JP2001509612A - ウェーブフィールド顕微鏡、ウェーブフィールド顕微鏡法、ｄｎａ順序決定のためのウェーブフィールド顕微鏡法、およびウェーブフィールド顕微鏡に対する較正方法 - Google Patents

ウェーブフィールド顕微鏡、ウェーブフィールド顕微鏡法、ｄｎａ順序決定のためのウェーブフィールド顕微鏡法、およびウェーブフィールド顕微鏡に対する較正方法

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JP2001509612A JP2000502406A JP2000502406A JP2001509612A JP 2001509612 A JP2001509612 A JP 2001509612A JP 2000502406 A JP2000502406 A JP 2000502406A JP 2000502406 A JP2000502406 A JP 2000502406A JP 2001509612 A JP2001509612 A JP 2001509612A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、２つの新たなウェーブフィールド顕微鏡タイプＩとタイプＩＩに関する。これらの顕微鏡は、それぞれ励起および照明システムを有し、このシステムは少なくとも１つのリアル照明源およびバーチャル照明源と、少なくとも１つの対物レンズ（タイプＩＩの場合）、ないしは２つの対物レンズ（タイプＩの場合）を有する。ここにおいて照明源および対物レンズは次のように相互に配置される。すなわち、１つの二次元または３次元定在ウェーブフィールドを対象空間に形成するのに適するよう配置される。本発明の較正方法は、このウェーブフィールド顕微鏡に適合しており、蛍光色素マーキングされた対象構造体間の幾何学的間隔を測定することができ、この間隔は有効点像分布関数の主最大値の半値幅よりも小さくてよい。本発明はさらに、ウェーブフィールド顕微鏡法ＤＮＡ順序決定のための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、照明ないし励起システムと、対象空間と、検知システムとを有する
ウェーブフィールド顕微鏡に関する。ここで前記照明ないし励起装置は、少なく
とも１つのリアル照明源およびバーチャル照明源と、少なくとも１つの対物レン
ズを有し、照明源および対物レンズは、一次元のウェーブフィールドを形成する
のに適するように配置されている。前記対象空間は、対象物に対するホルダと操
作装置を有する。また前記検知システムは、対物レンズ、接眼レンズ、および検
知器を有する。本発明はさらに、蛍光色素マーキングされた対象物構造体間の幾
何学的間隔測定のための較正方法に関する。ここで対象物構造体間の間隔は、有
効点像分布関数の主最大値の半値幅よりも小さくてもよい。さらに本発明は、ウ
ェーブフィールド顕微鏡によるＤＮＡ順序決定のための方法に関する。
【０００２】 従来の技術 高特異的マーカ、例えばＤＮＡ試料またはプロテインゾンデを使用することに
より、生物学的（微細）対象物、とりわけ細胞、細胞核、細胞器官または染色体
（以下、単に対象物と称する）でほとんど任意に小さな（サブ）構造体をマーキ
ングすることができる。このような数μｍ（１０-6ｍ）から数１０ｎｍ（１０-9 ｍ）の次元にある構造体を特異的に表示することができる。マーカは通常は蛍光
色素またはコロイド状微細（金）粒子と結合しており、その光学的検知および結
像を容易にし、これを初めて可能にする。
【０００３】 同じ対象物内で２つのマーカを相互に別個に検知するために、該当するマーカ
はしばしば色の異なる蛍光色素と結合される。通常使用される蛍光色素の色放射
スペクトルは、深い青から緑、赤を越え、赤外線スペクトル領域にまでわたる。
しかし励起スペクトルでも蛍光スペクトルでも区別できず、その蛍光放射寿命が
区別のためのパラメータとして利用される蛍光色素が使用されることもある。こ
のことの利点は、波長に依存する焦点シフトが発生しないことである。蛍光色素
はまた種々異なる放射スペクトルを有することもあり、従って異なるスペクトル
署名を有することもある。しかしこれは同じ光子エネルギーで、例えばマルチフ
ォトンプロセッサにより励起できる。この場合も波長に依存する焦点シフトを、
スペクトル署名が異なる蛍光色素間での励起で回避することができる。
【０００４】 このような、生物学的微細対象物において特異的な（サブ）構造体と結合可能
または結合した蛍光色素を以下、蛍光色素マーカと称する。
【０００５】 ２つの蛍光色素マーカの励起スペクトルおよび／または放射スペクトルおよび
／または蛍光寿命が一致すれば、この蛍光色素マーカは該当するパラメータの点
で同じスペクトル署名を有している。測定に関連する１つまたは複数のパラメー
タにおいて蛍光色素マーカが異なれば、これらは異なるスペクトル署名を有する
。
【０００６】 蛍光とは以下、同じ物質の励起スペクトルと放射スペクトルとの間で相違が発
生し、この相違が単色吸収または散乱によるものではあり得ない、いずれかの光
子交互作用であると理解されたい。これはとりわけ多光子交互作用も含み、この
交互作用では励起波長が放射波長よりも長くなることがある。
【０００７】 さらにここで概念「蛍光」は、これに密接に結びついた発光現象、とりわけ燐
光に対しても使用される。これは比較的に長い平均蛍光寿命、例えば数ｍｓから
数１０ｍｓの領域の蛍光寿命を含む。以下、密に結びついた発光、蛍光、および
燐光の過程を本発明では同じように取り扱う。
【０００８】 拡張された生物学的対象物、および定義された対象点／対象構造体に関する量
的位置決め（間隔および角度測定）での蛍光色素マーカの検知と結像は、光学顕
微鏡的測定方法によって実行される。ここではいわゆる“点像分布関数”（poin
t spread functikon=PSF）、または使用される顕微鏡または光学系一般の“点応
答”、すなわち理想点形状の対象物から同じように理想的な点形状の画像を形成
する能力が重要である。点像分布関数は結像光学系の特性を表し、結像光学系の
品質に対する尺度である。
【０００９】 対象構造体間の間隔測定は、有効点画像分布関数に実質的に依存する。有効と
は、マークされた対象点の局所位置により与えられるという意味である。この有
効点画像分布関数もまた、それぞれの局所的屈折率および対象物での吸収、すな
わち対象物の埋め込み媒体、液浸流体、およびカバーガラスでの吸収に大きく依
存する。
【００１０】 有効点画像分布関数は一般的に、使用される顕微鏡に対して計算された点画像
分布関数とは大きく異なる。技術的に最適化された周辺条件の下で測定された点
像分布関数も通常、実際的にルーチン実験条件の下で生物学的対象物で達成され
た有効点像分布関数とは異なる。
【００１１】 なぜなら有効点像分布関数は多くの場合得られるものではなく、間隔測定の較
正は計算された理想結果に基づくか、または標準条件の下で実行された較正測定
に基づいて行われるからである。これは例えば反射方法である。しかし２つの方
法は、生物学的対象物における３次元間隔測定の際には精度に問題がある。その
結果、対象構造体間の実際の空間的間隔の検出が甚だしく不確実になり、生物学
的対象物の場合はこのような不確実性の量的推定は数μｍまで含まれる。
【００１２】 最近まで当該専門分野では、全員一致の信念があった。すなわち、２つの対象
構造体は、これらが有効点像分布関数の主最大値の少なくとも半値幅だけ相互に
離れている場合にだけ分離することができると言うものである。
【００１３】 １９９６年に初めて、本願の発明者は、遠隔野顕微鏡（および蛍光分析）に対
する較正方法を提案した。これによれば、その相互間の間隔が該当する遠隔野顕
微鏡の分解能よりも小さい、すなわち有効点像分布関数の主最大値の半値幅より
も小さい対象構造体間の間隔測定が、該当する対象構造体の３次元空間における
位置に依存しないで高精度で実行可能である。
【００１４】 この方法は次のステップを有する： ・該当する対象物の対象物ホルダ、とりわけ対象物支持プレート、対象物支持フ
ァイバ／毛細管または対象物支持流体での準備前、準備中または準備後に、探査
すべきまたは位置決めすべき対象物（測定対象物）を、異なるおよび／または同
じスペクトル署名の蛍光色素によりマークし、すなわち、相互にごく近傍にあり
、その有効点画像分布関数の主最大値の半値幅内にある、位置決めすべき構造体
（測定構造体）をスペクトル署名の異なる蛍光色素によりマークし、その相互間
隔が有効点像分布関数の主最大値の半値幅よりも大きい測定構造体をスペクトル
署名の異なるまたは同じ蛍光色素によりマークする。位置決めすべき２つの測定
構造体は、これらが例えばその相対位置または別の基準により一義的に識別でき
る場合には常に同じスペクトル署名によりマークしなければならない。
【００１５】 ・同じ蛍光色素により、所定の大きさおよび空間的配置構成の較正ターゲットを
同じ蛍光色素によりマークする。
【００１６】 ・蛍光発光する較正ターゲットを対象物と共にまたは別個に、対象物ホルダ（対
象物支持プレート、対象物支持ファイバ／毛細管、対象物支持流体等）に準備す
る。
【００１７】 ・（被検）対象物および較正ターゲットを一致条件の下で同時にまたは順次、顕
微鏡でまたは蛍光分析法で探査する。
【００１８】 ・スペクトル署名の異なるそれぞれ定義された２つの較正ターゲットを、それぞ
れの光学系（顕微鏡または流体蛍光計）の波長に依存する結像特性またはローカ
リゼーション特性を考慮して測定し、ここで検出された測定値、すなわち実際値
を既知の実際の間隔値、すなわち目標値（すなわち幾何形状に基づいて計算され
た目標ローカリゼーション）と比較し、実際値と目標値との差、すなわち較正値
が、とりわけ測定対象物の種々の放射箇所の検知における光学系に起因するずれ
を補正するために使用される。
【００１９】 言い替えれば：（相互間の間隔に応じて）異なるまたは同じスペクトル署名に
よりマークされた対象（サブ）構造体（以下、測定構造体と称する）間の間隔測
定が、相応のスペクトル署名と既知の大きさおよび空間的配置構成を備えた独立
の（較正）ターゲットの高精度の位置決めに基づき、それぞれの光学系の波長に
依存する結像特性およびローカリゼーション特性を考慮して実行される。ここで
（較正）ターゲット間の較正測定と生物学的対象物の測定とは同じシステム条件
および周辺条件の下で行われる。この較正ターゲットは、測定すべき（対象）構
造体と同じまたはそれより高いマルチスペクトル性を有する。較正ターゲットは
生物学的対象物に直接配置することができる。または別個のプレパラートとして
対象物ホルダ（対象物支持プレート、または対象物支持ファイバ／毛細管、また
は対象物支持流体等）に存在するか、または対象物ホルダの一部とすることがで
きる。
【００２０】 無傷の３次元生物学的対象物における２つまたは３つの測定構造体であって、
その間隔および広がりが有効点画像分布関数の主最大値の半値幅よりも小さいも
のも、そのスペクトル署名（蛍光吸収波長および／または蛍光放射波長および／
