WO2006123967A2 - Procede de nanoscopie par fluorescence - Google Patents

Procede de nanoscopie par fluorescence Download PDF

Info

Publication number
WO2006123967A2
WO2006123967A2 PCT/RU2006/000231 RU2006000231W WO2006123967A2 WO 2006123967 A2 WO2006123967 A2 WO 2006123967A2 RU 2006000231 W RU2006000231 W RU 2006000231W WO 2006123967 A2 WO2006123967 A2 WO 2006123967A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fluorescent
molecules
fluorescence
frames
spots
Prior art date
Application number
PCT/RU2006/000231
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2006123967A3 (fr
Inventor
Andrey Alexeevich Klimov
Dmitry Andreevich Klimov
Evgeniy Andreevich Klimov
Tatiana Vitalyevna Klimova
Original Assignee
Andrey Alexeevich Klimov
Dmitry Andreevich Klimov
Evgeniy Andreevich Klimov
Tatiana Vitalyevna Klimova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37431689&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2006123967(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority to EP06757947A priority Critical patent/EP1892517A4/en
Priority to CA002648777A priority patent/CA2648777A1/en
Priority to CN2006800264573A priority patent/CN101228428B/zh
Priority to US11/920,661 priority patent/US7803634B2/en
Priority to JP2008512241A priority patent/JP5065256B2/ja
Application filed by Andrey Alexeevich Klimov, Dmitry Andreevich Klimov, Evgeniy Andreevich Klimov, Tatiana Vitalyevna Klimova filed Critical Andrey Alexeevich Klimov
Publication of WO2006123967A2 publication Critical patent/WO2006123967A2/ru
Publication of WO2006123967A3 publication Critical patent/WO2006123967A3/ru
Priority to US12/891,420 priority patent/US8110405B2/en
Priority to US13/366,813 priority patent/US8334143B2/en
Priority to US13/714,609 priority patent/US8668872B2/en
Priority to US14/155,979 priority patent/US9028757B2/en
Priority to US14/710,214 priority patent/US20150316478A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N13/00—Stereoscopic video systems; Multi-view video systems; Details thereof
    • H04N13/20—Image signal generators
    • H04N13/275—Image signal generators from 3D object models, e.g. computer-generated stereoscopic image signals
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N7/00—Television systems
    • H04N7/18—Closed-circuit television [CCTV] systems, i.e. systems in which the video signal is not broadcast
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/84—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/84—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure
    • Y10S977/849—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure with scanning probe
    • Y10S977/86—Scanning probe structure
    • Y10S977/868—Scanning probe structure with optical means
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/84—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure
    • Y10S977/849—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure with scanning probe
    • Y10S977/86—Scanning probe structure
    • Y10S977/868—Scanning probe structure with optical means
    • Y10S977/869—Optical microscope
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/84—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure
    • Y10S977/88—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure with arrangement, process, or apparatus for testing
    • Y10S977/881—Microscopy or spectroscopy, e.g. sem, tem
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation

Definitions

  • the invention relates to equipment for scientific research, in particular to lens fluorescence microscopes designed to obtain images of fluorescent objects immobilized on glass, more specifically, to a fluorescence-microscopic computerized method for reconstructing images of objects with a resolution of up to several nanometers (nm).
  • various design devices are used for fluorescence microscopy using lenses, in which a powerful arc lamp, an incandescent lamp, a laser, or sunlight is used as a light source.
  • Fluorescence is excited immediately in all dye molecules in the illuminated zone, either through the lens using a dividing dichroic mirror that transmits exciting light to the object and reflects fluorescence light onto the recorder, or from the side using lasers that illuminate the object to the full depth or through a glass slide at an angle of full internal reflection. In the latter case, light penetrates to a depth of less than 0.3 of the light wavelength through the boundary between the glass and an object having a lower refractive index of light than glass.
  • the fluorescence light of the object is collected by the lens, which transmits the image of the object for visual observation and registration using a photomultiplier, film or digital video camera.
  • the main drawback of all the lens microscopes created so far is the presence of a resolution limit of two neighboring points, calculated by the formula (1).
  • a device in which the fluorescence of an object is excited by a laser through an opening in the end of a glass fiber moved by motors in three directions so that the end of the fiber is near a surface that reflects, diffuses or is coated with fluorescent molecules.
  • this lensless model of a microscope it is possible to obtain an image with a resolution that is an order of magnitude higher than that achieved with conventional optical microscopes if the window at the end of the fiberglass has a diameter much smaller than the light wavelength. Light penetrates through such a window into an object to a depth much shorter than the length of the light wave, and returns to fiberglass almost completely except for the part of it that will be intercepted by objects outside the window.
  • the intensity of fluorescence, light scattering, or reflected light intercepted in the region of the object close to the window is measured using a photomultiplier and the surface image of the object is reconstructed using a computer that collects information about the intensity of the measured light and the coordinates of the end of the fiberglass.
  • the main disadvantages of this system are: the need to use expensive high-precision and high-speed mechanical units responsible for moving the end of the fiberglass in relation to the object; the process of manufacturing fiberglass with a window at the end with a diameter of less than
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 50 nm turned out to be very expensive, difficult and poorly reproducible; the window at the end of the fiberglass is easily contaminated and after that cannot approach the surface of the object; only an insignificant part of the light is able to exit out of the fiberglass to the near field region through a window with a diameter much shorter than the wavelength of light, and an increase in the intensity of light introduced into the fiberglass can cause local heating of the end of the fiberglass and its destruction; it is impossible to register fluorescence in areas of the object inaccessible to the end of the fiberglass; only one point can be recorded at each moment of time and the surface scanning speed does not exceed Imkm 2 / min.
  • Microsores Eptherte Napo Age The hybrid system is beiipg devalued so it is apd teasure féture s staler thap wavelef visible light ".
  • the article only says that using this technique it is possible to detect a nanoparticle 40 nm in size; there are no references to the two experiments already made, the authors managed to At a distance of less than 40 nm from each other. According to the figures and descriptions given by the authors, it is unclear how the proposed method will allow to observe the images of two particles located at a distance r ⁇ O.bl ⁇ / A separately and, in our opinion, the device proposed by the authors could not t reach resolution of object details, located at a distance much smaller than the wavelength of light.
  • the closest analogue of the present invention can be the method of using a conventional fluorescence microscope (Erwen, 'A Sharopov, JH Ferris, RM Noschstrasser: Direst visulizator opt nanopatterns imagelp. polymer film with empty open spherical cells with a diameter of 1 ⁇ m - stained with a solution of fluorescent protein in a very low concentration, allowing you to see separately the protein molecules that can move in Brownian motion inside hollow microspheres.
  • the sample is illuminated through a glass slide at an angle of total internal reflection by a laser beam that excites fluorescence in an object layer 150-200 nm thick near the glass.
  • the specificity of studying biological objects, such as muscles, is the presence of many completely different types of molecules located at a distance significantly less than the resolution of conventional optical microscopes, in which an enlarged image of an object is built using an objective in the plane of the recorder — an eye, a camera, or a video camera.
  • the diffraction limit of the resolution of the microscope limits the resolution both in microscopes with simultaneous observation of all points in the field of view, and in microscopes with sequential viewing of points of an object using a beam of light focused at one point (confocal and other scanning lens microscopes).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • the objective of the present invention is to develop methods for staining objects, their preparation for research, computer processing of the results, allowing to obtain an image of objects with a resolution better than 20 nm, as a result of which the fluorescence microscope turns into a “nanoscope”.
  • a fluorescence nanoscope can be based on standard designs used in fluorescence microscopy.
  • an optical system for visual observation and projection of the image of the sample on a digital video camera capable of recording and digitizing images of single fluorescent molecules and nanoparticles with a low noise level
  • computer for recording and image processing
  • sample holder located opposite the lens
  • a set of interchangeable locking light filters to highlight the fluorescence light of the sample
  • two light sources mounted to the side of the sample holder and at an angle to it, while the angle of installation of the sources is selected from the condition of providing illumination either over the entire depth of the cut of the sample, or in an object layer less than 150 nm thick adjacent to the glass, where fluorescent molecules can absorb the energy of light waves penetrating the border when illuminated at an angle of total internal reflection.
  • the object to be observed should be pre-stained in a solution with a saturating concentration of a “cool dye”) (cased dHomme Mel), which begins to fluoresce only after the UV light pulse tears off the fluorescence groups from the dye molecules. Excess dye must be thoroughly washed. For objects studied directly in a fresh washing solution, it is difficult to ensure the immobility of their molecular structures for a long time away from the prism glass and coverslip between which the object is clamped; therefore, the best resolution of the nanoscope can be obtained only for those layers of the object
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) which are separated from the prism glass no further than 150 nm — the depth at which light penetrates into the object, incident on the interface at an angle of total internal reflection.
  • RULE 26 SUBSTITUTE SHEET
  • the slots at the edges of the glass must be hermetically sealed (for example, with paraffin).
  • the object For three-dimensional nanoscopy, it is necessary to ensure complete immobility of the object and its parts relative to the lens, therefore, after painting with “caged” dye and washing, the object must be passed through dehydration solutions, enclosed in non-fluorescent polymeric medium (for example, epoxy resin) and its slices up to several microns can be used for three-dimensional reconstruction of an object with a resolution of up to 10-20 nm in all three coordinates.
  • non-fluorescent polymeric medium for example, epoxy resin
  • Such an object in the solid phase can be illuminated as is customary in conventional fluorescence microscopy, with the improvement that an additional flash lamp should be used to convert several hundred non-fluorescent dye molecules into fluorescent ones in each frame.
  • a UV flash with ⁇ ⁇ 360 nm periodically illuminates an object stained with non-fluorescent molecules and each time turns several hundred (or even thousands) of molecules in the field of view into fluorescent ones due to the photolysis of special blocking the fluorescence of chemical groups, and the laser illuminates the object constantly and excites the fluorescence of the newly formed fluorescent molecules with such intensity that each of them will emit several tens of thousands of light quanta in fractions of a second rows and discolor right after its fluorescence registration on digitized frame with low noise.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) and calculate the position of all tens of millions of fluorescent molecules covering the surfaces of structures in sight.
  • dyes with various active groups that bind either to proteins, or to nucleic acids, or to fats, etc. can be used to color the structures of various nature.
  • the suggested name of the method is “color nanoscopy”).
  • the second modification of the nanoscopy method is based on the fact that within a significant part of the volume of a biological sample with perforated membranes filled with a solution of salts, Brownian motion is possible for very brightly fluorescent and bleaching-resistant nanoparticles (phycobiliprotein molecules or fluorescent microspheres with a diameter of 10-40 nm), which can additionally regulated by electrophoresis by the current supplied through several alternating pairs of electrodes so that the current directs the movement of particles in different directions niyah and the particles thus scanned all available space.
  • nanoparticles phycobiliprotein molecules or fluorescent microspheres with a diameter of 10-40 nm
  • Both proposed methods are capable of providing a resolution of the nanoscope up to several nanometers, depending not on the resolution limit (f-la 1), but
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) from the internal mobility of the structures in the observed part of the object for a long time and the signal-to-noise ratio in the video signal, which can be regulated using various modifications of the above methods.
  • a number of image parameters of fluorescent particles can change as the particle moves away from the focal plane of the microscope objective, therefore, it is proposed to calculate these parameters in order to calculate the third coordinate of the position of the luminous particles.
  • the distribution of the fluorescence light intensity for each particle will differ when registered through different cameras and can be calibrated depending on the third coordinate and used to construct a three-dimensional image of objects.
  • FIG. 3 An illustration of the principle of three-dimensional nanoscopy.
  • the diameter and intensity of the spots from the fluorescent particles projected onto the CCD depends on the distance between the particle and the lens. Two cameras focused on different focal planes reproduce the same particle with different diameters and intensity distribution along the diameter. The diagrams in the upper right corner of the figure illustrate the difference between the diameters and the intensity distribution along the diameters, depending on the position of the cameras and fluorescent particles.
  • the nanoscope will help determine the position of the centers of spots created by fluorescent particles at two to three different wavelengths under the same excitation. In practice, this can be done using beam splitting dichroic mirrors that transmit light at one wavelength to one of the cameras and reflect light with a different wavelength to another camera. In accordance with the foregoing, in the present invention, the position of several
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of different types of object molecules stained with dyes with different radiation wavelengths and the number of spots visible from and recorded separately from fluorescent particles can be multiplied, since they can be seen separately at different wavelengths, even if the corresponding spots of different colors are visible overlapping.
  • the fluorescent molecules obtained as a result of such modifications can be excited with a laser and recorded using the same video cameras that are used to calculate the coordinates of the surface of the object’s structures as described previously, their coordinates can be defined as the calculated centers of the corresponding spots on the video frames, and then “Overlay” their image on the object reconstructed previously by the methods described as the position of the reactive groups of the same object with a resolution better than 20 nm.
  • the operation of the device in the nanoscope mode can be alternated using a fluorescence microscope in the usual mode with the possibility of direct visual observation of the object in real time at normal resolution (f-la 1), the ability to register images using an ultra-high sensitivity digital video camera in the computer's memory in order to process frames for measuring geometric parameters and light intensity in different places of the frame, for example, in bioluminescent and chemiluminescent studies.
  • the drawings show a modification of a fluorescence microscope for implementing the nanoscopy method according to this invention.
  • a fluorescence microscope-nanoscope as shown in figures 1 and 2, has: one (Fig. 1) or two (Fig. 2) monochrome video cameras 1 with digital video output and blocking light filters in front of their sensors (CCD), passing only
  • the installation should be placed in a soundproof cabinet installed on an anti-vibration table.
  • a device for supplying electrical voltage to electrophoretic electrodes that control the movement of mobile fluorescent nanoparticles inside an object filled with saline will be described separately.
  • the area illuminated by the laser with its lens system on the object should be slightly larger than 80 ⁇ m x 80 ⁇ m, with each CCD pixel corresponding to an area of the object measuring 80 nm x 80 nm.
  • At least 40 x 40 1600 spots can be simultaneously projected onto the CCD in each frame so that almost all of them will be visible separately.
  • various methods can be used. First, you can paint the object with brightly fluorescent particles at a fairly low
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) concentration so that they can be displaced in the field of view under the influence of Brownian forces and can be additionally moved by electrophoresis by the current supplied through several alternating pairs of electrodes so that the current directs the movement of particles in different directions.
  • the object can be painted with special dyes such as 5-carboxyfluoxypecine-bis- (5-carboxymexoxy-2-nitrobenzyl) ether, beta-alanine-carboxamide, succinimidyl ether, cerbulosorbel, or cerbosulfur, USA.
  • This dye does not absorb laser light and does not fade until it contains fluorescence-blocking groups; therefore, it is possible to repeat the same process cyclically tens of thousands of times: first, the CCD registers the image of the object with residual fluorescence, digitizes it in a video camera, and transfers it to a computer, then a UV flash creates 1000-1600 fluorescent molecules in the field of view, the laser excites fluorescence in them, the CCD records an image of fluorescent molecules and particles superimposed on the residual fluor stsentsiyu, the image is digitized in video camera and transmitted to the computer, where it is subtracted from the previous frame from the residual fluorescence.
  • the resulting difference frame is stored in the computer memory for further processing in order to calculate the coordinates of the center of the spot, its average diameter and intensity.
  • the object is illuminated by a laser without registering an image to completely discolor already registered molecules and the cycle repeats. In each cycle, all new fluorescent molecules will be created, registered and discolored until the coordinates
  • the cameras indicated in the example allow you to record images of individual fluorescent molecules with a good signal-to-noise ratio at a frequency of up to 10 frames per second, therefore, in principle, it is possible to register for several hours, for example, 40,000 frames containing each up to 1600 molecular images. Then the total number of registered coordinates of fluorescent molecules can reach 64 million, and the average distance between separately visible molecules can be only 10 nm, which is ten times better than in any other lens microscopes.
  • frames with their images should be saved in a format without compression or with compression without loss of information. Even if all frames are saved without compression, the total amount of memory for recording them in one experiment can reach tens of gigabytes, which is quite feasible with modern computer hard drives.
  • Various algorithms for calculating the centers of spots are described in the literature and we have written a computer program for such calculations and reconstruction of a complete image based on the coordinate table of the calculated centers of spots.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Description

