JP2007034020A - 顕微鏡対物レンズ - Google Patents

Abstract

【課題】開口数が大きく、液浸液の経時変化が少なく、生体細胞や生体組織や生体の固体の内部の観察時にも像性能の劣化が少ない、液浸系顕微鏡対物レンズの提供。
【解決手段】生体細胞または生体組織または生体の固体に代表されるような試料（屈折率ｎｄが１．３３〜１．５）を観察するまたは計測するための液浸用顕微鏡対物レンズであって、使用される液浸液が、屈折率が１．３４〜１．５の合成オイルであるとして設計されている。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体細胞または生体組織または生体の個体のような試料を観察または計測するための液浸系顕微鏡対物レンズに関するものである。

近年、生物学の分野で、光学顕微鏡を用いて生体細胞内や生体組織内の分子の運動や活性を観察し、細胞・組織の構造や機能を解明する研究が行なわれている。それらの研究を行なう手法として、コンフォーカルレーザースキャニング顕微鏡（ＣＬＳＭ）法、デジタルデコンボリューション法などを用いて生体細胞を三次元的に観察する手法が注目されている。また、２光子励起法を使って生体組織内の観察や分子イメージングする手法も広まりつつある。これらの観察法は、三次元像を構築するために、カバーガラス表面よりもさらに深部の試料内部を観察する。

ところが、合成オイルを液浸液として用いた従来の液浸系対物レンズは、カバーガラス表面よりもさらに深部を観察するには不適である。従来の液浸系対物レンズの液浸液に用いられている合成オイルの屈折率はｎｄ＝１．５〜１．８である。それに対して、細胞内や組織内の媒質は屈折率ｎｄ＝１．３３〜１．５であり、さらにその大部分は屈折率ｎｄ＝１．３７〜１．４の媒質で占められている。よって、カバーガラス表面よりもさらに深部の試料内部を観察する場合、合成オイル（ｎｄ＝１．５〜１．８）と細胞・組織（ｎｄ＝１．３７〜１．４）の屈折率差に起因する球面収差が発生し、結像性能が劣化する。

この現象を図９〜図１１を用いて説明する。図９は、倒立顕微鏡に取り付けられた対物レンズを用いて試料を観察する際の構成を概略的に示している。顕微鏡本体の図は省略している。試料２０はカバーガラス３０に載せられ、カバーガラス３０は対物レンズ１０の上方に配置されている。カバーガラス３０と対物レンズ１０の間の空間は液浸液４０で満たされている。対物レンズ１０のピント位置は所望の観察点に合わせられる。試料表面上の観察点Ｐ１すなわちカバーガラス表面上の観察点Ｐ１を観察する場合に比べて、試料内部の観察点Ｐ２すなわちカバーガラス表面よりも上方に位置する観察点Ｐ２を観察する場合には、対物レンズ１０は上方に配置され、カバーガラス３０と対物レンズ１０の間の距離（作動距離ＷＤ）は短い。

ここで、対物レンズとして代表的な液浸系１００倍対物レンズ（ＮＡ１．４）、液浸液としてｎｄ＝１．５１５の合成オイル、試料としてｎｄ＝１．３８相当の細胞を想定する。また、観察点Ｐ１はカバーガラス表面上に位置し、観察点Ｐ２はカバーガラス表面上から５μｍ上方に位置しているとする。図１０は観察点Ｐ１における球面収差を示し、図１１は観察点Ｐ２における球面収差を示している。対物レンズはカバーガラス表面上の観察点Ｐ１に対して最良の性能が出るように設計されており、図１０に示されるように観察点Ｐ１における球面収差は良好である。観察点Ｐ２を観察する場合、試料（ｎｄ＝１．３８）の厚さが大きくなり、液浸液（ｎｄ＝１．５１５）の厚さは少なくなる。そのため、図１１に示されるように球面収差が発生し、結像性能が大幅に劣化していることが分かる。