または蛍光放射寿命）の異なることに基づいて弁別することができ、その相互間
隔を検出することができる。
【００２１】 間隔測定は個々の測定構造体の位置決めに還元され、光学的遠隔野顕微鏡また
は蛍光分析計でも、点像分布関数の主最大値の半値幅よりも格段に高い精度によ
り実行することができる。該当する測定構造体の重心の位置決めは、その蛍光信
号の最大強度に適合される。すなわち、蛍光点（＝蛍光測定構造体）の測定され
た（回折に制限された）信号（強度曲線）から、主最大値と副最大値からの全体
情報を考慮して、信号の重心が検出され、ひいては測定構造体の位置が検出され
る。光学系にエラーがなく、その結果、測定された強度分布（＝強度曲線の経過
）が理想的に対称であれば、強度曲線の重心は位置決め精度内で、測定された強
度分布の主最大値（＝回析像の０次最大値）と位置的に一致する。この新たな較
正方法によって、光学的遠隔野顕微鏡並びに例えばウェーブフィールド顕微鏡を
用い（または走査蛍光分析計を用いても）、生物学的微細対象物の幾何学的間隔
を測定することができる。ここでは検出すべき間隔は、対象物における有効点像
強度分布関数の主最大値の半値幅より小さくてもよい。これにより実行された間
隔測定の情報内容は、分解能が向上された際に得られる間隔測定に相当し、（以
下）省略して“等価分解能”について述べることができる。
【００２２】 マルチスペクトル較正によって、システムの結像特性についてのin situ測定 を具体的な生物学的対象物で実行することができる。蛍光寿命を一般的にパラメ
ータ形式として使用する場合、および／または蛍光色素を同じ光子エネルギーに
より励起する場合には、対象物面における干渉的ずれのin situ補正は較正によ って省略される。高分解能の遠隔野顕微鏡、例えばウェーブフィールド顕微鏡に
対して、適切な蛍光色素マーカを使用すれば、この較正方法により３次元幾何形
状の間隔測定を生物学的対象物において分子レベルの精度（すなわち１０ｎｍ以
下の等価分解能で）で実行することができる。
【００２３】 補正値／較正値を比較および検出するための実際値と目標値の検出のために有
利には次の方法ステップが実行される。
【００２４】 ・Ｎ個の測定構造体の重心から有効点像分布関数の主最大値の半値幅よりも大き
な間隔を有する１つまたは複数の較正ターゲットＢを任意のスペクトル署名によ
りマークする。
【００２５】 ・Ｎ個の測定構造体のスペクトル的に分離された回折フィギュアの重心の間隔ｄ ik （ｉ，ｋ＝１...Ｎ、ｉ≠ｋ）と、較正ターゲットＢに対するＮ個の測定構造 体の間隔ｄiBを測定し、画像分析の自動方法を適用する。
【００２６】 ・測定構造体に対して区間ｄikとｄiBをもっとも細い点像分布関数の平面で測定
し、並びに他のすべての間隔を測定する。このために対象物を軸方向トモグラフ
ィックにそれぞれ所定の角度φmだけ回転する。
【００２７】 ・較正測定からの光学的収差を補正し、補正され測定された間隔ｄik（φm）と ｄiB（φm）に対してそれぞれ適切な位相シフトを伴うコサイン関数Ａik cos(φ m ＋φik）ないしはＡiB cos(φm＋φiB）を適合する。
【００２８】 ・ｄikないしはｄiBの適合関数の最大値ＡikとＡiBを拡大係数により割り算し、
Ｎ個の測定構造体相互間のユークリッド間隔ＤikないしはＤiB、または基準点Ｂ
に対する測定構造体の間隔を検出する。
【００２９】 最大値の検出に対しては有利には付加的に、これに相応する間隔ｚikの最小値
をｄik、ｄiBの平面に対して直交する平面で検出して同様に評価する。
【００３０】 Ｎ個の測定構造体のすべての座標の検出および基準点Ｂに対するその相対的座
標、すなわち位置ｘi、ｙi、ｚiおよびｘk、ｙk、ｚkの位置、ないしは間隔ｘk −ｘi、ｙk−ｙi、ｚk−ｚiおよびｘB−ｘi、ｙB−ｙi、ｚB−ｚiの検出は本発 明により、顕微鏡で測定された３Ｄ間隔Ｄik乃至ＤiBを基礎として、有利には次
の等式を使用して行う。
【００３１】 Ｄ2 ik＝（ｘk−ｘi）2＋（ｙk−ｙi）2＋（ｚk−ｚi）2 Ｄ2 iB＝（ｘB−ｘi）2＋（ｙB−ｙi）2＋（ｚB−ｚi）2 Ｄ2 kB＝（ｘB−ｘk）2＋（ｙB−ｙk）2＋（ｚB−ｚk）2 検出された測定結果が確実にするため、前に説明した方法ステップを複数の較
正ターゲットＢに対してと、同じＮ個の測定構造体に対して実行すべきである。
【００３２】 Ｎ個の測定構造体の座標および間隔は重心に基づいて検出することができ、こ
の重心はすべての基準点に対する測定の重心検出から得られる。
【００３３】 とりわけグラフィック表示に対しては、検出された位置ｘi、ｙi、ｚiおよび ｘB、ｙB、ｚBを有利には点像分布関数により畳み込む。この点像分布関数はそ れぞれ達成された等価分解能による半値幅を有している。
【００３４】 測定構造体および較正ターゲットを蛍光色素マーキングするために、有利には
紫外線、可視光線および／または赤外線光波長領域で励起でき、紫外線、可視光
線および／または赤外線光波長領域で検出することのできる蛍光色素を使用する
。
【００３５】 較正ターゲットとして生物学的較正ターゲットまたは非生物学的ないし合成較
正ターゲットを使用することができる。
【００３６】 生物学的較正ターゲットは、相互に既知の間隔を有する生物学的対象物のマー
キングされた領域とすることができる。該当する領域のマーキングは例えば適切
な生化学的ゾンデにより実行することができる。このような生物学的較正ターゲ
ットを使用することの、合成較正ターゲット、例えば較正小球を使用することに
対する実質的利点は、較正の際に対象物の光学的周辺条件の他に付加的に寄生的
周辺条件が較正に影響を与えることである。これは例えば、実際の蛍光信号と非
特異的背景との比である（自動的画像分析アルゴリズムによって検出される）。
【００３７】 非生物学的較正ターゲットないし合成較正ターゲットとして特に微細小球が適
する。この微細小球は、位置決めすべき測定構造体と同じか、またはこれより高
いマルチスペクトル署名を有する。この微細小球は生物学的対象物と同じように
取り扱われる。このような較正ターゲットは有利には対象物ホルダに所定の空間
的配置構成で固定される。この固定は、該当する対象物ホルダを作製する際にす
でに行うことができる。このことはルーチン利用に対して特に有利である。
【００３８】 点像分布関数の主最大値の幅、ひいては分解能限界は、空間における相対位置に
依存して、例えば光軸に対して垂直（＝側方）には、光軸の方向（＝軸方向）に
おけるよりも細いという公知のすべての遠隔野顕微鏡法において存在する問題を
除去するために、前記の較正方法を従来技術で公知のいわゆる微細軸トモグラフ
法と非常に良好に組み合わせることができる。この微細軸トモグラフ法では、（
生物学的）対象物が毛細管またはグラスファイバに配置され、顕微鏡下で所定の
ように軸、通常は顕微鏡の光軸に対して垂直な軸を中心に回転される。このとき
に間隔測定が、有効点像分布関数のもっとも狭い半値幅を有する方向で実行され
る。
【００３９】 遠隔野光顕微鏡法は、生物学的対象物における非常に小さい、蛍光色素マーカ
によって識別されるサブ構造体を検知および結像するのに特に適する。なぜなら
、公知のエピ蛍光顕微鏡法または共焦点レーザ走査顕微鏡に対して、軸方向にも
、すなわち波面に対して垂直にも深い弁別度を有しており、格段に良好な分解が
可能だからである（その次元は開口数が高い場合には、励起に使用する光の波長
よりも格段に小さくすることができる）。これがウェーブフィールド顕微鏡法で
ある。
【００４０】 ウェーブフィールド顕微鏡では、米国特許第４６２１９１１号に記載されてい
るように、蛍光または発光プレパラートが光学的顕微鏡で定在したウェーブフィ
ールドにより照明される（定在波フィールド蛍光顕微鏡法、ＳＷＦＭ）。定在す
るウェーブフィールドは、光がコヒーレントに重畳される箇所に（だけ）発生す
る。プレパラートは等間隔の平坦波面ゾーンに配置され、蛍光発光または燐光発
光のために励起される。波面とその相との間隔は（とりわけ画像形成のために）
変化することができる。個々の光学的断面から、コンピュータ画像処理によって
、蛍光発光または燐光発光する対象物点の３次元分布を再現することができる。
【００４１】 平坦な波面は検知された対象物の光軸に対して垂直に配置されており、２つの
レーザビームを顕微鏡系の光軸に対して所定の角度θｃでコヒーレントに重畳す
ることにより形成される。ここで角度θは、波長と屈折率が定まっている場合に
は波面相互間の間隔を定める。直交する２つのレーザビームの代わりに、ウェー
ブフィールドを次のようにして形成することができる。すなわち、レーザビーム
を所定の角度で適切に反射した（例えばミラーによる）後、それ自体を干渉させ
るのである。平坦な波面は次のことを特徴とする。すなわち、強度経過が波面に
対して垂直の方向に（コ）サイン形状である。
【００４２】 蛍光発光ないし燐光発光は相応の光学的フィルタによりスペクトル弁別され、
種々異なるビーム路に案内される。または共焦点検知される。達成可能な解像度
、すなわち同じスペクトル署名の蛍光色素によりマークされた２つの点状対象構
造体間の最小検知可能間隔は、アッベ基準（＝第１の点対象物の回折画像の０次
最大は第２の点対象物の回折画像の１次最小の中に位置決めされる）により、ま
たは有効点像分布関数の最大値の半値幅により与えられる。これはそれぞれの波
長、使用される対物レンズの開口数、並びに対象物、埋め込み媒体、場合により
使用されるカバーガラスおよび場合により使用される液浸流体の局所的屈折率に
依存する。
【００４３】 公知のウェーブフィールド顕微鏡は基本的に次のように構成される。この顕微
鏡は次の要素を有する。
【００４４】 （Ｉ）照明系ないしは励起系。これらは少なくとも１つのリアル照明源およびバ
ーチャル照明源と、少なくとも１つの対物レンズからなり、これらは１次元、正
弦波状のウェーブフィールドを形成するのに適するように相互に配置されている
。
【００４５】 （ＩＩ）対象物に対するホルダと操作装置を有する対象空間。
【００４６】 （ＩＩＩ）検知システム。検知システムは、少なくとも１つの対物レンズと、少
なくとも１つの接眼レンズと、少なくとも１つの検知器とからなり、しばしばカ
メラ、とりわけＣＣＤカメラであり、ＣＣＤチップが中間画像面に来るよう配置
されている。
【００４７】 この従来技術によるウェーブフィールド顕微鏡（以下、１次元ウェーブフィー
ルド顕微鏡（ＳＷＦＭ）と称する）の欠点、ないしこれにより実施可能なウェー
ブフィールド顕微鏡法の欠点は、周期的に形成されるウェーブフィールド（光学
的セクショニング法と関連したエピ蛍光検知において）のために対象構造体が多
義的に記録ないし結像され、その広がり波面に対して垂直方向にλ／２ｎよりも
格段に大きいことである（λ＝励起の波長、ｎ＝有効屈折率）。この多義性のた
めに、干渉パターンにより達成される解像度改善の効率的利用がまず困難となる
。
【００４８】 間隔測定を実行し、３次元対象物の空間的関係をさらに探査するために、公知
