JP2008197127A - 顕微鏡用対物レンズおよびそれを備えた蛍光検出システムと多光子励起レーザー走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明では多光子励起レーザー走査型顕微鏡に最適な対物レンズと、それを用いた蛍光検出システムを提供する。
【解決手段】上記課題は、標本面側から順に第１レンズ群と第２レンズ群を備え、前記第１レンズ群と前記第２レンズ群の間に光線分割手段を有することを特徴とする顕微鏡対物レンズによって解決される。
【選択図】図３

Description

本発明は顕微鏡の技術分野に係り、特に対物レンズおよびその対物レンズを備えた蛍光検出システムに関する。

顕微鏡における蛍光観察の手段として、多光子励起を利用した蛍光観察法が知られている。
多光子励起では、吸収波長のほぼ整数倍の波長を持つ波長の光線を同時に蛍光体に照射することにより、本来の吸収波長と同等な励起現象が引き起こされる。この多光子励起現象は非線形現象と呼ばれ、たとえば２光子励起の場合は励起光の強度の２乗に比例した確率で励起現象が起きる。

一方、顕微鏡の対物レンズによる励起光の集光は、焦点面からの距離の２乗に反比例して光密度が低くなる。すなわち、顕微鏡における多光子励起現象は焦点のごく近傍のみに起こり、この部分からのみ蛍光が放射される。

この性質により、通常の共焦点顕微鏡で使われる焦点面以外で起こる蛍光の放射を遮るための検出側の共焦点ピンホールは、多光子励起レーザー走査型顕微鏡においては必要とされない。また、焦点面でのみ励起現象が起きるために、試料内の蛍光の褪色も少なくてすむという利点もある。

また、多光子励起で用いられる励起光は通常よりも長い波長となるために、一般に赤外の領域の光線となる。そして、一般に波長が長い光のほうが散乱しにくいという性質（レイリー散乱）を持つことから、生体試料のような散乱性試料では試料のより深くまで励起光が到達するという性質を持っている。このことは、通常の可視光では観察することができなかった生体の深部まで観察することが可能になることを意味する。

例えばセロトニンという脳内物質は紫外線領域に吸収波長を持つ自家蛍光を持つ。しかしながら、紫外光は脳内の深部にまで到達することができず、また光毒性も強い。このような状況下では多光子励起レーザー走査型顕微鏡は有効に働く。紫外光と赤外光は波長が３倍程度離れているので、３光子励起を行えば赤外光を使ってセロトニンを励起できる。そして赤外光は脳のような散乱体のなかでは紫外光の数十倍も深くまで浸透できる。

以上のように顕微鏡において多光子励起を利用した蛍光観察は、現在において非常に有効な手段となっている。
しかし、この多光子励起を利用した観察には技術的な困難が伴う。例えば、多光子励起を起こすには一つの蛍光体に同時に光子を衝突させなければいけない。そのような現象を起こすには非常に高い光子密度を対物レンズの焦点位置に作らなければいけない。

一方、励起光は強力でありながらも、そこから放射される蛍光の光量は微弱である。よって、放射された蛍光は可能な限りロスの少ない方法で検出しなければいけない。
さらに、３光子励起のような場合には紫外光と赤外光のように非常に離れた波長の光を同時に扱わなければいけない。多くの光学素子は波長に依存した性質を持つので、このことは光学設計をする上で非常に困難を生じさせる。特に、紫外光を透過させる光学ガラスは非常に限られているので、構成の選択肢が限られてしまう。
特開平９−２８１３９９公報 特開２０００−２９２７０４公報

以上の技術的問題に鑑み、本発明では多光子励起レーザー走査型顕微鏡に最適な対物レンズと、それを用いた蛍光検出システムを提供することを課題とする。

本発明の上記の課題は標本面側から順に第１レンズ群と第２レンズ群を備え、前記第１レンズ群と前記第２レンズ群の間に光線分割手段を有することを特徴とする顕微鏡対物レンズによって解決される。この構成によって、観察光路と励起光路を標本面から近い位置で分離することができる。

ここで、前記光線分割手段はダイクロイックプリズムとすることが考えられる。ダイクロイックプリズムを使う構成では、非点収差への悪影響を抑えながら光線分割が行える。
また、前記光線分割手段はダイクロイックミラーでとすることが考えられる。ダイクロイックミラーを使う構成では、汎用のダイクロイックミラーが使用できるというメリットがある。

