JP5839897B2 - 非線形光学顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、非線形光学顕微鏡に関する。

非線形光学顕微鏡を用いた生体標本の観察において、観察深度を制限する最大の要因は、標本で生じる光の散乱である。例えば、２光子励起顕微鏡による蛍光観察では、励起光の散乱は、焦点面に照射される励起光の減少や散乱光によるＳ／Ｎ比の低下などを引き起し、標本の深部の観察を制限する。また、蛍光の散乱は、撮像素子に入射する蛍光の減少を引き起こし、標本の深部の観察を制限する。

このため、生体標本をより深くまで観察するためのアプローチとしては、散乱の抑制に効果的な光の長波長化が最も一般的である。
一方で、観察深度は、光の散乱の他に光の吸収によっても制限される。例えば、生体標本の主要な成分である水は、長波長帯域で低い光透過率を有している。観察深度が深くなるほど、光が生体標本内を通過する距離は長くなるため、標本の深部を観察する場合、生体標本内の水による光の吸収の影響は無視できない。

従って、観察深度は、一概に光の波長が長くなるほど深くなるというものではなく、各波長における光の散乱と光の吸収のバランスによって決まることになる。
このような観点から、光の散乱と光の吸収のバランスを考慮し、長波長でありながら光の吸収が比較的抑えられる波長帯域の光を利用した顕微鏡が、例えば、非特許文献１で開示されている。

非特許文献１に開示される顕微鏡によれば、光の散乱を抑制し得る長波長の光を使用しながら、水による過度な光の吸収を抑えることができるため、従来の顕微鏡に比べて、より深くまで生体標本を観察することができる。

D. Kobat, M.E.Durst, N. Nishimura, A. W. Wong, C. B. Schaffer; C. Xu: "Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation," Optics Express, Vol.17, No16(2009), 13354-13364.

ところで、光の吸収は、生体標本内でのみ生じるわけではなく、光路中の任意の場所で生じうる。例えば、２光子励起顕微鏡などの非線形光学顕微鏡では、対物レンズと標本の間を浸液で満たして開口数を向上させる液浸技術を用いることが多々あるが、浸液による光の吸収も標本内での光の吸収と同様に観察深さを制限する要因となる。

生体標本を対象とする観察では、標本との間の屈折率差を小さくすることができる場合が多く、且つ、取扱いが容易である、といった理由から、浸液として純水（水）を利用することが一般的である。非特許文献１に開示される顕微鏡でも、浸液として純水を利用している。

従って、非特許文献１に開示される顕微鏡では、水による光の吸収は、観察深度よりも長い作動距離に依存する。このため、非特許文献１に開示されるように、光の吸収が比較的抑えられる波長帯域の光を使用した場合であっても、水による光の吸収は未だ大きな影響を及ぼす。このため、非特許文献１に開示される顕微鏡によれば、従来の顕微鏡に比べて深い部位を観察することは可能であるが、その観察深度は十分なものではない。

以上のような実情を踏まえて、本発明では、散乱を抑制するために長波長の光を用いた場合であっても、光の吸収を抑制することができる顕微鏡の技術を提供することを目的する。

本発明の第１の態様は、屈折率が１．３８よりも大きい浸液を用いて標本の観察を行う非線形光学顕微鏡であって、１２００ｎｍ以上の波長を有するパルス光を射出する光源部と、前記光源部から射出される前記パルス光を前記標本に照射する、２ｍｍ以上の作動距離を有する対物レンズと、を含み、前記浸液は、前記標本と前記対物レンズの間に満たされる、前記光源部から射出される前記パルス光の波長に対して純水が有する内部透過率よりも高い内部透過率を有する非線形光学顕微鏡を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記パルス光の波長は、１６００ｎｍから１７５０ｎｍの間である非線形光学顕微鏡を提供する。
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記浸液の内部透過率は、前記パルス光の波長に対して、８０パーセント／ｍｍ以上である非線形光学顕微鏡を提供する。

本発明の第４の態様は、第１の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記パルス光の波長は、１２００ｎｍから１３５０ｎｍの間である非線形光学顕微鏡を提供する。
本発明の第５の態様は、第４の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記浸液の内部透過率は、前記パルス光の波長に対して、９５パーセント／ｍｍ以上である非線形光学顕微鏡を提供する。

