CN1193220C - 生物体组织染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用稀土荧光络合物使生物组织染色的方法。本发明所用染色试剂为一类稀土荧光络合物溶液，将之滴到生物组织上或将试样浸泡在染色剂稀土荧光络合物溶液中0.5-3分钟，然后用蒸馏水冲洗，在紫外光激发下，用荧光显微镜可以观察到已着色的组织试样的形态和结构细节。本发明方法操作简单方便，样品不需要预处理，省时间，用此方法整个过程不超过5分钟；色彩鲜艳，轮廓清晰；所用的生物样品不受种类、起源的限制；试剂无毒性或毒性极微弱，染色过程对细胞或组织的原有结构无任何影响；染色过程不受离体组织或在体组织的限制。可广泛应用于分子生物学、组织切片病理研究、医学鉴定、卫生防疫等领域。
Description
技术领域：
本发明涉及一种生物体组织染色方法，尤其涉及一种利用稀土荧光络合物作为染色剂进行尘物体组织染色的方法。
背景技术：
从人们发现构成人体的细胞后，对以人体为代表的生物体的微观结构的了解，一直是重要的研究领域。利用化学物质使细胞或组织染色是一种重要的研究手段，从以苏木精(Hematpxylin)和伊红(Epsin)染色(简称HE)为代表的组化染色到单克隆抗体标记的免疫组化染色，大大地提高了分辨能力，同时，也拓宽了观察水平，随着荧光试剂和荧光观察仪的发展，荧光组化，免疫荧光染色，以其特有的色彩被广泛地应用于生命科学的研究领域，并成为热门的研究课题。然而传统的染色方法的缺陷是，步骤烦琐、费时，而且，样品常常需要经过特殊处理；另外染色试剂毒性较大，一般不适于活体组织染色。
发明内容：
本发明的目的是提供一种步骤简单、省时，染色剂无毒或毒性极弱的快速染色方法，并可用于活体或离体组织的染色。
本发明的生物体组织染色方法，其步骤包括
1)在生物体组织试样上滴加、涂抹、喷涂或注射染色剂溶液，或将生物体组织试样浸泡于染色剂溶液中0.5-3分钟；
所述染色剂溶液为浓度1-50毫克/升的稀土荧光络合物溶液，该溶液溶剂选自水、乙醇、四氢呋喃、氯仿、苯或庚烷或者它们的混合物；所述稀土荧光络合物中的稀土元素选自铕或铽，其配体选自：
①二元配体，其中一种配体选自β-二酮类，包括乙酰丙酮、噻吩甲酰基三氟丙酮，另一种配体选自三苯基氧化膦、邻菲咯呤、吡啶、联吡啶或其取代基为C2-C5的烷基或苯基的取代物；
或②吡啶，或联吡啶，或者其取代基为C2-C5的烷基或苯基的取代物；
或③有机羧酸类及其取代物，取代基包括C2-C5的烷基、苯基或酰氧基；
或④取代的喹啉酮类，包括氧氟沙星，环丙沙星，或氟哌酸；
或⑤膦氧化物类，包括烷基膦氧化物、苯基膦氧化物或其一元或者多元取代的膦氧化物。
2)清洗生物体组织试样；
3)在紫外光激发下观察生物体组织试样。
本发明的生物体试样可以为人体的活体组织或离体组织，核酸、蛋白质、磷脂等大分子。
下列染色剂与生物体组织试样的搭配效果更好：
染色剂为铕-噻吩甲酰基-三苯基氧化膦，生物体组织试样为磷脂。
染色剂为铽-环丙沙星，生物体组织试样为粘蛋白核苷酸钠。
染色剂为铕-氧氟沙星，或铽-乙酰水杨酸，生物体组织试样为核苷酸钠。
染色剂为铽-乙酰水杨酸，或铕-氧氟沙星，生物体组织试样为乳腺组织。
染色剂为铕-氧氟沙星，或铽-环丙沙星，生物体组织试样为肺癌组织。
染色剂为铽-环丙沙星，生物体组织试样为乳腺癌组织。
染色剂为铽-环丙沙星，生物体组织试样为涎腺上皮组织切片。
染色剂为铕-氟哌酸，生物体组织试样为口腔内腺泡结构组织切片。