本発明の顕微鏡対物レンズにおいて、前記光線分割手段によって反射された観察光を検出する検出器をさらに備える構成が望ましい。標本から放射された蛍光のロスを可能な限り減らすには、蛍光を反射して分離する構成が有効である。

また、前記光線分割手段はロングパス特性を有することが好ましい。本発明の実施による顕微鏡対物レンズの利用される多光子励起では蛍光の波長は励起光の波長より短い。
また、前記第１レンズ群は石英または蛍石で構成されていることが望ましい。３光子励起では蛍光がＵＶ域になる場合がある。この場合、第１レンズ群は励起光である赤外光と蛍光である紫外光を含んだ広い波長帯域で高い透過率をもった光学部材であることが好ましい。

さらに、前記第２レンズ群は接合レンズを含むことが好ましい。第２レンズ群は接合レンズを用いて球面収差と色収差を補正することが好ましい。第１レンズ群は前述の通り広い波長域で透過率が高い硝材が必要である。このため、第１レンズ群にて接合レンズを多用するのはＵＶ域の透過率が下がるため好ましくない。しかし赤外光のみを透過する第２レンズ群は接合レンズを使い球面収差と色収差を補正する必要がある。

さらに、前記第２レンズ群は凹レンズを含むことが好ましい。第２レンズ群は凹レンズをつかって像面湾曲、非点収差を補正することが好ましい。
また、前記第１レンズ群の標本側に最も近いレンズ面の曲率が略平坦であることが好ましい。本発明の実施による顕微鏡対物レンズの利用される実験では標本側に最も近いレンズ面に気泡がたまるという問題が起こりうるので、標本側に最も近いレンズ面の曲率が略平坦にする構成が好ましい。

さらに、前記対物レンズは水浸対物レンズであることが好ましい。すなわち、標本と標本側に最も近いレンズ面との間の媒質の屈折率が水と同等であるときに最適化した光学設計をすることが好ましい。

前記検出器は対物レンズの瞳面とほぼ共役な位置に存在することが好ましい。多光子励起レーザー走査型顕微鏡では観察光の像ではなく光強度を計測したいので、瞳位置と共役な位置に検出器を配置することが好ましい。

本発明の上記課題は、標本面側からに第１レンズ群と第２レンズ群を備え、前記第１レンズ群と前記第２レンズ群の間に光線分割手段を有する対物レンズと、標本からの観察光を前記光線分割手段によって反射した光を検出する検出器を備えることを特徴とする蛍光検出システムによっても解決される。

標本から放射される蛍光の光量損失を最小限にとどめる顕微鏡対物レンズとそれを使った蛍光検出システムが提供される。すなわち多光子励起レーザー走査型顕微鏡に好適なシステムが提供される。

はじめに、本発明の実施の形態の説明を行う前に、図１を参照して一般的な多光子励起レーザー走査型顕微鏡の概略的な全体構成を示す。
多光子励起レーザー走査型顕微鏡における励起光源は赤外線パルスレーザー１が一般に用いられる。ここでパルスレーザーを用いる理由としては、焦点面での光子密度を効率よく高めることができることが挙げられる。赤外線パルスレーザー１は大きな装置であるので、顕微鏡の外部に備え付けられ、そこから顕微鏡のスキャンユニット２に励起光を導入する。

スキャンユニット２に導入された励起光はダイクロイックミラー等の光線分割手段３によってガルバノミラー等の走査手段４へと導かれる。ここで、励起光は走査手段４によって試料面上を走査するために偏向される。さらに瞳投影レンズ５と結像レンズ６を経由して、対物レンズ７により、励起光が標本８に照射される。

標本８から発した蛍光は、対物レンズ７によって集められ、結像レンズ６と瞳投影レンズ５を通過し、光線分割手段３によって励起光路と分離される。その後に不図示の赤外光吸収フィルタなどでノイズとなる励起光が取り除かれ、検出器９によって蛍光が検出される。同図に示される例では、さらにダイクロイックミラー１０によって蛍光を分離し、２チャンネル観察ができるように検出器が２基備えられている。なお、この検出器９としては、光電子増倍管を用いるのが一般的である。

このような従来の２光子励起蛍光顕微鏡では、対物レンズを初めとする複数の光学系を通過させることで、標本から発した蛍光の光量損失が大きい。
また、脳スライスなどの白濁した標本の２光子観察の場合は、蛍光が標本によって散乱されて対物レンズに入射される。このような散乱光を多く含む場合は、検出器までの距離が長いと、散乱成分が途中の光路中でレンズ枠などに吸収されてしまう。その結果、検出器で得られる光量に損失が生じてしまう。

