JP2010096813A - 非線形光学顕微鏡及びその調整方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、光の検出効率を確実に高く維持することのできる非線形光学顕微鏡及びその調整方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明を例示する非線形光学顕微鏡の一態様は、対物レンズ（１７）が形成する照明光のスポットで物体上を走査する走査手段（１６）と、前記照明光との強度関係が非線形な信号光を前記物体上のスポットから検出する検出手段（２００）とを備え、前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で前記信号光の強度にピークを与える特定値の近傍に設定されている。
【選択図】 図１

Description

本発明は、二光子励起蛍光顕微鏡、第二高調波発生顕微鏡（ＳＨＧ：Second-Harmonic Generation）・第三高調波発生顕微鏡（ＴＨＧ：Third-Harmonic Generation）・コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡（ＣＡＲＳ：Coherent anti-Stokes Raman scattering）などの非線形光学顕微鏡及びその調整方法に関する。

近年、バイオ産業の勢いはとどまるところを知らず、とりわけ生体試料をターゲットとした三次元分解顕微鏡の需要は高まる一方である。その中でも共焦点蛍光顕微鏡は古くから現在に至るまで広く使われている。
通常の共焦点蛍光顕微鏡は、物体に照射する光（照明光）の強度と、物体で発生する光（信号光）の強度との関係が線形となる線形光学顕微鏡であるが、近年はその関係が非線形となる非線形光学顕微鏡の研究開発が盛んに行われている。
例えば、二光子励起蛍光顕微鏡（非特許文献１等を参照）は、長い波長の励起光（近赤外線）で蛍光物質を励起するので、被観察物の深部を観察することが可能である。また、明るさを確保するために共焦点絞りを開放しても奥行き方向の分解能が損なわれないという利点もある。
Winfried Denk et al. "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, New Series, Vol. 248, No. 4951(April 6, 1990), pp. 73-76

しかしながら非線型光学顕微鏡では、照明光と対物レンズとの関係により、信号光の検出効率が著しく悪化する可能性のあることがわかった。

そこで本発明は、信号光を確実に高い効率で検出することのできる非線形光学顕微鏡及びその調整方法を提供することを目的とする。

本発明を例示する非線形光学顕微鏡の一態様は、対物レンズが形成する照明光のスポットで物体上を走査する走査手段と、前記照明光との強度関係が非線形な信号光を前記物体上のスポットから検出する検出手段とを備え、前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で前記信号光の強度にピークを与える特定値の近傍に設定されていることを特徴とする。

また、本発明を例示する非線形光学顕微鏡の調整方法の一態様は、対物レンズが形成する照明光のスポットで物体上を走査する走査手段と、前記照明光との強度関係が非線形な信号光を前記物体上のスポットから検出する検出手段とを備えた非線形光学顕微鏡の調整方法であって、前記照明光のパワーが一定という条件下で、前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏと、前記信号光の強度との関係を、前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で調べる計算手順と、前記計算手順で調べた関係に基づき、前記規格化ビーム径φの設定を行う設定手順と、を含むことを特徴とする。

本発明によれば、信号光を確実に高い効率で検出することのできる非線形光学顕微鏡及びその調整方法が実現する。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として二光子励起蛍光顕微鏡装置を説明する。

図１は、本装置の構成図である。図１に示すとおり本装置にはフェムト秒パルスレーザ光源１２と、ビームエキスパンダ１３と、ダイクロイックミラー１５と、１対のガルバノミラー（Ｘ走査鏡、Ｙ走査鏡）を互いの回転軸が直交するように配置したスキャナ１６と、リレー光学系１４と、絞り１７Ａと、対物レンズ１７と、検出部２００と、ステージ１１と、コントロールユニット３０とが備えられる。なお、絞り１７Ａの開口サイズは、対物レンズ１７の瞳と同等のサイズ、又は瞳より若干大きいサイズであって、この絞り１７Ａによって後述する照明光（ここでは励起光）が蹴られることはないものとする。

ステージ１１には標本１０Ａが載置される。標本１０Ａは、蛍光色素により標識された細胞試料である。その蛍光色素の励起波長（一光子励起により励起する波長）は４０５ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍである。また、フェムト秒パルスレーザ光源１２は照明光として、中心波長が８１０ｎｍのフェムト秒パルスレーザ光を例えば１ｋＨｚの周波数で射出する。