このような結像性能の劣化は、両者の屈折率差が大きいほど著しく、また観察点がカバーガラス表面から遠いほど著しく、また対物レンズの開口数（ＮＡ）が大きいほど著しい。

なお、液浸系対物レンズの中には、光軸方向に移動可能なレンズ群を備えることにより球面収差を補正する機能を持ったものが下記の文献に提案されている。
特開２００３−０１５０４６号公報 特開２００２−３４１２４９号公報 特許文献１には、倍率が５９．６倍でＮＡが１．４の対物レンズや、倍率が５５．９倍でＮＡが１．４の対物レンズが記載されており、それらは、カバーガラス厚さの変化や温度の変化による球面収差の変化を補正する移動レンズ群を備えている。

特許文献２には、倍率が６０倍でＮＡが１．４の対物レンズが記載されており、それは、カバーガラス厚さの変化や温度の変化による球面収差の変化を補正する移動レンズ群を備えている。

しかし、特許文献１や特許文献２の球面収差を補正する機能は、カバーガラス厚さの変化や使用温度の変化による球面収差の変化を補正するものであり、液浸液と試料との屈折率差によって発生する極端な球面収差の劣化は補正しきれない。

そこで、液浸液と試料の屈折率差によって発生する球面収差を抑える方法として、合成オイル（ｎｄ＝１．５〜１．８）の代わりに水（ｎｄ＝１．３３程度）を液浸液として用いた水浸対物レンズが下記の文献に提案されている。
特開２００３−０１５０４７号公報 特開２００３−１２１７５０号公報 特開２００３−１７２８７９号公報 特開２００４−０２９０６７号公報 特開２００４−１８４８２６号公報 特開２００４−３４１１７０号公報 特開平１１−２１８６８７号公報 特開平１０−３３３０４４号公報 特開平９−２５８１０７号公報 特開平８−２９２３７４号公報 特開平７−２３００３８号公報 特許第３２９９８０８号公報（特開平６−２８１８６４号公報） 特許文献３に記載されている対物レンズは、倍率が４０倍でＮＡが１．２の対物レンズである。

特許文献４に記載されている対物レンズは、倍率が１００倍でＮＡが１．１の対物レンズである。

特許文献５に記載されている対物レンズは、倍率が６０倍でＮＡが１．１の対物レンズである。

特許文献６に記載されている対物レンズは、倍率が４０倍でＮＡが１．２の対物レンズである。

特許文献７に記載されている対物レンズは、倍率が６０倍でＮＡが１．２の対物レンズである。

特許文献８に記載されている対物レンズは、倍率が６０倍でＮＡが１．０の対物レンズである。

特許文献９に記載されている対物レンズは、倍率が１５０倍でＮＡが１．２の対物レンズである。

特許文献１０に記載されている対物レンズは、倍率が４０倍でＮＡが１．１５の対物レンズである。

特許文献１１に記載されている対物レンズは、倍率が６０倍でＮＡが１．１５〜１．２の対物レンズである。

特許文献１２に記載されている対物レンズは、倍率が４０倍でＮＡが０．８の対物レンズや、倍率が６０倍でＮＡが０．９５の対物レンズである。

特許文献１３に記載されている対物レンズは、倍率が６０倍でＮＡが１．２の対物レンズである。

特許文献１４に記載されている対物レンズは、倍率が６０倍でＮＡが１．１５の対物レンズである。

これらの対物レンズでは、液浸液に水（ｎｄ＝１．３３程度）を用いることにより、液浸液と試料との屈折率差を小さくしている。特に、ｎｄ＝１．３３の媒質を多く含む試料の場合、液浸液（水）と試料の屈折率のマッチング（両者の屈折率差が小さい事）は良好であり、試料深部を観察する場合であっても像の劣化が少ない。

液浸液として用いられる水は、試料との屈折率のマッチングが完全でない。そのため、試料深部を観察する場合、わずかに像性能の劣化が起こる。また、水は屈折率が低いためＮＡを大きくすることができない。そのため、観察像は暗いものとなる。また、水は合成オイルと比較して揮発しやすいため経時変化に弱い。そのため、長時間の観察には使い勝手が悪い。

本発明の目的は、開口数が大きく、液浸液の経時変化が少なく、生体細胞や生体組織や生体の固体の内部の観察時にも像性能の劣化が少ない、液浸系顕微鏡対物レンズならびに観察または計測する方法を提供することである。

