JP2022000648A - ハイスループット生化学的スクリーニング - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、高いフレームレートおよび三次元での高い空間解像度で、主に微生物学的関連物質の調査、試験などを可能にすることである。【解決手段】観察体積が、照射手段からの光（１６）と検出手段の視野（１８）が重なる体積によって規定される、方法および装置を提供する。前記照射手段からの光（１６）の中心軸と前記検出手段の視野（１８）の中心軸とが平行ではなく、およびサンプルが、画像化中に、好ましくはサンプル（１２）を保持しているサンプルコンテナの回転によって、観察体積を通り抜けて運ばれる。【選択図】なし

Description

本発明は、無機物を除外するわけではないが、主として有機物から、またはこの物質に関する化学的、生化学的、または生物学的な反応、相互作用、経路または配列からデータを検出、観察、画像化、および検索する方法および装置を提供する。特に本発明は、例えば、生細胞、生活組織、および有機物の入った溶液において、ハイスループット、かつ、１サンプルあたり低コストで、三次元での高い空間解像度を用いて前述の物質を調査する方法およびデバイスを提供する。具体的に目標とされたさらなる応用は、生細胞または溶液中でのＤＮＡおよびＲＮＡ関連活性を観察する可能性である。

生物学的サンプルを画像化するための方法およびデバイスは非常に多く存在する。これらの大部分が、１９５０年代後半にＭａｒｖｉｎ Ｍｉｎｓｋｙによって特許が取得された共焦点顕微鏡のバリエーションである。共焦点顕微鏡の人気は、三次元における比較的高解像度を可能にするセクショニング能力、および従来の広視野顕微鏡で達成できるのに比べてより良好なコントラストのためである。共焦点顕微鏡は、特定の粒子、例えば、タンパク質がフルオロフォアでマークされて、これによりバックグラウンドから識別される蛍光分光法と組み合わせられることが非常に多い。

ほとんどの共焦点顕微鏡では、照射／励起のため、および調査中のサンプルからの光を調査するまたは検出するための両方で、同じレンズ（少なくとも同じ対物レンズ）が使用される。この構成の利点は、それが古典的な広視野顕微鏡の設計をまねており、そのため多少同じ光学要素が使用できる点である。別の利点は、照射と検出が自動的にアラインされる点である。更なる利点は、サンプル表面に対して垂線の視野軸を用いて照射することおよび調査することによって、例えば全反射などの問題に陥ることなく、Ｎ．Ａを大きくできる点である。

しかしながら、従来の共焦点顕微鏡のこの構造は、扱われことができる適用のスペクトルを制限する弱点および交換条件を付け加える。

共焦点顕微鏡では、解像度、すなわち、２つの区別可能な放射点間の距離は、それからの放出光が検出装置に到達可能な体積（観察体積）を制限することによって得られる。観察体積の制限は、２つのアプローチ：（ｉ）顕微鏡の照射（視野の同等物）軸と直交した寸法では、観察体積の広がりは対物レンズの焦点面の焦点幅によって決定される；および（ｉｉ）対物レンズの照射軸（視野軸）に沿った寸法では、観察体積は、検出装置の正面の光学共役平面に配置されたピンホールの幅によって決定される、を組み合わせることによって達成される。このピンホールは、照射軸方向に沿った焦点面から特定の距離の外側に存在する点から発するすべての光を妨げることができるくらい小さい。この経路は、非常に狭い焦点幅および小さくて正確に配置されたピンホール、三次元のすべてにおける非常に高い解像度を有する対物レンズを選ぶことによって得られる。ピンホールを使用する更なる利点は、観察体積の外側に存在するサンプルの照射部分から発する散乱光または蛍光は検出装置に決して到達しないので、それがコントラストを高める点である。

それにもかかわらず、実施の際に、これは次のいくつかの交換条件を必ず伴う：
第一に、対物レンズの開口数（Ｎ．Ａ．）によって焦点幅が決定される。よって、高解像度を得るためには本当に高いＮ．Ａ．を有することが望ましい。しかしながら、（サンプルの全深度を貫通できる）長い作動距離を有し、かつ、発光と検出光の両方（蛍光分光法では、これは数１００ｎｍである）の色収差を補う広範囲のスペクトルで作動する高いＮ．Ａのための対物レンズは、非常に高価である。

第二に、焦点面の外から発する光を取り除くのに使用されるピンホールは、その時点での焦点面の２点以上の画像化を不可能にする。これにより、１つの画像を得るために、当業者はサンプルと観察体積を互いに対して移動させ（走査させ）なければならない。画像はドットごとに合成され、そして、１０２４×１０２４フレームを取得するのに１秒を大幅に超える時間がかかる可能性がある。これは、画像化を並列処理にして、これによりハイスループットを達成する可能性を難しくする。