の遠隔野顕微鏡法は、一次元ウェーブフィールド顕微鏡法も含めて、軸トモグラ
フ法と組み合わせることができる。このために探査すべき生物学的対象物、場合
により較正ターゲットを装備した後、対象物ホルダないし対象物支持体としての
毛細管またはグラスファイバに準備される。毛細管／ファイバは正確に定義され
た直径を有し、ここでは種々異なる直径が可能である。この毛細管／ファイバを
顕微鏡に設定するために特別のホルダが提案される。このホルダは剛性の、有利
には背腹部が扁平化されたフレームからなり、これに少なくとも１つの支承ブッ
シュが取り付けられている。このブッシュ内には毛細管またはグラスファイバを
その長手軸を中心に回転することができるよう支承することができる（有利には
回転軸は顕微鏡の光軸に対して垂直）。（支承ブッシュは、毛細管／ファイバの
回転軸が顕微鏡の光軸に対して垂直に延在するよう配置しなければならない。）
毛細管／ファイバにおける被検対象物の回転は、毛細管／ファイバの回転により
直接、または有利には回転モータを使用して行う。
【００４９】 本発明の課題は、公知の形式のウェーブフィールド顕微鏡をさらに改善し、平
坦なウェーブフィールドを１次元以上で形成するのに、干渉最大の間隔の変異性
が高い場合でも適するようにすることである。さらに前記の較正方法をさらに改
善し、このようなウェーブフィールド顕微鏡と組み合わせて使用可能であるよう
にする。さらにウェーブフィールド顕微鏡的ＤＮＡ順序決定のための方法を提供
するものである。
【００５０】 この課題の解決手段は、一方では以降のいわゆる“多次元ウェーブフィールド
顕微鏡”にあり、他方では同じように後で説明する多次元ウェーブフィールド顕
微鏡の適用に適合した較正方法にある。さらに“蛍光ＤＮＡ順序決定”のための
方法が提案される。
【００５１】 本発明による“多次元ウェーブフィールド顕微鏡”（タイプＩ）では、冒頭に
述べた形式のウェーブフィールド顕微鏡が取り扱われる。この顕微鏡は以下にリ
ストアップした特徴を有する。
【００５２】 （１）照明系ないしは励起系が、２つまたは３つすべての空間方向に、コヒーレ
ントな光ビームに対する少なくとも１つのリアル照明源またはバーチャル照明源
を有し、少なくとも１つの反射器またはビームスプリッタを部分ビームを出力結
合するために有し、さらにコヒーレントな光ビームに対する別の照明源を有する
。これらの光ビームにはそれぞれ少なくとも１つの対物レンズが配属されており
、それぞれ光波シーケンスを形成するのに適するものである。ここで照明源の１
つの光波シーケンスは逆並列または可変調整可能な角度で反射器ないし他の照明
源の光波シーケンスに対して配向されている。そして照明源の１つから発する光
波シーケンスは反射器ないしは他の照明源の光波シーケンスにより、平坦な波面
を有する１つの定在的ウェーブフィールドに干渉される。
【００５３】 （２）検知システムは、エピ蛍光検知に適したおよび／またはラスタ状の点検知
に適した少なくとも１つの検知対物レンズを有する。この対物レンズは有利には
開口数が大きく、その光軸は干渉ウェーブフィールドの波面に対して垂直に配置
されており、励起系の対物レンズと同じであってもよい。エピ蛍光検知に適した
検知対物レンズには扁平な（２次元）検知器、例えばカメラが前置されており、
ラスタ状の点検知に適する検知対物レンズには少なくとも１つの固定の共焦点検
知リング絞りおよび／または検知ホール絞りおよび／または少なくとも１つの固
定の検知スリットが前置されており、点検知器、とりわけフォトマルチプライヤ
、フォトダイオード、またはダイオードアレイが後置されている。
【００５４】 開口数が大きいとは、ここでは開口数≧１であり、開口数が小さいとは、開口
数＜１であると理解されたい。
【００５５】 ウェーブフィールド顕微鏡（タイプＩ）の特に有利な実施形態では、少なくと
も１つの空間方向で、開口数の大きな対物レンズに開口数の小さな対物レンズま
たは反射器が配属されており、別の１つまたは２つの空間方向で、開口数の小さ
い２つの対物レンズまたは開口数の小さい対物レンズと反射器が相互に配属され
ている。
【００５６】 本発明の“多次元ウェーブフィールド顕微鏡”（タイプＩＩ）では、冒頭に述
べた形式のウェーブフィールド顕微鏡が取り扱われる。この顕微鏡は次の特徴を
有する。
【００５７】 （１）照明系ないし励起系は、３つの空間方向の少なくとも１つに、コヒーレン
トな光ビームに対する少なくとも１つのリアル照明源またはバーチャル照明源を
有し、少なくとも１つのビームスプリッタを少なくとも１つの部分ビームを出力
結合するために有し、これら光ビームには共通の対物レンズが配属されており、
この対物レンズに照明源およびビームスプリッタの光ビームないし光波シーケン
スを次のように入力結合することができる。すなわち、これら光ビームないし光
波シーケンスが（対象空間の反対側の）後方焦点面に、相互に間隔をおいた２つ
の焦点ポイントを形成し、２つの焦点面の間の空間で可変調整可能な角度で相互
に延在し、１次元の定在ウェーブフィールドに干渉するように入力結合すること
ができる。
【００５８】 （２）検知システムは、エピ蛍光検知に適したおよび／またはラスタ状の点検知
に適した少なくとも１つの検知対物レンズを有し、この検知対物レンズは有利に
は開口数が大きく、励起系の対物レンズと同じであってもよい。エピ蛍光検知に
適した検知対物レンズには平坦な２次元検知器、例えばカメラが前置されており
、ラスタ状の点検知に適した検知対物レンズには少なくとも１つの固定の共焦点
検知リング絞りおよび／または検知ホール絞りおよび／または少なくとも１つの
固定の検知スリットが前置されており、点検知器、とりわけフォトマルチプライ
ヤ、フォトダイオード、またはダイオードアレイが後置されている。
【００５９】 ウェーブフィールド顕微鏡（タイプＩＩ）の有利な実施例では、照明系ないし
励起系は同じ空間方向、または別の１つまたは２つの空間方向に、コヒーレント
な光ビームに対するそれぞれ１つの別のリアル照明源またはバーチャル照明源を
、および／または少なくとも１つの部分ビームを出力結合するための少なくとも
１つのビームスプリッタを有し、これらの部分ビームにそれぞれ１つの別の対物
レズが配属されており、この対物レンズにより光ビーム（光波シーケンス）が対
象空間に偏向され、次のように配向される。すなわちこれらが、同じ空間方向ま
たは別の２つの空間方向から発する光ビームにより、またはこれにより形成され
た１次元または２次元ウェーブフィールドにより、２次元または３次元ウェーブ
フィールドに干渉されるように配向される。
【００６０】 前記の本発明のウェーブフィールド顕微鏡全体（タイプＩとＩＩ）で非常に有
利な別の改善形態では、対象空間が対象物ホルダを有し、このホルダに測定構造
体および／または場合により較正ターゲットを備えた対象物が１つまたは相互に
直交して延在する２つの軸を中心にウェーブフィールド内で回転可能に支承され
、少なくとも１つの軸に対しては３６０゜（２π）の回転性が有利である。
【００６１】 この本発明の多次元ウェーブフィールド顕微鏡タイプＩとタイプＩＩにより、
時間的に連続して、および／または同時に複数の対象面を１つ、２つおよび／ま
たは３つの対物レンズ（ないしはこれらに直交する軸）によって実行することが
できる。スペクトル署名が同じまたは異なり、間隔が有効点像分布関数の主最大
値の半値幅よりも小さい点状対象物の精密間隔測定を（すべての）空間的方向で
行うことができる。
【００６２】 固定の共焦点検知リング絞り、検知ホール絞り、および／または固定の検知ス
リットを少なくとも１つの適切な光強度検知器と組み合わせれば、対象物をｘ、
ｙ、およびｚ方向でウェーブフィールドによりラスタ化する有利な手段が得られ
る（対象物走査またはステージ走査）。
【００６３】 本発明のウェーブフィールド顕微鏡タイプＩと、これにより実行可能なウェー
ブフィールド顕微鏡法は、とりわけ公知の一次元ウェーブフィールド顕微鏡に対
して次のような利点を有する。すなわち側方分解能（すなわち光軸に対して垂直
）も軸方向分解能も格段に改善される。扁平な対象物を軸方向で、共焦点システ
ムを使用せずに初めて弁別することができるようになった。さらに対象物を探査
中ないし記録／データ収集中にラテラル方向にシフトすることができる。画像処
理方法および再現方法により、このようにして得られた多重記録から比較的に高
い側方分解能が得られる。１つの対物レンズを有する本発明の構造タイプＩＩは
さらに一次元ウェーブフィールドを、エピ蛍光顕微鏡の光軸に対して垂直に形成
するのに適し、これによりその側方分解能を改善するのに適する。
【００６４】 この“多次元ウェーブフィールド顕微鏡”（タイプＩおよび／またはタイプＩ
Ｉ）の別の有利な実施例では、多次元ウェーブフィールドを形成する照明源尾ｙ
び／または反射器および／またはビームスプリッタおよび／または対物レンズ、
およびひいては多次元ウェーブフィールドが、１つまたは相互に直交して延在す
る２つの軸を中心に回転可能に配置ないしは取り付けられる。
【００６５】 ２次元または３次元のウェーブフィールドに定在する対象物のラテラル対象領
域を検知リング絞り、検知ホール絞りないしは検知スリットに結像するために、
それぞれ本発明のウェーブフィールド顕微鏡（タイプＩおよび／またはタイプＩ
Ｉ）に走査ミラーを装備することができる。この走査ミラーは該当するラテラル
対象領域を所望の、通常は最大の蛍光発光強度で結像するように配置される。
【００６６】 本発明の多次元ウェーブフィールド顕微鏡（タイプＩおよび／またはタイプＩ
Ｉ）の特に有利な改善形態では、この顕微鏡は２つまたはそれ以上の光子蛍光励
起に適し、いわゆる“マルチフォトン蛍光励起と組み合わされたウェーブフィー
ルド顕微鏡”を有する。この顕微鏡ではそれぞれ照明系が３つの空間方向の少な
くとも１つにリアル照明源を２フォトン励起またはマルチフォトン励起のために
、別の１つまたは２つの空間方向に１つのリアルおよび／またはバーチャル照明
源を２つまたはマルチフォトン励起のために有する。これにより形成された定在
ウェーブフィールド（ＷＦ１，ＷＦ２，...ＷＦｉ）は相互に異なる波長（λ１ ，λ２，...λ３）を有する。それぞれの最大波ないしは最小波との間の間隔（ ｄ１，ｄ２，...ｄ３）はｄ１＝λ１／２ｎ cosθ１，ないしｄ２＝λ２／２ｎ
cosθ２ないしｄｉ＝λｉ／２ｎ cosθｉ（ｎ＝対象空間における屈折率、θ１ ，θ２，...θｉ＝波長λ１，λ２，...λｉの光波シーケンスと光軸との交差角
）である。これらｎウェーブフィールドＷＦ１，ＷＦ２，...ＷＦｉは本発明で は次のように相互に配向される。すなわち、２つのまたはすべての定在波の少な
くとも１つの最大値が同じ箇所で、すなわちマルチフォトン励起の箇所に存在す
るように配向される。
【００６７】 ２フォトン励起またはマルチフォトン励起に対して適した照明源は従来の技術
で公知であり、例えば刊行物 W.Denk,J.H.Strickler,W.W.Webb,"Two-Photon Las
