CN101228428A - 荧光纳米显微方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及借助荧光显微镜对由荧光着色剂染色的物体实施分析。显微镜包括用于使样本图像可视化并将其投射到摄像机上的光学系统、用于记录和处理图像的计算机、布置在样本透镜前面的样本保持器以及荧光放射源。单独荧光可视的分子和纳米颗粒在物体不同的部分周期性的形成。激光产生的振荡足以记录所述分子和纳米颗粒的非重叠图形并使已经得到记录的荧光分子脱色。所记录的单个分子和纳米颗粒图像的画面通过计算机进行处理，以研究应变中心的坐标并根据与各个荧光分子和纳米颗粒的坐标相对应的应变中心的计算坐标建立物体图像。所述本发明可以获得分辨率大于20纳米的二维和三维图像并通过用不同的着色剂使蛋白质、核酸和脂类染色来记录彩色图像。

Description

荧光纳米显微方法
技术领域
本发明涉及科研设备，尤其涉及透镜荧光显微镜。这种显微镜被用于获取玻璃荧光物体的图像。更具体地，本发明是一种以达到几纳米(nm)的分辨率重建物体图像的计算机化荧光显微方法。
背景技术
已知的光学显微镜可以利用物镜形成放大的物体图像，所述物镜仅在物体上的两个点之间的距离大于通常所称的衍射极限时才可以分别显示它们。该极限可以采用以下公式进行计算：r＝0.61λ/A(1)，式中λ-通过孔径为A＝n*sin(φ)的物镜聚集的光的波长，n-物体点周围的物质的折射率，φ-在物镜轴线与落入物镜内并在检测器中发现的极端射线之间的角度。现在采用不同类型的设备通过物镜进行荧光显微。大功率弧光灯、白炽灯、激光或日光可以作为显微镜的光源。荧光产生于光照区域中存在的所有染料分子。采用分光分色镜通过物镜使所述区域得到光照。所述分色镜使射出的光落在物体上并将荧光反射到检测器。第二种类型的光照通过从侧面发送激光来产生。这样以总的内部反射角向下或穿过物镜一直到照射物体。在这种情况下，光仅达到距玻璃与折射率低于玻璃的物体之间的边界0.3倍波长的深度。物体荧光由物镜聚集。其发送可以目测并通过光电倍增器、摄影带或数字摄像机记录的物体图像。所有现有的透镜显微镜的主要缺陷是它们具有区分相邻两点的极限。这一极限可以根据公式(1)进行计算。
近年来已经研发了采用由银盐胶片(silver film)制成的超透镜进行显微。胶片厚度小于50纳米；可以确保两个点的分辨率距离相互大致为50纳米。(N.Fang and X.Zhang，Imaging properties of ametamaterial superlens(元物质超透镜的成像特性)，2003，App physLet v.82，2，161-163；Nicholas Fang，Zhaowei Liu，Ta-Jen Yen，andXiang Zhang Regenerating evanescent waves from a silver superlens(来自银盐超透镜的再生损耗波)，2003，OPTICS EXPRESS，Vol.11，No.7，682-687)。然而在生物体上采用这些显微镜还不是很清楚。当前显微镜的分辨率比该设备的分辨率低几倍。
存在着最大分辨率大于例如1纳米的设备，电子、隧道和原子力显微镜。应该注意到它们不仅具有真实的优点，而且具有严重的缺陷，例如：它们的设计和对物体的操作复杂而且昂贵；缺乏接收彩色图像以区别不同类型分子的能力；物体通常必须得到干燥并利用改变物体不同部分相互排列的物质进行处理。原子力和隧道显微镜还不能检测物体内的结构；一次只能检测一个点并且扫描速度不超过每分钟1平方微米；针的末端很容易变脏并且此后不能达到物体表面。