以上のように、従来の共焦点顕微鏡の観察体積は、狭い焦点幅をピンホール技術と組み合わせることによって決定される。三次元空間で観察体積を生じる別の方法は、いわゆる共焦θ顕微鏡を使用することである、Ｓｔｅｌｚｅｒ，ＥＨＫ，ｅｔ ａｌ．「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｉｎ ｆａｒ−ｆｉｅｌｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ａｘｉｓ： ｃｏｎｆｏｃａｌ ｔｈｅｔａ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｏｐｔ Ｃｏｍｍｕｎ．１１１，５３６−５４７，（１９９４）を参照のこと。この技術では、観察体積は、それらの視野軸が直交し、かつ、それらの焦点面が交差するように配置された２個の対物レンズの使用によって代わりに決定される。これにより、観察体積は、ある方向の１つの検出装置の焦点幅によって、および直交する第二の方向の第二の検出装置の焦点幅によって制限される。この場合の照射は、それが着目の観察体積を照射する限り任意である。

観察体積の観点から、θ共焦点顕微鏡はピンホールの必要性を取り除く。しかしながら、コントラストの観点から、検出装置に到達する観察体積の外から発する光を抑えるために、ピンホールが必要である。

共焦点顕微鏡が本質的に地点ごとの測定装置であるので、サンプルの画像は、サンプル体積を移動させ、顕微鏡の対物レンズと検出装置の正面のピンホールによって規定された観察体積に対して調査中なすべてのサンプルを入れ、そして、各地点の強度値を計測することによって形成される。二次元（ｘ−ｙ）画像全体が得られるまで運動を続け、経時的な一連の画像を作り出すためのプロセスが反復され得る。あるいは、観察体積はまた、光学切片の三次元（ｘ、ｙ、およびｚ）の画像スタックを入手するために、顕微鏡軸に沿って進んでもよい。このベクトル値を用いて、三次元画像を合成することができ、そしてスクリーンに一般的に断層撮影のように表示される。

共焦点顕微鏡の初期バージョンでは、サンプルは、画像ベクトルが作り出されるまで三次元でサンプルを系統的に移動させる高精密並進ステージ上に配置された。高いフレームレートを作成するために、サンプルを、サブマイクロメートル精度を維持しながら、あらかじめプログラムされた経路に沿って高速で移動させなければならない。これは、サンプルホルダーおよびステージの質量の著しい増大により、挑戦的、かつ、高価な課題である。また、広い面積にわたって焦点を維持することも難しく、比較的複雑な自動焦点システムがこのために導入された。

Ｇｒａｔｔｏｎら（米国特許第７，９７４，２９４号）は、観察体積にわたってサンプル体積を移動させるために別の解決法を提案した。サンプル体積の周りで移動するｘ−ｙ−ｚ並進ステージを有する代わりに、サンプルを、回転しているコンテナ内に置いた。これにより、非常に大きいサンプル体積を、最小限の必要加速で共焦点顕微鏡の観察体積を通過させることができる。定常状態にあるとき、回転ステージの摩擦だけが克服されなければならず、そして、コンテナはまた、サンプル体積のすべての部分にアクセスするように他の方向にゆっくり移動され得る。しかしながら、この設定は画像化を意図したものではなく、むしろ分光計測を意図している。

高いフレームレートを実現するための別のアプローチは、レーザー走査共焦点顕微鏡である。サンプルを移動させる代わりに、励起光ビームが、サンプル体積を横断する焦点ビームをラスタ走査する一対の振動性ガルバノメーターミラーまで拡大され、そしてそこに向けられた。サンプルからの光は、同じ鏡のセットを通して非走査化され、検出装置に達する前に共役（共焦）ピンホールを通過した。走査速度は最も速い鏡の機械的な仕様によって制限され、そしてそれは、像点（ピクセルまたは三次元空間でボクセルと呼ばれることもある）あたり約４〜５マイクロ秒の速度で一般的に走査される。よって、１秒後に回収された５１２×５１２ピクセルの画像に関して、走査線は約４マイクロ秒間、各ピクセルにとどまる。一方、鏡が急速に加速され、その視野を横断して走査している間、等速で保持され、その後、急速に減速され、そして進む方向が反転され、このサイクルがそれぞれの走査線について反復されなければならないという事実により、より高い速度を得るのは、不可能ではないにせよ、非常に困難である。

走査速度の制限は、共鳴走査スキームを用いることによって改善されるが、斯かる高速捕捉は別の問題を抱えている：いわゆる滞留時間が非常に短くなる。滞留時間とは、本明細書中では、サンプル（標本）の同じ部分が観察体積の照射部分内に「とどまる」時間と定義される。特に蛍光画像法がかかわる場合には、高速走査共焦点顕微鏡が不十分なシグナル対ノイズ比を欠点として有する可能性がある。

サンプルの高速走査のための別の代替手段は、（Ｎｉｐｋｏｗ）回転ディスク法である。この共焦点顕微鏡は、ディスクの１回転中にサンプル体積を網羅するように設計された渦巻きパターンに配置された１若しくは複数のピンホールアレイを有する円形の、回転するディスクに基づいている。加速はディスクを回転させる以外必要ないので、この構成は定常状態において機械的に非常に安定している。この方法の別の利点は、回転盤のピンホールにもかかわらず、いくつかの地点（ピクセル）が並行して見られる点である。高速と並列処理する能力を組み合わせて、１０００フレーム／秒を超える非常に高いフレームレートが、この技術を使用することによって達成された。しかし、回転ディスク共焦点顕微鏡はそれらの人工品を伴う。制限の一つは、焦点面の外からの散乱または出射光が、隣接しているピンホールを通り抜けて検出装置に達する、いわゆるピンホールクロストークである。第二の制限は、ディスクのピンホールを通り抜ける光のパーセンテージの低さ（多くの場合１０％未満）である。光の残りは反射され、検出装置においてバックグラウンドノイズとして現れ得る。これらの副作用の両方がシグナル対ノイズ比を制限する。恐らく考えられる最も大きい不都合はこの種の機器の複雑さであり、それがこの方法に基づく機器のコストを多くの適用において手が届かないものにしている。
したがって、従来技術はマイクロ画像化向けの装置の改善に向かって進んできたが、商業的に実施可能なコストにて高解像度およびハイスループットを実現するには、いまだにかなりの困難がある。