er Scanning Fluorescence Micrscopy",Science,Vol.248,pp.73-76(6.Apri 1990
)に記載されている。この照明源は、種々異なる波長のフォトンまたは同じ波長 のコヒーレントなフォトンを発生する。
【００６８】 １フォトン励起および２フォトン励起またはマルチフォトン励起を組み合わせ
ることの利点は、スペクトル署名の異なる蛍光色素マーカを同時に励起すること
である。このことにより間隔測定のエラーを対象物の色収差に基づいて除去する
ことができる。２フォトン励起の場合には、２つのフォトンが同時に分子を励起
するエネルギーを送出する場合に蛍光色素分子が励起される。ここでは分子の励
起に関与する２つのフォトンが同じ、または異なる波長ないしはエネルギーを有
する。異なる波長により（λ１，λ２）同時に発生する励起に対しては、いわゆ
る“２フォトンウェーブフィールド顕微鏡”の場合、それぞれの空間方向の各々
にそれぞれ波長λ１とλ２の２つのウェーブフィールドを組み込まなければなら
ない。２つの定在ウェーブフィールド（ＷＦ１，ＷＦ２）の最大波ないしは最小
波はここで間隔ｄ１＝λ１／２ cosθ１ないしｄ２＝λ２／２ｎ cosθ２を有す
る（ここでｎ＝対象空間における屈折率、θ１，θ２＝波長λ１，λ２のレーザ
ビームと光軸との交差角）。一般的に間隔ｄ１とｄ２は異なるから、２つのウェ
ーブフィールドは空間方向ごとに次のように配向される。すなわち、２つの定在
波の主最大値が同じ箇所に存在するように配向される。マルチフォトン効果は次
の箇所でだけ発生することができる。すなわち、２つのウェーブフィールドが重
なる箇所でだけ発生することができる。これにより１つの空間方向のウェーブフ
ィールドの個々の縞だけがマルチフォトン励起に使用される。次元がｄより大き
い対象物での多義性は、条件ｋ１ｄ１＝ｋ２ｄ２（ｋ１，ｋ２は整数）を満たす
次元で初めて発生する。蛍光マーキングされた測定構造体および較正ターゲット
のマルチフォトン励起によって、３次元結像の一義性が達成される。
【００６９】 ２フォトンまたはマルチフォトン励起蛍光励起法を使用することによって、対
象物、すなわち対象点、対象ライン、および対象面の高速走査が可能になり、こ
れにより対象物が運動する場合でも改善された結像品質が達成される。
【００７０】 本発明の多次元ウェーブフィールド顕微鏡の同様に有利な改善形態では、光源
、対物レンズ、および１次元電気的ウェーブフィールドを形成するのに適した導
線性ミラーからなる構成体が対象物支持ホルダに対して相対的に設けられ、対象
物に存在する測定構造体および／または較正ターゲットを、必要な場合には（例
えばこれらが分子鎖に存在する場合）電界の印加によって、顕微鏡測定過程前ま
たは中に整列させることができる。（このようにして空間的に整列された分子鎖
は続いて固定物質に固定することができる。）本発明のウエーブフィールド顕微
鏡のこの変形実施例は、とりわけウエーブ顕微鏡的ＤＮＡ順序決定に適し、ここ
では１次元電気ウェーブフィールドがＤＮＡ順序決定の較正に使用される。
【００７１】 蛍光発光を検知するために有利にはＣＣＤカメラが公知のように使用される。
カメラは検知リング絞りまたは検知ホール絞りまたは検知スリットの後方に配置
することができる。ＣＣＤカメラないしＣＣＤチップの代わりに、本発明の多次
元ウェーブフィールド顕微鏡に電子的画像記録装置を装備することができる。こ
れは、従来技術の共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）から公知である。本発明
では基本的に、いずれかの感光性検知システム、例えばフォトダイオード、フォ
トマルチプライヤ、ＣＣＤカメラ／チップ、ＣＣＤアレイ、アバランシュダイオ
ード、（アバランシュ）ダイオードアレイ、２次元（アバランシュ）ダイオード
マトリクスを検知リング絞りまたは検知ホール絞りまたは検知スリットの後方に
配置することができる。これは蛍光を検知し、記録し、蛍光寿命測定を行うこと
ができるようにするためである。
【００７２】 本発明の較正方法は、以下の特徴を有する、冒頭に述べた形式の較正方法であ
る。
【００７３】 （１）蛍光色素マーキングされた測定構造体および／または蛍光色素マーキング
された較正ターゲットを備えた生物学的対象物が連続的にまたは同時に、２つま
たは３つの空間方向で相互に直交して延在する、２次元または３次元ウェーブフ
ィールドに対して相互に干渉する定在的な個々の（別個の）ウエーブフィールド
により照明される。ここで蛍光色素は蛍光発光のために励起される。
【００７４】 （２）蛍光強度を検知するためにカメラ、および／または個別検知器からなる１
つまたは複数の２次元構成体が使用される。個別検知器は、それぞれ円形、リン
グ状、スリット状の絞り、または複数の円形、リング状、スリット状の絞りから
なる構成体を有する。
【００７５】 （３）測定構造体および／または較正ターゲットを備えた対象物または１次元な
いし２次元ウェーブフィールド、または両方を測定過程中にステップごとに１つ
の軸または相互に直交する２つの軸を中心に回転し、蛍光マーキングされた測定
構造体および／または較正ターゲットを連続的にまたは同時に、相互に直交する
１つまたは２つの個々のウェーブフィールドにより照明する。
【００７６】 同時照明の場合は、測定構造体および較正ターゲットを有する微細対象物が固
定されるか、または軸を中心に回転可能に支承される。２つまたは３つの相互に
直交して延在する定在的で平坦なウェーブフィールドが干渉され、微細対象物を
同時に照明する。ウェーブフィールドが２つの場合には、２次元対称グリッドを
備えた面が発生する。このグリッドは最大強度と最小強度の点からなる。３つの
ウェーブフィールドを使用する場合には、対称性で規則的に配置された、最大強
度と最小強度の点からなる３次元空間グリッドが発生する。最大強度と最小強度
との間には連続的強度分布が存在する。
【００７７】 連続照明の場合には、微細対象物をウェーブフィールド中で２つの軸を中心に
回転する。検知中または検知後に、ウェーブフィールドの位置を対象物に対して
相対的に変化することができる。
【００７８】 適切な蛍光色素マーカを使用すれば本発明により、スペクトル署名が同じまた
は異なる蛍光ターゲット間の３次元（３Ｄ）幾何学的間隔測定を分子レベルの精
度で行うことができる。すなわち１０ｎｍよりも良好な３Ｄ等価分解能と、１ｎ
ｍよりも良好な３Ｄ位置決め精度によって行うことができる。電子顕微鏡ないし
光学的および非光学的近接野顕微鏡とは異なり、探査すべき対象物の３次元構造
は完全なままである。なぜなら、機械的ステップが省略されるからである。これ
により３次元保存微細対象物において、３Ｄ間隔測定を有効点像分布関数の主最
大値の半値幅よりも小さい領域で行うことができる。とりわけこの方法により３
次元間隔測定を、生物学的対象物の生体条件の下で実行することができる。ＤＮ
Ａ順序決定の際には、ゲルの作製とＤＮＡ片を電気泳動的に分離することが省略
される。同じようにオートラジオグラフも省略することができる。なぜなら放射
性マーキングは実行されないからである。長いＤＮＡ順序決定（例えば＞１ｋｂ
ｐ）の場合でも直ちに分析することができる。
【００７９】 この本発明の方法変形実施例によりさらに、形態的サイズ（例えば容積、表面
）の検出が格段に改善される。これはマルチスペクトル蛍光色素マーカが適切に
、例えば対象物の表面に分散される場合である。例えばこのようにして数１００
ｎｍの半径の球形微細対象物の容積を、従来の形態学的セグメント化技術を用い
る場合よりも良好に検出できる。これは例えば、CavalieriおよびVoronoi法、ま
たは容積保存漸次閾値法である。
【００８０】 本発明の多次元ウェーブフィールド顕微鏡（タイプＩおよび／またはタイプＩ
Ｉ）と本発明の較正方法によって、顕微鏡的ＤＮＡ順序決定を実行することがで
きる。このために本発明では、以下に説明する“ＤＮＡ順序決定のためのウェー
ブフィールド顕微鏡法”が提案される。
【００８１】 （１）分析すべきＤＮＡシーケンスのすべての相補的サブシーケンスが次のよう
に作成される。すなわち、すべてのサブシーケンスが分析すべきシーケンスの同
じヌクレオチドで開始するように作成される。
【００８２】 （２）分析すべき破片をすべての３’エンドで基準蛍光色素マーカαにより、５
’エンドおよび／または所定の中間箇所で蛍光色素マーカａ，ｇ，ｃまたはｔに
よりマーキングする。これはヌクレオチドがアデニン（マーカａ）、グアニン（
マーカｇ）、シトシン（マーカｃ）またはチミン（マーカｔ）をキャリーするか
に応じて行う。ここで蛍光色素マーカａ，ｇ，ｃ，ｔおよびαは異なるスペクト
ル署名を有し、それぞれ１つまたは複数の蛍光色素分子を含む。
【００８３】 （３）マークされたＤＮＡサブシーケンスを次のようにキャリアに固定する。す
なわちこれらが線形シーケンスとして存在し、１次元または多次元ウェーブフィ
ールド顕微鏡にもたらされるように固定する。
【００８４】 （４）線形ＤＮＡサブシーケンスは定在波面に次のように配向される。すなわち
、αとａ，ｇ，ｃまたはｔとの正確な間隔測定（精度≦１＊１０-10ｍ）が、強 度重心の検出と結像特性の較正後に実行できるように配向される。
【００８５】 （５）蛍光色素マーカの信号をステップごとに、相互にスペクトル分離して記録
し、 （６）蛍光色素マーカの間隔とそのスペクトル署名から、分析すべきＤＮＡ片の
ＤＮＡベースシーケンスを検出する。
【００８６】 この従来技術にはない全く新しい方法により、ＤＮＡ断片の長さをヌクレオチ
ドに正確に測定することができ、そのベースシーケンスも正確に検出することが
できる。ゲル電気泳動および後続のバンド評価を省略することができる。
【００８７】 本発明を詳細に説明するための実施例および比較例： 例１：回転可能に支承される対象物を備えたタイプＩの多次元ウェーブフィー
ルド顕微鏡の構造 基礎は従来の“一次元ウェーブフィールド顕微鏡”である。この顕微鏡は、開
口数の大きな対向する２つの対物レンズを有するか、または開口数の小さい対物
レンズと開口数の大きな対物レンズを有するか、または干渉する２つのレーザビ
ームに対する対物レンズを有する。対物レンズによりレーザの２つの部分ビーム
が次のように干渉される。すなわち、一次元の定在ウェーブフィールドが発生す
るように干渉される。開口数の大きい１つまたは２つの対物レンズを介して蛍光
が検知される。それぞれ検知対物レンズの光軸に対して直交する１つまたは２つ
の方向で、レーザのそれぞれ２つの別の部分ビームが開口数の小さい対物レンズ
および／または焦点レンズ系を介して適切な間隔で入力結合され、相互に一次元
の定在ウェーブフィールドと干渉される。これにより強度最大値と強度最小値か
らなる２次元または３次元の対称性強度パターンが発生する。
【００８８】 この“多次元”ウェーブフィールド顕微鏡に対象物支承のために微細軸トモグ
ラフが組み込まれる。
【００８９】 軸トモグラフでは、ガラス対象物支持体の代わりに毛細管またはグラスファイ
バが使用され、これらは回転可能に支承され、（生物学的）対象物を収容（毛細