本発明の第６の態様は、第１の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記パルス光の波長は、１５５０ｎｍから１８５０ｎｍの間である非線形光学顕微鏡を提供する。

本発明の第７の態様は、第１の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記浸液は、シリコーンである非線形光学顕微鏡を提供する。
本発明の第８の態様は、第３の態様、第５の態様又は第６の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、さらに、球面収差を補正するための球面収差補正機構を含む非線形光学顕微鏡を提供する。

本発明の第９の態様は、第８の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記球面収差補正機構は、前記対物レンズの補正環である非線形光学顕微鏡を提供する。
本発明の第１０の態様は、第３の態様、第５の態様又は第６の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記光源部は、光源と、前記光源から射出された光の波長を変換する光パラメトリック発振器と、を含む非線形光学顕微鏡を提供する。

本発明の第１１の態様は、第３の態様、第５の態様又は第６の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記光源部は、ファイバレーザである非線形光学顕微鏡を提供する。

本発明の第１２の態様は、第３の態様、第５の態様又は第６の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、さらに、前記対物レンズと前記標本の間に前記浸液を保持する浸液保持部を含む非線形光学顕微鏡を提供する。
本発明の第１３の態様は、第１の態様に記載の非線形光学顕微鏡において、前記浸液は、官能基を有するパーフルオロポリエーテルを含む水浸顕微鏡に用いる浸液である非線形光学顕微鏡を提供する。
本発明の第１４の態様は、屈折率が１．３８よりも大きい浸液を用いて非線形光学顕微鏡で標本の観察を行う方法であって、１２００ｎｍ以上の波長であって、前記浸液が当該波長に対して純水が有する内部透過率よりも高い内部透過率を示す波長を有するパルス光を射出し、射出した前記パルス光を２ｍｍ以上の作動距離を有する対物レンズを介して前記標本に照射する方法を提供する。
本発明の第１５の態様は、第１４の態様に記載の方法において、前記パルス光の波長は、１６００ｎｍから１７５０ｎｍの間であり、前記浸液の内部透過率は、前記パルス光の波長に対して、８０パーセント／ｍｍ以上である方法を提供する。
本発明の第１６の態様は、第１４の態様に記載の方法において、前記パルス光の波長は、１２００ｎｍから１３５０ｎｍの間であり、前記浸液の内部透過率は、前記パルス光の波長に対して、９５パーセント／ｍｍ以上である方法を提供する。
本発明の第１７の態様は、第１４の態様または第１５の態様に記載の方法において、前記浸液は、シリコーンである方法を提供する。
本発明の第１８の態様は、第１４の態様または第１５の態様に記載の方法において、前記浸液は、官能基を有するパーフルオロポリエーテルを含む水浸顕微鏡に用いる浸液である方法を提供する。

本発明によれば、散乱を抑制するために長波長の光を用いた場合であっても、光の吸収を抑制することができる顕微鏡の技術を提供することができる。

実施例１に係る２光子励起顕微鏡について説明するための図である。 浸液の透過率特性を示した図である。 浸液の屈折率と浸液内での実距離との関係について説明するための図である。 実施例２に係る２光子励起顕微鏡について説明するための図である。

図１は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡について説明するための図である。図２は、浸液の透過率特性を示した図であり、横軸を波長（ｎｍ）とし、縦軸を単位長さ（１ｍｍ）当たりの内部透過率（％）とした透過率特性を示している。

図１に例示される非線形光学顕微鏡の一種である２光子励起顕微鏡１００は、チタンサファイアレーザ１ａと光パラメトリック発振器１ｂ（ＯＰＯ：optical parametric oscillator、以降、ＯＰＯと記す。）とからなる光源部２と、ビーム径を拡大するビームエクスパンダ３と、標本１２を走査するためのガルバノミラー４と、瞳リレーレンズ５と、結像レンズ６と、ミラー７と、標本１２を励起するレーザ光を透過させて標本１２から生じる蛍光を反射するダイクロイックミラー８と、光源部２から射出されたレーザ光を標本１２に照射する対物レンズ９と、標本１２と対物レンズ９の間に満たされる浸液であるシリコーンオイル１１と、を含んでいる。

さらに、２光子励起顕微鏡１００は、図１に例示されるように、蛍光を反射するダイクロイックミラー８の反射光路上に、リレーレンズ１３と、ＩＲカットフィルタ１４と、反応光検出フィルタ１５と、蛍光を検出する光検出器である光電子増倍管１６（ＰＭＴ：Photomultiplier、以降、ＰＭＴと記す）と、を含んでいる。