フェムト秒パルスレーザ光源１２から射出した照明光（８１０ｎｍの近傍）は、ビームエキスパンダ１３により径の太い光束に変換され、ダイクロイックミラー１５へ入射する。ダイクロイックミラー１５の特性は、波長が８１０ｎｍの近傍である光を反射し、波長が４５０ｎｍの近傍である光を透過する特性に設定されている。よって、レーザユニット１２から射出した照明光はダイクロイックミラー１５を反射し、スキャナ１６、リレー光学系１４、絞り１７Ａ、対物レンズ１７を順に介した後、標本１０Ａに向けて集光する。標本１０Ａにおける照明光の照射領域（レーザスポット）の中央では、蛍光分子が二光子励起され、信号光である蛍光（二光子励起蛍光）を発生させる。なお、レーザスポットのサイズは、対物レンズ１７のＮＡに依存し、そのＮＡが大きいほどレーザスポットのサイズは小さくなるので本装置の空間解像度は高まる。

レーザスポットで発生した二光子励起蛍光（４５０ｎｍの近傍）は、そのレーザスポットを形成した照明光の光路を逆向きに辿り、対物レンズ１７、絞り１７Ａ、リレー光学系１４、スキャナ１６を順に介した後、ダイクロイックミラー１５を透過し、検出部２００へ入射する。なお、検出部２００には、結像レンズ１８と、絞り１９と、レンズ２０と、バンドパスフィルタ２１１と、光電子増倍管（ＰＭＴ）２０１とが備えられる。

検出部２００へ入射した二光子励起蛍光は、結像レンズ１８、絞り１９、レンズ２０、バンドパスフィルタ２１１を順に介してＰＭＴ２０１へ入射する。なお、バンドパスフィルタ２１１の特性は、波長が４５０ｎｍの近傍である光を透過し、他の波長の光を除去する特性に設定されている。よって、その二光子励起蛍光はバンドパスフィルタ２１１を透過し、ＰＭＴ２０１にて電気信号（蛍光量を示す蛍光信号）に変換される。

スキャナ１６が駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上の観察領域内（対物レンズ１７の視野内）を二次元状に走査する。コントロールユニット３０は、レーザスポットが各位置にあるときにＰＭＴ２０１から蛍光信号を読み出し、各位置について読み出された各蛍光信号に基づき観察領域の蛍光画像を作成する（イメージング）。なお、コントロールユニット３０がステージ１１を光軸方向へ上下動させながらイメージングを繰り返せば、標本１０Ａの三次元画像を得ることができる。

ここで、図２に示すとおり、対物レンズ１７に投光される照明光の光束径をφ_ｆとおき、対物レンズ１７の瞳径をφ_ｏとおき、瞳径φ_ｏを基準とした光束径φ_ｆのサイズ（φ_ｆ／φ_ｏ）を、規格化ビーム径φとおく。

但し、対物レンズ１７へ向かう照明光の光束径φ_ｆは、図３に示すとおり、対物レンズ１７へ投光される照明光のうち、光軸上強度Ｉ_ｐのｅ^−２倍以上の強度を有した部分の径である。

以下、規格化ビーム径φが満たすべき条件を説明する。

図４には、規格化ビーム径φと、信号光の強度Ｉ_ｆ（ここでは二光子励起蛍光の強度）との関係を示す特性カーブＣ_１を示した。この特性カーブＣ_１は、本装置の光学設計データに基づくシミュレーションにより得たものであり、シミュレーションの条件は以下のとおりである。

・対物レンズ１７へ向かう照明光の断面強度分布をガウス分布と仮定する。

・対物レンズ１７へ向かう照明光のパワー（レーザ光源のパワー）は一定とする。

・信号光の強度は、対物レンズ１７の焦点位置における照明光の点像振幅分布関数（ＡＳＦ）の４乗に比例すると仮定する（二光子励起蛍光顕微鏡の原理）。

この特性カーブＣ_１から明かなとおり、規格化ビーム径φは、特定値φ_１（≒０．８）であるときに信号光の強度Ｉ_ｆに対してピークを与える。よって、特定値φ_１と同じ値に規格化ビーム径φを設定すれば、本装置における信号光の検出効率を最大にすることができる。なお、このようなピークは、線形光学顕微鏡では発生しない。

図４には、規格化ビーム径φと、光軸に垂直な方向の最小分解距離Δｈとの関係を示す特性カーブＣ_２も示した。また、図４には、規格化ビーム径φと、光軸方向の最小分解距離Δｚとの関係を示す特性カーブＣ_３も示した。これらの特性カーブＣ_２、Ｃ_３も、本装置の光学設計データに基づくシミュレーションにより得たものであり、そのシミュレーションの条件も、前述した条件と同じである。

特性カーブＣ_２、Ｃ_３から明かなとおり、最小分解距離Δｈ、Δｚの各々は、規格化ビーム径φの単調減少関数となる。図４からは、規格化ビーム径φをφ_２（≒１．０）より大きく設定すれば、最小分解距離Δｈ、Δｚの各々が十分に小さくなる（すなわち空間分解能が十分に高くなる）ことがわかる。