管）するか、または（生物学的）対象物が適切に取り付けられる（毛細管／ファ
イバ）。手動でまたはコンピュータ制御したステップモータにより、通常は検知
対物レンズの光軸に対して垂直に配置された毛細管／ファイバをファイバ軸を中
心に所定の角度だけ回転することができる。３６０゜（２π）の角度の回転も可
能である。毛細管／ファイバに対する支持体ホルダは半円に回転可能に支承され
る。ここで回転軸は検知対物レンズの光軸に対して垂直に延在する。
【００９０】 微細ターゲットおよびその間隔の空間的構成の検知は本発明の較正方法とデジ
タル画像分析を用いて行われる。強度経過の多義性、すなわち蛍光ポイントの強
度主最大値と副最大値は適切なコンピュータアルゴリズムを用いて統計的に評価
することができ、これにより位置決め精度を向上させることができる。対象物が
膨張している場合には、多義性は種々異なる波長のフォトンによって２またはマ
ルチフォトン励起することにより低減される。
【００９１】 例２：多次元ウェーブフィールド顕微鏡、本発明の較正方法および場合により
軸トモグラフを用いて細胞核内の染色体の遺伝子部分の間隔を測定する。
【００９２】 （Ｉ）細胞核で個々の染色体のクロマチンは所定の部分領域を取る。このような
１つまたは複数の染色体部分領域内で、位置決めすべき構造体、すなわち測定構
造体、例えば遺伝子または遺伝子の破片のような小さな染色体部分が、従来技術
から公知の蛍光法によって in situ で特異的にマークされる。すなわち異なる 既知のスペクトル署名Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，...の蛍光色素によりマークされる。 マーキング箇所の間隔（マークされた測定構造体の間隔）は古典的分解能以下で
ある。すなわちこの間隔は、有効点像分布関数の主最大値の半値幅よりも小さい
。（対象）構造体（測定構造体）のマーキングは、スペクトル署名が位置決めす
べき構造体（測定構造体）においてほぼ同じダイナミクスにより代理されるよう
に行われる。
【００９３】 生物学的対象物は正確に所定の直径を有するグラスファイバに、または所定の
大きさの丸いまたは矩形の毛細管に準備される。
【００９４】 （ＩＩ）間隔を検出するために、較正ターゲットを備えた顕微鏡プレパラートが
作製される。すなわち、対象物ないし位置決めすべき対象構造体（＝測定構造体
）と同じ物理的および化学的探査条件の下で作製される。
【００９５】 較正ターゲットとして、ないしは較正ターゲットを備えたプレパラートとして
例えば ａ）（単色）スペクトル署名の微細注入された小球を用いる。
【００９６】 小球は、公知の方法に従いそれぞれ１つの蛍光色素により単色マーキングされ
、その大きさに基づいて、対象物（測定構造体）中の測定すべき（位置決めすべ
き）構造体から区別することができる。次のような較正小球を注入する。すなわ
ち対象物に存在する測定構造体のスペクトル署名を表す、そうでなければ有利に
は同じ（大きさ、幾何形状、材料特性等）較正小球を注入する。言い替えれば、
測定構造体並びに較正ターゲットのスペクトル署名を次のように選択する。すな
わち所与の探査条件の下で、これらにより放射された蛍光発光が相互に別個に分
析できるように選択される。単色較正小球の注入と固定は次のように行われる。
すなわち、スペクトル署名の異なる個々の小球がクラスタで、グラスファイバ表
面または毛細管壁に直接整列され、有利にはファイバないし毛細管の横断面に整
列されるように行われる。精密ファイバおよび／または精密毛細管を使用する場
合には、小球は相互に所定の間隔で、または基準面、基準軸または基準線から所
定の間隔に位置する。
【００９７】 ｂ）マルチスペクトル署名（多色）および同じスペクトルダイナミックスの微細
注入可能な検査小球 小球は公知の方法に従い、マーキングされた（対象）構造体（測定構造体）に
おいて生じるすべてのスペクトル署名によりマーキングされる。その結果、小球
は任意の箇所で測定すべき生物学的対象物（ここでは核）に注入することができ
る。ａ）の場合のような目標幾何形状は必要ない。なぜなら、各署名に対して単
色重心が同じ箇所で位置決めされるべきだからである。マーキングされた（対象
）構造体（測定構造体）から区別するために、小球は別の大きさ等級に所属する
か、または付加的なスペクトル署名を有する。この付加的なスペクトル署名は測
定すべき構造体、すなわち測定構造体（準備プロトコルによる）に現れない。
【００９８】 ｃ）１つの別の染色体における既知の間隔の同時マーキングされた染色体領域を
、位置決めすべき構造体（測定構造体）を支持するものとして： 較正小球、すなわちここでは相互に既知の間隔を有する染色体領域はＤＮＡシ
ーケンスの試行組み合わせを用いて異なってマークされる。このＤＮＡシーケン
スは異なるスペクトル署名を有する。染色体較正ターゲットを位置決めすべき（
染色体）構造体（測定構造体）から区別することは、例えば種々異なる蛍光強度
により行うことができる。またはスペクトル署名の異なる蛍光色素間の異なる強
度関係により、または測定ターゲットの蛍光マーキングの際に使用されたスペク
トル署名とは異なる付加的な蛍光色素を使用することにより行うことができる。
【００９９】 較正ターゲットが位置決めすべき測定構造体とは別の大きさ等級に所属するこ
ともできる。
【０１００】 （ＩＩＩ）間隔測定は本発明の多次元ウェーブフィールド顕微鏡により、フォト
マルチプライヤおよび／またはカメラおよびデータ処理装置と組み合わせて実行
される。生物学的対象物、ここでは例として細胞核から一連の光学的断面が記録
される。測定構造体Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３,...Ｍｌはｌ＝１，２，...,Ｌのスペクト
ル署名を有する。較正ターゲットＵ１，Ｕ２，Ｕ３,...,Ｕｌのスペクトル署名 は測定構造体のスペクトル署名とは、例えば容積、直径、強度またはスペクトル
署名の数（ｌ＝１，２，...Ｌ＋ｌ）の点で異なる。光学的断面の画像は各スペ クトル署名ごとに別個に記録され、場合によりさらにバックグランド補正される
。評価のためにまず、較正ターゲットが同定され、色収差が検出される。このた
めに較正ターゲットが各スペクトル署名の下で位置決めされ、ペクトル署名の異
なるス蛍光色素マーキングを備えた較正ターゲット間の間隔が測定される。測定
された位置（すなわち測定されたターゲット間隔）は幾何形状に基づき計算され
た目標位置（すなわち実際のターゲット間隔）と比較され、これからスペクトル
に起因するずれ（シフト）が検出される。
【０１０１】 このずれ（シフト）は、位置決めすべき（対象）構造体（測定構造体）間で測
定された間隔値に対する較正値である。
【０１０２】 このずれはプレパラートの光学的特性（例えば核およびプレパラート媒体にお
ける屈折率）に依存するから、構成は in situ で行わなければならない。すな わちこの実施例では、較正ターゲットは、探査しマーキングすべき（染色体）構
造体（測定構造体）の傍らで核内に存在しなければならない。
【０１０３】 さらに、位置決めすべき（対象）構造体（測定構造体）間の間隔が位置決めさ
れる。ここでは各スペクトル署名でまず、相互に依存しないで、測定された強度
信号の重心位置が検出される。すなわち、種々異なる色信号間の間隔ないしは該
当する測定構造体の色点間の間隔、例えば赤発光する色点と緑発光する色点との
間の間隔が測定される（最大強度から最大強度まで、または重心から重心まで）
。そしてこの測定値が較正ターゲットにより検出された（種々異なるスペクトル
署名に起因する）ずれだけ高精度に補正される。
【０１０４】 測定構造体の補正された位置は比較点を基準に表される。この比較点は例えば
対象物内で任意に示された固定の点、または較正ターゲット（例えばマーキング
された染色体領域）の重心、または何らかの方法で示された染色体テリトリーの
重心とすることができる。しかしすべての測定構造体の重心座標が染色体テリト
リー内にあることもできる。
【０１０５】 較正ターゲットがマルチスペクトル署名（多色）を有する微細注入可能な検査
小球の形態であれば、色収差は各署名に対する重心の位置差から検出される。較
正ターゲットに所属する蛍光発光の、そのために必要な同定は例えば、容積閾値
法または閾値変化の際のセグメント化結果を平均することによって行うことがで
きる。
【０１０６】 較正ターゲットが、マルチスペクトル署名（多色）を備え、蛍光色素マーキン
グされた対象領域の形態にあれば、色収差は正確に検出される。
【０１０７】 蛍光色素マーキングされた構成領域として動原体領域も適する。この動原体領
域は、次のようなＤＮＡシーケンスの試行組み合わせによりハイブリッド化され
る。このＤＮＡシーケンスはすべてを同じ染色体ＤＮＡ部分で結合するが、スペ
クトル署名の異なる蛍光色素によってマーキングされる。ハイブリッド化が首尾
一貫した条件の下で行われれば、１細胞核当たりに２つのマーキング領域が存在
し、条件が緩和されれば、付加的な副次結合領域により付加的な動原体領域がマ
ーキングされる。これにより構成領域の数が上昇する。これは場合により非常に
有利である。
【０１０８】 （ＩＶ）説明した測定方法は軸トモグラフとの組み合わせでも実行することがで
きる。このために生物学的微細対象物、例えば細胞核がグラスファイバまたは毛
細管に配置される。この細胞核では位置決めすべき測定構造体がすでに蛍光色素
によりマーキングされており、またすでに較正ターゲットを含んでいる（例１参
照）。軸トモグラフにより対象物をはステップごとに所定の角度だけ回転され、
場合により自動的にリフォーカスされる。各角度ステップから完全な２Ｄ画像ス
テープルまたは３Ｄ画像ステープルが記録される。
【０１０９】 回転は、２つの測定構造体ないし較正ターゲット間のそれぞれの（すなわち蛍
光強度重心間の）間隔が最大になるように行われる。測定された最大間隔は実際
の間隔に相応する。
【０１１０】 次に測定構造体ないし較正ターゲット間の間隔に興味があれば、すなわちその
空間的絶対配置には興味がなければ、既知の測定構造体ないしは較正ターゲット
から出発して、第３の測定構造体ないしは第３の較正ターゲットまでの間隔を最
大にし、検出することができる。測定構造体ないし較正ターゲット間の間隔が点
像分布関数の主最大値の半値幅よりも大きければ、ただ１つのスペクトル署名で
十分である。これに対して間隔がそれより小さければ、測定構造体ないし較正タ
ーゲットをマルチスペクトル署名により区別しなければならない。信号の重心（
最大値）は位置決めに用いられる。探査される測定構造体が、有効点像分布関数
の主最大値の半値幅よりも小さい直径を有していれば、測定構造体ないし較正タ
ーゲットのすべての回折画像は鮮鋭な点像分布関数により検出される。これによ
り最大値を最適に検出することができる。
【０１１１】 測定構造体ないし較正ターゲットの空間における絶対的配置に興味があるなら
、それぞれの重心を正確に検出しなければならない。全体の測定手続きを複数回