本发明的稀土荧光络合物具有特异染色性能的荧光络合物，其可以与核酸、蛋白质或磷脂等生物大分子作用，而产生很好的特征性的染色效果，在紫外光激发下，用荧光显微镜，可以看到组织分子的形态和结构细节(如图1、2、3所示)，并对不同的细胞和组织显示不同的着色效果。采用这类络合物进行生物组织染色，观察所得的结果与用传统的HE染色法观察到的结果较为一致。从而可以对细胞、组织的生理和病理状态及其结构正常或异常做出判断。
本发明通过在组织试样上滴加、涂抹、喷涂或注射染色剂溶液，或将之在上述溶液中浸泡0.5-3分钟，然后用蒸馏水冲洗试样，样品已着色。在紫外光的激发下，即可呈现出绿色、红色、橙色或蓝色的多种颜色。在双染色时，按照上述步骤分别依次进行。染色后的样品在紫外光激发下，用荧光显微镜、内窥镜或肉眼观察染色的组织结构，可确定组织的正常与否。
本发明方法的优异特点：
(1)本发明方法操作简单方便，样品不需要预处理，省时间，色彩鲜艳，轮廓清晰，为尽快得出生物组织是否发生病变的结论，创造了可靠的依据。
(2)实施本发明方法，所用的生物样品不受种类、起源的限制，从细菌、病毒到高等生物的细胞组织，都能发生染色作用。
(3)染色过程试剂无毒性或毒性极微弱，对细胞或组织的原有结构无任何影响。
(4)染色过程不受离体组织或在体组织的限制。
除了前述的通过对细胞、生物大分子或生物组织的染色确定其是否正常外，还可以通过本发明染色方法研究细胞或组织的生理功能、形态结构和微观状态的特征，同时，也能用于观察或研究亚细胞水平和生物大分子水平的生理和病理过程。由于本发明方法中所用试剂的荧光特性，它能作用于细胞或组织的光敏部位或相关的物质，从而产生中断病理过程的作用。总之，本发明方法可应用于分子生物学、组织切片病理研究、医学鉴定、卫生防疫等领域。
附图说明：
图1为磷脂染色后在紫外光下出现红紫色团块。
图2粘蛋白染色后在紫外光下出现亮绿色。
图3核甘酸纳染色后在紫外光下出现城红色。
图4乳腺组织的血管壁染色后在紫外光下出现亮绿色。
图5肺癌组织的细胞核染色后在紫外光下出现亮绿色。
图6乳腺癌周酸织腺上皮染色后在紫外光下出现绿色荧光。
图7(A)涎腺上皮组织切片经HE染色，用普通光学显微镜观察，看到的图形。
(B)涎腺上皮组织切片经络合物铽-环沙星染色，在紫外光的激发下，用荧光显微镜观察到的图形。
图8(A)口腔内腺泡结构组织切片经嗜伊红染色，用普通光学显微镜观察，所见到的图形。
(B)口腔内腺泡结构组织切片经络合物铕-氟哌酸染色，在紫外光的激发下，用荧光显微镜观察，所看到的图形。
具体实施方式：
为了更清楚地说明本发明，列出下列实施例，但其对本发明的范围无任何限制。
实施例1
将荧光络合物铕-噻吩甲酰三氟丙酮-三苯基氧化膦配制成5毫克/升的乙醇溶液，将之滴加到磷脂上，一分钟后，用蒸馏水冲洗，然后用荧光显微镜观察，磷脂着色成紫色团块状，如图1所示。
实施例2
用类似实施例1的方法，以浓度为1毫克/升的铽-环丙沙星溶液使粘蛋白染色，时间为3分钟，在紫外光激发下，出现亮绿色荧光，如图2所示。
实施例3
用类似实施例1的方法，以浓度为10毫克/升的铽-氧氟沙星溶液使核苷酸钠染色，染色3分钟，在紫外光激发下，出现亮红色的荧光图形，如图3所示。
实施例4
用类似实施例1的方法，以浓度为50毫克/升的铽-乙酰水杨酸溶液使乳腺组织切片染色，染色时间0.5分钟，在紫外光激发下，血管内皮细胞呈现出的亮绿色荧光图形，如图4所示。
实施例5