なお、図１中で示される符号１１と１２は光路を制御するためのミラーである。
以下では、図２を参照しながら本発明の実施による多光子励起レーザー走査型顕微鏡の概略的な全体構成を示す。

本発明の実施による多光子励起レーザー走査型顕微鏡においても励起光源は赤外線パルスレーザー１が用いられる。赤外線パルスレーザー１からスキャンユニット２に導入された励起光はガルバノミラー等の走査手段４へと導かれる。ここで、励起光は走査手段４によって試料面上を走査するために偏向される。さらに瞳投影レンズ５と結像レンズ６を経由して、対物レンズ７により、励起光が標本８に照射される。

標本８から発した蛍光は、対物レンズ７によって集められ、この対物レンズ７の中に備えられた光線分割手段１３によって励起光路と分離され、検出器ユニット１４へと導かれる。なお、検出器ユニット１４は顕微鏡本体に備えても、外部に備えても、対物レンズと一体でもかまわない。

検出器ユニット１４では不図示の赤外光吸収フィルタなどでノイズとなる励起光が取り除かれ、検出器９によって蛍光が検出される。同図に示される例では、さらにダイクロイックミラー１０によって蛍光を分離し、２チャンネル観察ができるように検出器が２基備えられている。

上記の構成によれば、検出器９は可能な限り標本８に近くに配置されている。
［実施形態１］

図３では、本発明の実施による対物レンズ７と検出ユニット１４の内部構成例の一つを説明する。
図３に示される対物レンズ７は、物体面より順に、第１レンズ群Ｇ１とダイクロイックプリズム１５と第２レンズ群Ｇ２によって構成される。すなわち、図２に示される光線分割手段１３としてダイクロイックプリズム１５を利用した構成例である。

ダイクロイックプリズム１５はプリズムの対角面に多層膜を挟んだ構成をしており、その多層膜は長波長光を透過し、短波長光を反射するように設計する。好もしくは、赤外光を透過し、可視光を反射するように設計する。すなわち、赤外光線にとってダイクロイックプリズム１５は単なる平行ガラス板であるように振る舞い、可視光にとってはミラープリズムのように振舞う。

蛍光を反射する構成には多層膜設計の点から見ても優位性を持つ。反射率を１００％に近づける多層膜設計は比較的容易であるが、透過率を１００％に近づける多層膜設計は非常に困難である。多光子励起現象で放射される蛍光の光量は非常に小さいので、蛍光の光量損失を少なく抑えるには蛍光を反射する構成が好ましい。

第１レンズ群Ｇ１は開口数ＮＡと有効径が大きくなるように設計することが好ましい。対物レンズによって検出される光量は開口数ＮＡの２乗に比例する。したがって、多光子励起現象で放射される蛍光の量は非常に小さいので、可能な限り開口数ＮＡを大きくする構成が望ましい。

また、第１レンズ群Ｇ１単体では収差補正を行う必要はない。多光子励起レーザー走査型顕微鏡には共焦点ピンホールが必要ないので、検出光学系は集光性能がそれほど必要とされないからである。

このため、第１レンズ群Ｇ１には収差補正のための結合レンズを使う必要がなく、その分の設計の自由度を開口数ＮＡの大きさ確保のために利用できる。
また、第１レンズ群Ｇ１は石英または蛍石で構成されることが望ましい。赤外光の３光子励起などでは放射される蛍光が紫外域になるので、紫外域から近赤外域を含んだ広範囲で高い透過率をもった光学部材で第１レンズ群Ｇ１を構成することが求められる。そのためには石英又は蛍石を使って第１レンズ群Ｇ１を構成することが望まれる。

なお、本発明が利用される多光子励起レーザー走査型顕微鏡では、培養液中で生きた（生体反応を維持した）ままの脳片などの生体試料観測に用いられることが多い。その場合、対物レンズの先端は培養液中に浸して用いられる（水浸対物レンズ）。このような用途のためには第１レンズ群Ｇ１の最も物体側のレンズ面の曲率はほぼ平坦であることが望ましい。これによりレンズ面に気泡ができてしまう現象を防ぐ効果を持つ。