よって、本発明の重要な目標は、本発明に基づく方法および装置が十分資金のある調査研究室から、例えばポイントオブケア適用におけるはるかに一般的な用法に移行できるコストレベルにて、高いフレームレートおよび三次元での高い空間解像度で、主に微生物学的関連物質の調査、試験などを可能にすることである。

本発明によると、上記の目標は、サンプル体積がどのように観察体積を通り抜けて運ばれるか、および前記の観察体積がどのように規定されるか、そして、観察体積からの出射または散乱光がどのように検出されるかに関して新規な組み合わせによって達成される。

最初に、本発明の実施形態において、観察体積はθ共焦点顕微鏡に類似しているが、しかし、観察体積が照射／出射光の焦点幅と検出手段の対物レンズの視野の焦点幅によって決定される非常に重要な差異を伴った方法で定義される。照射／出射光の焦点面と対物レンズの焦点面は交差しており、そして、照射／励起光と対物レンズの軸は、好ましくは直交しているが、少なくとも平行でないように選ばれる。この構成は、検出装置のみが照射された検出手段の視野の部分からの光を受けるので、ピンホールの必要性を取り除く。検出装置の正面のピンホールなしに、当時照射／励起手段によって照射された面のいくつかの地点を調査することが可能である。好ましい実施形態において、照射手段のレンズは、照射が線状焦点であり、これにより、好ましくは検出手段の視野の軸に平行な垂直ベクトルを有する照射面を形成するように選ばれる。このように、検出手段は、それが並行して照射面の多くの地点（ピクセルまたは三次元化空間のボクセル）を調査するように工夫される。これは、従来の共焦点顕微鏡のｘ−ｙフレームに相当している。

第二に、調査中のサンプルまたは標本は、サンプルコンテナ保持手段に取り付けられたまたは組み込まれたサンプルコンテナ内に置かれ、そしてそれは、サンプルが回転し、そして、上記の段落に従って規定された観察体積を通過させるように回転を作り出す手段に順に連結されている。これは、Ｇｒａｔｔｏｎら、Ｓｐａｕｌｄｉｎｇ，Ｈａｒｕｆｕｍｉ（ＵＳ４９４０３３２Ａ）によって提案された回転するサンプルホルダーと同様であるが、本発明の方法と装置は他のほとんどの態様において異なる。サンプル体積の回転に関する別の非常に重要な機能は、観察体積にサンプルを通すこと以外に、サンプルホルダーの内面に対して機械的な平衡状態で固定されたサンプルを保持するのに十分な遠心力をサンプルにかけることである。

第三に、対物レンズの視野軸、および（回転による）サンプル体積の運動ベクトルが、垂直にならないように、好ましくはそれらが４５度の角度を有するように選択される。検出手段が照射ボクセルの面を調査する手段を備えている場合、前記のように、サンプル体積の運動が、ボクセルの面を通してサンプルを移動させ、そして、時間の関数としてサンプルを切片化し、そして、画像スタックの作成を可能にする。これは、先に記載した従来の顕微鏡法のｚ−方向のステッピングに相当している。
よって、本発明は、請求項１に記載の装置、ならびに請求項１０に記載の方法を提供する。本発明の好ましい実施は、従属クレームに概説されている。

以下に続く詳細な説明では、添付の図面を参照する。

図１は、本発明の実施形態による装置の一般的な構成を図式的に示す。 図２は、サンプルを精査するための本発明の配置構成の拡大図を図式的に示す。 図３は、本発明に従って照射および検出がどのように協調的に観察体積を規定するかを図式的に例示する。

詳細な説明
先に概説されているように、サンプルを、回転手段によって観察体積を通過させる。この配置構成は、本発明による実施形態のいくつかの好都合な特性を達成する役目を果たす。いったんサンプルコンテナを所望の回転速度にし、そして、この速度が一定に保たれると、サンプルに作用する力は、遠心力と、サンプルコンテナの内壁によってサンプルに作用する垂直抗力だけである。サンプルはまた、蓋は必要としないように、化学的結合または接着によってサンプルコンテナに保持されてもよい。よって、サンプルは、制御された位置に機械的な平衡状態で維持される。さらに、運動の手段としての回転は、精度の点から有利であり、本発明の完全な潜在能力の達成を容易にする。最先端のエアベアリング技術を使用することによって、ならびにサンプル保持手段およびサンプル含有手段のバランスを慎重にとることによって、サンプルの十分に制御された軌道が達成できる。定常状態では、すなわち、一定の回転速度では、サンプルコンテナ保持手段の位置は、観察体積を通り抜けるとき、一桁のボクセルサイズで、すなわち、検出された光の波長の半分程度で制御できる。