用类似实施1的方法，以浓度为30毫克/升的铕-氧氟沙星溶液使肺癌组织切片染色1分钟，在紫外光激发下，细胞核出现亮红色荧光，如图5所示。
实施例6
用类似实施例1的方法，以浓度为40毫克/升的铽-环丙沙星溶液使乳腺癌组织切片染色，染色时间1分钟，在紫外光激发下，上皮组织呈现出的亮绿色的荧光图形，如图6所示。
实施例7
采用涎腺上皮组织切片，用HE染色法染色，以普通光学显微镜观察，获得如图7(A)所示的图象，其中深紫色的颗粒为苏木精结晶。而上述组织切片用类似实施例1的方法，以浓度为20毫克/升的稀土络合物铽-环沙星溶液染色1.5分钟，在紫外光激发下，用荧光显微镜观察，其细胞核呈亮绿色，如图7(B)所示。比较两种染色方法，其所获得的组织形态是一致的。
实施例8
将口腔内腺泡结构组织切片用嗜伊红染色，用普通光学显微镜观察，所获得的图形，如图8(A)所示；将上述组织切片用类似实施例1的方法，以浓度为5毫克/升的络合物铕-氟哌酸溶液染色3分钟，在紫外光激发下，用荧光显微镜观察，观察到的图形如图8(B)所示。其中箭头所示的部分为腺泡结构，比较两种染色法，其所显示的组织中的管状结构是一致的，只是颜色深浅不同。
Claims (10)
1、一种生物体组织染色方法，其步骤包括
1)在生物体离体组织试样上滴加、涂抹、喷涂或注射染色剂溶液，或将生物体组织试样浸泡于染色剂溶液中0.5-3分钟；
2)清洗生物体离体组织试样；
3)在紫外光激发下观察生物体离体组织试样；
其特征在于
所述染色剂溶液为浓度1-50毫克/升的稀土荧光络合物溶液，该溶液溶剂选自水、乙醇、四氢呋喃、氯仿、苯或庚烷或者它们的混合物；所述稀土荧光络合物中的稀土元素选自铕或铽，其配体选自：
①二元配体，其中一种配体选自乙酰丙酮、噻吩甲酰基三氟丙酮的β-二酮类，另一种配体选自三苯基氧化膦、邻菲咯呤、吡啶、联吡啶或其取代基为C2-C5的烷基或苯基的取代物；
或②吡啶，或联吡啶，或者其取代基为C2-C5的烷基或苯基的取代物；
或③有机羧酸及其取代物，取代基包括C2-C5的烷基、苯基或酰氧基；
或④氧氟沙星，环丙沙星，或氟哌酸的取代的喹啉酮；
或⑤烷基膦氧化物、苯基膦氧化物或其一元或者多元取代的膦氧化物的膦氧化物。
2、如权利要求1所述的生物体组织染色方法，其特征在于所述生物体离体组织试样选自人体的离体组织，核酸、蛋白质、磷脂等大分子。
3、如权利要求2所述的生物体组织染色方法，其特征在于所述染色剂为铕-噻吩甲酰基-三苯基氧化膦，生物体组织试样为磷脂。
4、如权利要求2所述的生物体组织染色方法，其特征在于所述染色剂为铽-环丙沙星，生物体组织试样为粘蛋白核苷酸钠。
5、如权利要求2所述的生物体组织染色方法，其特征在于所述染色剂为铽-氧氟沙星，生物体组织试样为核苷酸钠。
6、如权利要求2所述的生物体组织染色方法，其特征所述的染色剂为铽-乙酰水杨酸，生物体组织试样为乳腺组织。
7、如权利要求2所述的生物体组织染色方法，其特征在于所述的染色剂为铕-氧氟沙星，生物体组织试样为肺癌组织。
8、如权利要求2所述的生物体组织染色方法，其特征在于所述的染色剂为铽-环丙沙星，生物体组织试样为乳腺癌组织。
9、如权利要求2所述的生物体组织染色方法，其特征在于所述的染色剂为铽-环丙沙星，生物体组织试样为涎腺上皮组织切片。
10、如权利要求2所述的生物体组织染色方法，其特征在于所述的染色剂为铕-氟哌酸，生物体组织试样为口腔内腺泡结构组织切片。
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