本発明は、ひとつの側面によると、生体細胞または生体組織または生体の個体に代表されるような試料（屈折率ｎｄが１．３３〜１．５）を観察または計測するための液浸系顕微鏡対物レンズであり、使用される液浸液が、屈折率ｎｄが１．３４〜１．５の合成オイルであるとして設計されていることを特徴とする。

本発明は、別の側面によると、液浸系顕微鏡対物レンズを用いて生体細胞または生体組織または生体の個体に代表されるような試料（屈折率ｎｄが１．３３〜１．５）を観察または計測する方法であり、液浸液に、屈折率ｎｄが１．３４〜１．５の合成オイルを使用することを特徴とする。

本発明によると、開口数が大きく、液浸液の経時変化が少なく、生体細胞や生体組織や生体の固体の内部の観察時にも像性能の劣化が少ない、液浸系顕微鏡対物レンズが提供される。また、大きい開口数の液浸系顕微鏡対物レンズを用いて液浸液の経時変化が少なく生体細胞や生体組織や生体の個体の内部を観察する場合でも像性能の劣化が少ない観察像で観察する方法が提供される。

以下、本発明の実施形態を説明するにあたり、まず、本発明の基本構成について述べ、そのあとで、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

本発明では、液浸系顕微鏡対物レンズは、使用される液浸液が、屈折率ｎｄが１．３４〜１．５の合成オイルであるとして設計されている。言い換えれば、観察は、液浸液に、屈折率ｎｄが１．３４〜１．５の合成オイルを使用して行なう。屈折率ｎｄが１．３４〜１．５の合成オイルを液浸液に用いることにより、生体細胞や生体組織や生体の個体に代表されるような試料の屈折率とマッチングを図ることができる。よって、試料内部を観察する場合であっても、結像性能の劣化を抑えることができる。また、液浸液が合成オイルであることにより、水のような揮発しやすい性質を抑えることができる。つまり、液浸液の少ない経時変化をもって観察することができる。さらに、水よりも屈折率が高い液浸液を使用することにより、開口数ＮＡを大きくすることができる。なお、合成オイルは、有機化合物で構成され、可視域で十分な透過率を持つ液体である。

好ましくは、使用される液浸液が、屈折率ｎｄが１．３７〜１．４５の合成オイルである。これにより、試料の屈折率とのマッチングを高めることができる。また、開口数ＮＡを大きくすることができる。さらに好ましくは、使用される液浸液が、屈折率ｎｄが１．３７〜１．４未満の合成オイルである。これにより、試料の屈折率とのマッチングをさらに高めることができる。また、開口数ＮＡをさらに大きくすることができる。

使用される液浸液は、例えば、シリコーンオイルである。シリコーンオイルの屈折率ｎｄは１．４程度であり、試料の屈折率とのマッチングは良好である。さらにジメチルポリシロキサン構造を持った合成シリコーンオイルであれば、屈折率ｎｄ＝１．３７〜１．４１から選択可能である。シリコーンオイルは入手しやすく、また、化学的に安定している、揮発しにくい、金属等への腐食性が少ない、等々の優れた性質を有している。よって、対物レンズの液浸液として使い勝手に優れている。

前述の特許文献３〜特許文献１４の対物レンズは、合成オイルを液浸液に使用する一般的な対物レンズ（ＮＡ１．４〜１．６５）と比較してＮＡが小さく、１．２しかない。ＮＡが小さい理由は、水の屈折率が小さいため光学設計上ＮＡを大きくすることが困難であることによる。このように特許文献３〜特許文献１４の対物レンズはＮＡが小さいため、これらを用いて得られる像は暗いものとなる。

これに対して本発明では、好ましくは、液浸系顕微鏡対物レンズの開口数ＮＡが１．２５以上である。これにより、明るい像を観察することができる。さらに好ましくは、開口数ＮＡが１．３１以上である。これにより、さらに明るい像を観察することができる。

