JP2020030366A - 蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光顕微鏡の観察画像をもとにレーザ照射位置を選択するレーザ照射装置において、蛍光観察時から構成を変えずにレーザ照射を行うことができ、通常の蛍光顕微鏡に取り付けが容易な蛍光顕微鏡観察機能を有するレーザ照射装置を供給する。【解決手段】蛍光顕微鏡観察機能を有するレーザ照射装置１０３は、可視光帯域のレーザ光を発光するレーザ光源と、前記レーザ光を透過し、かつ、蛍光画像を観察する際に用いることができるフィルターキューブ６１と、を備える。【選択図】図１３

Description

本発明は、蛍光顕微鏡に簡易に取り付けることができ、蛍光観察から構成を変えずにレーザ照射を行うことができる蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置に関するものである。

山中伸弥教授らが発明したｉＰＳ細胞は、どの臓器の細胞へも分化誘導させる可能性があるとされているため、再生医療研究者によりさまざまな臓器への分化誘導工程の研究がなされている。再生医療研究者は、所定の臓器への分化工程が１００％の確率で行われることを目標として研究を行っているが、工業製品においても不良品が生成されてしまうように各工程においてすべての細胞を目標の形態の細胞に分化させることは容易でない。そのため、細胞分化工程の確認を容易にする手法として、蛍光観察により分化の状態を確認する手法（非特許文献１）などが開発されている。この手法を用いると、蛍光顕微鏡を用いて細胞の分化状態の観察を行うことが容易に行うことができることとなる。

米国特許第５９３３２７４号明細書

前 伸一ら「Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ：４， ｐｐ．１３６７（２０１３） Ａｒａｖｉｎｄ Ｋｕｍａｒ Ｒｅｎｇａｎら「Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｇｏｌｄ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ」， ２０１２ １２ｔｈ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ， ｐｐ．１−４（２０１２）

図１に細胞観察を行う蛍光顕微鏡装置の概略構成図を示す。観察対象である細胞３３は、細胞培養ディッシュ３０の中に、細胞に栄養を供給する細胞培養液３２とともに入れられている。観察対象には、観察用ガラス３１を介して観察対象と対向して配置されている対物レンズ２により蛍光材料を励起する照明光が照射される構成となっている。照明光は、水銀ランプなどのランプ光源１より出射されレンズ１１を介してフィルターキューブ２１ａに照射される。フィルターキューブ２１ａには、観察対象の蛍光材料の励起波長を選択し透過するエキサイトフィルター２２ａ、および、エキサイトフィルター２２ａにより選択された蛍光材料の励起波長の光を反射し、蛍光材料から発光される蛍光波長の光を透過するダイクロイックミラー２３ａ、さらには、蛍光材料から発光される蛍光波長の光を透過し蛍光材料の励起波長の光を遮蔽するエミッションフィルター２４ａが固着されている。ランプ光源１より出射される広波長帯域の光は、エキサイトフィルター２２ａにより蛍光材料の励起波長の帯域の波長帯域の光とされ、照明光光束１５に示すようにダイクロイックミラー２３ａにより反射し対物レンズ２により観察対象に照射される。また、観察対象より発光する蛍光は、蛍光観察光光束１６に示すように、対物レンズ２により集光された後、ダイクロイックミラー２３ａおよびエミッションフィルター２４ａを透過し、結像レンズ３によりカメラ３５内の撮像素子４に結像されるように配置されている。ここで、カメラ３５は蛍光顕微鏡に複数配置されているカメラ接続ポートの１つであるカメラ接続ポート５ａに接続されている。カメラ接続ポート５ａと結像レンズ３には切り替えミラー１２がある構成である。一般に蛍光顕微鏡は、さまざまな蛍光材料の観察を簡易に切り替えるために、エキサイトフィルター２２ａ、ダイクロイックミラー２３ａおよびエミッションフィルター２４ａが固着されているフィルターキューブ２１ａは、他の蛍光材料を観察するフィルターキューブ２１ｂ、フィルターキューブ２１ｃ、フィルターキューブ２１ｄなどとともにフィルターボックス２０に搭載されている。