СПОСОБ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ НАНОСКОПИИ
Изобретение относится к оборудованию для научных исследований, в частности к линзовым флуоресцентным микроскопам, предназначенным для получения изображения иммобилизованных на стекле флуоресцирующих объектов, точнее к флуоресцентно-микроскопическому компьютеризованному способу реконструкции изображения объектов с разрешением до нескольких нанометров (нм).
Известны оптические микроскопы, производящие увеличенное изображение объекта с помощью линзовых объективов, которые могут воспроизвести изображения двух соседних точек объекта порознь только тогда, когда расстояние между ними превышает так называемый дифракционный предел, определяемый по формуле r=0.61λ/A (1), где λ - длина волны света, собираемого объективом с апертурой A=n*sin(φ), п - показатель преломления света для среды окружающей рассматриваемые точки, φ - угол между осью объектива и крайними лучами, улавливаемыми объективом и проходящими к регистратору. В настоящее время для флуоресцентной микроскопии с использованием линзовых объективов применяются различные по конструкции устройства, в которых источником света служит мощная дуговая лампа, лампа накаливания, лазер или солнечный свет. Флуоресценция возбуждается сразу во всех имеющихся в освещенной зоне молекулах красителя либо через объектив с использованием светоделительного дихроичного зеркала, пропускающего возбуждающий свет на объект и отражающего флуоресцентный свет на регистратор, либо сбоку с помощью лазеров, освещающих объект на всю глубину или через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения. В последнем случае свет проникает на глубину менее 0,3 длины световой волны через границу между стеклом и объектом, имеющим меньший показатель преломления света, чем стекло. Свет флуоресценции объекта собирается объективом, который передает изображение объекта для визуального наблюдения и регистрации с помощью фотоумножителя, фотопленки или цифровой видеокамеры. Основным недостатком всех созданных до сих пор линзовых микроскопов является наличие предела разрешения двух соседних точек, вычисляемого по формуле (1).
Объявлено о зарождении микроскопии с использованием суперлинз из пленки серебра толщиной менее 50 нм, способных обеспечить разрешение двух точек, находящихся на расстоянии около 50 нм (N. Fang and X. Zhапg, Imаgiпg рrореrtiеs оf а mеtаmаtеriаl suреrlепs, 2003, Арр Рhуs Lеt v. 82, 2, 161-163; Niсhоlаs Fапg, Zhаоwеi Liu,
1
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Ta-Jen Yеп, and Xiang Zhang Regenerating еvапеsсепt wаvеs frоm а silvеrsuреrlепs, 2003, OPTICS EXPRESS5 VoI. 11, No. 7, 682-687). Перспективы применения таких микроскопов для биологических объектов пока неясны, достигнутое разрешение у построенного образца в несколько раз хуже, чем у предлагаемого нами устройства.
Известны устройства с предельным разрешением лучше 1 нм, например электронные, туннельные и силовые микроскопы. Следует заметить, что они обладают наряду с очевидными достоинствами и существенными недостатками: сложность и дороговизна их устройства и работы с объектами; невозможность получения цветного изображения для того, чтобы различить разнотипные молекулы; объекты, обычно, должны быть высушены и обработаны веществами, изменяющими взаимное положение деталей объекта. В силовом и туннельном микроскопе, кроме того, невозможно регистрировать структуры в глубине объекта; лишь одна точка может регистрироваться в каждый момент времени, и скорость сканирования не превышает lмкм /мин; конец иглы легко загрязняется и после этого не может приблизиться к поверхности объекта.
Известно также устройство, в котором возбуждение флуоресценции объекта осуществляют лазером через отверстие в торце стеклянного волокна, передвигаемого моторами в трех направлениях так, чтобы конец волокна оказался вблизи светоотражающей, светорассеивающей или покрытой флуоресцирующими молекулами поверхности. В этой безлинзовой модели микроскопа удается получать изображение с- разрешением, на порядок превосходящим достигаемое в обычных оптических микроскопах, если окошко на конце стекловолокна имеет диаметр намного меньше длины световой волны. Свет проникает через такое окошко в объект на глубину много меньшую, чем длина световой волны, и возвращается в стекловолокно почти полностью за исключением той его части, которую перехватят объекты снаружи от окошка. Интенсивность флуоресценции, светорассеивания или отраженного света, перехваченного в близкой к окошку области объекта, измеряют с помощью фотоумножителя и реконстрируют изображение поверхности объекта с помощью компьютера, собирающего информацию об интенсивности измеренного света и координатах конца стекловолокна. Основными недостатками этой системы являются: необходимость применения дорогих высокоточных и быстродействующих механических узлов, отвечающих за перемещение конца стекловолокна по отношению к объекту; процесс изготовления стекловолокна с окошком на конце диаметром менее
2
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 50 нм оказался очень дорогим, трудным и плохо воспроизводимым; окошко на конце стекловолокна легко загрязняется и после этого не может приблизиться к поверхности объекта; лишь ничтожная часть света способна выйти наружу из стекловолокна в область ближнего поля через окошко с диаметром много меньшим длины волны света, а увеличение интенсивности вводимого в стекловолокно света может вызвать локальное нагревание конца стекловолокна и его разрушение; невозможно регистрировать флуоресценцию в областях объекта, недоступных для конца стекловолокна; лишь одна точка может регистрироваться в каждый момент времени и скорость сканирования поверхности не превышает Iмкм2/мин.
Описан еще один тип нового микроскопа, сканирующего поверхность объекта одновременно с помощью нескольких световых пучков, для 5-летних исследований которого выделен грант в National Institute of Standards and Technology (NIST)5 http://wvyw.betterhшnansxom/News/news.aspx?articleID=2005-02- 11 -4, "Орtiсаl
Мiсrоsсореs Епtеr thе Nапо Аgе. Нуbrid sуstет bеiпg dеvеlореd tо iтаgе апd теаsurе fеаturеs sтаllеr thап thе wаvеlепgth оf visiblе light". В статье говорится лишь о том, что с помощью данной методики можно обнаружить наночастицу размером 40 нм; нет упоминаний, удавалось ли авторам в уже проведенных экспериментах различить две частицы на расстоянии менее 40 нм друг от друга. По приведенным авторами рисункам и описаниям неясно, как предлагаемая методика позволит наблюдать изображения двух частиц, находящихся на расстоянии r< О.бlλ/А раздельно и, по нашему мнению, предлагаемое авторами устройство не сможет достичь разрешения деталей объекта, находящихся на расстоянии много меньшем длины световой волны.
Наиболее близким аналогом данного изобретения может служить метод использования обычного флуоресцентного микроскопа (Erwen,'A Shаrопоv, JH Fеrris, RM Носhstrаssеr: Dirесt visuаlizаtiоп оf nanopatterns bу siпglе-mоlесulе imаgiпg. Арр Рhуs Lеt 2005, 86: 043102), в котором образец - тонкая пленка полимера с пустыми открытыми сферическими ячейками диаметром 1 мкм - прокрашен раствором флуоресцирующего белка в очень низкой концентрации, позволяющей видеть раздельно молекулы белка, способные перемещаться в Броуновском движении внутри полых микросфер. Образец освещается через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения лазерным лучом, возбуждающим флуоресценцию в слое объекта толщиной 150-200 нм рядом со стеклом. Положение нескольких десятков молекул флуоресцирующего белка, каждая из которых покрашена множеством
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) одновременно флуоресцирующих молекул, регистрировали на высокочувствительную видеокамеру (Rореr Sсiепtifiс, Саsсаdе 512F c умножителем электронов, встроенным в ПЗС) в 500 последовательных кадрах, каждый из которых записывали в память компьютера. Все накопленные изображения, каждое содержащее множество пятен с диаметром около 0,5 мкм, умноженным на увеличение системы, складывали и получали суммарное изображение с разрешением не лучше, чем у обычного флуоресцентного микроскопа. Основными недостатками этой системы являются: нет никаких упоминаний в статье о возможности вычислять положение центров регистрируемых пятен и строить изображение из точек, соответствующих центрам пятен, с разрешением более высоким, чем обусловлено диффракционным пределом (ф- ла 1); не описаны подходы к избирательной окраске различных структур самого объекта; не описано решение следующей проблемы: после неизбежного обесцвечивания красителей в процессе их регистрации уже нефлуоресцирующие молекулы белка останутся в зоне наблюдения, будут увеличивать вязкость раствора и не позволят заменять их на свежие флуоресцирующие молекулы белка, что препятствует накоплению значительно большего, чем 500 числа кадров, необходимых для получения изображений с разрешением лучшим, чем обусловлено диффракционным пределом (ф-ла 1).
Спецификой изучения биологических объектов, например мышц, является наличие множества совершенно различных типов молекул, находящихся на расстоянии значительно меньшем, чем разрешающая способность обычных оптических микроскопов, в которых увеличенное изображение объекта строится с помощью объектива в плоскости регистратора - глаза, фотоаппарата или видеокамеры. При этом диффракционный предел разрешения микроскопа (ф-ла 1) ограничивает разрешение как в микроскопах с одновременным наблюдением всех точек в поле зрения, так и в микроскопах с последовательным просмотром точек объекта с помощью сфокусированного в одну точку луча света (конфокальный и др. сканирующие линзовые микроскопы). В этой связи желательно, чтобы все достоинства оптических микроскопов и применяемых для них методов избирательного окрашивания различных типов молекул в поле зрения можно было бы совместить с таким улучшением разрешающей способности, которое позволило бы видеть раздельно молекулы, находящиеся на расстоянии менее 10-20 нм друг от друга.
4
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Задачей настоящего изобретения является разработка способов окрашивания объектов, их подготовка к исследованию, компьютерная обработка результатов, позволяющих получить изображение объектов с разрешением лучше 20 нм, в результате чего флуоресцентный микроскоп превращается в «нaнocкoп». Данная задача решается за счет многократной съемки слабо окрашенного объекта, (в котором все флуоресцирующие молекулы видны раздельно как пятна с диаметром 2r=l,22λ/A, занимающие разные места в десятках тысяч последовательных кадров), последующей обработки всех полученных кадров с целью вычисления пололсений центров зарегистрированных пятен, (соответствующих реальным координатам флуоресцирующих молекул), и трехмерной реконструкции положений всех молекул красителя с разрешением, сравнимым с размером самих флуоресцирующих молекул, причем разные структуры объекта могут быть окрашены в различные цвета. Флуоресцентный наноскоп может базироваться на стандартных конструкциях, используемых во флуоресцентной микроскопии. Он должен содержать, как минимум, оптическую систему для визуального наблюдения и проецирования изображения образца на цифровую видеокамеру, способную регистрировать и оцифровывать с низким уровнем шума изображения одиночных флуоресцирующих молекул и наночастиц; компьютер для записи и обработки изображений; держатель образца, расположенный напротив объектива; набор сменных запирающих светофильтров для выделения света флуоресценции образца; два источника света, установленных сбоку от держателя образца и под углом к нему, при этом угол установки источников выбран из условия обеспечения освещения либо по всей глубине среза образца, либо в слое объекта толщиной менее 150 нм, прилегающем к стеклу, где флуоресцентные молекулы могут поглощать энергию световых волн, проникающих через границу при освещении под углом полного внутреннего отражения. Объект для наблюдения должен быть предварительно окрашен в растворе с насыщающей концентрацией «зaпepтoгo красителя)) (саgеd dуе (англ.)), начинающего флуоресцировать только после того, как импульс УФ света оторвет от молекул красителя блокирующие флуоресценцию группы. Избыток красителя должен быть тщательно отмыт. Для объектов, изучаемых прямо в свежем отмывающем растворе, сложно, обеспечить неподвижность их молекулярных структур в течение длительного времени вдали от стекла призмы и покровного стекла, между которыми зажат объект, поэтому наилучшее разрешение наноскопа может быть получено только для тех слоев объекта,