繰り返し、統計的に評価することにより、測定構造体ないし較正ターゲットの絶
対的位置決め、すなわち角度測定を改善できる。
【０１１２】 前に説明した較正と、位置決めすべき構造体、すなわち測定構造体間の間隔測
定を同じ生物学的対象物で実行する代わりに、較正を測定構造体に依存しないで
、同種の生物学的対象物で実行することができる。この方法変形実施例では、較
正ターゲットの蛍光信号と、測定構造体の蛍光信号との区別が容易になる。較正
ターゲットにより検出された光学的ずれの値に基づいて、測定構造体間の間隔測
定に対する較正曲線を作成することができる。この種の較正曲線により例えば、
使用される液浸媒体、使用される光学系、フィルタおよび検知ユニット、使用さ
れる評価アルゴリズム、使用される生物学的対象物、測定構造体ないし較正ター
ゲットの位置等の屈折率および吸収の関数としてのスペクトルずれを表すことが
できる。この特別な較正曲線からの情報は本発明の間隔測定に、とりわけ大きな
精度公差が許容される場合に使用される。
【０１１３】 例３；３次元に膨張した対象物を多次元ウェーブフィールド顕微鏡、本発明の
較正方法および同時画像記録によって探査し表示する。
【０１１４】 通常、生物学的微細対象物から３Ｄ間隔が連続的記録によって得られる。例え
ば共焦点レーザ走査顕微鏡では３Ｄ対象物容積を点ごとまたは線ごとに走査する
ことにより得られる。第２の方法は、対象面からの蛍光放射を検知アレイの位置
決めによって記録することに基づくものである。この検知アレイの位置決めは対
象面と共役の中間像面で行われ、通常は中間画像面の位置が固定される。生物学
的対象物の３Ｄ情報を得るために、対象物は連続的に固定の中間画像面に対して
共役の対象面を通過して運動される。そのたびに該当する蛍光放射の２Ｄ画像デ
ータ集合が記録される。および／または対象物は軸トモグラフ法によって種々異
なる回転角度だけ回転され、そのときに固定の中間画像面に対して共役の対象面
の２Ｄデータ集合が記録される。
【０１１５】 対象点、対象ライン、または対象面のこの連続的記録は種々の欠点を有する。
例えば、３Ｄデータ集合の記録が褪色すれば、所定のスペクトル署名でマーキン
グされた対象点の蛍光分布において本発明により検出された３Ｄ重心がずれてし
まう。別の欠点は、３Ｄデータ記録が十分に高速ではなく、恒久的には安定しな
い、すなわち運動する対象物の場合、とりわけ数ｎｍ／ｓまでの速度による物理
的条件の下で運動する生体細胞の核において染色体領域が蛍光マーキングされる
ような in vivo マーキングの場合には、満足できる画像品質が保証されない。
【０１１６】 対象物が運動する場合でも満足できる結像品質を得るために、本発明では蛍光
マーキングされた対象物を３Ｄデータ集合を同時記録する。このために対象物か
ら放射された所与のスペクトル署名の蛍光光が光学的要素、例えばハーフミラー
によってＮ個の部分ビームに分割され、Ｎ個のデータアレイに結像される。デー
タアレイはＮ個の異なる中間画像面に存在し、この中間画像面はＮ個の異なる対
象面に対して共役である。結像等式に基づいた簡単な推定により、中間画像面（
検知面）の間隔は、１０μｍの軸方向広がりを有する対象領域と、従来の像距離
と開口数の大きい対物レンズとを同時に記録する場合には、≦２０ｃｍのオーダ
ーで１領域だけ変化しなければならないことが判明した（使用される対物レンズ
に依存して）。別のＮ個の中間光学系により、高精度間隔測定のために、記録す
べきＮ個の対象面に関連する対象領域を、同じ適切な大きな寸法の検知アレイ（
ないしはＬ＜Ｎの検知アレイ）の別の領域に結合することができる。この場合、
Ｌ個の検知アレイの所定の部分にはＮ個の共役対象面の１つが相当する。例えば
数μｍの広がりの小さな対象領域を測定のためにウェーブフィールド顕微鏡にま
ず次のように粗く位置決めする。すなわち、その重心が所定の（中間）画像面Ｂ
０に対する検知点増分布関数により定められた、記録に使用される顕微鏡対物レ
ンズの観察容積のほぼ中心に来るように粗く位置決めする。３Ｄ対象物から発す
る蛍光光をそのスペクトル署名に従って別個にＮ個の部分ビームに分割する。こ
のＮ個の部分ビームはＮ個の検知アレイ（例えばそれぞれ８×８，１６×１６ま
たは６４×６４のピクセルサイズ）に結像され、それらの位置決めによりＮ個の
共役対象面からの蛍光放射の記録が検知点増分布関数（画像面Ｂ０を基準にして
）の最大値を中心に行われる。
【０１１７】 例えばそれぞれ２０ｎｍの間隔を有する対象物を同時に記録する場合、簡単な
推定によれば上記の前提の下で、共役中間画像面をそれぞれ少なくとも１００μ
ｍ（点像分布関数の最大値の近傍で）だけずらさなければならない。または相応
の小さな光学的個別補正を、関連する対象部分の同時検知の際に相応するピクセ
ル数のただ１つの検知アレイ（またはＬ＜Ｎ）で実行しなければならない。蛍光
放射を例えば同じ強度のＮ＝２０の部分ビームに分割する場合には、Ｎ＝２０の
検知アレイの各々（または検知アレイ部分）により単位時間当たりに記録される
フォトンの数はほぼ同じ係数だけ低下する。蛍光マーキングされた対象物の位置
決め精度はこの場合、フォトン統計の悪化により推定で係数√（２０）だけ低下
する。この欠点は、記録時間を係数Ｎ（例えばＮ＝２０）だけ上昇することによ
り除去できる。この場合、対象物の同時記録は、連続記録の場合と同じ程度長く
持続する。褪色特性を有する対象物の場合、同時３次元記録の利点は、観察容積
のすべてのターゲット（所与のスペクトル署名の）に対して類似の褪色特性が存
することである。褪色に起因する蛍光放射像の重心のずれがこのことにより緩和
される。
【０１１８】 時間的にダイナミックな構造体（例えばin vivo でマーキングされた細胞）を
有する対象物の場合は、連続記録に対して係数Ｎだけ短縮された記録時間（例え
ば２０秒ではなく１秒）の場合、個々の対象点の位置決め精度は推定で係数√（
Ｎ）だけ（Ｎ＝２０の場合は４．５）低下する。
【０１１９】 例えばウェーブフィールド顕微鏡における３Ｄ位置決め精度が約±３ｎｍの場
合、画像面ごとに１秒の連続記録時間により、同時記録の前記条件の下で位置決
め精度が、そのほかは同じ条件で２０対象面を同時記録すると推定で±４．５＊
３ｎｍ≒１４ｎｍに低下する。（例として）仮定した５ｎｍ／ｓ（平均ずれ）の
対象物運動では、実際の位置決め精度は、２０秒の全体記録時間による連続記録
の際に褪色効果を考慮しなくてもすでに格段に大きくなる。ここで本発明によれ
ば、前記の対象面の同時記録は１つの光軸についてだけでなく、２つおよび３つ
の直交する光軸についても行われる。
【０１２０】 必要な場合には、この本発明の同時画像記録を問題なしに従来の連続画像記録
と組み合わせることができる。
【０１２１】 例４：多次元ウェーブフィールド顕微鏡を使用したＤＮＡ順序決定 公知の方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、分析すべきＤＮＡシーケ
ンスのすべての相補的サブシーケンスを作製することができる。サブシーケンス
はすべて分析すべきシーケンスの同じヌクレオチドから開始する。分析すべき断
片はすべて３’エンドにおいて基準蛍光色素マーカαによりマーキングされる。
別のエンド、５’エンドないし所定の中間箇所においては、スペクトル署名の異
なる蛍光色素マーカａ，ｇ，ｃ，ｔによりそれぞれマーキングされる。これはヌ
クレオチドがベース、アデニン（マーカａ）、グアニン（マーカｇ）、シトシン
（マーカｃ）またはチミン（マーカｔ）をキャリーしているかによる。
【０１２２】 使用される蛍光色素マーカのすべての形式はそのスペクトル署名において、こ
れら蛍光色素マーカα、ａ，ｇ，ｃ，ｔ（場合によりさらに多数）は相互に別個
に識別することができるように異なる。１つの所定の蛍光色素マーカは本発明に
よれば、１から多数の同じまたは種々異なる蛍光色素分子により形成される。こ
こで蛍光色素マーカの長さおよび組成は、開始部にある蛍光色素マーカαの強度
分布と終端部にある蛍光色素マーカ（ａまたはｇまたはｃまたはｔまたは場合に
より別のベースに対する別の）の強度分布の重心間の間隔測定が多次元ウェーブ
フィールド顕微鏡の方法により可能であるように選択される。すなわち蛍光マー
カに対するリンク分子は例えば１／２ヌクレオチド直径よりも小さくなければな
らない。本発明によれば、比較的に長いリンク分子を使用することもできる。こ
れは、リンク分子が剛性の高い構造を有し、これに起因して間隔変動が十分に小
さく、例えば＜１／２ヌクレオチド直径である場合である。
【０１２３】 このようにマーキングされたサブシーケンスは分析すべきＤＮＡシーメンスを
完全に表す。蛍光マーカ、ａ，ｇ，ｃ，ｔないし基準蛍光マーカαはそれぞれ１
つまたは複数の蛍光色素分子を含むことができる。ＤＮＡサブシーケンスはすべ
て適切なキャリアに固定され、このキャリアは線形シーケンスとして存在する。
【０１２４】 蛍光色素マーキングされたＤＮＡ破片はＤＮＡコーミング技術によって線形に
整列される。従来の一次元ウェーブフィールド顕微鏡とは異なり本発明の多次元
ウェーブフィールド顕微鏡では、ＤＮＡ列をシステムの光軸の方向に付加的に正
確に整列することはもはや必要ない。ＤＮＡシーケンスは有利には４角形のグラ
スファイバに取り付けられる。このグラスファイバの屈折率は周囲の媒体の屈折
率とはほとんど違わない。ここでは所定の角度、とりわけグラスファイバの軸に
対して直交する角度での整列が行われる。そしてＤＮＡシーケンスの重心相互の
平均間隔は、蛍光信号の記録に使用された点像分布関数の最大半値幅よりも大き
い。別の方法が、３’エンドをスペクトル署名αの微細小球で結合し、続いてＤ
ＮＡ糸を光学的ピンセット工具により伸張する。ここでは“ピンセットレーザ”
の波長を適切に選択しなければならない。
【０１２５】 ＤＮＡシーケンスを線形化ないし配向した後、このようにして作製されたプレ
パラートが固定され、例えば温度低下による分子運動が低減される。択一的にＤ
ＮＡ終端部を結晶性に整列された固体構造体に埋め込むことができる。測定のた
めに較正目的で、別のとりわけ多色微細対象物ががグラスファイバ、ＤＮＡ対象
支持体、またはＤＮＡ終端部の固定固体に取り付けられる。較正対象物は付加的
に、ａ，ｔ，ｃ，またはｇでないスペクトル署名を含む。ＤＮＡ列の線形化は、
すべてのヌクレオチドが分析すべきＤＮＡ相補列の合成の際に適切に蛍光マーキ
ングされるなら省略することができる。
【０１２６】 固定されたＤＮＡシーケンスは多次元ウェーブフィールド顕微鏡に取り付けら
れる。このとき線形なＤＮＡサブシーケンスは定在波面に次のように配向される
。すなわち、αとａないしｇ、ｃまたはｔとの正確な間隔測定（精度≦１＊１０ -10 ｍ）が強度重心の検出と結像特性の較正の後で可能であるように配向される 。
【０１２７】 測定は、in situ 較正の場合、本発明の較正方法を適用して行われる。蛍光色
素マーカの信号は、適切に適合されたステップ幅を有するウェーブフィールド顕
微鏡において相互に分離して記録される（有利にはデジタルで）。蛍光マーカの