还有一种设备，其中通过激光穿过玻璃纤维粗端上的孔发射物体荧光。通过驱动装置使纤维在三个方向移动以使纤维末端定位在光反射、光漫射或涂有荧光的分子表面附近。这种类型的显微镜不采用透镜并且可以获得分辨率比普通光学显微镜大十倍的图像。仅当玻璃纤维粗端上的孔直径小于光的波长时才能实现这样的结果。光在物体上达到的深度比光的波长小得多。实际上，所有的光回到玻璃纤维内，除了物体从孔的外部收集的那部分。通过光电倍增器测定物体在孔附近收集的荧光、光漫射和反射光强度。通过计算机采集有关测定光的强度的信息以及有关玻璃纤维末端坐标的数据来重建物体表面的图像。这一系统的主要缺陷是：需要采用昂贵的高精度和快速作用的机械单元，其负责相对物体移动玻璃纤维；制造端孔直径小于50纳米的玻璃纤维非常昂贵、复杂和难以复制；孔很容易变脏并在此后不能达到物体表面；仅有很少一部分光可以穿过直径小于光波长的孔离开纤维；如果光比玻璃纤维末端更强，则所述末端会变热并受到破坏；不能对玻璃纤维接触不到的物体区域上的荧光进行检测；一次只能检测一个点，表面扫描速度不超过每分钟1平方微米。
介绍一种更新类型的显微镜。其利用几个光束同时扫描物体表面。National Institute of Standards and Technology(NIST)公布了关于形成这种显微镜的5年的研究工作成果(http://www.betterhumans.com/News/news.aspx？articleID＝2005-02-11-4，″Optical Microscopes Enter the Nano(光学显微镜进入纳米时代)。研发混合系统对小于可见光波长的特征进行成像和测定)。在文章中指出，采用这种方法可以区分40纳米的纳米级颗粒。作者没有暗示可以成功地区分相互距离小于40纳米的两个单独的颗粒。从所提出的附图和说明书中不能清楚地了解到该方法怎样区分之间距离小于r＜0.61λ/A的两个颗粒。据我们看来，所提出的设备不能达到距离比光波长小的多的物体细部的分辨率。
采用普通荧光显微镜的方法(Erwen，A Sharonov，JH Ferris，RM Hochstrasser：Directvisualization of nanopatternsbysingle-molecule imaging(通过单个分子成像实现纳米方式的直接可视化).App Phys Let 2005，86：043102)被认为是与本发明最接近的。该方法的主要思想是利用非常低浓度的荧光肽对样本-由具有1微米直径自由开口的球形细胞的聚合物制成的光胶片-进行染色。所述浓度可以对在布朗(Brownian)运动中移动到中空球内的单个肽分子进行观测。通过激光束穿过物镜照射样本。照射角等于总的内部反射角。激光束激发玻璃附近150-200微米样本层中的荧光。通过高灵敏的摄像机(RoperScie П tific，Cascade 512F with electrons multiplier builtin CCD(具有在CCD中构建的电子倍增器的级联512F))以500顺序帧检测各自通过同时向分子发荧光而得到染色的荧光肽几十个分子的位置。每个帧被记录到计算机存储器内。每个图像包含许多直径大致0.5微米的点，这些点以系统放大值得到倍增。所有的这些图像相互叠加。最终图像的分辨率不超过普通荧光显微镜的分辨率。该系统的主要缺陷是：文章中没有关于能够计算检测点中心位置以根据这些点产生分辨率高于衍射极限的图像(参见公式1)；文章中没有描述选择性地对物体结构进行染色的方法；对解决以下问题没有任何描述：染色后在检测观测区域中非荧光肽分子的过程中物质将释放颜色。这样将使溶液更厚并且不能用新的荧光分子替换所述荧光分子。这样不能获得大于500帧的更大数量。接收分辨率比衍射极限(参见公式1)所允许的更大的图像就需要大数量的帧。
生物体例如肌肉的研究特征在于存在许多不同类型的分子，它们的定位比通过物镜在记录器-眼睛、照片或摄像机平面上形成物体放大图像的普通光学显微镜的分辨率更靠近。显微镜分辨率(公式1)的衍射极限通过同时观测在观测区域中的所有点限制显微镜的分辨率，并且通过聚焦在一个点上的光线顺序观测物体的所有点(共焦和其它类型的扫描显微镜)限制显微镜的分辨率。这就是如果将光学显微镜和所采用的对可视区域中不同类型的分子进行选择性染色的方法的所有优点与所述改进的分辨率组合将是最好的原因，这样可以单独观测相互位置小于10-20纳米的分子。