5
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) которые отстоят от стекла призмы не далее 150 нм - глубины, на которую в объект проникает свет, падающий на границу раздела под углом полного внутреннего отражения. В случае неживого, фиксированного объекта обычно допустимо многочасовое наблюдение при почти абсолютной неподвижности различных структур, близких к стеклу подложки, сохраняющих свое положение в пространстве за счет множества стабильных взаимных связей и связей с подложкой, несмотря на то, что порядка 80% объема занято водными растворами солей. Чтобы раствор не пересыхал, щели на краях стекла должны быть герметично закрыты (например, парафином).
Для трехмерной наноскопии необходимо обеспечить полную неподвижность объекта и его частей относительно объектива, поэтому после окраски «зaпepтым (caged)» красителем и отмывки объект должен быть проведен через обезвоживающие растворы, заключен в полимерную нефлуоресцирующую среду (например, эпоксидную смолу) и его срезы толщиной до нескольких мкм могут быть использованы для трехмерной реконструкции объекта с разрешением до 10-20 нм по всем трем координатам. Такой объект в твердой фазе можно освещать так, как это принято в обычной флуоресцентной микроскопии, с тем усовершенствованием, что дополнительная лампа-вспышка должна быть использована для превращения нескольких сотен нефлуоресцирующих молекул красителя во флуоресцирующие в каждом кадре. Как для объекта в жидкости, так и для среза объекта в полимерной пленке УФ вспышка с λ<360 нм периодически освещает объект, прокрашенный нефлуоресцирующими молекулами, и каждый раз превращает несколько сотен (и даже тысяч) молекул в поле зрения во флуоресцирующие за счет фотолиза специальных блокирующих флуоресценцию химических групп, а лазер освещает объект постоянно и возбуждает флуоресценцию вновь образованных флуоресцентных молекул с такой интенсивностью, что каждая из них испустит несколько десятков тысяч квантов света за доли секунды и обесцветится сразу после регистрации ее флуоресценции на оцифрованном кадре с невысоким уровнем шума. Чередование процессов генерации флуоресцентных молекул, их возбуждения, регистрации и обесцвечивания может повторяться десятки тысяч раз, и каждый раз будут создаваться, регистрироваться и обесцвечиваться все новые флуоресцентные молекулы, а еще не преобразованные нефлуоресцентные молекулы не будут обесцвечиваться, так как они не поглощают лазерный свет. Пользуясь описанным способом можно зарегистрировать десятки тысяч кадров с сотнями и даже тысячами флуоресцирующих молекул в каждом кадре
6
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) и вычислить положение всех десятков миллионов флуоресцирующих молекул, покрьшающих поверхности структур, находящихся в поле зрения. При этом для цветной окраски структур различной природы можно использовать красители с различными активными группировками, связьшающимися либо с белками, либо с нуклеиновыми кислотами, либо с жирами и т.д. (Предлагаемое название метода - «цвeтнaя нaнocкoпия»).
Вторая модификация метода наноскопии основана на том, что внутри значительной части объема биологического образца с продырявленными мембранами, заполненного раствором солей, возможно Броуновское движение очень ярко флуоресцирующих и устойчивых к отбеливанию наночастиц (молекул фикобилипротеинов или флуоресцентных микросфер с диаметром 10-40 нм), которое может регулироваться дополнительно с помощью электрофореза током, подаваемым через несколько чередующихся пар электродов так, чтобы ток направлял движение частиц в различных направлениях, и частицы таким образом сканировали все доступное им пространство. Если в каждом кадре будут регистрироваться несколько сотен одних и тех же (или обмениваемых с находящимися вне освещенной зоны) флуоресцентных частиц, плавающих на расстоянии больше 1-2 мкм друг от друга, то возможно вычислить их положение с точностью до нескольких нанометров (как координаты центров соответствующих им пятен) и использовать полученные во всех кадрах координаты для определения всех мест, где могут оказаться частицы за длительное время, то есть весь объем, занятый жидкостью. Ту часть объема, где частицы не смогли побывать, можно считать занятой плотными структурами различного происхождения — белками, хромосомами, остатками неповрежденных мембран и т.д. Возможные флуктуации положения частицы несколько увеличат размер светового пятна за время его регистрации на кадре, но положение центра пятна все же можно считать усредненной координатой положения частицы в объекте. Следует отметить, что нейтральные, положительно и отрицательно заряженные флуоресцентные наночастицы смогут посетить различные области объекта из-за взаимодействия с локальными зарядами био-структур, поэтому этот метод полезен для изучения поверхностных зарядов структур объекта. (Предлагаемое название метода - «чepнo-бeлaя нaнocкoпия»).
Оба предлагаемых метода способны обеспечить разрешение наноскопа до нескольких нанометров, зависящее не от предела разрешающей способности (ф-ла 1), а
7
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) от внутренней подвижности структур в наблюдаемой части объекта за длительное время и соотношения сигнал-шум в видеосигнале, которые поддаются регуляции с помощью различных модификаций приведенных методов. Например, можно ввести в объект немного ярко светящихся «oпopныx» флуоресцентных частиц и отсчитывать координаты сменяемых частиц с учетом смещений в поле зрения жестко связанных с объектом опорных частиц. Такой подход позволит достичь двумерное разрешение деталей объекта, находящихся на расстоянии всего несколько нанометров.
Следует отметить, что ряд параметров изображения флуоресцирующих частиц (диаметр пятен и распределение интенсивности света вдоль сечения каждого пятна) может меняться по мере удаления частицы из фокусной плоскости объектива микроскопа, поэтому предлагается проводить вычисление и этих параметров с целью вычисления третьей координаты положения светящихся частиц. Для повышения точности определения третьей координаты предлагается изображение объекта проецировать на две видеокамеры, расщепляя свет после объектива на два пучка и разместив камеры так, чтобы на них проецировались через один и тот же объектив две соседние фокусные плоскости внутри объекта. Распределение интенсивности флуоресцентного света для каждой частицы будет отличаться при регистрации через разные камеры и может быть проградуировано в зависимости от третьей координаты и использовано для построения трехмерного изображения объектов. На фиг. 3. приведена иллюстрация принципа трехмерной наноскопии. Диаметр и интенсивность пятен от флуоресцентных частиц, проецируемых на ПЗС, зависит от расстояния между частицей и объективом. Две камеры, сфокусированные на различные фокальные плоскости воспроизводят одну и ту же частицу с разными диаметрами и распределением интенсивности вдоль диаметра. Диаграммы в верхнем правом углу рисунка иллюстрируют различие между диаметрами и распределением интенсивности вдоль диаметров в зависимости от положения видеокамер и флуоресцентных частиц.
Кроме того, в ряде случаев, наноскоп поможет определить положение центров пятен, создаваемых флуоресцирующими частицами в двух-трех разных длинах волн при одном и том же возбуждении. На практике это можно осуществить с помощью светоделительных дихроичных зеркал, пропускающих свет на одной длине волны на одну из видеокамер и отражающих свет с другой длиной волны на другую видеокамеру. В соответствии с изложенным, в настоящем изобретении может одновременно реконструироваться с наноразрешением положение нескольких
8
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) различных типов молекул объекта, прокрашенных красителями с различающимися длинами волн излучения и может умножаться число одновременно видимых и регистрируемых порознь пятен от флуоресцирующих частиц, так как они могут быть видны порознь на разных длинах волн, даже если соответствующие им пятна разных цветов видны перекрывающимися.
Очень полезным может оказаться сочетание описанных вариантов работы наноскопа с дополнительным превращением «зaпepтыx» молекул в объекте из нефлуоресцирующие во флуоресцирующие в результате химических реакций или различных физических воздействий, отрьшающих блокирующие флуоресценцию химические группы, например, в результате АТФ-азных реакций, работы эстераз, перекисного окисления, радиоактивного распада и т.д. Полученные в результате таких модификаций флуоресцентные молекулы можно возбуждать с помощью лазера и регистрировать с помощью тех же видео камер, которые используются для вычисления координат поверхности структур объекта описанными ранее способами, их координаты могут быть определены как вычисленные центры соответствующих им пятен на видеокадрах, после чего можно «нaлoжить» их изображение на реконструированный ранее описаннами методами объект как положение реакционно- активных групп этого же объекта с разрешением лучше 20 нм.
Для специалиста является очевидным, что изобретение, охарактеризованное в прилагаемой формуле изобретения, может быть модифицировано различными способами без отхода от основных идей изобретения.
Работа устройства в режиме наноскопа может чередоваться с использованием флуоресцентного микроскопа в обычном режиме с возможностью прямого визуального наблюдения объекта в реальном времени при обычном разрешении (ф-ла 1), возможностью регистрации изображения с помощью цифровой видеокамеры сверхвысокой чувствительности в память компьютера с целью обработки кадров для измерения геометрических параметров и интенсивности света в разных местах кадра, например, в био- люминесцентных и хеми-люминесцентных исследованиях.
На представленных чертежах изображена схема модификации флуоресцентного микроскопа для реализации способа наноскопии согласно данному изобретению.
Флуоресцентный микроскоп-наноскоп, как показано на фигурах 1 и 2, имеет: одну (фиг. 1) или две (фиг. 2) монохромные видеокамеры 1 с цифровым видеовыходом и запирающими светофильтрами перед их сенсорами (ПЗС), пропускающими только
9
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) флуоресцентный свет на камеры; убираемую светоделительную призму 2; объектив 3 с увеличением до 10Ox и апертурой до A=I ,4; объект 4, прижатый к стеклянному держателю образца 5 со скошенными в виде усеченной призмы краями; лазер 6 с линзовой системой для возбуждения флуоресценции через грани призмы; импульсный УФ-источник 7 с линзовой системой для фотолиза имеющихся на молекулах красителя блокирующих флуоресценцию групп; компьютер 8 с програмой записи и обработки оцифрованных изображений, используемой одновременно для управления источником питания УФ импульсов и электрофоретического устройства; окуляр микроскопа 10 (фиг. 1) для визуального наблюдения 9. Установка должна быть помещена в звукоизолирующий шкаф, установленный на антивибрационный стол. Устройство подачи электрического напряжения на электрофоретические электроды, управляющие движением подвижных флуоресцентных наночастиц внутри объекта, заполненного солевым раствором, будет описано отдельно.