チタンサファイアレーザ１ａは、サブピコ秒オーダーのパルス幅を有するパルス光を射出し、ＯＰＯ１ｂは、チタンサファイアレーザ１ａから射出されたパルス光の波長を１２００ｎｍ以上の波長に変換する。つまり、光源部２は、１２００ｎｍ以上の波長を有し、且つ、例えば、数十から数百フェムト秒程度のサブピコ秒オーダーのパルス幅を有するパルス光として、レーザ光を射出する。

ビームエクスパンダ３は、光源部２から射出されたレーザ光のビーム径を拡大して平行光束として射出する。ガルバノミラー４は、対物レンズ９の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。つまり、２光子励起顕微鏡１００では、瞳リレーレンズ５及び結像レンズ６により、ガルバノミラー４の像が対物レンズ９の瞳位置に形成される。このため、ガルバノミラー４がビームエクスパンダ３からの平行光束を偏向することで、対物レンズ９へ入射する平行光束の光軸に対する傾きが変化し、それによって、標本１２を走査することができる。

対物レンズ９は、２ｍｍ以上の作動距離を有し、且つ、球面収差補正機構として補正環１０を備えている。補正環１０は、シリコーンオイル１１と標本１２の間の屈折率の不整合によって生じる球面収差や、観察深さの変化などによって生じる球面収差を補正するために用いられる。なお、対物レンズ９は、１２００ｎｍ以上の波長帯域、より具体的には、１２００ｎｍから１８５０ｎｍまでの波長帯域に対して、良好に収差が補正されていることが望ましい。良好に補正されていない波長帯域では、補正環１０により球面収差を補正しても良い。

シリコーンオイル１１は、その屈折率がおよそ１．４と純水の屈折率（１．３３）よりも高く、且つ、図２に示されるように、光源部２から射出されるレーザ光（パルス光）の波長（１２００ｎｍ以上）に対して純水が有する内部透過率よりも高い内部透過率を有している。

なお、図１では、浸液としてシリコーンオイル１１を例示したが、浸液はシリコーンオイル１１に限られない。例えば、シリコーンオイル１１の代わりに、市販される官能基を有するパーフルオロポリエーテルを含む水浸顕微鏡に用いる浸液（単に、市販される浸液と記す。）を用いても良い。この市販される浸液の屈折率は、シリコーンオイル１１に比べて純水に近い屈折率を有しているが、図２に示されるように、シリコーンオイル１１と市販される浸液は、いずれも１２００ｎｍを超える長波長帯域で、純水が有する内部透過率よりも高い内部透過率を有している。

ＩＲカットフィルタ１４は、光源部２から射出されるレーザ光がＰＭＴ１６に入射することを防止するために用いられる、赤外領域の波長の光を遮断するフィルタである。反応光検出フィルタ１５は、標本１２の蛍光分子によって定まる特定波長の蛍光（反応光）のみをＰＭＴ１６で検出するために用いられるフィルタである。

ＰＭＴ１６は、対物レンズ９の瞳位置と光学的に共役な位置近傍に配置されている。２光子励起顕微鏡１００では、リレーレンズ１３が対物レンズ９の瞳をＰＭＴ１６の近傍に投影することで、標本１２の走査によって標本１２の任意の領域から生じ得る蛍光を検出することができる。

以上のように構成された２光子励起顕微鏡１００では、１２００ｎｍ以上の長波長の光が対物レンズ９により標本１２に照射されるため、標本１２で生じる光の散乱を抑制することができる。

また、２光子励起顕微鏡１００は、深部観察を可能とするために、作動距離が２ｍｍ以上の対物レンズ９を備えている。このため、観察に用いられる浸液の量も必然的に増加することになる。しかしながら、２光子励起顕微鏡１００では、純水に比べて内部透過率が高いシリコーンオイル１１が浸液として用いられているため、対物レンズ９から標本１２までの間で生じる光の吸収を抑制することができる。