发明内容
本发明的目的是提出对物体进行染色、制备研究所用物体、对结果进行计算机分析的方法。这种计算机分析可以接收分辨率高于20纳米的物体图像。这样使荧光显微镜变为“纳米显微镜”。通过制造低染色物体的多个画面(物体中的所有荧光分子被分别看作直径为2r＝1.22λ/A的点，具有在上万顺序帧上的不同位置)实现所述目的。此外，所有的这些帧被用于计算所有检测点的中心位置(这些位置与荧光分子的实际坐标相对应)。而后完成所有染料分子位置的3-D重建。分辨率可以与染料分子的尺寸相比。物体的不同结构以不同颜色得到染色。荧光纳米显微镜可以基于在荧光显微中采用的标准模块。本发明包括多种模块：用于可视化观测和向数字摄像机传递物体图像的光学系统。数字摄像机应该能够检测并对具有低背景噪声级的单个荧光分子和纳米颗粒进行数字化成像。系统的第二模块是用于记录和分析图像的计算机。第三部件是与物镜相对定位的样本保持器。第四部件是用于吸取来自样本荧光的光的可变抑制滤色器组件。纳米显微镜应该装有安装在样本保持器旁边的两个光源。安装角度应该确保样本的所有切片深度或在玻璃附近小于150纳米的层中受到光照。在该层中的荧光分子可以吸收以总的内部反射角照射时流过边界的光波的能量。观测物体应该在具有装入染料饱和浓度的溶液中得到初步染色，所述染料仅在UV光脉冲使阻碍荧光基团与染料分子分离时开始发荧光。剩余染料应该仔细洗掉。确保分子结构从覆盖玻璃和保持物体的棱镜玻璃起长期稳定是非常困难的。对于以新的冲洗溶液准确观测的物体是的确存在这一问题。这就是纳米显微镜最高分辨率仅可以接收到物体位于距棱镜玻璃不大于150纳米距离的那些层的原因。这是光以中的内部反射角落在边界表面时所达到的深度。对于观测保持静止的物体来说，通常可以在长时间内观测物体。定位在基准玻璃附近的不同结构几乎完全不可移动。由于多个稳定的相互连接以及与基准玻璃的连接，它们可以保持它们的位置。尽管容积的大约80％填充有不同盐分的水溶液，但它们不可移动。玻璃边缘上的间隙应该得到密封(例如用石蜡)以避免溶液被烘干。
3-D纳米显微镜需要物体及其部件相对于透镜具有总体固定性。这就是物体应该利用干燥溶液进行处理并在干燥后被放入具有装入染料的聚合物非荧光物质(例如环氧树脂)内并得到冲洗的原因。物体几微米厚的切片可以被用于在所有三个方向上利用10-20纳米对物体进行3-D重建。包含在固体物质中的所述物体如同其在普通荧光显微镜中一样得到照射。仅有的改进是应该采用另外的闪光灯以将几百个不发荧光的分子转变为在每帧中发荧光。对于在液体中的物体和在聚合物胶片中的物体，具有λ＜360纳米的UV闪光灯周期性照射由不发荧光的染料染色的物体，并且每次通过阻碍荧光的特殊化学基团将几百(甚至几千)个不发荧光的分子转变成发荧光的分子。激光持续照射物体并以这种强度激发新形成的荧光分子中的荧光，所述分子中的每个将在不到一秒内发送几万光量子。分子将在其在具有低背景噪声级的数字化帧上得到荧光记录之后释放颜色。荧光分子再生、它们的射出、记录和释放颜色的循环可以充分几万次。每次新的荧光分子将产生、得到检测以及释放颜色。由于不会吸收激光，因此没有得到转化的非荧光分子不会释放颜色。可以采用这一方法检测几万个帧。可以在每帧上检测成百甚至成千的荧光分子。可以计算覆盖所有结构表面、位于可视区域内的所有数百万荧光分子的位置。具有不同活性基的染料可以被用于对不同颜色不同属性的结构进行染色。活性基可以与任意蛋白质、任意核酸、任意脂肪等链接。(所提出方法的命名-有色纳米显微术)。
