水を透過しない波長範囲内の波長の光をＡＦ光として用いることで、励起光または蛍光との波長の重なりを避けることが可能であり、従って、ＡＦ光によってＡＦ光以外の光の波長が制限されることをより確実に防止することができる。

なお、ＡＦ光として水を透過しない波長範囲内の波長の光を使用する場合には、浸液として、例えば、シリコーンなど、水以外の液体を使用することが望ましい。また、ＡＦ光として水を透過しない波長範囲内の波長の光を使用する場合には、バリアフィルタ１３などのＡＦ光を遮断するための光学フィルタを、純水を封入した光学素子で代用してもよい。

また、図１では、ダイクロイックミラー１１が可視域から二光子励起で励起光として用いられる赤外域までの波長の光（つまり、励起光と蛍光）を透過させ、ＡＦ光を反射させる特性を有する例を示したが、ＡＦ装置３０の配置によっては、分離合成手段１０に含まれるダイクロイックミラーは、可視域から二光子励起で励起光として用いられる赤外域までの波長の光を反射させ、ＡＦ光を透過させる特性を有しても良い。

また、ＡＦ光は、標本Ｓからの観察光である蛍光を検出する光検出器が観察光の波長に比べて低い検出効率を示す波長を有することが望ましく、例えば、光検出器のＡＦ光に対する検出効率は、光検出器の最大検出効率の１％未満であることが望ましい。光検出器のＡＦ光に対する検出効率が低ければ、ＡＦ光が誤って光検出器に入射した場合であっても、ＡＦ光による影響を小さく抑えることができるからである。

また、顕微鏡１００は、光ピンセット装置として用いられても良い。ＡＦ光が、光ピンセット装置で光ピンセット操作に用いられる赤外域の波長の光よりも長波長の光であれば、ＡＦ光以外の光の波長を制限することなく、ＡＦ光とＡＦ光以外の光を容易に分離することができる。

図５は、本実施例に係る顕微鏡の構成を示す図である。図５に示す顕微鏡１０１は、実施例１に係る顕微鏡１００と同様に、対物レンズ６とアクティブ方式のＡＦ装置３０とを備えたレーザ走査顕微鏡であり、標本Ｓ中の蛍光物質の励起に二光子過程を利用する二光子励起顕微鏡である。顕微鏡１０１は、レーザ走査顕微鏡、特に、二光子励起顕微鏡で励起光として用いられる赤外域の波長の光よりも長い波長の光をＡＦ装置３０がＡＦ光として標本Ｓに照射することにより、ＡＦ光以外の光の波長を制限することなく、ＡＦ光とＡＦ光以外の光を容易に分離することを可能としている点も、顕微鏡１００と同様である。

顕微鏡１０１は、ミラー５と対物レンズ６の間の光路上に、レーザ１からの励起光を対物レンズ６の光軸上に導入するためのダイクロイックミラー９を備え、レーザ１とダイクロイックミラー９の間に、ガルバノミラー３とＬＳＭ光学系４とを備えている点が、顕微鏡１００と異なっている。

また、顕微鏡１０１は、標本Ｓから見てミラー５の後段に、分離合成手段４０を備えていて、分離合成手段４０の透過光路上にＡＦ装置３０を、分離合成手段４０の反射光路上に光検出器５０を、備えている点も、顕微鏡１００とは異なっている。

分離合成手段４０は、標本Ｓを反射したＡＦ光と標本Ｓからの蛍光とを分離するように構成されていて、ダイクロイックミラー４１と、バンドパスフィルタ４２と、バリアフィルタ４３を含んでいる。ダイクロイックミラー４１及びバンドパスフィルタ４２は、蛍光及び励起光を含むＡＦ光よりも短い波長の光を反射させ、ＡＦ光を含む長波長域の光を透過させる、図２（ｂ）に示すような特性を有するように設計される。一方、バリアフィルタ４３は、蛍光及び励起光を含むＡＦ光よりも短い波長の光を透過させ、ＡＦ光を含む長波長域の光を反射させる、図２（ａ）に示すような特性を有するように設計される。なお、光検出器５０に励起光が入射することを防止するために、ダイクロイックミラー４１と光検出器５０の間に、さらに、励起光を反射するバリアフィルタを設けても良い。

本実施例に係る顕微鏡１０１でも、ＡＦ装置３０がレーザ走査顕微鏡で励起光として用いられる赤外域の励起波長の光よりも長い波長λ_ＡＦの光をＡＦ光として標本Ｓに照射するように構成されているため、実施例１に係る顕微鏡１００と同様の効果を有している。つまり、ＡＦ光によってＡＦ光以外の光の波長が制限されることが防止し、且つ、ＡＦ光とＡＦ光以外の光を容易に分離することができる。なお、本実施例に係る顕微鏡１０１でも、実施例１に係る顕微鏡１００と同様に、ＡＦ光は水を透過しない波長範囲内の波長を有することが望ましい。