間隔とそのスペクトル署名から、分析すべきＤＮＡ破片のＤＮＡベースシーケン
スが検出される。
【０１２８】 スペクトル分離の代わりにまたはこれに追加して、蛍光寿命持続パラメータを
分析することができる。評価の第１フェーズでは、蛍光色素マーカ信号の重心の
粗検出が行われ、この情報を基礎として、ＤＮＡシーケンスに所属する信号が上
の述べたような間隔基準に従い、別のＤＮＡシーケンスに所属する信号から分離
される。評価の第２フェーズでは、スペクトル分離されて記録され、変調された
蛍光色素マーカの信号が適切に適合された関数によって分析される。ここから、
ＤＮＡシーケンスの開始部にある蛍光色素マーカ信号と終端部にある蛍光色素マ
ーカ信号の重心の間隔が分子レベルの精度で検出される。ここで較正対象物で行
われた測定は間隔差の補正、例えば色収差の補正に使用される。評価の第３フェ
ーズでは、ＤＮＡシーケンスの長さに相応する蛍光色素マーカ信号の間隔が長さ
の増大後に、終端部の蛍光色素マーカ（例えばａ，ｇ，ｃ，ｔ）の形式に従って
分離して配列される。このようにして達成された構成は、従来の方法で達成され
たパターンに相応する。このパターンから公知の方法に従って所望のシーケンス
情報を取り出すことができる。
【０１２９】 線形シーケンスないしは既知の配列構造を有する巨大分子の場合も同じように
行う。ここで蛍光色素マーカの数と形式は分子構成要素の数と形式に依存する。
【０１３０】 個々のＤＮＡ列の測定が光軸の方向における整列を必要とする場合には、本発
明により以下のように措置される。ＤＮＡ鎖のの既知の終端部をスペクトル署名
αの蛍光マーカに加えて化学的マーカによりマーキングするのである。ＤＮＡ鎖
プレパラートの残余部分、とりわけ終端部の蛍光マーカａ，ｃ，ｇ，ｔのマーキ
ングは冒頭に述べたように実行される。終端部のベースおよび／またはストップ
ヌクレオチドのマーカ、および場合により整列すべきＤＮＡクサイの別のベース
は電荷を有する（例えば負の）。
【０１３１】 ＤＮＡ鎖の整列は顕微鏡法の前または間に行うことができ、まず顕微鏡法の前
の整列方法が説明される。
【０１３２】 準備されたＤＮＡ鎖はイオン濃度の低いバッファ中の溶液で、特別の被覆され
た対象物支持体（またはカバーガラス、これは以下では対象物支持体と称する）
に取り付けられる。対象物支持体は核ＤＮＡ鎖の化学的にマークされた３’エン
ドを結合（接着）することができる。溶液は次に不動の成分が添加される。この
成分は所定時間後に溶液中のＤＮＡ鎖を硬化させる。対象物支持体は（被覆され
ない）カバーガラスにより覆われ、封印される。ここで対象物支持体からカバー
ガラスまでの間隔は適切な“スペーサ”（例えば薄いダイヤフラム）により十分
に定義された値に調整することができる。このようにして封印された対象物支持
体は適切で均質な静電界に曝される。この静電界は荷電されたベースを整列させ
る。電界（例えばコンデンサ）の極性はここでは、ベースが負に荷電している場
合はカソードが被覆された対象物支持体（接着された３’エンドを有する）に、
アノードが被覆されないカバーガラスに来るようにする。ベースが正に荷電して
いる場合はその反対である。電界線は対象物支持体の表面に対して垂直に延在す
る。電界の強度は、溶液中のＤＮＡ鎖が整列されるように十分に大きく選択する
。
【０１３３】 このように整列されたＤＮＡ鎖が対象物支持体カバーガラスの中間空間で不動
になった後、ＤＮＡ鎖は多次元ウェーブフィールド顕微鏡により前に説明したよ
うに記録され測定される。
【０１３４】 ＤＮＡ鎖の配向を顕微鏡記録の間に行うべきならば、上に述べた電界は本発明
により次の方法に従って構成される。
【０１３５】 被覆された対象物支持体は十分な平面性を有する導電ミラーである。ＤＮＡ鎖
の溶液（小さいイオン濃度）は適切な粘度を有し、不動成分は溶液に添加されな
い。ここでも（場合により適切なスペーサを使用して）カバーガラスが取り付け
られ、封印される。ウェーブフィールドは次にただ１つの対物レンズによりミラ
ーと関連して形成される。ここで、対物レンズから発せられた励起光はミラーに
より反射され、一次元のウェーブフィールド（焦点面またはミラー表面に対して
平行）を形成する。正（負）の電圧を、負（正）に荷電したベースを使用する場
合に印加すると、ＤＮＡ鎖がミラーの表面に対して垂直に整列される。すなわち
顕微鏡の光軸に沿って整列され、前に説明したように順序決定することができる
。この方法でも電界の強度は、ＤＮＡ鎖を整列させるために十分に大きくなけれ
ばならない。分子の熱運動は例えば温度低下によって低減することができる。
【０１３６】 この実施例と同じように任意の他の線形巨大分子を取り扱うことができる。
【０１３７】 例５：側方空間に変調された蛍光励起による多次元ウェーブフィールド顕微鏡
タイプＩＩ 多次元ウェーブフィールド顕微鏡タイプＩＩは空間方向ｘにコヒーレントな光
ビームに対するリアル照明源を有し、さらに部分ビームを出力結合するためのビ
ームスプリッタを仮想照明源として有する。第１の対物レンズはこれら２つの照
明源に配属されている。この第１の対物レンズに照明源の光ビームないし光波シ
ーケンスが次のように入力結合される。すなわち光ビームないし光波シーケンス
が、対象空間とは反対側の後方焦点面（この面は“裏焦点面”と称される）に、
相互に間隔をおいた２つの焦点を形成し、２つの焦点面間の間の空間で所定の角
度で相互に延在し、一次元の定在ウェーブフィールドと干渉するように入力結合
される。
【０１３８】 光ビーム（光波シーケンス）を光軸に対して適切な間隔でこの焦点面にフォー
カシングすれば、（光軸は焦点面に対して垂直であり、その中心を通って延在す
る）対象空間では平坦な波面を有する平行光束が対物レンズを、光軸に対して所
定の角度で通過する。この角度は可変調整することができ、光軸に対してどの程
度の間隔で光ビームが対物レンズに入力結合されるか、および対物レンズの形式
に依存して調整される。
【０１３９】 第２の光ビーム（光波シーケンス）をこのような角度の下で第１の対物レンズ
に入力結合すれば、その焦点は裏焦点面で第１の光ビームの焦点に対して直径の
反対側に来る。すなわち、焦点１−光軸−焦点２となり後方焦点面にラインが形
成される。そして２つの焦点面の間の空間に、平坦な波面を備えた第２の平行光
束が発生する。この光束は所定の角度で第１の光束に対して延在し、これと共に
対象空間で、最大光強度の縞を有する一次元定在ウェーブフィールドと干渉する
。
【０１４０】 第１の対物レンズには第２の対物レンズが間隔をおいて、鏡像的に対向して配
置されている。これによりこれら２つの対物レンズは３次元対象空間の２つの対
向する側に来る。この第２の対物レンズには、コヒーレントな光ビームに対する
第３と第４（リアルまたはバーチャル）の照明源が次のように配属されている。
すなわち、２つの照明源の光ビームが、第１の対物レンズに対して説明したのと
同じように、後方の、対象空間とは反対側のこの第２の対物レンズの焦点面にフ
ォーカシングできるように配属されており、この第２の対物レンズの２つの焦点
面の間の空間で、一次元定在ウェーブフィールドと干渉することができる。そし
て対象空間では第１の対物レンズの一次元定在ウェーブフィールドと干渉するこ
とができ、これにより３次元ウェーブフィールドが発生し、このウェーブフィー
ルドは３次元空間に連続する最大強度の点を有している。
【０１４１】 ２次元ウェーブフィールドを形成するために（すなわち１つの面での最大強度
の点）、前記の構成が次のように変更される。すなわち、第１および第２の対物
レンズを使用するが、そのうちの一方を照明源と結合する。
【０１４２】 またはただ１つの対物レンズだけを使用し、これを第３の照明源と結合する。
第３の照明源のコヒーレントな光ビームを他の２つの照明源の光ビームに、この
ただ１つの対物レンズで入力結合する。これにより相応する３つの焦点が焦点面
に二等辺三角形を形成し、その中心に光軸が延在する。対象空間では３つすべて
の光ビームが顕微鏡対物レンズを光軸に対して同じ角度で通過するが、それぞれ
方向が異なる。
【０１４３】 ただ１つの対物レンズを使用する、多次元ウェーブフィールド顕微鏡を形成す
るための本発明によるウェーブフィールド顕微鏡タイプＩＩの変形実施例は、３
次元ウェーブフィールドを形成するのにも使用できる。このために４つの光ビー
ムを同じ対物レンズに偏向する。これはこれに相応する４つの焦点が後方焦点面
で等辺の四角形を形成するように行う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 Ｓｅｍｉｎａｒｓｔｒａｓｓｅ ２、Ｄ− 69117 Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍ ａｎｙ (72)発明者 ヨアヒム ブラドル ドイツ連邦共和国 シュリースハイム マ ックス−プランク−シュトラーセ 33 (72)発明者 ベルンハルト シュナイダー ドイツ連邦共和国 シュパイヤー フィン ケンヴェーク 14

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 照明ないし励起システムと、対象空間と、検知システムとを
    有し、 前記照明ないし励起システムは、照明源と、第１の対物レンズと、第２の対物
    レンズまたは反射器とを有し、 第１の対物レンズと、第２の対物レンズまたは反射器とは、これらが一次元の
    定在ウェーブフィールドを形成するのに適するように相互に配置されており、 前記対象空間は、対象物に対する保持および操作装置を有し、 前記検知システムは、対物レンズ、接眼レンズおよび検知器を有する形式の、
    ウェーブフィールド顕微鏡において、 前記照明ないし励起システムは、２つまたは３つすべての空間方向に、コヒー
    レントな光ビームに対する少なくとも１つのリアル照明源またはバーチャル照明
    源と、部分ビームを出力結合するための少なくとも１つの反射器またはビームス
    プリッタ、またはコヒーレントな光ビームに対する別の照明源とを有し、 前記部分ビームにはそれぞれ１つの対物レンズが配属されており、かつ当該部
    分ビームは光波シーケンスを形成するのに適したものであり、 照明源の１つの光波シーケンスは、反射器ないしは別の照明源の光波シーケン
    スに対して逆並列に、または可変調整可能な角度で配向されており、 当該配向は、前記照明源の１つから発する光波シーケンスが、反射器ないしは
    別の照明源の光波シーケンスにより、平坦な波面を有する定在ウェーブフィール
    ドに干渉されるようになされており、 検知システムは、エピ蛍光検知に適した、および／またはラスタ状の点検知に
    適した少なくとも１つの検知対物レンズを有し、 該検知対物レンズの開口数は有利には大きく、当該対物レンズの光軸は干渉ウ
    ェーブフィールドの１つの波面に対して垂直に配置されており、 当該検知対物レンズは励起システムの対物レンズと同じであってよく、 エピ蛍光検知に適した検知対物レンズには平坦な（２次元）検知器、例えばカ