纳米显微方法的第二个改进是基于可以在具有穿透薄膜、充有盐溶液的生物样本的大部分容积内实现发出非常亮的荧光并经受起释放颜色的纳米颗粒的布朗运动。通过无胆蛋白质(ficobiliprotein)或直径10-40纳米发荧光的微球代表纳米颗粒。所述运动可以通过由几对交叉电极提供的电流所进行的电泳来得到调节。电流引导颗粒在不同方向的运动。所以它们扫描所有可接触的容积。如果几百个相同(或者因具有超出光照区域的颗粒而变化)的荧光颗粒在比每帧中检测的相互距离1-2微米更大的距离上移动，则可以以几纳米的精度计算它们的位置(作为相应点的中心的坐标)。来自所有帧中的坐标可以被用于发现颗粒长期出现的所有位置。其表示由液体填充的所有容积。颗粒不能存在的部分容积可以被认为是填充有不同原始肽的致密结构、染色体、部分未受破坏的薄膜等。颗粒位置可能的波动会使点的尺寸放大少许，但点的中心位置可以被认为是颗粒在物体中的平均坐标。应该注意到，具有正电荷、负电荷的颗粒以及中性颗粒可以到达物体的不同区域。其发生的原因是它们与生物结构的局部电荷相互作用，这就是该方法可以用于研究物体结构表面电荷的原因。(所提出的方法命名-单色纳米显微术)
两种所提出的方法都可以确保纳米显微镜分辨率达到几微米，不取决于分辨力(公式1)，而是取决于物体长期得到观测的部分中的结构的内在流动性。第二个因素是视频数据中噪声与信号之间的比例。通过对所提出的方法的多种改进可以调节这两个因素。例如，可以在物体内引入一些明亮发光的关键的荧光颗粒。则可以考虑与物体刚性相连的关键颗粒在可视区域中的移动来计算变化的颗粒的坐标。这种方法可以对物体定位在几纳米距离上的部分实现2-D分辨。
应该注意到荧光颗粒成像的一些参数(点的直径以及沿每个点剖面的光强度分布)可以随着颗粒距显微镜物镜焦面的距离而改变。则就是提出完成这些产生的计算以计算发光颗粒第三坐标的原因。提出在两个摄像机上投射物体的图像。这样可以改进第三坐标确定的精度。光线在通过物镜之后被分成两条线。摄像机被定位成使得物体的两个相邻焦面通过一个透镜被投射在所述摄像机上。每个颗粒的光强度分布可以在通过不同摄像机检测时不同。其可以根据第三坐标成比例并被用于形成物体的3-D图像。图3表示3-D纳米显微基础的视图。来自投射在CCD上的荧光颗粒的点的直径和强度取决于颗粒与物镜之间的距离。聚焦在不同焦面上的两个摄像机显示具有不同直径和沿直径不同强度分布的一个颗粒。图中右上角的示意图表示直径与沿直径强度分布之间的差异取决于摄像机和荧光颗粒位置。
除此之外，在一些情况下纳米显微术可以有助于发现通过荧光颗粒以2-3个不同波长和同一激发状态形成的点的中心。这一点可以通过使光分色镜分离来实现。所述分色镜将具有一个波长的光传到一个摄像机并将具有另一波长的光反射到另一摄像机。据此，所提出的发明可以以纳米级分辨率位置重建几个不同类型的物体分子。这些分子将通过具有不同发射波长的染料进行染色。这样可以使同时从荧光颗粒中单独看到和检测的点的数量扩大。这一点可以实现，因为即使看到不同颜色的相应点存在干涉也可以单独看到不同波长的这些点。
如果所描述的纳米显微方法与在荧光分子中装入不发荧光的分子的其它变化相组合，则其变得非常有用。这一点可以通过使阻碍荧光的基团分离的化学反应或不同的物理影响来实现。所述反应的实例是ATP反应、酯酶影响、过氧化反应、放射性转化等等。这种改进最终形成的荧光分子可以通过激光射出并利用用于根据上述方法即使物体结构表面坐标的摄像机进行检测。它们的坐标可以被计算作为适当点在图像帧上的中心。而后它们的图像可以“重叠”在物体的早期重建的图像上。它们将显示物体反应活性基团的位置。这种图像的分辨率大于20纳米。
对专业人员显而易见的是在附加权利要求中描述的本发明可以通过不同方法得到修改，这些方法不脱离本发明的主要思想。
可以在常规状态下通过采用荧光显微镜来改变作为纳米显微的设备操作。所述状态提供了以普通分辨率(公式1)原地直接可视观测物体的可能性。其还提供了以非常高灵敏度的摄像机检测图像并将其传送到计算机存储器内的可能性。而后，这些帧得到分析以测定帧的不同区域的几何参数和光强度。这一点可以用于例如生物发光和化学发光研究。
所提出的附图表示如何改进荧光显微镜以实施根据本发明的纳米显微方法。
具体实施方式