例として図２に、６個のフィルターキューブを搭載可能なフィルターボックス２０の構造を対物レンズ２の光軸に垂直な方向で示した図を示す。この図に示すように、フィルターボックス２０には、６個のフィルターキューブを搭載するためのフィルターキューブホルダー２５ａ、２５ｂ、２５ｃ、２５ｄ、２５ｅ、２５ｆが配置されており、図２に示す例においてはフィルターキューブホルダー２５ａ、２５ｂ、２５ｃ、２５ｄにフィルターキューブ２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄが搭載されており、フィルターキューブホルダー２５ｅ、２５ｆにはフィルターキューブは搭載されていない。現在観察している蛍光材料とは異なる蛍光材料を観察する際には、フィルターボックス２０を回転させ、観察を行う蛍光材料に対応するフィルターキューブを光路内に挿入する作業を行う。

再生医療研究者が分化誘導工程の研究において、蛍光顕微鏡により所定の分化がなされていない細胞が一部に発見された際においても次工程の検討を行うためには、所定の分化がなされていない細胞を除去し、所定の分化がなされた細胞のみとすることが望ましい。所定の分化がなされていない細胞の除去方法として、非特許文献２に示すように近赤外のレーザ光を照射する方法がある。蛍光顕微鏡装置１００においてフィルターキューブ２１ａ内のエミッションフィルター２４ａは、蛍光材料より発光する蛍光の波長のみを透過し、蛍光の波長は一般的に可視光帯域であるので、エミッションフィルターは近赤外の波長域の光を一般的に透過しない。そのため、近赤外のレーザ光を照射する場合には、図１に示した蛍光顕微鏡１００の光路を変更する必要がある。蛍光顕微鏡装置１００にレーザ照射ユニット９９を取り付けるための変更を行った構成図を図３に示す。変更後の光路は、シャッター１９により照明光路を閉じ、フィルターボックス２０をフィルターキューブのない位置に回転させ、蛍光観察時に用いていたフィルターキューブ２１ａを光路からはずす。さらに、カメラ３５が接続されていないカメラ接続ポート５ｂにレーザ光源６を有するレーザ照射ユニット９９を配置し、切り替えミラー１２を光路からはずすことにより、レーザ光光束１７に示すようにレーザ光が対物レンズ２に入射する構成とする。レーザ光源６から出射されるレーザ光はカップリングレンズ７、レンズ８、ミラー１３、レンズ９により結像レンズ３により形成される結像面３６に集光されるようにする。結像面３６に形成された集光スポットは、結像レンズ３および対物レンズ２により観察面にレーザ集光スポットを形成し、レーザ集光スポットの位置に除去したい細胞を配置させることにより、除去したい細胞にレーザ光が照射されることとなる。しかし、対物レンズ２は波長により焦点位置が異なる軸上色収差という現象が存在し、一般的に蛍光顕微鏡に用いる対物レンズは、近赤外の波長に対する軸上色収差現象は考慮されていないことが一般的である。したがって、ともに可視光帯域である照明光光束１５および蛍光観察光光束１６の焦点位置は、軸上色収差の対応がなされている範囲であるのでほぼ一致する。しかし、可視光帯域ではない近赤外のレーザ光の集光スポット位置１８は、軸上色収差の対応がなされていない波長であるので、図４に示すように遠くなる場合、あるいは、図５に示すように近くなる場合のいずれかとなり、可視光帯域である照明光光束１５および蛍光観察光光束１６の焦点位置とは一致していないことが一般的である。そしてこの焦点位置の違いは、対物レンズごとに異なるので、レーザ光を照射させる際には、対物レンズごとに焦点位置をレーザ光照射に適した位置に調整する必要がある。したがって、この方法においては、レーザ照射時には蛍光観察ができないことに加え、対物レンズに応じた焦点位置の微調整を行うという極めて複雑な工程を行う必要がある。

近赤外のレーザ光を用いることによる問題点の対策方法として、特許文献１に示すように可視光の波長帯域のパルスレーザ光源２６を用いる方法がある。この可視光の波長帯域のパルスレーザ光源２６を用いた蛍光顕微鏡レーザ照射システム１０１の概略構成図を図６に示す。この構成においては、照明光路系にレーザ発振波長を反射し、その他の波長を透過するダイクロイックミラー２８を挿入し、このダイクロイックミラー２８を介してレーザ光を照明光学系から導入する方法である。この方法においては、フィルターキューブ２１ｂからエキサイトフィルター２２ｂを除き、ダイクロイックミラー２８とランプ光源１との間にエキサイトフィルター２２ｂ配置すること。さらに、ダイクロイックミラー２３ｂにおいて、蛍光励起波長に加えて、レーザ光源２６の波長も反射するミラーとするという光学系の修正を行っている。そしてこの修正を行うことにより、蛍光観察工程とレーザ照射工程の切り替えにおいてフィルターボックス２０を回転することなく、レーザ光の照射も行うことができ、レーザ光源２６を発光しない際には、蛍光観察を行うことができることとなる。