    メラが前置されており、ラスタ状の点検知に適した検知対物レンズには少なくと
    も１つの固定共焦点検知リング絞りおよび／または検知ホール絞り、および／ま
    たは少なくとも１つの固定の検知スリットが前置されており、かつ点検知器、と
    りわけフォトマルチプライヤ、フォトダイオード、またはダイオードアレイが後
    置されている、 ことを特徴とするウェーブフィールド顕微鏡。
  2. 【請求項２】 少なくとも１つの空間方向で、開口数の大きな対物レンズに
    開口数の小さな対物レンズまたは反射器が配属されており、 別の１つのまたは２つの空間方向で、開口数の小さい２つの対物レンズ、また
    は開口数の小さい対物レンズと反射器とが相互に配属されている、請求項１記載
    のウェーブフィールド顕微鏡。
  3. 【請求項３】 照明ないし励起システムと、対象空間と、検知システムとを
    有するウェーブフィールド顕微鏡であって、 前記照明ないし励起システムは、照明源と対物レンズとを有し、当該照明源と
    対物レンズとは相互に、定在ウェーブフィールドを形成するのに適するように配
    置されており、 前記対象空間は、対象物に対する保持および操作装置を有し、 前記検知システムは、対物レンズ、接眼レンズおよび検知器を有する形式のウ
    ェーブフィールド顕微鏡において、 前記照明ないし励起システムは、３つの空間方向の少なくとも１つに、コヒー
    レントな光ビームに対する少なくとも１つのリアル照明源またはバーチャル照明
    源と、少なくとも１つの部分ビームを出力結合するための少なくとも１つのビー
    ムスプリッタとを有し、 前記照明源とビームスプリッタには共通の１つの対物レンズが配属されており
    、 該対物レンズに、照明源および／またはビームスプリッタの光ビームないしは
    光波シーケンスが入力結合可能であり、 これら光ビームないしは光波シーケンスは、後方（対象空間の反対側）焦点面
    に相互に間隔をおいた２つの焦点を有し、かつ２つの焦点面の間の空間で可変調
    整可能な角度で相互に延在し、１つの一次元定在ウェーブフィールドに干渉し、 前記検知システムは、エピ蛍光検知に適した、および／またはラスタ状の点検
    知に適した少なくとも１つの検知対物レンズを有し、 該検知対物レンズの開口数は有利には大きく、かつ当該検知対物レンズは励起
    システムの対物レンズと同じでもよく、 エピ蛍光検知適した検知対物レンズには平坦な（二次元）検知器、例えばカメ
    ラが前置されており、 ラスタ状の点検知に適した検知対物レンズには少なくとも１つの固定共焦点検
    知リング絞りおよび／または検知ホール絞り、および／または少なくとも１つ固
    定検知スリットが前置されており、点検知器、とりわけフォトマルチプライヤ、
    フォトダイオードまたはダイオードアレイが後置されており、 ことを特徴とするウェーブフィールド顕微鏡。
  4. 【請求項４】 照明ないし励起システムは、同じまたは別の１つまたは２つ
    の空間方向に、コヒーレントな光ビームに対するそれぞれ少なくとも１つの別の
    リアル照明源またはバーチャル照明源、および／または少なくとも１つの部分ビ
    ームを出力結合するための少なくとも１つのビームスプリッタを有し、 当該部分ビームには、それぞれ１つの別の対物レンズが配属されており、 当該対物レンズによって光ビーム（光波シーケンス）が対象空間に偏向され、
    次のように配向されている、すなわちこれら光ビームが同じ、または別の１つま
    たは２つの空間方向から発した光ビーム、ないしはこれにより形成された一次元
    または二次元のウェーブフィールドにより、１つの二次元ないし３次元ウエーブ
    フィールドに干渉されるように配向されている、請求項３記載のウェーブフィー
    ルド顕微鏡。
  5. 【請求項５】 対象空間は対象物ホルダを有し、 該対象物ホルダには、測定構造体および／または場合により較正ターゲットを
    有する対象物が１つまたは２つの相互に直交して延在する軸を中心に回転可能に
    ウェーブフィールド内で支承され、 少なくとも１つの軸に対しては３６０゜（２π）の回転性が有利である、請求
    項１から４までのいずれか１項記載のウェーブフィールド顕微鏡。
  6. 【請求項６】 多次元ウェーブフィールドを形成する照明源、および／また
    は反射器、および／またはビームスプリッタ、および／または対物レンズ、およ
    び３次元ウェーブフィールドは、１つまたは２つの相互に直交して延在する軸を
    中心に回転可能である、請求項１から５までのいずれか１項記載のウェーブフィ
    ールド顕微鏡。
  7. 【請求項７】 検知システムには走査ミラーが設けられており、該走査ミラ
    ーは、側方対象領域を所望の有利に最大蛍光強度で結像するのに適するように配
    置されている、請求項１から６までのいずれか１項記載のウェーブフィールド顕
    微鏡。
  8. 【請求項８】 照明システムは、３つの空間方向の少なくとも１つに、２ま
    たはマルチ蛍光励起のためのリアル照明源を有し、さらに別の１つまたは２つの
    空間方向に２またはマルチ蛍光励起のためのリアルおよび／またはバーチャル照
    明源を有し、 当該照明源は、これにより形成された相互に異なる波長（λ1、λ2,..,λi） の定在ウェーブフィールド（ＷＦ1、ＷＦ2,..,ＷＦi）と、それぞれｄ１＝λ1/ ２ｎ cosθ1ないしｄ２＝λ2/２ｎ cosθ２ないしｄi＝λi/２ｎcosθiである最
    大波ないし最小波間の間隔（ｄ１，ｄ２，..,ｄi）を有し（ただし、ｎ＝対象空
    間における屈折率、θ1、θ2,...,θi＝波長がλ１，λ２,...,λiである光波シ
    ーケンスと光軸との交差角）、 ウェーブフィールドＷＦ1、ＷＦ2、ＷＦiは相互に、２つまたはすべての定在 波の少なくとも最大が同じ箇所（すなわちマルチフォトン励起の箇所）に発生す
    るように配向されている、請求項１から７までのいずれか１項記載のウェーブフ
    ィールド顕微鏡。
  9. 【請求項９】 照明源、対物レンズ、および一次元電気ウェーブフィールド
    を形成するのに適した導電性ミラーの配置構成が、対象物支持体ホルダに対して
    相対的に設けられており、対象物に存在する測定構造体および／または較正ター
    ゲットが電界の印加によって顕微鏡測定過程の前、または測定中に整列可能であ
    る、請求項１から８までのいずれか１項記載のウェーブフィールド顕微鏡。
  10. 【請求項１０】 請求項１から９までのいずれか１項記載のウェーブフィー
    ルド顕微鏡を使用して、ＤＮＡ順序決定するためのウェーブフィールド顕微鏡法
    において、 分析すべきＤＮＡシーケンスのすべての相補サブシーケンスを、すべての相補
    サブシーケンスが分析すべきシーケンスの同じヌクレオチドで開始するように作
    成し、 分析すべき破片を、すべての３’エンドにおいて基準蛍光色素マーカαにより
    、５’エンドおよび／または所定の中間箇所において蛍光色素ａ，ｇ，ｃまたは
    ｔにより、それぞれヌクレオチド、ベースがアデニン（マーカａ）、グアニン（
    マーカｇ）、シトシン（マーカｃ）またはチミン（マーカｔ）をキャリーしてい
    るかに応じてマーキングし、 ここで蛍光色素マーカ、ａ，ｇ，ｃ，ｔおよびαは異なるスペクトル署名を有
    し、それぞれ１つまたは複数の蛍光色素分子を含んでおり、 マーキングされたＤＮＡサブシーケンスをキャリアに固定し、これらが線形の
    シーケンスとして存在し、多次元ウェーブフィールド顕微鏡にもたらされるよう
    にし、 線形ＤＮＡサブシーケンスを定在波面に対して、αと、ａないしｇ、ｃまたは
    ｔとの間の正確な間隔測定（精度≦１＊１０-10ｍ）が強度重心の検出と結像特 性の較正後に実行可能であるように配向し、 蛍光色素マーカの信号をステップごとにスペクトル分離して相互に記録し、 蛍光マーカの間隔とスペクトル署名とから、分析すべきＤＮＡ部分のＤＮＡベ
    ースシーケンスを検出する、 ことを特徴とするＤＮＡ順序決定するためのウェーブフィールド顕微鏡法。
  11. 【請求項１１】 該当する対象物を対象物ホルダ、とりわけ対象物支持プレ
    ート、対象物支持ファイバ、対象物支持毛細管、または対象物支持液体に準備す
    る前、準備中、または準備後に、探査すべきないし位置決めすべき対象構造体（
    同じ測定構造体）を異なるまたは同じスペクトル署名の蛍光色素によりマーキン
    グし、 ここで少なくとも、その相互の間隔が有効点像分布関数の主最大値の半値幅よ
    りも小さい、このように位置決めすべき測定構造体をスペクトル署名の異なる蛍
    光色素によってマーキングし、 同じ蛍光色素により、所定の大きさおよび空間的構成の較正ターゲットをマー
    キングし、 蛍光発光する較正ターゲットを、対象物と共にないし測定構造体と共に、また
    は別個に対象物ホルダに準備し、 測定構造体および較正ターゲットを、一致条件の下で同時にまたは順次顕微鏡
    的に探査し、 スペクトル署名の異なるそれぞれ２つの所定の較正ターゲットを、それぞれの
    光学系の波長に依存する結像または位置決め特性を考慮して測定し、 ここで検出された測定値（すなわち実際値）を既知の実際の間隔値（すなわち
    目標値）と比較し、 実際値と目標値との差から補正値（すなわち較正値）を検出し、 当該補正値により、光学系に起因するずれを、種々の放射焦点、とりわけ測定
    構造体の検知の際に補正する較正方法において、 蛍光色素マーキングされた測定構造体および／または蛍光色素マーキングされ
    た較正ターゲットを有する生物学的対象物をシーケンシャルにまたは同時に、個
    々の（別個の）２つまたは３つの空間方向で直交して相互に延在する定在の、１
    つの二次元または三次元ウェーブフィールドに相互に干渉するウエーブフィール
    井戸により照明し、ここで蛍光色素を蛍光放射のために励起し、 蛍光強度を検知するために、カメラおよび／または１つまたは複数の二次元構
    成体を使用し、 当該二次元構成体は、それぞれ円形、リング、またはスリット状の絞りを有す
    る個別検知器からなるか、または複数の円形、リング、またはスリット状の絞り
    からなる構成体であり、 測定構造体および／または較正ターゲットを有する対象物、または一次元ない
    し二次元ウェーブフィールド、または両方を測定過程中にステップごとに１つま
    たは２つの直交して延在する軸を中心に回転し、 ここで蛍光色素マーキングされた測定構造体および／または較正ターゲットを
    、シーケンシャルにまたは同時に、１つまたは２つの個別に相互に直交するウェ
    ーブフィールドにより照明する、 ことを特徴とする較正方法。
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