Рассмотрим, как пример, способ получения изображения с помощью наноскопа, в котором используются высокочувствительные камеры Саsсаdе IK, производимые компанией Рhоtоmеtriсs, или камеры SISl_t285EM, производимые компанией Тhеtа- sуstеm, со встроенным ПЗС TC285SPD, производимым компанией Техаs Iпstrumепts, с умножителем электронов, встроенным на кристалле ПЗС, который имеет квантовую эффективность до 63% и имеет 1004 активных горизонтальных квадратных пикселя со стороной 8 мкм в 1002 строках на светочувствительной площади размером около 8мм х 8мм. Если изображение объекта проецируется непосредственно на ПЗС видеокамеры с помощью объектива 10Ox, то площадь, освещаемая лазером с его линзовой системой на объекте, должна иметь размеры несколько большие, чем 80 мкм х 80 мкм, при этом кажый пиксель ПЗС соответствует площадке объекта размером 80 нм х 80 нм. Каждая светящаяся частица или молекула видна на объекте как пятно с диаметром 2r=l,22λ/A, то есть около 560 нм, и будет проецироваться на площадку ПЗС с диаметром около 7 пикселей. Чтобы почти все хаотически распределенные флуоресцентные частицы были видны раздельно достаточно, чтобы среднее расстояние между ними в каждом кадре было больше 2000 нм. Тогда по крайней мере 40 х 40 = 1600 пятен могут одновременно проецироваться на ПЗС в каждом кадре так, что почти все они будут видны раздельно. Чтобы достичь такой концентрации одновременно флуоресцирующих частиц, можно использовать различные методы. Во- первых, можно покрасить объект ярко флуоресцирующими частицами в достаточно низкой
10
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) концентрации так, что они смогут смещаться в поле зрения под действием Броуновских сил и смогут дополнительно перемещаться с помощью электрофореза током, подаваемым через несколько чередующихся пар электродов так, чтобы ток направлял движение частиц в различных направлениях. Во-вторых, объект может быть покрашен специальными красителями типа 5-кapбoкcифлyopecцeин-биc-(5- кapбoкcимeтoкcи-2-нитpoбeнзил) эфир, бета-аланин-карбоксамид, суксинимидиловый эфир (СМNВ-саgеd саrbохуfluоrеsсеiп, SE), производимым компанией Моlесulаг Рrоbеs, США. После освещения УФ вспышкой света с длиной волны 310-365 нм (с заранее подобранной экспозицией) около 1000-1600 молекул этого нефлуоресцирующего красителя в зоне наблюдения потеряют специальные группы, блокирующие флуоресценцию, и смогут при освещении голубым светом произвести несколько десятков тысяч квантов зеленого света перед тем, как будут обесцвечены. При апертуре объектива A=I, 1-1,3 более 10% света от каждой флуоресцирующей частицы будут направлены на видеокамеру и примут участие в формировании пятна, покрывающего около 40 пикселей ПЗС с интенсивностью до 100 квантов в центре пятна, что вполне достаточно для получения видеосигнала с достаточно хорошим соотношением сигнал-шум (при использовании вышеуказанных камер), которое позволит вычислить координаты центра пятна с точностью лучше 20 нм. Данный краситель не поглощает лазерный свет и не обесцвечивается до тех пор, пока на нем находятся блокирующие флуоресценцию группы, поэтому возможно десятки тысяч раз циклически повторять один и тот же процесс: сначала ПЗС регистрирует изображение объекта с остаточной флуоресценцией, оцифровывает его в видеокамере и передает в компьютер, затем УФ вспышка создает 1000-1600 флуоресцентных молекул в поле зрения, лазер возбуждет в них флуоресценцию, ПЗС регистрирует изображение флуоресцирующих молекул и частиц, наложенное на остаточную флуоресценцию, изображение оцифровывается в видеокамере и передается в компьютер, где из него вычитается предыдущий кадр с остаточной флуоресценцией. Полученный разностный кадр сохраняется в память компьютера для дальнейшей обработки с целью вычисления координат центра пятна, его усредненного диаметра и интенсивности. Некоторое время объект освещается лазером без регистрации изображения для максимально полного обесцвечивания уже зарегистрированных молекул и цикл повторяется. В каждом цикле будут создаваться, регистрироваться и обесцвечиваться все новые флуоресцентные молекулы до тех пор, пока координаты
11
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) всех молекул красителя не будут зарегистрированы. Кроме указанного красителя компания Моlесulаr Рrоbеs производит подобные красители по заказу, а также она производит набор реактивов для самостоятельного изготовления подобных красителей "caging kit" (D-2516).
Указанные в примере камеры позволяют записывать с хорошим соотношением сигнал-шум изображения отдельных флуоресцирующих молекул с частотой до 10 кадров в секунду, поэтому в принципе возможно зарегистрировать за несколько часов, например, 40000 кадров, содержащих каждый до 1600 изображений молекул. Тогда полное число зарегистрированных координат флуоресцентных молекул может достичь 64 миллионов, и среднее расстояние между видимыми порознь молекулами может быть всего 10 нм, что в десятки раз лучше чем в любых других линзовых микроскопах. Для наиболее точного вычисления координат молекул кадры с их изображениями следует сохранять в формате без сжатия или со сжатием без потери информации. Даже в случае сохранения всех кадров без сжатия суммарный объем памяти для их записи в одном эксперименте может достигать десятков гигабайт, что вполне реализуемо с современными жесткими дисками компьютеров. В литературе описаны различные алгоритмы для вычисления центров пятен и нами написана компьютерная программа для подобных вычислений и реконструкции полного изображения на основе таблицы координат вычисленных центров пятен.
12
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ «CПOCOБ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ HAHOCKOПИИ»
1. Способ наноскопии окрашенных объектов, находящихся в растворе или в срезе фиксированного и заключенного в полимер образца, в котором используется флуоресцентный микроскоп, содержащий цифровые видеокамеры с запирающими фильтрами для выделения света флуоресценции образца, способные регистрировать с низким уровнем шума изображение отдельных флуоресцирующих молекул, возбуждаемых лазерным источником света, компьютер для записи видеоизображений, поступающих от видеокамеры, отличающийся тем, что периодически с помощью УФ вспышки одна-две тысячи нефлуоресцирующих молекул красителя, покрывающих структуры объекта, превращаются во флуоресцирующие за счет отрыва от них блокирующих флуоресценцию химических групп, изображения образовавшихся флуоресцентных молекул регистрируется в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры, при этом молекулы обесцвечиваются в процессе регистрации, кадры с остаточным флуоресцентным излучением вычитаются из кадров, содержащих смесь изображений флуоресцентных частиц и остаточной флуоресценции и разностные кадры спасаются в память компьютера с целью дальнейшего поиска центров пятен, являющихся координатами молекул красителя; процесс повторяется десятки тысяч раз с целью вычисления координат всех молекул красителя в освещаемой части объекта и компьютерной реконструкции двух- или трехмерного изображения объекта с разрешением лучше, чем 20-50 нм.
2. Способ наноскопии по п.l, отличающийся тем, что вместо регулярно создаваемых и обесцвечиваемых флуоресцентных молекул объект прокрашивается видимыми раздельно флуоресцентными наночастицами, содержащими каждая множество флуоресцентных устойчивых к отбеливанию светом молекул, способных двигаться в растворе между структурами объекта в Броуновском движении и под действием двумерного электрофореза, при этом лазер постоянно возбуждает флуоресценцию частиц, видеокамера и компьютер регистрируют десятки тысяч кадров с одной-двумя тысячами видимых раздельно пятен в каждом кадре, отражающих положение частиц, по вычисленным координатам центров пятен во всех кадрах реконструируется жидкая часть пространства в объекте, доступная для движущихся частиц, а также недоступная для флуоресцентных частиц часть пространства, занятая неподвижными структурами объекта.
13
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
3. Способ наноскопии по п. I5 отличающийся тем, что используется видеокамера 2, идентичная видеокамере 1 , но расположенная так относительно объектива, что на ее сенсоре фокусируется изображение плоскости объекта, сдвинутой по глубине на 50- 2000 нм относительно плоскости, которая фокусируется на видеокамеру 1, при этом различие в распределении интенсивности света в сечениях пятен, полученных через обе камеры, используется для вычисления третьей координаты положения молекул красителя в объекте и для построения трехмерного изображения объекта; объект в растворе, предпочтительно, освещается через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения, а объект в твердом срезе толщиной от долей микрометра до нескольких микрометров может освещаться через объектив на всю глубину тэердого среза или через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения.
4. Способ наноскопии по п.l, отличающийся тем, что различающиеся структуры объекта одновременно окрашиваются различными красителями, флуоресцирующими на разных длинах волн, а набор дихроичных зеркал и светофильтров используется для избирательного проецирования изображений различных структур на две или более видеокамеры, что умножает количество одновременно регистрируемых молекул.
5. Способ наноскопии по п.l, отличающийся тем, что впридачу к изображению, сформированному согласно одному из способов, перечисленных в пунктах 1-4 в объект периодически вводятся различные «зaпepтыe (caged)» молекулы, способные превращаться из нефлуоресцирующие во флуоресцирующие в результате химических реакций или различных физических воздействий, отрывающих блокирующие флуоресценцию химические группы, с такой скоростью, что все образовавшихся флуоресцентные молекулы регистрируется в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры, при этом молекулы обесцвечиваются в процессе регистрации, кадры с остаточным флуоресцентным излучением вычитаются из кадров, содержащих смесь изображений флуоресцентных частиц и остаточной флуоресценции и разностные кадры спасаются в память компьютера с целью дальнейшего поиска центров пятен, являющихся координатами молекул красителя; процесс повторяется много раз за счет создания различными способами все новых флуоресцентных молекул в освещенной зоне с целью вычисления координат всех молекул красителя в, объекте и компьютерной реконструкции положения таких «cпeциaльныx» молекул на ранее полученном двух- или трехмерном изображении объекта.
14
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2006/000231 2005-05-18 2006-05-05 Procede de nanoscopie par fluorescence WO2006123967A2 (fr)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06757947A EP1892517A4 (en) 2005-05-18 2006-05-05 FLUORESCENCE NANOSCOPY METHOD
CA002648777A CA2648777A1 (en) 2005-05-18 2006-05-05 Method of fluorescent nanoscopy
CN2006800264573A CN101228428B (zh) 2005-05-18 2006-05-05 荧光纳米显微方法
US11/920,661 US7803634B2 (en) 2005-05-18 2006-05-05 Fluorescent nanoscopy method
JP2008512241A JP5065256B2 (ja) 2005-05-18 2006-05-05 蛍光ナノスコピー方法
US12/891,420 US8110405B2 (en) 2005-05-18 2010-09-27 Fluorescent nanoscopy method
US13/366,813 US8334143B2 (en) 2005-05-18 2012-02-06 Fluorescent nanoscopy method
US13/714,609 US8668872B2 (en) 2005-05-18 2012-12-14 Fluorescent nanoscopy device and method
US14/155,979 US9028757B2 (en) 2005-05-18 2014-01-15 Fluorescent nanoscopy device and method
US14/710,214 US20150316478A1 (en) 2005-05-18 2015-05-12 Fluorescent nanoscopy device and method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2005115052 2005-05-18
RU2005115052/28A RU2305270C2 (ru) 2005-05-18 2005-05-18 Способ флуоресцентной наноскопии (варианты)