また、図３に示されるように、同じ開口数（ＮＡ）を実現する場合、対物レンズ９と焦点面１９の間の媒質の屈折率ｎが高いほど、光軸１７に対して最大の角度で入射する光１８と光軸１７とのなす角θ（以降、最大入射角と記す。）は小さくなる。つまり、純水に比べて高い屈折率を有するシリコーンオイル１１を浸液として使用する２光子励起顕微鏡１００では、純水を使用する場合に比べて最大入射角θを小さくすることができる。最大入射角θが小さいほど、最大入射角で入射する光１８が対物レンズ９から射出されてから焦点位置１９ｐに入射するまでの距離は短くなるため、２光子励起顕微鏡１００では、浸液による光の吸収をさらに抑えることができる。なお、このような効果を得るためには、浸液が純水に対してある程度大きな屈折率を有することが必要であるため、浸液の屈折率は１．３８よりも大きいことが望ましい。

上述した理由により、本実施例に係る２光子励起顕微鏡１００によれば、散乱を抑制するために長波長の光を用いた場合であっても、光の吸収を抑制することができる。このため、従来の顕微鏡に比べて、標本のより深い部位を観察することができる。

なお、極短いパルス幅（例えば、サブピコ秒オーダー）のパルス光を用いて非線形光学現象を生じさせる非線形光学顕微鏡では、焦点面で非常に高い光子密度が要求される。このため、本実施例に係る２光子励起顕微鏡１００により実現される、長波長の光を用いた場合であっても光の吸収を抑制することができる構成は、非線形光学顕微鏡において特に好適である。

また、図１では、非線形光学顕微鏡のうちの２光子励起顕微鏡を例示したが、本実施例に係る顕微鏡は、２光子励起顕微鏡に限られず、例えば、２光子励起顕微鏡以外の多光子励起顕微鏡、第二高調波（ＳＨＧ）顕微鏡、第三高調波（ＴＨＧ）顕微鏡、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡などの他の非線形光学顕微鏡であってもよい。その場合、反応光検出フィルタ１５としては、反応光に応じた波長特性を有する光学フィルタが用いられる。例えば、ＳＨＧ顕微鏡の場合には、反応光検出フィルタ１５は、光源波長（励起波長）の２分の１の波長を透過させるフィルタであり、ＴＨＧ顕微鏡の場合には、反応光検出フィルタ１５は、光源波長（励起波長）の３分の１の波長を透過させるフィルタである。

以下、本実施例に係る２光子励起顕微鏡１００のさらに好ましい構成について、具体的に説明する。
上述した２光子励起顕微鏡１００は、純水の代わりにシリコーンオイル１１を浸液として使用することで、浸液での光の吸収を抑制することが可能であり、その結果、標本をより深くまで観察することができる。このように、上述した２光子励起顕微鏡１００では、主に浸液での光の吸収に着目しているが、観察深度が深い場合は、標本内の水による光の吸収の影響も大きくなる。従って、浸液による光の吸収に加えて、標本内の水による光の吸収も、併せて抑制することができる構成がより望ましい。

純水の内部透過率は、図２に示されるように、波長が１３５０ｎｍを超えたあたりから急激に低下して、およそ１４００ｎｍから１５００ｎｍの波長に対して低い内部透過率を示すが、その後一旦透過率が増加に転じて、およそ１５００ｎｍから１８５０ｎｍの間の波長に対して比較的高い内部透過率を示す。なお、以降では、この低い内部透過率を示す帯域を反射帯と、比較的高い内部透過率を示す帯域を透過帯と記す。この透過帯は、１６００ｎｍから１７５０ｎｍの間で内部透過率の極大点を有している。

従って、２光子励起顕微鏡１００は、光源部２から射出されるパルス光の波長が、透過帯が形成される１５００ｎｍから１８５０ｎｍの間であるように構成されることが望ましい。これにより、長波長の光を用いた場合であっても、浸液と標本内の水の両方による光の吸収を抑制することができるため、標本をより深部まで観察することが可能となる。より望ましくは、２光子励起顕微鏡１００は、光源部２から射出されるパルス光の波長が純水の内部透過率の極大点を含む内部透過率がより高い帯域である１６００ｎｍから１７５０ｎｍの間であり、且つ、浸液の内部透過率がそのパルス光の波長に対して８０パーセント／ｍｍ以上であるように構成される。これにより、浸液と標本内の水の両方による光の吸収をさらに抑制することができるため、標本をさらに深部まで観察することが可能となる。