しかしながら、図６に示した蛍光顕微鏡レーザ照射システム１０１においては、蛍光観察に用いる蛍光フィルター２２ｂがフィルターボックス２０の外にあるので、フィルターボックス２０を回転させることにより他の蛍光材料の観察に切り替える際には、フィルターキューブを切り替えたのみではエキサイトフィルター２２ｂが光路に残っているので、フィルターキューブを切り替えとともにエキサイトフィルター２２ｂの取り外しを同時に行う必要がある。また、他の蛍光波長での観察後に、フィルターボックス２０を回転させ、レーザ光源２６による細胞へのレーザ光照射と蛍光観察を行うフィルターキューブ２２ｂの位置に戻した際に、図７に示すように、フィルターボックス２０の位置がずれた場合にレーザ照射位置が大きくずれるという問題が生じる。図７には、フィルターボックス２０の位置ずれにより、フィルターキューブ２１ｂの本来の照明光の入射光軸２７が、ランプ光源１から出射される照明光光束１５およびレーザ光源２６より出射されるレーザ光光束１７の光軸と一致していない構成例を示す。フィルターキューブ２１ｂの正しい入射光方向２７がレーザ光光束１７の光軸とがずれていた場合においては、ダイクロイックミラー２３ｂが所定位置から傾斜しているために、対物レンズ２に入射するレーザ光の光軸が傾斜することとなる。そのため、レーザ照射位置は図８に示すように、死滅させたい細胞３３ａ上の希望するレーザ光集光位置４１にではなく、死滅させたくない細胞３３ｂ上の位置４２に照射されてしまう危険性がある。図７に示すフィルターボックス２０の位置ずれが生じていても、蛍光観察像は、ダイクロイックミラー２３ｂを透過する光により形成されるので、蛍光観察像の位置はほとんど変化しない特性を有している。また、励起照明光は、フィルターキューブ２１ｂの正しい入射光方向２７が照明光光束１５の光軸からずれて、対物レンズ２に入射する光軸が傾斜しても、照明範囲よりも広い範囲を照明する照明エリアがずれることとなり、観察している視野には照明がなされているので、照明位置の変化に気づきにくいという特性がある。したがって図７に示すようなフィルターボックス２０の位置ずれは、レーザ光源２６の観察視野における集光スポットの位置のみに大きな影響を与えるので、観察している視野に照射してみないと位置ずれに気が付かない問題である。したがって対策を施しにくい問題であるので、問題の回避が容易でない。

本発明は以上の点を考慮してなされたもので、フィルターボックスの回転と、焦点位置の微調整をすることなく、蛍光観察とレーザ照射を行うことができる蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置、さらに、フィルターボックスの設置位置が少しずれている場合においても、レーザ照射位置が観察している画像からずれるという問題を生じない蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置を提案しようとするものである。

かかる課題を解決するため本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置においては、蛍光観察に用いる被観察物に照射する励起光の波長を遮蔽し被観察物より発せられる蛍光の波長を透過する光学フィルター部材が、被観察物に照射するレーザ光を透過する特性を有し、さらに、被観察物に照射するレーザ光の波長を可視光帯域とすることにより、フィルターボックスの回転と焦点位置の微調整を行うことなく、蛍光観察とレーザ光照射を行うことができる。また、フィルターボックスの設置位置が少しずれている場合においても、レーザ照射位置がずれるという問題が生じない。

以上のように、本発明によれば、フィルターボックスの回転と焦点位置の微調整を行うことなく、蛍光観察とレーザ光照射を行うことができるので、蛍光観察時に目標を定めた対象物にレーザ光が照射されていることを確認することができる。また、蛍光観察工程からレーザ光照射工程に移る際に、フィルターボックスの回転および顕微鏡のフォーカス位置の調整が不要であるので、作業時間の短縮が可能である。そして、フォーカス位置の調整が不要であることは、フォーカス位置の調整が失敗することがないということであるので、信頼性も向上する。フィルターボックスの設置位置が少しずれている場合においても、レーザ照射位置が観察している画像からずれるという問題を生じないので、信頼性が向上する。