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/920,661 A-371-Of-International US7803634B2 (en) 2005-05-18 2006-05-05 Fluorescent nanoscopy method
US12/891,420 Continuation US8110405B2 (en) 2005-05-18 2010-09-27 Fluorescent nanoscopy method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2006123967A2 true WO2006123967A2 (fr) 2006-11-23
WO2006123967A3 WO2006123967A3 (fr) 2007-03-22

Family

ID=37431689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2006/000231 WO2006123967A2 (fr) 2005-05-18 2006-05-05 Procede de nanoscopie par fluorescence

Country Status (7)

Country Link
US (6) US7803634B2 (ru)
EP (1) EP1892517A4 (ru)
JP (2) JP5065256B2 (ru)
CN (2) CN101228428B (ru)
CA (1) CA2648777A1 (ru)
RU (1) RU2305270C2 (ru)
WO (1) WO2006123967A2 (ru)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009059378A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Commonwealth Scientific & Industrial Research Organisation Differential aberration correction microscopy (dac)
US7535012B2 (en) 2005-05-23 2009-05-19 Robert Eric Betzig Optical microscopy with phototransformable optical labels
CN101918816A (zh) * 2007-12-21 2010-12-15 哈佛大学 三维中的亚衍射极限图像分辨率
US7916304B2 (en) 2006-12-21 2011-03-29 Howard Hughes Medical Institute Systems and methods for 3-dimensional interferometric microscopy
US10073035B2 (en) 2006-08-07 2018-09-11 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution and other imaging techniques
US10866170B2 (en) 2011-01-24 2020-12-15 Roche Molecular Systems, Inc Devices, systems, and methods for extracting a material from a material sample
US10871425B2 (en) 2015-01-31 2020-12-22 Roche Molecular Systems Inc. Systems and methods for meso-dissection
US10876933B2 (en) 2016-11-09 2020-12-29 Ventana Medical Systems, Inc. Automated tissue dissection instrument and methods of using the same
US11125660B2 (en) 2015-01-31 2021-09-21 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for meso-dissection