また好ましくは、液浸系顕微鏡対物レンズが光軸方向に移動可能な移動レンズ群を備えている。一般に使われているカバーガラスは、屈折率ｎｄが１．５２程度である。よって、カバーガラスの厚さが設計と異なっていれば、その厚さの変化によって球面収差が発生する。光軸方向に移動可能なレンズ群を備えていることにより、カバーガラスの厚さによる球面収差の発生を補正することが可能となる。あるいは、試料と液浸液の屈折率にわずかな差があり若干の球面収差が発生する場合であっても、その球面収差の発生量が小さければ補正することが可能である。

＜第一実施形態＞
本発明の第一実施形態の液浸系顕微鏡対物レンズの構成は図１に示す通りである。液浸系顕微鏡対物レンズは、物体側から順に配置された、物体側に平面を向けた平凸レンズＬ１と物体側に凹面を向けたメニスカスレンズＬ２からなる接合レンズと、正レンズＬ３と、正レンズＬ４と負レンズＬ５と正レンズＬ６からなる三枚接合レンズと、正レンズＬ７と、負レンズＬ８と正レンズＬ９と負レンズＬ１０からなる三枚接合レンズと、正レンズＬ１１と負レンズＬ１２とからなる二枚接合レンズと、正のメニスカスレンズＬ１３と、負レンズＬ１４と、負レンズＬ１５と正レンズＬ１６とからなる二枚接合レンズとから構成されている。

本実施形態の液浸系顕微鏡対物レンズのレンズデータは下記の表１に示す通りである。ここで、ｆ＝１．８、β＝１００倍、ＮＡ＝１．３３、視野数＝２２、ＷＤ＝０．１３（ｄ１＝０のとき）である。

ｄ１はピント位置からカバーガラス表面までの距離である。カバーガラス表面を観察する場合はｄ１＝０である。試料は様々な媒質（ｎｄ＝１．３３〜１．５）で構成されているが、ここでは細胞液（ｎｄ＝１．３８程度）を仮定した。ｄ２はＷＤであり、その空間はオイルで充てんされている。

本実施形態に用いられるカバーガラスは、厚さが０．１７ｍｍ、ｎｄ＝１．４５８４７、νｄ＝６７．７である。また、オイルはシリコーンオイルであって、ｎｄ＝１．４０５５９、νｄ＝５２．０である。

レンズデータ中、ｒは各レンズ面の曲率半径（単位ｍｍ）、ｄは各レンズ面間の間隔（単位ｍｍ）、ｎｄは各レンズのｄ線の屈折率、νｄは各レンズのｄ線におけるアッベ数である。また、ｆは焦点距離（単位ｍｍ）、βは倍率、ＮＡは開口数、ＷＤは作動距離（単位ｍｍ）である。

レンズＬ１〜Ｌ１６をそれぞれ構成する各光学ガラスは、紫外域での透過率が優れた自家蛍光の少ない光学ガラスであり、本実施形態は蛍光観察に最適な対物レンズとなっている。また、各光学ガラスは、環境対応ガラス（鉛フリーガラス）であり、本実施形態は環境に配慮した対物レンズとなっている。

また、本実施形態は、対物レンズからの射出光が平行光束となる無限遠補正型の対物レンズであり、それ自身では結像しない。そこで、例えば、図８にレンズ断面を示す結像レンズ（焦点距離１８０ｍｍ）と組み合わせて使用される。

この結像レンズは、物体側から順に配置された、正レンズＩＬ１と正のメニスカスレンズＩＬ２からなる接合レンズと、正レンズＩＬ３と負レンズＩＬ４からなる接合レンズとから構成されている。

この結像レンズのレンズデータは下記の表２に示す通りである。

レンズデータ中、ｒは各レンズ面の曲率半径、ｄは各レンズ面間の間隔、ｎｄは各レンズのｄ線の屈折率、νｄは各レンズのｄ線におけるアッベ数である。

この場合、本実施形態の対物レンズと結像レンズの間隔は５０ｍｍ〜１７０ｍｍの間の任意の値でよい。この間隔が１２０ｍｍである場合における本実施形態の収差図を図２〜図７に示す。図２はｄ１＝０における球面収差、図３はｄ１＝０．００５ｍｍ（５μｍ）における球面収差、図４は正弦条件違反量、図５は非点収差、図６は歪曲収差、図７はコマ収差を示している。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