さらに、本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置は、従来の蛍光顕微鏡のカメラ接続ポートにイメージング機能付きレーザ照射ユニットを取り付ける作業と、蛍光フィルターボックスに本発明のフィルターキューブを取り付ける作業という顕微鏡使用者が日常行う作業にのみにより、構築することができるので、きわめて利便性および可搬性が高い装置となる。そのため、他の蛍光顕微鏡への取り付けが容易となり使用範囲が広がるので、導入メリットの高い装置である。

蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。 蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。 従来の蛍光顕微鏡装置にレーザ光源を取り付けた装置の概略説明図である。 対物レンズの設計対応波長でない波長の焦点位置を示す図である。 対物レンズの設計対応波長でない波長の焦点位置を示す図である。 従来の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置の概略説明図である。 フィルターボックスの位置ずれ示す図である。 蛍光顕微鏡の観察視野におけるレーザ照射位置のずれを示す図である。 本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置の概略構成図である。 本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置のレーザ光源部の概略構成図である。 本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置のフィルターキューブの波長特性を示す図である。 本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置のレーザ照射ユニットに搭載する波長フィルターの波長特性を示す図である。 第２の実施の形態による本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置の概略構成図である。 第２の実施の形態による本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置におけるレーザ照射位置の調整方法を示す図である。 第２の実施の形態による本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置により蛍光顕微鏡の観察視野におけるレーザ照射位置のずれを示す図である。 第３の実施の形態による本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置の概略構成図である。 第３の実施の形態による本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置の第２の形態の概略構成図である。 第３の実施の形態による本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置に用いる第１の形態のフィルターキューブの波長特性を示す図である。 第３の実施の形態による本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置に用いる第２の形態のフィルターキューブの波長特性を示す図である。 第４の実施の形態による本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置の概略構成図である。

第１の実施の形態による蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０２を図９に示す。この蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０２は、図１に示す蛍光顕微鏡装置のカメラ接続ポート５ａにイメージング機能付きレーザ照射ユニット１１１が取り付けられ、フィルターボックス２０に蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置に対応するフィルターキューブ６１が配置されたものである。したがって、蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０２は、通常の蛍光顕微鏡に対して蛍光顕微鏡使用者がほぼ日常的に行っているカメラ接続ポートへの部材の取り付けと、フィルターボックス２０へのフィルターキューブ６１を取り付けるという２つの作業により構成することができるものであるので、一般の蛍光顕微鏡使用者が蛍光顕微鏡への取り付けと取り外しを容易に行うことができる。

イメージング機能付きレーザ照射ユニット１１１は、結像レンズ３の結像面に撮像素子３４が配置されており、蛍光顕微鏡画像の観察が可能となっている。蛍光顕微鏡画像は、ランプ光源１より出射された光が、フィルターキューブ６１内のエキサイトフィルター６２により、観察目標とする蛍光材料の励起波長帯域の波長の光とされ、ダイクロイックミラー６３により対物レンズ２に入射するよう反射され、対物レンズ２により観察視野に照射され観察視野にある蛍光材料を励起する。蛍光材料より発光する蛍光は対物レンズ２および集光レンズ３により撮像素子３４に結像する。ここで、フィルターキューブ６１内のダイクロイックミラー６３およびエミッションフィルター６４は、蛍光材料の励起波長帯域の波長の光は透過しない構成となっており、観察目標とする蛍光材料より発光する蛍光の波長は透過する構成となっている。

撮像素子３４とカメラ接続ポート５ａの間には、ダイクロイックミラー２８が配置され、結像レンズ３により形成される第２の結像面１０を構成している。可視光レーザ光源２６より出射されるレーザ光は、カップリングレンズ７、レンズ８、ミラー１３、レンズ９により結像レンズ３により形成される観察面第２の結像面１０に集光スポットが形成されるように配置されている。フィルターキューブ６１内のダイクロイックミラー６３およびエミッションフィルター６４は、可視光レーザ光源２６より出射されるレーザ光の波長を透過する特性とされている。結像面１０に形成された集光スポットは、フィルターキューブ６１内のダイクロイックミラー６３およびエミッションフィルター６４を透過し、結像レンズ３および対物レンズ２により観察面にレーザ集光スポットが形成される。レーザ集光スポットの位置に除去したい細胞を配置させることにより、除去したい細胞にレーザ光が照射されることとなる。ダイクロイックミラー２８と撮像素子３４の間には、可視光レーザ光源２６の波長をブロックし、観察目標とする蛍光材料より発光する蛍光の波長を透過するブロックフィルター２９が配置されている。対物レンズ２あるいは結像レンズ３などの光路上の光学部品から反射される可視光レーザ光源２６より出射されるレーザ光がダイクロイックミラー２８を透過し撮像素子３４に至る光をブロックフィルター２９を配置することにより、除去することができる。