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2305270C2 (ru) 2005-05-18 2007-08-27 Андрей Алексеевич Климов Способ флуоресцентной наноскопии (варианты)
RU2319948C2 (ru) * 2006-04-07 2008-03-20 Юрий Владимирович Микляев Способ получения изображения повышенной разрешающей способности
WO2009002225A2 (ru) * 2007-06-25 2008-12-31 Closed Company 'molecular-Medicine Technologies' Многофункциональное устройство для диагностики и способ тестирования биологических объектов
US10568535B2 (en) 2008-05-22 2020-02-25 The Trustees Of Dartmouth College Surgical navigation with stereovision and associated methods
CA2730429C (en) 2008-07-24 2018-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for imaging using absorption
US9140649B2 (en) 2008-07-24 2015-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Inflatable membrane having non-uniform inflation characteristic
US9170199B2 (en) 2008-07-24 2015-10-27 Massachusetts Institute Of Technology Enhanced sensors in three dimensional scanning system
US9291565B2 (en) 2008-07-24 2016-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Three dimensional scanning using membrane with optical features
US8845526B2 (en) 2008-07-24 2014-09-30 Massachusetts Institute Of Technology Integrated otoscope and three dimensional scanning system
US9170200B2 (en) 2008-07-24 2015-10-27 Massachusetts Institute Of Technology Inflatable membrane with hazard mitigation
WO2010090673A1 (en) 2009-01-20 2010-08-12 The Trustees Of Dartmouth College Method and apparatus for depth-resolved fluorescence, chromophore, and oximetry imaging for lesion identification during surgery
WO2011106323A2 (en) * 2010-02-23 2011-09-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Photobleaching and intermittency localization microscopy
JP2013114042A (ja) * 2011-11-29 2013-06-10 Sony Corp 画像取得装置、画像取得方法及び画像取得プログラム
US9176032B2 (en) 2011-12-23 2015-11-03 General Electric Company Methods of analyzing an H and E stained biological sample
US8568991B2 (en) 2011-12-23 2013-10-29 General Electric Company Photoactivated chemical bleaching of dyes
US11510600B2 (en) 2012-01-04 2022-11-29 The Trustees Of Dartmouth College Method and apparatus for quantitative and depth resolved hyperspectral fluorescence and reflectance imaging for surgical guidance
WO2014127145A1 (en) * 2013-02-13 2014-08-21 The Trustees Of Dartmouth College Method and apparatus for medical imaging using differencing of multiple fluorophores
US9336592B2 (en) 2012-02-03 2016-05-10 The Trustees Of Dartmouth College Method and apparatus for determining tumor shift during surgery using a stereo-optical three-dimensional surface-mapping system
CN103536291B (zh) * 2012-07-10 2017-04-19 花王株式会社 体表皮脂分布的测定方法
RU2502983C1 (ru) * 2012-08-17 2013-12-27 Игорь Викторович Чеботарь Способ наноскопии
WO2014062716A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Visen Medical, Inc. Systems, methods, and apparatus for imaging of diffuse media featuring cross-modality weighting of fluorescent and bioluminescent sources
US11937951B2 (en) 2013-02-13 2024-03-26 The Trustees Of Dartmouth College Method and apparatus for medical imaging using differencing of multiple fluorophores
JP6037889B2 (ja) * 2013-02-25 2016-12-07 オリンパス株式会社 走査型観察装置
WO2014138197A1 (en) 2013-03-06 2014-09-12 General Electric Company Methods of analyzing an h&e stained biological sample
JP2015025759A (ja) * 2013-07-26 2015-02-05 Hoya株式会社 基板検査方法、基板製造方法および基板検査装置
CN103411936B (zh) * 2013-07-29 2015-12-02 深圳大学 一种三维纳米分辨定位方法及装置
RU2544047C1 (ru) * 2013-10-07 2015-03-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева", РХТУ им. Д.И. Менделеева Способ определения микровключений примесей в порошковых органических люминофорах
CN104749758A (zh) * 2015-04-24 2015-07-01 南开大学 折射率荧光显微镜
US10783697B2 (en) 2016-02-26 2020-09-22 Yale University Systems, methods, and computer-readable media for ultra-high resolution 3D imaging of whole cells
US20180143123A1 (en) * 2016-09-22 2018-05-24 Mehmet Selim Hanay System and method for sizing and imaging analytes in microfluidics by multimode electromagnetic resonators
CN107132181A (zh) * 2017-04-17 2017-09-05 金华职业技术学院 一种研究单分子层的摩擦学的方法
CN107356571A (zh) * 2017-06-27 2017-11-17 暨南大学 一种测定表面电荷的方法
US10585270B2 (en) * 2017-10-25 2020-03-10 University Of Vermont And State Agricultural College Reflected image macroscopy system
JP7200945B2 (ja) 2017-12-01 2023-01-10 ソニーグループ株式会社 画像着色装置、画像着色方法、プログラム、及び画像着色システム
RU2680664C1 (ru) * 2017-12-18 2019-02-25 Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Казанский Национальный Исследовательский Технический Университет Им. А.Н. Туполева-Каи", Книту-Каи Способ регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа
JP7228917B2 (ja) * 2018-01-02 2023-02-27 キングス カレッジ ロンドン 局在化顕微鏡法のための方法及びシステム
CA3095410A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Systems and methods for 3d reconstruction of anatomical organs and inclusions using short-wave infrared (swir) projection tomography
US10732100B2 (en) 2018-06-29 2020-08-04 L'oreal Systems and methods for predicting sun protection factor of sunscreen formulations in vitro
WO2020030954A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Integrative Medicine Clinic, Sia Theranostics-like protein sanps conjugated to integrin and pmsa targeting peptides and therapy of prostate cancer
US10481379B1 (en) * 2018-10-19 2019-11-19 Nanotronics Imaging, Inc. Method and system for automatically mapping fluid objects on a substrate
WO2022246155A1 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Gleghorn Jason P Method for enumeration and physical characterization of nanoparticles

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1493673A1 (ru) * 1987-05-21 1989-07-15 Предприятие П/Я А-1631 Краситель дл флуоресцентной микроскопии бактериальных клеток, осажденных на мембранном фильтре
US5233197A (en) * 1991-07-15 1993-08-03 University Of Massachusetts Medical Center High speed digital imaging microscope
CN2238435Y (zh) * 1994-07-12 1996-10-23 王仲明 光荧光显微镜
US6259104B1 (en) * 1994-07-15 2001-07-10 Stephen C. Baer Superresolution in optical microscopy and microlithography
US5635608A (en) * 1994-11-08 1997-06-03 Molecular Probes, Inc. α-carboxy caged compounds
DE4445214C2 (de) * 1994-12-17 2000-06-29 Laser & Med Tech Gmbh Verfahren zur Bestimmung und Rekonstruktion räumlicher Verteilungen und Intensitäten von Fluoreszenzfarbstoffen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
JP3872856B2 (ja) * 1997-01-23 2007-01-24 オリンパス株式会社 蛍光顕微鏡
US6480285B1 (en) * 1997-01-28 2002-11-12 Zetetic Institute Multiple layer confocal interference microscopy using wavenumber domain reflectometry and background amplitude reduction and compensation
JPH10285613A (ja) * 1997-03-31 1998-10-23 Shinichi Hirabayashi ３ｄ画像撮像装置
JP2001509612A (ja) * 1997-07-10 2001-07-24 ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルク ウェーブフィールド顕微鏡、ウェーブフィールド顕微鏡法、ｄｎａ順序決定のためのウェーブフィールド顕微鏡法、およびウェーブフィールド顕微鏡に対する較正方法
IL127359A0 (en) * 1998-12-01 1999-10-28 Yeda Res & Dev Computerized adaptive imaging
JP4488259B2 (ja) * 1999-09-13 2010-06-23 オリンパス株式会社 量子ドット観察装置
RU2166201C1 (ru) * 1999-12-28 2001-04-27 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Флуоресцентный микроскоп
JP2001194303A (ja) * 2000-01-13 2001-07-19 Bunshi Biophotonics Kenkyusho:Kk 蛍光分子拡散運動解析装置
CN1261159A (zh) * 2000-03-08 2000-07-26 中国科学院广州地球化学研究所 激光诱导荧光显微镜组装方法
US7110118B2 (en) * 2000-12-19 2006-09-19 Trustees Of Boston University Spectral imaging for vertical sectioning
JP3958987B2 (ja) * 2002-03-25 2007-08-15 浜松ホトニクス株式会社 フォトンカウンティングシステム及びフォトンカウンティング方法
GB0211072D0 (en) * 2002-05-15 2002-06-26 Amersham Biosciences Uk Ltd Reagent and method for the determination of changes in a cellular morphological parameter
CN1188529C (zh) * 2002-06-11 2005-02-09 刘全俊 一种基因芯片的纳米金标记银染检测法
US6953927B2 (en) * 2002-08-09 2005-10-11 California Institute Of Technology Method and system for scanning apertureless fluorescence microscope
JP2004177312A (ja) * 2002-11-28 2004-06-24 Japan Science & Technology Agency 流体の三次元温度・速度同時計測方法
CN1193220C (zh) * 2002-12-26 2005-03-16 北京大学 生物体组织染色方法
US20040227694A1 (en) * 2003-05-14 2004-11-18 Xiao-Dong Sun System and method for a three-dimensional color image display utilizing laser induced fluorescence of nanopartcles and organometallic molecules in a transparent medium
JP2004347454A (ja) * 2003-05-22 2004-12-09 Mitsubishi Rayon Co Ltd シェーディング補正方法
CN1206534C (zh) * 2003-07-18 2005-06-15 北京航天瑞祺科技发展有限公司 一种神经网识别荧光染色精子的方法
EP1677097A4 (en) * 2003-10-10 2010-09-01 Hamamatsu Photonics Kk METHOD AND SYSTEM FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF A FLUORESCENT PIGMENT
EP1582858A1 (de) * 2004-03-29 2005-10-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zur Anregung der Moleküle von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand mit einem optischen Signal
WO2005106462A2 (en) * 2004-04-26 2005-11-10 Drexel University Methods for use of fluorescent nanoparticles to determine free volume and to detect and deliver materials to repair cracks in polymers and polymer composites
EP1839037B1 (en) * 2005-01-16 2013-10-30 Stephen C. Baer Single wavelength stimulated emission depletion microscopy
US7476787B2 (en) * 2005-02-23 2009-01-13 Stc.Unm Addressable field enhancement microscopy
DE102005012739B4 (de) * 2005-03-19 2010-09-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zur Herstellung räumlicher Feinstrukturen
DE102005013969A1 (de) * 2005-03-26 2006-10-05 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung einer räumlichen Feinstruktur
US7767414B1 (en) * 2005-04-20 2010-08-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Optical imaging of molecular characteristics of biological specimen
RU2305270C2 (ru) 2005-05-18 2007-08-27 Андрей Алексеевич Климов Способ флуоресцентной наноскопии (варианты)
EP1894010B2 (en) * 2005-05-23 2016-06-15 Harald F. Hess Optical microscopy with phototransformable optical labels