次いで、第２レンズ群Ｇ２は、赤外光領域（700〜1000nm）における収差を補正するように設計する。特に、第１レンズ群Ｇ１は収差を低減させるための技法を用いていないために、第２レンズ群Ｇ２では第１レンズ群Ｇ１で発生してしまった収差をキャンセルさせるための収差補正を行う。そうすることによって、励起光の照射スポット径を小さくでき、多光子励起を起こすための光子密度を高めることができる。

第２レンズ群Ｇ２は接合レンズを含むことが好ましい。赤外光領域（700〜1000nm）の結像性能確保し、軸上色収差を抑えるには、第２レンズ群Ｇ２に接合レンズを利用することが望ましい。

第２レンズ群Ｇ２は凹レンズを含むことが好ましい。照射スポット径を小さくするためには非点収差を補正する必要がある。そのためには、第１レンズ群Ｇ１の凸レンズで発生してしまった収差を補正するために、第２レンズ群Ｇ２に凹レンズを使うことによって収差を打ち消す。

瞳リレー光学系Ｇ３は、第１レンズ群Ｇ１の瞳を検出器９に投影する役割を担っており、主にリレーレンズ１７、２０と、励起光を取り除く赤外光カットフィルター１８と、蛍光を分離する蛍光フィルタ１９などによって構成する。

多光子顕微鏡における励起光の光量は、放射される蛍光に比べて非常に強い。そのためにダイクロイックプリズム１５や対物レンズの内面反射によって、励起光が検出光路に入り込んでしまう。この励起光を排除するために赤外光カットフィルター１８を備えることが望ましい。

また、検出される蛍光からノイズを排除するために、蛍光の波長域を選択的に透過させる蛍光フィルタ１９を備える構成が望ましい。
なお、２光子励起または３光子励起の場合は、試料内のレーザー集光ポイントからのみ蛍光が放出されるため、通常のレーザー走査型顕微鏡で必要なピンホールが必要ない。また、検出器９は、対物レンズ７の瞳面とほぼ共役な位置に配置することが望ましい。また、検出器９には、従来と同様に一般的に蛍光の光量を検出する光電子増倍管を用いるのが好ましい。
［実施形態２］

図４では、本発明の実施による対物レンズ７と検出ユニット１４のもう一つの内部構成例を説明する。
図４に示される対物レンズ７は、物体面より順に、第１レンズ群Ｇ１とダイクロイックミラー１６と第２レンズ群Ｇ２によって構成される。すなわち、図２に示される光線分割手段１３としてダイクロイックミラー１６を利用した構成例である。これ以外の構成は、図３による実施形態１とほぼ同様であるので、両者の違いを中心にして説明する。

一般にダイクロイックミラーの方がダイクロイックプリズムよりも分離特性が優れている。どちらも多層膜によって光線を反射と透過に分離するのだが、多層膜の作成の困難さがダイクロイックプリズムの方が高いのである。それゆえに、ダイクロイックプリズムでは十分な分離性能の持たせるほどの積層をすることができずに、性能面ではダイクロイックミラーよりも劣ってしまう。つまり、本実施形態は光線分割手段の性能が優れた構成といえる。

一方、本実施形態は収差補正という点から見ると難点を持つ。ダイクロイックミラー１６を収斂光線中に配置すると非点収差が生じる。非点収差の影響を可能な限り減らすために、第１レンズ群Ｇ１から第２レンズ群Ｇ２へと射出される光線はほぼ平行光となることが望ましい。すなわち、ダイクロイックミラー１６はアフォーカル光路の中に配置されるように第１レンズ群Ｇ１と第２レンズ群Ｇ２を設計することが望ましい。アフォーカル光路に配置された平行光学素子板は、非点収差を発生しないためである。ダイクロイックミラー１６への入射角度は５度以内が好ましい。

一方、実施形態１ではダイクロイックプリズム１５は光軸対称な光学素子となっているので、収差の発生を抑えるという点では、実施形態２よりも好ましい。つまり実施形態１と実施形態２は目標とする性能によって適切に選択して実施されるべきである。

以上より、対物レンズ内部の途中で光線分割手段を備え、蛍光を分離し検出する構成をすることで光量の損失を最小限にとどめることができる対物レンズと、それを備えた蛍光検出システムの構成と効果を記載した。

なお、本発明の対物レンズは、上述の実施形態としての例に限らず、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変更が可能である。例えば、本発明における対物レンズの第１レンズ群を一つの対物レンズとみなし、第２レンズ群の機能を結像レンズに持たせるなどの変更が可能である。