可視光レーザ光源２６の構成図を図１０に示す。可視光レーザ光源２６の構成は、特許文献１に示す実施例と同様に、励起用パルスレーザ光源５０のレーザ光を光ファイバー５１により導光し可視光レーザ２６内において、コリメートレンズ５２、シリンドリカルレンズ５３、さらには、励起ウインドウ５７を介して、色素容器５４内の色素レーザ媒体５８を励起する。色素レーザ媒体５８に接するように高反射率を有するリアミラー５５と、リアミラー５５よりも低い反射率を有するフロントミラー５６が配置されており、色素レーザ媒体５８は、リアミラー５５とフロントミラー５６によりレーザ共振器を構成し、フロントミラー５６側にレーザ光を出射し、レーザ光光束１７を形成する。ここで、励起用パルスレーザ光源５０に例えば紫外線の波長帯域である３３７ｎｍのレーザ光を発光する窒素ガスパルスレーザを用い、色素レーザ媒体５８としてスチルベンなどを用いると例えば波長４３５ｎｍの可視光パルスレーザ２６を構成することができる。また、特許文献１に示す構成と同様に、色素容器５４とともに、色素レーザ媒体５８を保持する壁面の一部として、励起ウインドウ５７、リアミラー５５、フロントミラー５６を用いることにより、可視光レーザ光源２６の小型化がなされる。

蛍光観察を行う蛍光材料をＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）とし、可視光レーザ光源２６の波長を４３５ｎｍとして場合の、フィルターキューブ６１内のエキサイトフィルター６２、ダイクロイックミラー６３およびエミッションフィルター６４の透過波長特性を図１１に示す。またイメージング機能付きレーザ照射ユニット１１１内のダイクロイックミラー２８およびブロックフィルター２９の透過波長特性を図１２に示す。ここでダイクロイックミラー６３の透過率およびダイクロイックダイクロイックミラー２８の透過率は、４５度の角度で入射する光の場合を示している。エキサイトフィルター６２の透過波長特性Ｔ（６２）は、ＧＦＰおよびＦＩＴＣの励起光である４８０ｎｍ付近の光のみを透過するような波長特性となっている。ダイクロイックミラー６３の透過波長特性Ｔ（６３）は、可視光レーザ光源２６の波長である４３５ｎｍの光を透過し、ＧＦＰおよびＦＩＴＣの蛍光観察に適した５１０ｎｍ付近から５５０ｎｍ付近の波長を透過し、エキサイトフィルター６２の透過波長帯域の波長を反射する波長特性となっている。エミッションフィルター６４の透過波長特性Ｔ（６４）は、可視光レーザ光源２６の波長である４３５ｎｍの光を透過し、ＧＦＰおよびＦＩＴＣの蛍光観察に適した５１０ｎｍ付近から５５０ｎｍ付近に至る波長の光を透過し、エキサイトフィルター６２の透過波長帯域の波長をブロックするような波長特性となっている。ダイクロイックミラー２８の透過波長特性Ｔ（２８）は、可視光レーザ光源２６の波長である４３５ｎｍの光を反射し、ＧＦＰおよびＦＩＴＣの蛍光観察に適した５１０ｎｍ付近から５５０ｎｍ付近の波長を透過する特性となっている。ブロックフィルター２９の透過波長特性Ｔ（２９）は、可視光レーザ光源２６の波長である４３５ｎｍの光をブロックし、ＧＦＰおよびＦＩＴＣの蛍光観察に適した５１０ｎｍ付近から５５０ｎｍ付近に至る波長の光を透過する特性となっている。