または、２光子励起顕微鏡１００は、光源部２から射出されるパルス光の波長が、内部透過率の急激に低下する直前の帯域である１２００ｎｍから１３５０ｎｍの間であり、且つ、浸液の内部透過率がそのパルス光の波長に対して９５パーセント／ｍｍ以上であるように構成されることが望ましい。この場合も、長波長の光を用いた場合であっても、浸液と標本内の水の両方による光の吸収を抑制することができるため、標本をさらに深部まで観察することが可能となる。

図４は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡について説明するための図である。
図４に例示される非線形光学顕微鏡の一種である２光子励起顕微鏡２００は、１２８０ｎｍの波長のレーザ光を射出するファイバレーザ２１ａと１６５０ｎｍの波長のレーザ光を射出するファイバレーザ２１ｂとからなる光源部２２と、１２８０ｎｍの波長の光を反射し１６５０ｎｍの波長の光を透過させるダイクロイックミラー２３と、ビーム径を拡大するビームエクスパンダ２４と、プリズム２５と、対物レンズ３２の瞳共役位置でレーザ光の位相を変調して波面を制御する位相変調型ＳＬＭ２６と、瞳リレーレンズ２７と、標本３６を走査するためのガルバノミラー２８と、結像レンズ２９と、ミラー３０と、標本３６を励起するレーザ光を透過させて標本３６から生じる蛍光を反射するダイクロイックミラー３１と、光源部２２から射出されたレーザ光を標本３６に照射する対物レンズ３２と、標本３６と対物レンズ３２の間に満たされる浸液であるシリコーンオイル３３と、その一部がカバーガラス３５により形成された浸液保持部３４と、を含んでいる。

さらに、２光子励起顕微鏡２００は、図４に例示されるように、蛍光を反射するダイクロイックミラー３１の反射光路上に、リレーレンズ３７と、ＩＲカットフィルタ３８と、ダイクロイックミラー３９と、蛍光検出用フィルタ４０と、ＰＭＴ４１と、ミラー４２と、蛍光検出用フィルタ４３と、ＰＭＴ４４と、を含んでいる。

なお、位相変調型ＳＬＭ２６としては、例えば、反射型の液晶位相変調器、ミラーの駆動により光路長差を生じさせる反射型ミラー位相変調器、デフォーマブルミラーなどを用いることができる。図４では、位相変調型ＳＬＭ２６が反射型のデバイスである場合が例示されているが、位相変調型ＳＬＭ２６は反射型のデバイスに限られず、例えば、透過型の液晶位相変調器などの透過型のデバイスであってもよい。また、標本３６を走査するＸＹスキャナとして、ガルバノミラー２８の代わりに、音響光学偏向素子（ＡＯＤ：Acoustic Optical Deflector）などを用いてもよい。

ファイバレーザ２１ａ、ファイバレーザ２１ｂは、それぞれサブピコ秒オーダーのパルス幅を有するパルス光を射出する。つまり、光源部２２は、１２８０ｎｍまたは１６５０ｎｍの波長のレーザ光を、選択的にまたは同時に射出することができる。ダイクロイックミラー２３は、ファイバレーザ２１ａ及びファイバレーザ２１ｂから射出されたレーザ光をビームエクスパンダ２４に導く。

ビームエクスパンダ２４は、レーザ光のビーム径が拡大して平行光束としてプリズム２５へ射出する。プリズム２５は、ビームエクスパンダ２４から射出されたレーザ光を位相変調型ＳＬＭ２６へ向けて反射し、位相変調型ＳＬＭ２６で変調されたレーザ光を瞳リレーレンズ２７へ向けて反射する。

位相変調型ＳＬＭ２６は、対物レンズ３２の瞳共役位置に配置されていて、レーザ光の波面を制御することにより、レーザ光の集光位置を対物レンズ３２の光軸と直交するＸＹ方向に任意の位置に移動させることができる。また、レーザ光の集光位置を対物レンズ３２の光軸と平行なＺ方向に任意の位置に移動させることもできる。さらに、レーザ光の集光位置における球面収差を良好に補正することもできる。即ち、位相変調型ＳＬＭ２６は、球面収差補正機構として機能し、例えば、標本３６と接する媒質と標本３６の間の屈折率の不整合によって生じる球面収差や、観察深さの変化などによって生じる球面収差を補正することができる。