図１は、本発明による構成を図式的に示し、そしてそこでは、サンプルは回転可能なサンプルコンテナホルダー上のサンプルコンテナ内に提供される。図１では、ホルダー１０は、そこにサンプル１２が存在している中空円筒として示されている。円筒形の蓋１４は、ホルダーの上に配置されて、サンプルコンテナを規定し、そして、サンプルは、サンプルが蓋１４に対して適所で安定状態を維持するのを確実にする遠心力により、回転中は適所に保たれる。図面では、サンプルは小さな円１２として示されおり、そして、図が複雑になり過ぎない程度に、ほんのいくつかのサンプルしか示されていない；しかしながら、サンプルコンテナホルダーの外縁全体がサンプルによって占有されても、または一般的に占有される可能性があってもよいことは、理解されるべきである。サンプルを精査するために、照射手段１６および検出手段１８が提供される。照射手段１６は、好ましくは、例えばダイオードレーザーなどの１若しくは複数のレーザーであってもよい。検出手段１８は、好ましくは単光子計数検出装置であってもよい。

本発明の好ましい実施形態において、サンプルコンテナ保持手段の回転は、以下の配置構成で達成される：回転発生手段、一般的に電動ブラシレスＤＣモーターは、前記サンプルコンテナ保持手段が同じ速度で回転させるサンプルコンテナ保持手段に、好ましくは電磁誘導の力で、そのローターシャフトの角運動量を伝える。サンプルコンテナ保持手段は、好ましくは、例えばアルミニウムもしくは鉄鋼などの金属であるか、またはプラスチック材料かもしれず、理想的には空洞または中身の詰まった円筒、すなわちチューブまたはロッドで作られた。平滑で正確な回転を可能にするために、前記サンプルコンテナ保持手段は、それがその長さに沿った軸の周りに対称であり、かつ、質量が軸からすべての径方向に均等に分配されるように設計および製造されているのが好ましい。また、その軸の周りの平滑で再現性のある回転を確保するために、回転するサンプルコンテナ保持手段は、非接触サスペンションを実現するようなベアリング、好ましくはエアベアリングまたは動電力ベアリングによって適切な位置に保たれ、前記ベアリングは、前記サンプルコンテナ保持手段と内側または外側の固定式継手との間で組み立てられる。サンプルコンテナ保持手段の一部は継手の外側に伸び、サンプルコンテナの手動または自動取り付けに利用できるようにした。

サンプルコンテナは、非常に多くのやり方で設計され得る。しかしながら、本発明の目標のためになるように、サンプルコンテナは、理想的には、容易にサンプルコンテナ保持手段に取り付けされ、組み合わせたサンプルコンテナ保持手段とサンプルコンテナの重心の中心が著しく片寄っていない方法で形作られ、光学的に透明であり、化学的に不活性であり、サンプルまたは標本の保護を提供し、および産業アッセイの標準手続きに適合できなければならない。

次に、図２を概括的に参照する。本発明の一実施形態において、サンプルコンテナは、非常に高度に偏平なガラス、高分子またはシリカのプレート様媒体２４を含む。前記プレート様媒体の厚さは、破損の危険を冒さずに、サンプルコンテナ保持手段の少なくとも一部の外面と同じ半径に傾けることができるように選択された。プレート様媒体２４の一方の面は、サンプルまたは標本２５を当てはめ得るウェルのパターン、溝、隆起部または同様のものを備えてもよい。前記プレート様媒体２４上に、好ましくは不活性な高分子の、光学的に透明な薄板またはフィルム２２が、プレート様媒体のパターンが形成されている側の上に蓋として取り付けられて、プレート様媒体に置かれたサンプルまたは標本２５を取り囲むまたは保護する。蓋の別の機能は、サンプルが回転による遠心力によって外側に向かって押されるとき、サンプルに対して垂直抗力を提供する最外層としての役目を果たすことである。高分子の蓋の第三の機能は、サンプルまたは標本とサンプル保持手段との間の反射を最小にすることである。好ましい実施形態において、蓋は、水の屈折率（ｎ＝約１．３３）に近い屈折率を有する材料、例えばＣｙｔｏｐから作られる。

非常に微小な詳細を調査することができるように、高い空間解像度を得ることが本発明の目標である。先に概説した実施形態において、２つの要因が空間解像度を決定する。対物レンズの焦点面の寸法では、理論解像度を決定するのはそのレンズの解像力である。解像力は、Ｒ．Ｐ．＝λ／２ＮＡによって開口数と光波長から順に決定される。検出手段がこれらの２つの地点を見分けることができる限り、これもまた、実用的な解像度である。照射によって規定された寸法では、線源が、例えば単一モードレーザーまたは単一モードファイバーなどの点線源である場合、同じ式が成立する。よって、ボクセルの最小体積は、解像力の３乗によっておおまかに決定される。