本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置では、フィルターキューブ６１内のダイクロイックミラー６３およびエミッションフィルター６４の透過波長特性に複数の透過波長帯域を有する特性とし、レーザ光源２６の波長帯域と蛍光観察を行う波長帯域とで異なる帯域を割り当てる、そして、ダイクロイックミラー２８およびブロックフィルター２９により、それらの帯域ごとに分離を行うことにより、ダイクロイックミラー２８およびブロックフィルター２９に精密な波長精度を有する部材を用いなくても、図１２に示したように単なるロングパスフィルターなど安価な部材で分離を行うことができる。蛍光観察を行う蛍光試薬は目視により観察を行うことを想定して開発がなされたものが一般的であるので蛍光観察を行う波長帯域は一般的に可視光帯域である。本発明のレーザ光源２６の波長は可視光であるので、対物レンズ２により形成される蛍光観察を行う波長の焦点位置とレーザ光源２６の焦点位置はほぼ同一の位置となり、蛍光観察時とレーザ照射時で焦点位置の調整は不要となる。また上記のように蛍光観察時およびレーザ光照射時ともにフィルターキューブ６１が光路に挿入された状態であるので、蛍光観察時とレーザ照射時とを切り替える際にフィルターボックスを回転させる作業は不要である。さらに、本発明の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置においては、蛍光観察光光束１６およびレーザ光光束１７がともに、フィルターキューブ６１内のダイクロイックミラー６３およびエミッションフィルター６４を透過する構成となっているので、フィルターボックス２０の位置がずれたとしても、蛍光観察光光束１６およびレーザ光光束１７は問題となる位置変化は生じないので、蛍光観察画像から選定したレーザ照射位置がずれることはないという特徴を有している。

本発明の第２の実施の形態による蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０３を図１３に示す。この蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０３は、図９に示した第１の実施の形態による蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０２におけるイメージング機能付きレーザ照射ユニット１１１のミラー１３をスキャンミラー１４に置き換えたイメージング機能付きレーザ照射ユニット１１２が蛍光顕微鏡のカメラ接続ポート５ａに接続された構成である。スキャンミラー１４は、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）方式のデバイスなどであり、図１３には図示していなコントローラからの制御信号によりミラーの反射角度が調整可能なミラーである。図１４に示すようにスキャンミラー１４の角度を変えることにより、第２の結像面１０における可視光レーザ光源２６の集光スポットの位置が制御可能となり、結像レンズ３および対物レンズ２により観察面におけるレーザ集光スポットの位置を制御することができる。

具体的なスキャンミラー１４の使用方法の説明を行う。図１５は撮像素子３４により観察される蛍光顕微鏡画像の例であり、観察視野４０の中に、除去するべき細胞３３ａが観察されている。撮像素子３４は、対物レンズ２および結像レンズ３により形成される観察面の結像面に配置されているので、撮像素子３４により観察される蛍光顕微鏡画像におけるすべての画素に対応する位置は、第２の結像面１０においてそれぞれ存在する。したがって、撮像素子３４の画像において除去するべき細胞３３ａを認知しレーザを照射したい位置である４１を選択すると、第２の結像面１０におけるレーザを照射したい位置である４１に対応する位置４３に可視光レーザ光源２６の集光スポットを動かすことにより、レーザを照射したい位置にレーザ光を照射することができ、除去するべき細胞３３ａにレーザ光を照射することができる。図１４にレーザ光光束１７を用いて示すように、第２の結像面１０におけるレーザを照射したい位置である４１に対応する位置４３に集光スポットが形成されるように、スキャンミラー１４の位置を調整することにより、観察面における除去するべき細胞３３ａに集光スポットを配置することができる。この観察面における除去するべき細胞３３ａに照射するレーザ光スポットは、撮像素子３４において図１５に示す位置４２となる。このように、イメージング機能付きレーザ照射ユニット１１１の中にスキャンミラーなどを用いて、第２の結像面１０におけるレーザ光スポットの位置を調整可能な構成とすることにより、観察している視野にレーザ照射対象がある場合に、ステージを動かすことなくレーザ照射位置を制御することができ、細胞培養の仮定においては、細胞に対して余計な振動を与えることを低減することができる。

本発明の第３の実施の形態による蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０４を図１６および図１７に示す。この蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０４は、図１３に示した第２の実施の形態による蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０３においては、ＧＦＰあるいはＦＩＴＣなどの主に緑色の発色する蛍光材料の蛍光画像を観察し、レーザ光を照射する装置を例に示したが、蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０４は、フィルターキューブ７１とフィルターキューブ８１の交換のみで、ＧＦＰあるいはＦＩＴＣなどの主に緑色の発色する蛍光材料を観察する蛍光顕微鏡から、ＴＲＩＴＣ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）など赤色の発色する蛍光材料を観察する蛍光顕微鏡に変更できる構成となっている。また、この例においては、フィルターキューブ７１とフィルターキューブ８１の構成の違いは、エキサイトフィルター７２とエキサイトフィルター８２の構成の違いのみであり、ダイクロイックミラー７３とエミッションフィルター７４は同じ特性を有するものである。