如图1和2所示的荧光显微镜-纳米显微镜装有：一个(图1)和两个(图2)单色摄像机1，其具有与它们的传感器(CCD)相对定位的数字输出和抑制滤色器。这些滤色器仅将荧光传到摄像机。显微镜还装有可拆除的分光棱镜2；变焦达100x以及孔径达A＝1.4的物镜3。物体4被向下压向玻璃物体保持器5，其具有截顶棱镜边缘的形式。设备还装有用于透镜系统的激光6，以穿过棱镜平面激发荧光；装有用于透镜系统的脉冲UV源以对在染料分子上存在的阻碍荧光基团进行光分解。另一重要部件是计算机8，其具有用于记录以及加工数字化图像的软件。该软件还被用于控制电源，提供UV脉冲和电泳设备所需的能量。目镜10(图1)被用于可视化观测(9)。单元应该被放置在置于防震桌上的隔音柜内。将单独描述向电泳电极提供动力的设备，所述电极引导可移动荧光纳米颗粒在充有盐溶液的物体内移动。
以通过采用由Photometrics生产的高灵敏摄像机CascadelK或由Theta系统生产的摄像机SISI_t285EM的纳米显微镜接收图像作为实例。摄像机装有由Texas Instruments生产的CCD TC285SPD，其具有包含在CCD晶体中的电子倍增器。其具有达63％的量子效能、1004活性水平正方形像素，在大致8×8毫米的感光正方形上有8微米的边在1002线上。如果物体图像通过100x物镜直接投射在摄像机的CCD上，则由激光及其透镜系统照射的物体上的正方形应该比80×80微米更大一点。每个CCD像素与80×80纳米的物体正方形相对应。每个发光颗粒或分子在物体上被看作直径为2r＝1.22λ/A、大约560纳米的点。其以大约7像素的直径投射在CCD正方形上。在每帧上无序分布的颗粒之间的平均距离应该大于2000纳米。在这种情况下，实际上它们中所有的都可以单独被看到。在这种情况下，至少40×40＝1600个点可以同时以它们将单独被观测到的方式被投射到每帧的CCD上。可以采用不同的方法达到同时使颗粒发荧光的所述浓度。首先，可以利用低浓度的明亮荧光颗粒对物体染色。这样可以使它们在观测区域内移动作布朗运动并且它们可以另外通过电泳电流进行移动。可以通过几对电极以它们引导颗粒在不同方向上移动的方式提供电流。其次，可以通过类似由Molecular Probes，USA制造的5-羧基荧光素-二(5-carboxymetoxy-2-硝基联苯酰)酯、β-丙氨酸-羧基lamid、suxynimidil酯(CMNB-装入羧基荧光素，SE)的特殊染料进行染色。在利用波长310-365纳米的UV闪光对观测区域中不发荧光的染料中的大约1000-1600个分子进行照射将释放阻碍荧光的特殊基团。这些分子能够在被蓝光照射时产生几千量子的绿光。此后它们将释放颜色。当物镜孔径为A＝1.1-1.3时，每个荧光颗粒中超过10％的光被传递到摄像机并参与形成覆盖在CCD40像素附近的点。点中心的光强度达到100量子。这一数量足以接收信号和噪声比例相当符合要求的视频信号(当采用上述摄像机时)。这一比例可以通过高于20纳米的分辨率计算点中心的坐标。这种染料不吸收激光并直至阻碍荧光的基团链接在其上才释放颜色。这样可以重复以下过程上万次：开始CCD检测具有剩余荧光的物体的图像。而后图像在摄像机中得到数字化并被传送到计算机。此后UV闪光在可视区域形成1000-1600个荧光分子，激光激发这些分子中的荧光。CCD检测荧光分子和重叠在剩余荧光上的颗粒的图像。图像在摄像机中得到数字化并被传送到计算机，在那里具有剩余荧光的之前德帧被从中减去。所接收的被减去的帧存储在计算机存储器中以为了计算点中心坐标、其平均直径以及强度而作进一步的分析。此后，在不检测图像的情况下对物体照射一段时间。执行这一操作是为了使已经检测的分子的脱色最大化。而后重复整个循环。新的荧光分子将在每个循环中得到形成、检测和脱色，直至所有染料分子的坐标都得到检测。Molecular Probes不仅生产上述染料。公司还可以按照要求生产这种染料。它还可以生产用于单个形成所述染料的成套试剂-“灌装件”(D-2516)。