上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。各実施例に係る顕微鏡は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
たとえば、各実施例では、ＡＦ装置３０を結像レンズ３６よりＡＦ用光源３１側に配置された構成要素からなる装置として説明したが、ＡＦ装置３０を分離合成手段１０，４０を含めたＡＦユニットとして、一体に設けてもよい。

１ レーザ
２、９、１１、４１ ダイクロイックミラー
３ ガルバノミラー
４ ＬＳＭ光学系
４ａ、３６ 結像レンズ
４ｂ 瞳投影レンズ
５、３５、３８ ミラー
６ 対物レンズ
７、２１ レンズ
８、２３、３９、５０ 光検出器
１０、４０ 分離合成手段
１２、４２ バンドパスフィルタ
１３、２２、４３ バリアフィルタ
２０ 透過検出系
３０ ＡＦ装置
３０ａ 筐体
３１ ＡＦ用光源
３２ 絞り
３３、３７ 瞳分割絞り
３４ ビームスプリッタ
１００、１０１ 顕微鏡
Ｓ 標本
ＡＬ１ 出射光
ＡＬ２ 反射光
ＥＬ 励起光
ＣＧ カバーガラス
ＩＭ 浸液

Claims (10)

1. 対物レンズと、
   前記対物レンズと標本の間での焦点移動を検出するオートフォーカス装置を備え、
   前記オートフォーカス装置は、レーザ走査顕微鏡で二光子励起用の励起光として用いられる、または、光ピンセット装置で光ピンセット操作に用いられる、赤外域の１３００ｎｍの波長の光よりも長い波長の光を、オートフォーカス光として前記標本に照射するアクティブ方式のオートフォーカス装置である
   ことを特徴とする顕微鏡。
2. 請求項１に記載の顕微鏡において、さらに、
   前記対物レンズと前記オートフォーカス装置の間に、可視域から二光子励起顕微鏡で励起光として用いられる赤外域の１３００ｎｍまでの波長の光と前記オートフォーカス光とを合成するダイクロイックミラーを備える
   ことを特徴とする顕微鏡。
3. 請求項２に記載の顕微鏡において、
   前記ダイクロイックミラーは、
   可視域から二光子励起で励起光として用いられる赤外域の１３００ｎｍまでの波長の光を透過させ、
   前記オートフォーカス光を反射させる
   ことを特徴とする顕微鏡。
4. 請求項２に記載の顕微鏡において、
   前記ダイクロイックミラーは、
   可視域から二光子励起で励起光として用いられる赤外域の１３００ｎｍまでの波長の光を反射させ、
   前記オートフォーカス光を透過させる
   ことを特徴とする顕微鏡。
5. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡において、
   前記オートフォーカス光は、水を透過しない波長範囲内の１４００から１５００ｎｍの間の波長、または、１８５０から１９００ｎｍの間の波長を有する
   ことを特徴とする顕微鏡。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡において、さらに、
   標本からの観察光を検出する光検出器を備え、
   前記オートフォーカス光は、前記光検出器が前記観察光の波長に比べて低い検出効率を示す波長を有する
   ことを特徴とする顕微鏡。
7. 請求項６に記載の顕微鏡において、
   前記光検出器の前記オートフォーカス光に対する検出効率は、前記光検出器の最大検出効率の１％未満である
   ことを特徴とする顕微鏡。
8. 対物レンズと、
   前記対物レンズと標本の間での焦点移動を検出するオートフォーカス装置を備え、
   前記オートフォーカス装置は、水を透過しない波長範囲内の１４００から１５００ｎｍの間の波長、または、１８５０から１９００ｎｍの間の波長の光を、オートフォーカス光として前記標本に照射するアクティブ方式のオートフォーカス装置である
   ことを特徴とする顕微鏡。
9. 対物レンズと、
   前記対物レンズと標本の間での焦点移動を検出するオートフォーカス装置を備え、
   前記オートフォーカス装置は、レーザ走査顕微鏡で励起光として用いられる、または、光ピンセット装置で光ピンセット操作に用いられる、赤外域の波長の光よりも長い波長の光を、オートフォーカス光として前記標本に照射するアクティブ方式のオートフォーカス装置であり、
   前記オートフォーカス光は、１４００から１５００ｎｍの間の波長を有する
   ことを特徴とする顕微鏡。
10. 対物レンズと、
    前記対物レンズと標本の間での焦点移動を検出するオートフォーカス装置を備え、
    前記オートフォーカス装置は、レーザ走査顕微鏡で励起光として用いられる、または、光ピンセット装置で光ピンセット操作に用いられる、赤外域の波長の光よりも長い波長の光を、オートフォーカス光として前記標本に照射するアクティブ方式のオートフォーカス装置であり、
    前記オートフォーカス光は、１８５０から１９００ｎｍの間の波長を有する
    ことを特徴とする顕微鏡。