上記から、照射手段２６および検出手段２８の両方の大きい開口数が、高解像度の画像を得るのに必要であることは明白である。大きいＮ．Ａ．の更なる利点は、調査下でサンプル２５からの散乱または出射光を捕捉する検出手段２８の能力を増強する点である。特に蛍光分光法用途において検出される必要があり得る低レベルの光を考慮すると、これは非常に重要である。しかしながら、これは、光が照射手段２６からサンプル体積２５に入り、そして、サンプル体積２５から散乱または出射した光を回転するサンプルホルダー表面の垂直ベクトルに対して大きい角度でそうすることを可能にする必要を伴うので、高いＮ．Ａは難題を持ち込む。これは、結合がどうにか軽減されない限り、反射のため光が失われることを意味している。

本発明の一実施形態において、これにより、手段は、大きい角度にてサンプルコンテナへのおよびそこからの光の結合を容易にするために導入される。これは、回転するサンプルコンテナ保持手段と光学接触している少なくとも１つの結合手段を配置することによって達成される。結合手段は、通常、サンプルコンテナ保持手段と共に回転しないが、好ましくは検出手段および／または照射手段に固定されている。この点における光学接触によって、結合手段の表面が、結合手段とサンプルコンテナの間の光のエバネセント結合を可能にするのに十分にサンプルコンテナ表面に近いか、またはサンプルの屈折率（すなわち、ほぼ水の屈折率）と少なくとも同じくらい高い屈折率を有する十分な量の液体が結合手段とサンプルコンテナとの間に維持されており、かつ、それらと接触していることが意味される。結合手段の反対側には、可能な限りその表面の垂直ベクトルに近くその表面を光が通過できるように、表面が一般的に凸状またはプリズムとして設計される。好ましい実施形態において、この結合手段は、半球の形状をした結合プリズム２３を備える。球の形状は、光がすべての方向でプリズムに入るのを許容し、これにより、検出手段２８および照射手段２６が自由自在に配置できる。プリズム２３の内部は、液体、好ましくはわずかに塩を含んだ水で満たされる。半球の平面２３ａは、サンプルコンテナ保持手段が回転して結合手段を通過する間に、サンプルコンテナ保持手段に対してスライドしている。プリズム２３の底部では、穴２３ｂが半球内からの体液の制御された漏出を可能にする。半球内からの体液は、結合手段とサンプルコンテナ保持手段との間の摩擦を軽減する潤滑剤として作用すると同時に、光学接触を達成する。穴は、照射手段からの光にとって入射するため、かつ、検出手段によって調査される光が液体部分を通過するために十分に大きく作られる。

ここで、図３を参照する。本発明の別の目標は、装置の総合コストを低減することであり、この点で、照射手段の線源としてダイオードレーザー３２を選択するのは有益である。本発明の好ましい実施形態において、照射手段３４は、関連ドライバーおよびパルス発生器を有する高出力ダイオードレーザー、ならびに線状焦点を作り出すように設計された焦点合わせ手段を備える。線状焦点は、検出手段３７の視野の軸に好ましくは垂直の、かつ、その検出手段の焦点面と交差する面を照射する役目を果たす。これらの条件が満たされるとき、検出手段３７の焦点面は照射面と一致して、観察面３５を規定する。これは、最大数のボクセル（観察面３５の「ボックス」と図面で示されている）が最適条件下で照射および観察されることを意味する。簡単さを目的として、この面は観察面と規定される。線状焦点は、円柱レンズまたは光ファイバー３４を使用することで好ましくは達成される。図面を過度に複雑にし、その結果、その理解を低減する危険を冒さないように、破線の軌跡線は、検出手段／観察面の１つ、ならびに照射手段の一部だけに含まれるのみである。

以上のように、ダイオードレーザーはコスト観点から好まれる。しかしながら、ダイオードレーザーは、空間干渉性の見地から理想的でない。特に、高出力を有するものは、空間的にマルチモードであることが多く、これが照射によって規定された寸法において可能な解像度に影響する。本発明の別の実施形態において、第二の検出手段３７ａが導入され、第一の検出手段の軸に対して好ましくは垂直な視野軸を有するが、少なくとも有意に平行ではない。また、第二の照射手段３２ａは、好ましくは円柱レンズまたは光ファイバー３４ａを使用した線状焦点と共に導入される。前記第二の照射／励起光の焦点面と対物レンズの焦点面は交差していて、そして、前記第二の照射／出射光の軸と前記第二の検出手段の軸は、好ましくは直交し、少なくとも有意に平行でないように選択される。これは、サンプルの運動（図３の左を指している矢印によって図式的に示されている）のため、サンプル３９の同じ体積が、第一の検出手段３７および第一の照射手段３２、３４によって規定された観察面３５を最初に通過し、次に、第二の検出手段３７ａおよび第二の照射手段３２ａ、３４ａによって規定された観察面３５ａを後の時点で通過する構成を可能にする。前記２つの観察面３５および３５ａによって作成される画像を相関させることによって、レーザー光源のマルチモード挙動のため、ある寸法における位置の不確実性は、同じ寸法のもう片方の観察面による位置のより良好な精度によって埋め合わせることができる。よって、この実施形態は、低価格レーザーの使用を可能にすると同時に、回折限界の解像力近くでまだ得られる。この実施形態の別の利点は、狭い焦点幅の要件を緩和し、より大きい焦点深度を可能にし、これにより、より大きい有効照射領域を可能にするので、照射面の有効面積を増大するという点である。