そこで、本装置の製造者（又はオペレータ）は、規格化ビーム径φを、特定値φ_１のプラス側の値域であって、しかも信号光の強度Ｉ_ｆをピーク強度の８割以上に維持できる値域φ_１〜φ_３の上限値φ_３（≒１．２）と同じ値に設定する。この上限値φ_３は、本装置の空間分解能を十分に高くすることのできる値域の下限値φ_２より、若干大きい程度である。

したがって、本装置では、空間分解能を十分に高くしつつ、信号光の検出効率を確実に高く（信号光の強度をピーク強度の８割以上に）することができる。

なお、前述したとおり規格化ビーム径φは、対物レンズ１７の瞳径φ_ｏを基準とした照明光の光束径φ_ｆのことなので、規格化ビーム径φの調整は、照明光の光束径φ_ｆの調整、すなわちビームエキスパンダ１３のビーム拡大比の調整によって行うことができる。

［第２実施形態］
次に、本発明の第２実施形態としてハイブリッド型の非線形光学顕微鏡装置を説明する。ここでは第１実施形態との相違点のみ説明する。

図５は、本装置の顕微鏡部分の構成図である。

図５に示すとおり本実施形態の顕微鏡は、二光子励起に加えて、第二高調波発生、コヒーレントアンチストークスラマン散乱の各検出原理が適用されている。

本実施形態の顕微鏡には、２つのレーザ光源１２１、１２２が備えられる。一方のレーザ光源１２１は、二光子励起観察と、第二高調波発生観察と、コヒーレントアンチストークスラマン散乱観察とに兼用されるフェムト秒パルスレーザ光源であり、他方のレーザ光源１２２は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱観察に使用されるレーザ光源である。なお、コヒーレントアンチストークスラマン散乱観察時、レーザ光源１２１はアンチストークス光の光源として使用され、レーザ光源１２２はポンプ光の光源として使用される。

また、本実施形態の顕微鏡には、２つの検出部２００、３００が備えられる。一方の検出部２００は、二光子励起観察と第二高調波発生観察とに兼用される検出部であって、第１実施形態におけるそれと同様の構成をしている。但し、検出部２００内のバンドパスフィルタ２１１は二光子励起観察用のフィルタなので、第二高調波発生観察時には別のバンドパスフィルタ２１１’に交換される。そのバンドパスフィルタ２１１’には、第二高調波を透過し、それ以外の光をカットする機能がある。

また、他方の検出部３００は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱観察に使用される検出部である。検出部３００には、レンズ２４と、ミラー２５と、分光素子２６と、レンズ２７と、遮光部材２８と、レンズ２９と、検出器３０とが配置されている。なお、遮光部材２８には、コヒーレントストークスラマン散乱光を通過させ、それ以外の光を遮光する機能がある。

また、ダイクロイックミラー１５と検出部２００との間にはダイクロイックミラー１５’が配置される。ダイクロイックミラー１５’は、標本１０Ａで発生したコヒーレントストークスラマン散乱光を反射して検出部３００へ導光し、かつ標本１０Ａで発生した二光子励起蛍光及び第二高調波を透過して検出部２００へ導光する。

本実施形態の顕微鏡において、レーザ光源１２１、１２２の双方が駆動されると、ポンプ光とアンチストークス光とが標本１０Ａに照射される。このとき標本１０Ａで発生したコヒーレントストークスラマン散乱光は、検出部３００によって検出される。また、標本１０Ａで発生した第二高調波、二光子励起蛍光は、検出部２００へ入射する。このとき、検出部２００の光路に挿入されるバンドパスフィルタをバンドパスフィルタ２１１の方に設定すれば、検出部２００により二光子励起蛍光を検出することができ、そのバンドパスフィルタをバンドパスフィルタ２１１’の方に設定すれば、検出部２００により第二高調波を検出することができる。

本実施形態においても、第１実施形態と同様、対物レンズ１７の瞳径φ_ｏと照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φは、信号光の強度（ここでは、コヒーレントストークスラマン散乱光、第二高調波、二光子励起蛍光の強度）がピークとなる特定値φ_１の近傍（値域φ_１〜φ_３に属する何れかの値、例えばφ_３）に設定される。

したがって、本実施形態では、コヒーレントストークスラマン散乱光、第二高調波、二光子励起蛍光の各々の検出効率を確実に高くすることができる。

なお、規格化ビーム径φと信号光の強度との関係が、コヒーレントストークスラマン散乱光と、第二高調波と、二光子励起蛍光との間で異なる場合は、ビームエキスパンダ１３としてビーム拡大比が可変の可変ビームエキスパンダを使用し、そのビーム拡大比をオペレータが観察方法に応じて変更すればよい。