ガルバノミラー２８は、対物レンズ３２の瞳共役位置に配置されていて、瞳リレーレンズ２７を介して入射したレーザ光を偏向することで、対物レンズ３２へ入射する光束の光軸に対する傾きを変化させて、それによって、標本３６を走査する。

対物レンズ３２は、２ｍｍ以上の作動距離を有する。さらに、１２００ｎｍ以上の波長帯域、より具体的には、１２８０ｎｍと１６５０ｎｍの波長帯域に対して、良好に収差が補正されていることが望ましい。良好に補正されていない波長帯域では、ＳＬＭ２６により球面収差を補正しても良い。

シリコーンオイル３３は、その屈折率がおよそ１．４と純水の屈折率（１．３３）よりも高く、且つ、図２に示されるように、光源部２２から射出されるレーザ光（パルス光）の波長に対して純水が有する内部透過率よりも高い内部透過率を有している。

なお、図４では、浸液としてシリコーンオイル３３を例示したが、実施例１と同様に、本実施例でも、浸液として市販される官能基を有するパーフルオロポリエーテルを含む水浸顕微鏡に用いる浸液を用いても良い。

浸液保持部３４は、浸液（シリコーンオイル３３）を標本３６と対物レンズ３２の間に保持する部材であり、図４に例示されるように、皿のような形状を呈している。浸液は、通常、表面張力により標本と対物レンズの間に保持されるが、本実施例に係る対物レンズ３２は作動距離が２ｍｍ以上と長いため、比較的多量の浸液を対物レンズ３２と標本３６の間に保持する必要がある。このため、浸液を安定して保持するために、浸液保持部３４を用いることが望ましい。なお、浸液保持部３４が標本３６への光の照射を妨げないように、光が通過する浸液保持部３４の中心部分には、透過率の高いカバーガラス３５がはめ込まれている。

ＩＲカットフィルタ３８は、光源部２２から射出されるレーザ光がＰＭＴ（ＰＭＴ４１、ＰＭＴ４４）に入射することを防止するために用いられる、赤外領域の波長の光を遮断するフィルタである。

ダイクロイックミラー３９は、１２８０ｎｍのレーザ光で励起された蛍光を反射し１６５０ｎｍのレーザ光で励起された蛍光を透過させるダイクロイックミラーであり、蛍光検出用フィルタ４０、蛍光検出用フィルタ４３は、それぞれ、１６５０ｎｍのレーザ光で励起された蛍光、１２８０ｎｍのレーザ光で励起された蛍光を透過させるフィルタである。

ＰＭＴ４１、ＰＭＴ４４は、それぞれ対物レンズ３２の瞳位置と光学的に共役な位置近傍に配置されている。２光子励起顕微鏡２００では、リレーレンズ３７が対物レンズ３２の瞳をＰＭＴ４１、ＰＭＴ４４の近傍に投影することで、標本３６の走査によって標本３６の任意の領域から生じ得る蛍光を検出することができる。

以上のように構成された２光子励起顕微鏡２００によれば、実施例１に係る２光子励起顕微鏡１００と同様に、長波長の光を用いることで光の散乱を抑制することができる。また、光源波長に対して純水よりも高い内部透過率を有し、且つ、大きな屈折率を有する浸液を用いることで、対物レンズ３２から標本３６までの間で生じる光の吸収を抑制することができる。従って、本実施例に係る２光子励起顕微鏡２００によっても、実施例１に係る２光子励起顕微鏡１００と同様に、従来の顕微鏡に比べて、標本のより深い部位を観察することができる。

また、本実施例に係る２光子励起顕微鏡２００は、光源波長として１２８０ｎｍと１６５０ｎｍのレーザ光を使用する。図２に示されるように、１２８０ｎｍは、純水の内部透過率が急激に低下する直前の波長であり、また、１６５０ｎｍは、純水の内部透過率の極大点近傍の波長である。このため、２光子励起顕微鏡２００は、いずれの波長の光に対しても標本３６内の水による光の吸収を抑制することができる。従って、本実施例に係る２光子励起顕微鏡２００によれば、浸液と標本内の水の両方による光の吸収を抑制することができるため、標本をさらに深部まで観察することができる。