多くの適用において、例えば、スクリーニング用途においてまたは生化学反応の力学が調査されるとき、ハイスループットまたはフレームレートが非常に望ましい。本発明は、このために少なくとも２つの方法で貢献する。本発明がピンホールの必要性を取り除くので、先に規定される、照射面のいくつかの地点（からシグナルを検出する）の検出を並列処理すること、すなわち、同時に調査することを可能にする。よって、毎秒あたりのボクセルで計測される得られたスループットは、並列して調査され得るボクセル数に毎秒あたり照射面を通過するボクセル数を掛けて計測される並列処理の程度になる。よって、スループットは、回転速度を高くすることによるか、または並列化を増強することによるかのいずれかによって向上され得る。本発明の目標とされる適用の１つは、生細胞の生化学を調査することを可能にすることである。生細胞は非常に複雑な系なので、例えば特定のタンパク質−タンパク質相互作用などの特定の事象を識別することは、非常に困難なタスクである。斯かる事象を可視化するために、着目のタンパク質は、別の波長の光によって励起されたとき、特定の波長で発光するフルオロフォアで標識される。（単数若しくは複数の）特定の波長だけを検出装置に到達できるようにするフィルターを使用することによって、顕微鏡によって作り出される画像は、本来の励起光の代わりに蛍光から作られる。これにより、標識したタンパク質だけが画像に現れる。

理想的には、フルオロフォアは、非常に多くの回数、励起され、そして蛍光を発することが可能である。残念ながら、フルオロフォアの励起は、所望の蛍光の放出でいつも終わるというわけではない。何らかの可能性を伴って、励起分子は、代わりに暗状態（例えば、いわゆる三重項状態）で終わり、そしてそれは、基底状態（いわゆる、光漂白）への分子の復帰を無効にするか、または根本的に減速させる。三重項状態への遷移はまた、その環境に対して分子を毒性にする。よって、光漂白および毒性を避けるために、フルオロフォアの励起を最小限に保つことが非常に好ましい。同時に、実際の適用における蛍光の量は通常、非常に少ない。これは、レンズ、検出装置、および検出手段のシグナル処理に非常に高い要求を出す。この点に関する重要パラメーターは、いわゆる滞留時間である。滞留時間とは、サンプル（標本）の同じ部分が照射ボクセル内に「滞留する」時間と定義される。高いシグナル対ノイズ比を得るために、機器の滞留時間がフルオロフォアのライフタイムを少なくとも１桁超えているのが望ましい。この方法は、フルオロフォアが検出手段の積分時間中、何回も励起および蛍光を発することができる。

本発明は、光漂白を最小にすること、十分なシグナル対ノイズ比を確実にするのに十分に長い滞留時間を有すること、およびハイスループットを維持することの間のバランスをとることが可能になる。観察体積が照射によって部分的に規定されるので、フルオロフォアは、観察されているときのみ励起される。これは光漂白を最小にする。回転スピードを調整することによって、滞留時間は、良好なシグナル対ノイズ比を得るように調整できる。さらに、（検出手段によって並列で観察された地点の数）並列化を増強することによって、ハイスループットは中程度の回転速度で維持できる。

単純にした記述では、本発明の実施形態に使用される検出手段は、画像化手段、任意の画像輸送手段、任意の波長フィルタリング手段、ここでは、光シグナルを検出し、そしてそれらを電気シグナルに変換する手段の省略である検出装置、任意の増幅手段、ならびに捕捉した画像に相当するシグナルを加工、提示および保存する最終的な手段を備える。画像化手段は、反射または屈折のいずれかで、像平面における焦点面の強度分布の像を作成する。画像化手段の通過に並行して、好ましくない波長を取り除くために、フィルターが導入されてもよい。光ファイバーをバンドルする場合がある任意の画像輸送手段の一端は、像平面に配置され、そして、検出装置が配置されている画像輸送手段のもう一方の末端に前記の面の強度分布を輸送する。強度分布を電気表示に変換した後に、これらのシグナルは、必要に応じて、加工、表示、または保存前に増幅される。検出手段の１つの実施において、画像化手段は、高い開口数を有する対物レンズ、および像平面における、観察面の強度分布の鏡像を作成する第二レンズを備える。画像輸送手段として、ファイバーバンドルが好ましく使用される。ファイバーバンドルの先端は、像平面に配置され、そして、観察面の各ボクセルがファイバーバンドル内の単ファイバー上に像を描くように配置構成される。好ましくは、それらのクラッドと比較して高いＮ．Ａおよび大きいコアを有するファイバーが、ボクセル間のクロストークを最小にし、かつ、損失を最小にするのに使用される。次に、バンドル内のファイバーが切り離され、そして、各ファイバーが検出装置に接続される。好ましい実施形態において、これらの検出装置は、いわゆるＧｅｉｇｅｒモードで作動するアバランシェ光検出装置（ＡＰＤ）、すなわちＡＰＤの降伏電圧より高い逆電圧で作動したＡＰＤである。このタイプの検出装置の利点は、それが非常に高い内部利得があり、これにより、まばらな光子を伴う適用に好適である点である。