［実施形態への補足］
なお、上述した各実施形態では、規格化ビーム径φの値を、信号光の強度Ｉ_ｆをピーク強度の８割以上に維持できるような値域の上限値に設定したが、信号光の強度Ｉ_ｆをピーク強度の９割以上に維持できるような値域の上限値に設定してもよい。さらに言えば、空間分解能と信号光の検出効率とのうち、信号光の検出効率を優先させたい場合には、その割合を大きく想定すればよく、空間分解能を優先させたい場合には、その割合を小さく想定すればよい。但し、その割合が小さすぎると信号光の検出効率が悪化するので、その割合は８割〜１０割の範囲に収まっていることが望ましい。

また、上述した第２実施形態の顕微鏡には、二光子励起、第二高調波発生、コヒーレントアンチストークスラマン散乱の各検出原理が適用されたが、二光子励起、第二高調波発生、コヒーレントストークスラマン散乱の各検出原理が適用された顕微鏡にも本発明は適用可能である。さらに言えば、本発明は、二光子励起、第二高調波発生、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントトークスラマン散乱の少なくとも1つの検出原理が適用された顕微鏡に適用可能である。

また、上述した各実施形態では、落射型の光学顕微鏡を説明したが、透過型の光学顕微鏡にも本発明は適用可能である。

また、上述した各実施形態では、二次の非線形光学顕微鏡を説明したが、本発明は、三次以上の次数の非線形光学顕微鏡にも適用可能である。

［前述した一態様への補足］
なお、前述した非線形光学顕微鏡の一態様において、前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で前記信号光の強度にピークを与える特定値の近傍、かつその特定値より大きい値に設定されてもよい。

また、前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で前記信号光の強度をピーク強度の８割以上にする値に設定されてもよい。

また、前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、０．８≦φ≦１．２の式を満たし、前記光束径φ_ｆは、前記照明光のうち光軸上強度のｅ^−２倍以上の強度を有した部分の径であってもよい。

また、前記信号光の検出原理は、二光子励起、第二高調波発生、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の少なくとも１つであってもよい。

第１実施形態の装置の構成図である。 照明光の光束径φ_ｆ、対物レンズ１７の瞳径φ_ｏの関係を示す図である。 照明光の断面強度分布を示す模式図である。 信号光の強度Ｉ_ｆ、光軸と垂直な方向の最小分解距離Δｈ、光軸方向の最小分解距離Δｚと、規格化ビーム径φとの関係を示す特性カーブである。 第２実施形態の装置の顕微鏡部分の構成図である。

符号の説明

１２…フェムト秒パルスレーザ光源、１４…リレー光学系、１５…ダイクロイックミラー、１６…スキャナ、１７…対物レンズ、１７Ａ…絞り、１８…結像レンズ、１９…絞り、２０…レンズ、２１１…バンドパスフィルタ、２０１…光電子増倍管（ＰＭＴ）、１１…ステージ、３０…コントロールユニット

Claims (6)

1. 対物レンズが形成する照明光のスポットで物体上を走査する走査手段と、
   前記照明光との強度関係が非線形な信号光を前記物体上のスポットから検出する検出手段とを備え、
   前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、
   前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で前記信号光の強度にピークを与える特定値の近傍に設定されている
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
2. 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、
   前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で前記信号光の強度にピークを与える特定値の近傍、かつその特定値より大きい値に設定されている
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
3. 請求項２に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、
   前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で前記信号光の強度をピーク強度の８割以上にする値に設定されている
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
4. 請求項３に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏは、
   ０．８≦φ≦１．２の式を満たす。
   但し、前記光束径φ_ｆは、前記照明光のうち光軸上強度のｅ^−２倍以上の強度を有した部分の径である
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
5. 請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の非線形光学顕微鏡において、
   前記信号光の検出原理は、
   二光子励起、第二高調波発生、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱
   の少なくとも１つであることを特徴とする非線形光学顕微鏡。
6. 対物レンズが形成する照明光のスポットで物体上を走査する走査手段と、
   前記照明光との強度関係が非線形な信号光を前記物体上のスポットから検出する検出手段とを備えた非線形光学顕微鏡の調整方法であって、
   前記照明光のパワーが一定という条件下で、前記対物レンズの瞳径φ_ｏと前記対物レンズへ投光される照明光の光束径φ_ｆとの比である規格化ビーム径φ＝φ_ｆ／φ_ｏと、前記信号光の強度との関係を、前記対物レンズへ向かう照明光のパワーが一定という条件下で調べる計算手順と、
   前記計算手順で調べた関係に基づき、前記規格化ビーム径φの設定を行う設定手順と、
   を含むことを特徴とする非線形光学顕微鏡の調整方法。

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