フィルターキューブ７１を構成する、エキサイトフィルター７２、ダイクロイックミラー７３、エミッションフィルター７４の透過波長特性を図１８に示し、フィルターキューブ８１を構成する、エキサイトフィルター８２、ダイクロイックミラー７３、エミッションフィルター７４の透過波長特性を図１９に示す。ここで、図１１と同様に、ダイクロイックミラー７３の透過率は、４５度の角度で入射する光の場合を示している。エキサイトフィルター７２の透過波長特性Ｔ（７２）は、ＧＦＰおよびＦＩＴＣの励起光である４８０ｎｍ付近の光のみを透過するような波長特性となっている。エキサイトフィルター８２の透過波長特性Ｔ（８２）は、ＴＲＩＴＣの励起光である５６０ｎｍ付近の光のみを透過するような波長特性となっている。ダイクロイックミラー７３の透過波長特性Ｔ（７３）は、可視光レーザ光源２６の波長である４３５ｎｍの光を透過し、ＧＦＰおよびＦＩＴＣの蛍光観察に適した５１０ｎｍ付近から５５０ｎｍ付近までの波長を透過し、ＴＲＩＴＣの蛍光観察に適した５８５ｎｍ付近から６３０ｎｍ付近までの波長を透過し、エキサイトフィルター７２の透過波長帯域の波長およびエキサイトフィルター８２の透過波長帯域の波長を反射する波長特性となっている。エミッションフィルター７４の透過波長特性Ｔ（７４）は、可視光レーザ光源２６の波長である４３５ｎｍを透過し、ＧＦＰおよびＦＩＴＣの蛍光観察に適した５１０ｎｍ付近から５５０ｎｍ付近に至る波長の光を透過し、ＴＲＩＴＣの蛍光観察に適した５８５ｎｍ付近から６３０ｎｍ付近までの波長を透過し、エキサイトフィルター７２の透過波長帯域の波長およびエキサイトフィルター８２の透過波長帯域の波長をブロックするような波長特性となっている。

本発明の第３の実施の形態による蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０４は、フィルターキューブ７１とフィルターキューブ８１とフィルターボックス２０内で交換することにより、ＧＦＰあるいはＦＩＴＣなどの緑色の蛍光を発色する蛍光材料が観察可能な蛍光顕微鏡から、ＴＲＩＴＣなどの赤色の蛍光を発色する蛍光材料が観察可能な蛍光顕微鏡に切り替えることができ、ともに、可視光レーザ２６から出射されるレーザ光を観察面の目標位置に照射することができることとなる。フィルターキューブ７１に用いるダイクロイックミラーとエミッションフィルターにおいては、ＴＲＩＴＣなどの赤色の蛍光を透過する機能は不要であり、フィルターキューブ８１に用いるダイクロイックミラーとエミッションフィルターにおいては、ＧＦＰあるいはＦＩＴＣなどの緑色の蛍光を透過する機能は不要であるが、フィルターキューブ７１とフィルターキューブ８１においては、部品の共有化がなされているので、部品種類削減の観点でメリットをもたらしている。また、図１８および図１９に示した本発明の第３の実施の形態においても、フィルターキューブ７１および８１内のダイクロイックミラー７３およびエミッションフィルター７４の透過波長特性に複数の透過波長帯域を有する特性とし、レーザ光源２６の波長帯域と蛍光観察を行う波長帯域とで異なる帯域を割り当てている。そして、ダイクロイックミラー２８およびブロックフィルター２９により、それらの帯域ごとに分離を行うことにより、ダイクロイックミラー２８およびブロックフィルター２９に詳細な波長精度を有する部材を用いなくても容易に分離を行うことができる。

本発明の第４の実施の形態による蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０５を図２０に示す。この蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０５は、図１６に示した第３の実施の形態による撮像素子３４に替わり、接眼観察光学系８０を用い、肉眼での観察機能を有する構成のものである。本発明においては、ブロックフィルター２９を配置することにより、レーザ光源２６の光は接眼レンズ光学系８０には至らない構成となっているので肉眼による観察も可能である。蛍光顕微鏡観察においては、蛍光画像の観察ができない場合に、肉眼での観察を望む研究者が多いので、本発明の第４の実施の形態による蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置１０５におけるイメージング機能付きレーザ照射ユニット１１４のようにイメージング機能を肉眼観察とすることができることにより、研究効率が高まることもある。