別の実施形態において、ファイバーバンドルの後端では、検出装置アレイ上に像が描かれる。これはボクセルあたりのコストを削減するが、しかし、ダークカウントとアフターパルス化のため、Ｇｅｉｇｅｒモードで作動しているＡＰＤを用いた検出装置アレイは成熟技術でない。

さらに別の実施形態において、ファイバーバンドル内のファイバーは、すべてが異なった長さを有する。そして、いくつかのファイバーが、同様に好ましくはＧｅｉｇｅｒモードによる同じ単一検出装置に接続されてもよい。これにより、同時に出射した２つの異なったボクセルからの光は、検出装置上にいろいろな時間に到達する。２つのファイバー間の長さの最小許容差は、検出装置のバンド幅とその後のシグナル処理で決定される。長さの最小差は、検出装置とごくわずかな関連シグナル加工が長さの最小差に相当する２つのボクセルを見分けることができるように、好ましくは選択される。この実施形態において、照射手段からの励起光は、任意の２つのファイバー間の遅延の最長差を超える遅延時間で放出される短パルスを含む。この実施形態の利点は、並列処理の程度を低減することなく、よって、毎秒あたりのボクセル数を低減することなく、検出装置の数を削減できる点である。これは同様に、方法および装置のコストを低減する。

先に述べたように、好ましい実施形態において、検出装置はＧｅｉｇｅｒモードで作動するＡＰＤである。これは、非常に意識的な選択であり、蛍光標識が特異性（感度）を達成するのに使用されるとき、特に有効である。斯かる適用において、ボクセル内のフルオロフォアからの光子が検出される化合物の可能性はかなり小さい。この可能性を高める方法は、滞留時間、すなわちフルオロフォアが照射されたボクセル内に留まる時間を増やすことである。この方法は、フルオロフォアを励起し、そして、蛍光を発する回数を増やし、これにより、光子を検出する可能性を増強し得る。しかしながら、先に考察されたとおり、滞留時間が延長するほどスループットが低下するが、これは並列度を増強することによって補うことができ、このアプローチに対して制限がある。滞留時間を延長することはまた、検出手段の積分時間が増加することも意味し、そしてそれは、我々が増幅段階も含めて検出装置のダークカウントを増やしていることを意味する。実際には、ノイズレベルは、積分時間と共に直線的に増強される。ＧｅｉｇｅｒモードによるＡＰＤには、非常に大きい内部増幅（しばしば１０の６乗を超える）があり、そして、これは単光子さえ強いシグナルをもたらすことを意味する。好ましい実施形態において、滞留時間は、約１００ｎｓになるように選択される。この間に１つの光子が放出される尤度は約１である。光子が到達する時間が１００ｎｓ未満であることは公知なので、積分時間のみがその水準である必要がある。これにより、統合ノイズは比較的低くなる。１ｋＨｚのフレームレートを有する回転ディスクでは、はるかに低い増幅、ピンホールクロストークなどと共に、積分時間が１００００倍より長い必要がある。よって、ハイスループットおよび／または低い光レベルのために最適化された適用において、Ｇｅｉｇｅｒモードで動作する検出装置の形態で検出手段を使用するアプローチは、非常に有用である。

本発明の別の目標は、方法または装置を使用するときに、ワークフローを簡単なままにしておくことである。サンプルの画像化は、一般的にアッセイにおける多くのステップのうちの１ステップにすぎない。ほとんどのアッセイでは、画像化前に、サンプルは、例えば増幅、沈殿、洗浄などの多くの調製手順を経る。産業適用において、斯かるアッセイは、プレート、皿、マイクロアレイ、または他のタイプのサンプル包含手段を使用して自動化されており、加工を分割することによってサンプルを効果的に閉じ込め、そして、輸送する。前記サンプルコンテナは、多数の組み合わせで多くの標的（分析物）と試薬を調査できるように多くの系統的に配置構成されたウェルを備えることが多い。多くの検査室では、アッセイの自動化を提供する装置の大規模なインストールベースが存在するので、よって、本発明の実施形態に使用されるサンプルコンテナがこれらの標準手順を守っていれば、それは利点になる。この目的のために、本発明の一実施形態において、サンプルは平面またはプレート様媒体の上に置かれるが、前記媒体は、それがサンプルコンテナ保持手段の湾曲または形状に従うように、回転発生手段に取り付けられるのに十分な柔軟である材料もしくは材料の組み合わせからできているか、または適切な寸法を有する。このような方法で、サンプルコンテナは、平らな形態にあるとき、標準的な調製方法に適合するように製造され、その後、本発明の企図に従うサンプルコンテナ保持手段の形状を呈する。

本発明の別の大きな利点は、観察体積においてボクセルまたはボクセルのセットから強度のスナップショット、つまり、現場記録を取得する点である。当該技術分野の現状と異なって、サンプルが観察体積内に存在する間に強度のプロファイルを記録する必要はない。これは、サンプルが観察体積を通過するスピードが、時間を算定可能なスピードより何桁も速く起こり得ることを意味する。一般的に、回転速度は、１００回転／秒程度なので、観察体積を通過するサンプルのスピードは、毎秒数メートル〜数十メートル程度である。サンプル体積を高速、一般的に毎秒１０メートルで観察体積を横切って移動させることによって、これにより、本発明の実施形態は、当該技術分野の現状、例えば、従来の共焦点顕微鏡と比較して、大量のサンプルのスクリーニングを可能にする。