在实例中指出的摄像机可以以每秒10帧的频率记录单个荧光分子的图像。以符合要求的信号和噪声比例记录图像。可以在几小时内检测例如40000帧。每帧将包含高达1600个分子图像。这样的话，总的检测荧光分子坐标的量可以达到64000000，观测的各个分子之间的平均距离可以仅有10纳米。这比任何其它的透镜显微镜都好十几倍。具有分子图像的帧应该在不压缩或不损失质量压缩的情况下得到保存。这一点应该实现以更精确地计算分子坐标。在一次实验中有关所有不压缩帧的信息总量可以达到几万兆字节。考虑到新型硬盘驱动容量这一点不成问题。文献源提供了有关计算点的中心的多种算法的信息。我们已经编制了计算机软件完成所述计算并基于点的中心的计算坐标平台重建完整的图像。

Claims (5)

1.一种对染色物体进行纳米显微的方法，所述物体被放置在溶液中或作为保存样本的切片被放置在聚合物上，所述方法采用荧光显微镜，其装有具有抑制滤色器的数字摄像机，用于吸取物体的荧光，所述摄像机能够(以低噪声级)检测由激光激发的各个荧光分子的图像，显微镜还装有用于记录从摄像机接收到的图像的计算机；其特征在于，1-2千不发荧光的染料分子通过UV闪光周期性地被转化成发荧光的染料分子，这些分子覆盖物体结构，所述分子被转化成发荧光的分子是因为阻碍荧光的化学基团与它们分离，所形成的荧光分子的图像在摄像机帧上作为单个点得到检测，所述分子在检测的过程中释放颜色并且具有剩余荧光的帧被从包含荧光颗粒和剩余荧光混合物的帧中减去，被减去的帧保存在计算机存储器内以发现代表染料分子坐标的点的中心，这一过程被重复多次以计算在物体光照区域中所有染料分子的坐标并以大于20-50纳米的分辨率重建物体的2-D或3-D图像。
2.如权利要求1所述的纳米显微方法，其特征在于，利用单个观测的荧光纳米颗粒代替荧光分子对规则形成并脱色的物体进行染色，这些纳米颗粒各自包含多个耐荧光分子，由于布朗力这些分子可以在物体结构之间移动并且在由2-D电泳驱动时，激光持续激发这些颗粒的荧光，摄像机和计算机检测上万个帧，每帧上具有1-2千单独检测的点，这些点反射颗粒位置，根据计算的所有帧上点中心的坐标检测区域的液体部分并且颗粒可以在这些区域中移动。
3.如权利要求1所述的纳米显微方法，其特征在于，采用第二摄像机，第二摄像机与第一摄像机相同，但其定位成使得其传感器检测深度与由第一摄像机检测的平面不同的物体平面的图像，这一差值可以从50纳米到2000纳米，通过两个摄像机接收的光强度分布的差异被用于计算物体中染料分子位置的第三坐标，其被用于形成物体的3-D图像，液体样本中的物体在与总的内部反射角相等的角度下通过物镜得到照射，厚度为不足一微米到几微米的固体切片中的物体可以在固体切片的全部深度上通过物镜或者在总的内部反射角下通过物镜得到照射。
4.如权利要求1所述的纳米显微方法，其特征在于，利用不同染料、不同波长的荧光、一组分色镜对物体的不同结构同时染色，并且滤色器被用于选择性地将不同结构的图像投射在两个或多个摄像机上，这样使同时得到检测的分子的数量倍增。
5.如权利要求1所述的纳米显微方法，其特征在于，除了根据权利要求1-4所述的方法形成的图像，不同的装入分子可以周期性地引入物体，这些分子可以因不同的化学反应或者由于不同的物理过程而由不发荧光变为发荧光，这些因素使阻碍荧光的化学基团分离，以所有产生的荧光分子在摄像机帧上作为单个点得到检测的速度使基团分离，在记录过程中分子释放颜色，具有剩余荧光的帧被从包含剩余荧光图像和荧光分子图像的混合物的帧中减去，减去的帧保存在计算机存储器内以进一步发现点的中心，这些中心代表染料分子的坐标，通过在光照区域形成新的荧光分子以计算物体中所有染料分子的坐标并完成这些“特殊”分子在早期接收到的物体2-D或3-D图形上的计算机位置重建，多次重复上述循环。
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