本発明は、たとえば再生医療研究を行う場合において、目標としない細胞に分化してしまった細胞を取り除く場合などにおいて利用することができる。また、蛍光に発光する部分にレーザ光を照射することにより反応などを行う分野においては、バイオ関係に限定することなく本発明を利用することができる。

１……ランプ光源、２……対物レンズ、３……結像レンズ、４、３４……撮像素子、５……カメラ接続ポート、６……レーザ光源、７、８、９、１１……レンズ、１０、３６……結像面、１２……切り替えミラー、１３……ミラー、１４……スキャンミラー、１５……照明光光束、１６……蛍光観察光光束、１７……レーザ光光束、１８……レーザ光集光スポット位置、１９……シャッター、２０……フィルターボックス、２１、６１、７１、８１……フィルターキューブ、２２、６２，７２、８２……エキサイトフィルター、２３、２８、６３，７３……ダイクロイックミラー、２４、６４、７４……エミッションフィルター、２５……フィルターキューブホルダー、２６……可視光レーザ光源、２７……フィルターキューブの正しい入射光方向、２９……ブロックフィルター、３０……細胞培養ディッシュ、３１……観察用ガラス、３２……培養液、３３……細胞、３５……カメラ、４０……顕微鏡視野、４１……ユーザが希望するレーザ光集光位置、４２……実際のレーザ光集光位置、４３……第２の結像面におけるユーザが希望するレーザ光集光位置、５０……励起用レーザ、５１……光ファイバー、５２……コリメートレンズ、５３……シリンドリカルレンズ、５４……共振器容器、５５……リアミラー、５６……フロントミラー、５７……励起ウィンドウ、５８……色素溶液、５９……励起レーザ光光束、８０……接眼レンズ、９９……レーザ照射光源、１００……蛍光顕微鏡、１０１……光源接続部にレーザ光源を接続した蛍光顕微鏡、１０２……蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置、１０３、１０４、１０５……蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置、１１１、１１２、１１３、１１４……イメージング機能付きレーザ照射ユニット

Claims (6)

1. 被観察物に励起光を照射することにより発せられる蛍光の観察を行う蛍光顕微鏡光学系と、可視光の波長帯域を有するレーザ光源とを有する蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置において、
   被観察物に照射する励起光の波長を遮蔽し被観察物より発せられる蛍光の波長を透過する光学フィルター部材を有し、
   前記被観察物より発せられる蛍光の波長を透過する光学フィルター部材は、前記レーザ光源の波長を透過する特性を有していることを特徴とする蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置。
2. 前記蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置において、
   前記被観察物より発せられる蛍光の波長を透過する光学フィルター部材は、複数の透過波長帯域を有し、蛍光の波長を透過する波長帯域とは異なる帯域において上記レーザ光源の波長を透過することを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置。
3. 前記蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置において、
   被観察物に照射される励起光は、照明用光源から発生された光を、蛍光材料を励起する波長帯域を透過するフィルター部材を透過させた光であり、
   前記蛍光材料を励起する波長帯域を透過するフィルター部材と前記被観察物より発せられる蛍光の波長を透過する光学フィルター部材は、
   前記蛍光顕微鏡光学系から着脱可能な部材に固着されていることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置。
4. 前記蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置において、
   被観察物より発せられる蛍光を画像化する機能を有する部材を有し、
   前記画像化する機能を有する部材と前記被観察物より発せられる蛍光の波長を透過する光学フィルター部材との間には、前記レーザ光源との光路の分岐を行うミラー部材が配置されており、
   前記画像化する機能を有する部材と前記ミラー部材との間には、前記レーザ光を遮蔽し被観察物より発せられる蛍光の波長を透過する光学フィルター部材が配置されていることを特徴とする請求項１または２または３に記載の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置。
5. 前記蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置において、
   前記画像化する機能を有する部材は撮像素子であることを特徴とする請求項１または２または３または４に記載の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置。
6. 前記蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置において、
   前記画像化する機能を有する部材は接眼レンズ光学系であることを特徴とする請求項１または２または３または４に記載の蛍光顕微鏡観察機能付きレーザ照射装置。

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