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of EP1892517A4 *

Cited By (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7782457B2 (en) 2005-05-23 2010-08-24 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US7864314B2 (en) 2005-05-23 2011-01-04 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US7626694B2 (en) 2005-05-23 2009-12-01 Robert Eric Betzig Optical microscopy with phototransformable optical labels
US7626695B2 (en) 2005-05-23 2009-12-01 Robert Eric Betzig Optical microscopy with phototransformable optical labels
US7626703B2 (en) 2005-05-23 2009-12-01 Robert Eric Betzig Optical microscopy with phototransformable optical labels
US7710563B2 (en) 2005-05-23 2010-05-04 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US7535012B2 (en) 2005-05-23 2009-05-19 Robert Eric Betzig Optical microscopy with phototransformable optical labels
US11988604B2 (en) 2005-05-23 2024-05-21 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US9360426B2 (en) 2005-05-23 2016-06-07 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US11009460B2 (en) 2005-05-23 2021-05-18 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US8462336B2 (en) 2005-05-23 2013-06-11 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US8599376B2 (en) 2005-05-23 2013-12-03 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US10107753B2 (en) 2005-05-23 2018-10-23 Hestzig Llc Optical microscopy with phototransformable optical labels
US10794828B2 (en) 2006-08-07 2020-10-06 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution and other imaging techniques
US10073035B2 (en) 2006-08-07 2018-09-11 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution and other imaging techniques
US9482512B2 (en) 2006-12-21 2016-11-01 Howard Hughes Medical Institute Methods for 3-dimensional interferometric microscopy
US7916304B2 (en) 2006-12-21 2011-03-29 Howard Hughes Medical Institute Systems and methods for 3-dimensional interferometric microscopy
US9127925B2 (en) 2006-12-21 2015-09-08 Howard Hughes Medical Institute Method of 3-dimensional imaging of activated samples
US8780442B2 (en) 2006-12-21 2014-07-15 Howard Hughes Medical Institute Optical interfering apparatus
WO2009059378A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Commonwealth Scientific & Industrial Research Organisation Differential aberration correction microscopy (dac)
US9712805B2 (en) 2007-12-21 2017-07-18 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution in three dimensions
CN105403545A (zh) * 2007-12-21 2016-03-16 哈佛大学 三维中的亚衍射极限图像分辨率
CN105403545B (zh) * 2007-12-21 2019-05-28 哈佛大学 三维中的亚衍射极限图像分辨率
US10412366B2 (en) 2007-12-21 2019-09-10 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution in three dimensions
CN101918816A (zh) * 2007-12-21 2010-12-15 哈佛大学 三维中的亚衍射极限图像分辨率
US10866170B2 (en) 2011-01-24 2020-12-15 Roche Molecular Systems, Inc Devices, systems, and methods for extracting a material from a material sample
US10871425B2 (en) 2015-01-31 2020-12-22 Roche Molecular Systems Inc. Systems and methods for meso-dissection
US11125660B2 (en) 2015-01-31 2021-09-21 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for meso-dissection
US11181449B2 (en) 2015-01-31 2021-11-23 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for meso-dissection
US11768136B2 (en) 2015-01-31 2023-09-26 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for meso-dissection
US11860072B2 (en) 2015-01-31 2024-01-02 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for meso-dissection
US11971333B2 (en) 2016-11-09 2024-04-30 Ventana Medical Systems, Inc. Automated tissue dissection instrument and methods of using the same
US10876933B2 (en) 2016-11-09 2020-12-29 Ventana Medical Systems, Inc. Automated tissue dissection instrument and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
US20110175982A1 (en) 2011-07-21
CN101228428A (zh) 2008-07-23
US8668872B2 (en) 2014-03-11
CN102023148B (zh) 2013-07-24
CN102023148A (zh) 2011-04-20
WO2006123967A3 (fr) 2007-03-22
US8110405B2 (en) 2012-02-07
US8334143B2 (en) 2012-12-18
US20140127079A1 (en) 2014-05-08
CN101228428B (zh) 2012-11-07
US20090045353A1 (en) 2009-02-19
JP2012198234A (ja) 2012-10-18
US20120133740A1 (en) 2012-05-31
CA2648777A1 (en) 2006-11-23
JP2008541128A (ja) 2008-11-20
RU2005115052A (ru) 2006-11-27
US20150316478A1 (en) 2015-11-05
US9028757B2 (en) 2015-05-12
EP1892517A4 (en) 2013-03-13
US20130099136A1 (en) 2013-04-25
US7803634B2 (en) 2010-09-28
JP5065256B2 (ja) 2012-10-31
JP5656920B2 (ja) 2015-01-21
RU2305270C2 (ru) 2007-08-27
EP1892517A2 (en) 2008-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2305270C2 (ru) Способ флуоресцентной наноскопии (варианты)
Gustafsson Extended resolution fluorescence microscopy
CN105556280A (zh) 用于3d多尺度显微术的具有集成微镜的微构造表面
JP2004170977A (ja) 分解能の深度で試料を光学的に把握する方法および配置
CN108267445A (zh) 三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法
US20110226972A1 (en) Reflective Focusing and Transmissive Projection Device
Haustein et al. Trends in fluorescence imaging and related techniques to unravel biological information
EP3420338B1 (en) Method and apparatus for high throughput imaging
CN107209110B (zh) 高吞吐量生化筛查
JP2004361087A (ja) 生体分子解析装置
Botvinick et al. Laser‐based measurements in cell biology
Eggeling et al. STED fluorescence nanoscopy
Wurm et al. STED Nanoscopy
US20220065783A1 (en) Line scanning mechanical streak systems and methods for phosphorescence lifetime imaging
Sennoune et al. Analysis of intracellular pH (pH cyt) in mouse models of angiogenesis and carcinogenesis by spectral imaging microscopy, real-time confocal imaging microscopy, and multiphoton spectral imaging
JPH03113349A (ja) ３次元空間分解・時間分解吸収スペクトル測定装置
JPH1194645A (ja) ３次元スペクトル取得装置

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680026457.3

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2008512241

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11920661

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006757947

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 9758/DELNP/2007

Country of ref document: IN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 06757947

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006757947

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2648777

Country of ref document: CA