従来における一般的な多光子励起蛍光顕微鏡の全体構成図を示している。 本発明の実施による多光子励起レーザー走査型顕微鏡の概略的な全体構成を示す。 本発明の実施による対物レンズを備えた蛍光検出システムの実施例１を示している。 本発明の実施による対物レンズを備えた蛍光検出システムの実施例２を示している。

符号の説明

１・・・赤外線パルスレーザー
２・・・スキャンユニット
３・・・光線分割手段
４・・・走査手段
５・・・瞳投影レンズ
６・・・結像レンズ
７・・・対物レンズ
８・・・標本
９・・・検出器
１０・・・ダイクロイックミラー
１１・・・ミラー
１２・・・ミラー
１３・・・光線分割手段
１４・・・検出器ユニット
１５・・・ダイクロイックプリズム
１６・・・ダイクロイックミラー
１７・・・リレーレンズ
１８・・・赤外光カットフィルター
１９・・・蛍光フィルタ
２０・・・リレーレンズ

Claims (23)

1. 標本面側から順に第１レンズ群と第２レンズ群を備え、
   前記第１レンズ群と前記第２レンズ群の間に光線分割手段を有することを特徴とする顕微鏡対物レンズ。
2. 前記光線分割手段はダイクロイックプリズムであることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡対物レンズ。
3. 前記光線分割手段はダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡対物レンズ。
4. 請求項１から請求項３の何れかに記載の顕微鏡対物レンズにおいて、
   前記光線分割手段によって反射された観察光を検出する検出器をさらに備えることを特徴とする顕微鏡対物レンズ。
5. 前記検出器は対物レンズの瞳面とほぼ共役な位置に存在することを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡対物レンズ。
6. 前記光線分割手段はロングパス特性を有することを特徴とする請求項１から請求項５の何れかに記載の顕微鏡対物レンズ。
7. 前記第２レンズ群は接合レンズを含むことを特徴とする請求項１から請求項６の何れかに記載の顕微鏡対物レンズ。
8. 前記第２レンズ群は凹レンズを含むことを特徴とする請求項１から請求項７の何れかに記載の顕微鏡対物レンズ。
9. 前記第１レンズ群は石英または蛍石で構成されていることを特徴とする請求項１から請求項８の何れかに記載の顕微鏡対物レンズ。
10. 前記第１レンズ群の標本側に最も近いレンズ面の曲率が略平坦であることを特徴とする請求項１から請求項９の何れかに記載の顕微鏡対物レンズ。
11. 前記対物レンズは水浸対物レンズであることを特徴とする請求項１から請求項１０の何れかに記載の顕微鏡対物レンズ。
12. 標本面側から順に第１レンズ群と第２レンズ群を備え、
    前記第１レンズ群と前記第２レンズ群の間に光線分割手段を有する対物レンズと、
    標本からの観察光を前記光線分割手段によって反射した光を検出する検出器を備える
    ことを特徴とする蛍光検出システム。
13. 前記光線分割手段はダイクロイックプリズムであることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光検出システム。
14. 前記光線分割手段はダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光検出システム。
15. 前記光線分割手段はロングパス特性を有することを特徴とする請求項１２から請求項１４の何れかに記載の蛍光検出システム。
16. 前記第２レンズ群は接合レンズを含むことを特徴とする請求項１２から請求項１５の何れかに記載の蛍光検出システム。
17. 前記第２レンズ群は凹レンズを含むことを特徴とする請求項１２から請求項１６の何れかに記載の蛍光検出システム。
18. 前記第１レンズ群は石英または蛍石で構成されていることを特徴とする請求項１２から請求項１５の何れかに記載の蛍光検出システム。
19. 前記第１レンズ群の標本側に最も近いレンズ面の曲率が略平坦であることを特徴とする請求項１２から請求項１８の何れかに記載の蛍光検出システム。
20. 前記対物レンズは水浸対物レンズであることを特徴とする請求項１２から請求項１９の何れかに記載の蛍光検出システム。
21. 前記検出器は対物レンズの瞳面とほぼ共役な位置に存在することを特徴とする請求項１２から請求項２０の何れかに記載の顕微鏡対物レンズ。
22. 請求項１から請求項１１に記載の顕微鏡対物レンズを搭載した多光子励起レーザー走査型顕微鏡。
23. 請求項１２から請求項２１に記載の蛍光検出システムを搭載した多光子励起レーザー走査型顕微鏡。

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