１ａ ・・・チタンサファイアレーザ
１ｂ ・・・ＯＰＯ
２、２２ ・・・光源部
３、２４ ・・・ビームエクスパンダ
４、２８ ・・・ガルバノミラー
５、２７ ・・・瞳リレーレンズ
６、２９ ・・・結像レンズ
７、３０、４２ ・・・ミラー
８、２３、３１、３９ ・・・ダイクロイックミラー
９、３２ ・・・対物レンズ
１０ ・・・補正環
１１、３３ ・・・シリコーンオイル
１２、３６ ・・・標本
１３、３７ ・・・リレーレンズ
１４、３８ ・・・ＩＲカットフィルタ
１５、４０、４３ ・・・反応光検出フィルタ
１６、４１、４４ ・・・ＰＭＴ
１７ ・・・光軸
１８ ・・・マージナル光線
２１ａ、２１ｂ ・・・ファイバレーザ
２５ ・・・プリズム
２６ ・・・ＳＬＭ
３４ ・・・浸液保持部
３５ ・・・カバーガラス
１００、２００ ・・・２光子励起顕微鏡

Claims (18)

1. 屈折率が１．３８よりも大きい浸液を用いて標本の観察を行う非線形光学顕微鏡であって、
   １２００ｎｍ以上の波長を有するパルス光を射出する光源部と、
   前記光源部から射出される前記パルス光を前記標本に照射する、２ｍｍ以上の作動距離を有する対物レンズと、を含み、
   前記浸液は、前記標本と前記対物レンズの間に満たされる、前記光源部から射出される前記パルス光の波長に対して純水が有する内部透過率よりも高い内部透過率を有する
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
2. 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記パルス光の波長は、１６００ｎｍから１７５０ｎｍの間である
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
3. 請求項２に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記浸液の内部透過率は、前記パルス光の波長に対して、８０パーセント／ｍｍ以上である
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
4. 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記パルス光の波長は、１２００ｎｍから１３５０ｎｍの間である
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
5. 請求項４に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記浸液の内部透過率は、前記パルス光の波長に対して、９５パーセント／ｍｍ以上である
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
6. 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記パルス光の波長は、１５５０ｎｍから１８５０ｎｍの間である
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
7. 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記浸液は、シリコーンである
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
8. 請求項３、請求項５又は請求項６に記載の非線形光学顕微鏡において、さらに、
   球面収差を補正するための球面収差補正機構を含む
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
9. 請求項８に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記球面収差補正機構は、前記対物レンズの補正環である
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
10. 請求項３、請求項５又は請求項６に記載の非線形光学顕微鏡において、
    前記光源部は、
    光源と、
    前記光源から射出された光の波長を変換する光パラメトリック発振器と、を含む
    ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
11. 請求項３、請求項５又は請求項６に記載の非線形光学顕微鏡において、
    前記光源部は、ファイバレーザである
    ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
12. 請求項３、請求項５又は請求項６に記載の非線形光学顕微鏡において、さらに、
    前記対物レンズと前記標本の間に前記浸液を保持する浸液保持部を含む
    ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
13. 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
    前記浸液は、官能基を有するパーフルオロポリエーテルを含む水浸顕微鏡に用いる浸液である
    ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
14. 屈折率が１．３８よりも大きい浸液を用いて非線形光学顕微鏡で標本の観察を行う方法であって、
    １２００ｎｍ以上の波長であって、前記浸液が当該波長に対して純水が有する内部透過率よりも高い内部透過率を示す波長を有するパルス光を射出し、
    射出した前記パルス光を２ｍｍ以上の作動距離を有する対物レンズを介して前記標本に照射する
    ことを特徴とする方法。
15. 請求項１４に記載の方法において、
    前記パルス光の波長は、１６００ｎｍから１７５０ｎｍの間であり、
    前記浸液の内部透過率は、前記パルス光の波長に対して、８０パーセント／ｍｍ以上である
    ことを特徴とする方法。
16. 請求項１４に記載の方法において、
    前記パルス光の波長は、１２００ｎｍから１３５０ｎｍの間であり、
    前記浸液の内部透過率は、前記パルス光の波長に対して、９５パーセント／ｍｍ以上である
    ことを特徴とする方法。
17. 請求項１４又は請求項１５に記載の方法において、
    前記浸液は、シリコーンである
    ことを特徴とする方法。
18. 請求項１４又は請求項１５に記載の方法において、
    前記浸液は、官能基を有するパーフルオロポリエーテルを含む水浸顕微鏡に用いる浸液である
    ことを特徴とする方法。