本発明の第一実施形態による対物レンズの断面を示している。 図１の対物レンズを用いて観察する場合においてｄ１＝０における球面収差を示している。 図１の対物レンズを用いて観察する場合においてｄ１＝０．００５ｍｍ（５μｍ）における球面収差を示している。 図１の対物レンズを用いて観察する場合における正弦条件違反量を示している。 図１の対物レンズを用いて観察する場合における非点収差を示している。 図１の対物レンズを用いて観察する場合における歪曲収差を示している。 図１の対物レンズを用いて観察する場合におけるコマ収差を示している。 結像のために図１の対物レンズと一緒に使用される結像レンズの断面を示している。 倒立顕微鏡に取り付けられた対物レンズを用いて試料を観察する際の構成を概略的に示している。 液浸系１００倍対物レンズを用いてカバーガラス表面上の観察点Ｐ１を観察する場合における球面収差を示している。 液浸系１００倍対物レンズを用いて試料内部の観察点Ｐ２を観察する場合における球面収差を示している。

符号の説明

１０…対物レンズ、２０…試料、３０…カバーガラス、４０…液浸液、ＩＬ１…正レンズ、ＩＬ２…メニスカスレンズ、ＩＬ３…正レンズ、ＩＬ４…負レンズ、Ｌ１…平凸レンズ、Ｌ２…メニスカスレンズ、Ｌ３…正レンズ、Ｌ４…正レンズ、Ｌ５…負レンズ、Ｌ６…正レンズ、Ｌ７…正レンズ、Ｌ８…負レンズ、Ｌ９…正レンズ、Ｌ１０…負レンズ、Ｌ１１…正レンズ、Ｌ１２…負レンズ、Ｌ１３…メニスカスレンズ、Ｌ１４…負レンズ、Ｌ１５…負レンズ、Ｌ１６…正レンズ、Ｐ１…観察点、Ｐ２…観察点。

Claims (14)

1. 生体細胞または生体組織または生体の個体に代表されるような試料（屈折率ｎｄが１．３３〜１．５）を観察または計測するための液浸系顕微鏡対物レンズであって、使用される液浸液が、屈折率ｎｄが１．３４〜１．５の合成オイルであるとして設計されていることを特徴とする液浸系顕微鏡対物レンズ。
2. 使用される液浸液が、屈折率ｎｄが１．３７〜１．４５の合成オイルであることを特徴とする、請求項１に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。
3. 使用される液浸液が、屈折率ｎｄが１．３７〜１．４未満の合成オイルであることを特徴とする、請求項１に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。
4. 使用される液浸液が、シリコーンオイルであることを特徴とする、請求項１に記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。
5. 開口数ＮＡが１．２５以上であることを特徴とする、請求項１〜請求項４にいずれかひとつに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。
6. 開口数ＮＡが１．３１以上であることを特徴とする、請求項１〜請求項４にいずれかひとつに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。
7. 光軸方向に移動可能な移動レンズ群を備えていることを特徴とする、請求項１〜請求項６にいずれかひとつに記載の液浸系顕微鏡対物レンズ。
8. 液浸系顕微鏡対物レンズを用いて生体細胞または生体組織または生体の個体に代表されるような試料（屈折率ｎｄが１．３３〜１．５）を観察または計測する方法において、液浸液に、屈折率ｎｄが１．３４〜１．５の合成オイルを使用することを特徴とする方法。
9. 液浸液に、屈折率ｎｄが１．３７〜１．４５の合成オイルを使用することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 液浸液に、屈折率ｎｄが１．３７〜１．４未満の合成オイルを使用することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
11. 液浸液に、シリコーンオイルを使用することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
12. 液浸系顕微鏡対物レンズの開口数ＮＡが１．２５以上であることを特徴とする、請求項８〜請求項１１にいずれかひとつに記載の方法。
13. 液浸系顕微鏡対物レンズの開口数ＮＡが１．３１以上であることを特徴とする、請求項８〜請求項１１にいずれかひとつに記載の方法。
14. 液浸系顕微鏡対物レンズが光軸方向に移動可能な移動レンズ群を備えていることを特徴とする、請求項８〜請求項１３にいずれかひとつに記載の方法。

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