本発明の実施形態の更なる利点は、検出されたシグナルを受け入れるまたは分析するのにパターン認識アルゴリズムを必要としない点である。それぞれのボクセルの位置が時間の関数として分かっており、かつ、各ボクセルからの光の強度が瞬時に検出されるので、作り出されるデータは、観察体積を通り抜けた全体積の高解像度立体マップで表される。

同じ体積を次々と観察し得る高精度の回転は、細胞または溶液中の粒子の運動の（少なくとも統計的に）連続した観察を可能にする。運動は、ランダムウォークによるか、求心力によるか、または適用された電界によるかのいずれかであり得る。サンプルまたは標本に関する非常に重要な情報は、運動データ、特に運動の喪失から推論できる。

Claims (21)

1. サンプルを画像化するための装置であって、前記サンプルに照射するための照射手段、前記サンプルから放出または散乱する光子を検出するための検出手段、および前記サンプルを保持するためのサンプルコンテナを備え；
   画像化中にそこから光子が放出または散乱する、サンプルコンテナ内の観察体積が、照射手段からの光と検出手段の視野とが重なる空間内の体積によって規定されること；
   前記の照射手段からの光の中心軸と前記の検出手段の視野の中心軸が、平行ではないこと；および
   画像化中に、前記サンプルコンテナの回転運動によって、前記サンプルの少なくとも一部が前記観察体積を通り抜けて運ばれ得るように、サンプルコンテナが回転できるように配置されること、を特徴とする装置。
2. 前記検出手段が、Ｇｅｉｇｅｒモードのアバランシェ光検出装置を備える、請求項１に記載の装置。
3. 回転できるように配置されたサンプルコンテナを浮動させるためのエアベアリングをさらに備える、請求項１または２に記載の装置。
4. 回転できるように装置に据え付けられるサンプルコンテナ保持手段、およびサンプルコンテナ保持手段の外面に当てはまるように半径まで曲げられることができ、かつ、サンプルコンテナ保持手段に取り付けられることができるプレート様サンプルコンテナをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
5. 少なくとも２つの観察体積を規定するために少なくとも２つの照射手段および検出手段を備え、ここで、前記サンプルの少なくとも一部が別々の時点で前記２つの観察体積を通り抜けて運ばれ得るように、サンプルコンテナが回転できるように配置される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
6. 前記サンプルコンテナが、サンプルを保持するための溝、ウェルまたは同様のものを提供するプレート様媒体、ならびにその中にサンプルを収容するための、前記溝、ウェルまたは同様のものを覆う薄板またはフィルム形態の蓋を備え、前記蓋が、好ましくは水の屈折率に近い屈折率を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
7. サンプルコンテナの回転中に、蓋と反対方向にサンプルを保持する遠心力により、サンプルが、サンプルコンテナ内に固定されるように配置される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
8. 第一の側面においてサンプルコンテナと光学接触の状態にあり、かつ、結合手段に入るまたは出る光子の反射を低減するために第二の側面に曲面を有する結合手段をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
9. 前記照射手段および前記検出手段が、前記結合手段に対して静止しており、そしてここで、前記サンプルコンテナが、前記結合手段に対して回転できるように配置される、請求項８に記載の装置。
10. 前記結合手段が、液体を保持するための空洞を備え、そしてここで、サンプルコンテナと光学接触の状態にある第一の側面に、結合手段とサンプルコンテナとの間の潤滑および／または改善された光学接触を提供するための、それを通して空洞から液体を漏出し得る開口部を有する、請求項９に記載の装置。
11. 少なくとも２つの異なるボクセルからの光子が一般的な検出装置を使用して連続して検出できるように、前記検出手段が、一般的な検出装置に連結された異なる長さの少なくとも２本の光ファイバーを備える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置。
12. サンプルコンテナの回転中に、それぞれサンプルが複数回、観察体積を通り抜けて運ばれ得るように、前記サンプルコンテナが回転できるように配置される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
13. 観察体積が、照射手段からの光と検出手段の視野が重なる体積によって規定される、サンプルを画像化する方法であって、前記の照射手段からの光の中心軸と前記検出手段の視野の中心軸が平行ではないこと；およびサンプルが、画像化中に、サンプルを保持しているサンプルコンテナの回転によって観察体積を通り抜けて運ばれることを特徴とする方法。
14. 検出が、Ｇｅｉｇｅｒモードで作動しているアバランシェ光検出装置を使用しておこなわれる、請求項１３に記載の方法。
15. サンプルコンテナが、エアベアリングによって浮動する、請求項１３または１４に記載の方法。
16. サンプルコンテナ保持手段の外面に当てはまるように半径まで曲げられるプレート様サンプルコンテナ内にサンプルを保持すること、およびサンプルコンテナ保持手段にサンプルコンテナを取り付けることをさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 少なくとも２つの観察体積が規定され、そしてここで、サンプルが、連続して前記少なくとも２つの観察体積を通り抜けて運ばれる、請求項１３に記載の方法。
18. サンプルが、回転によって観察体積またはそれぞれの観察体積を通り抜けて運ばれ、それによって、サンプルが、前記回転中に、繰り返し画像化される、請求項１３または１４に記載の方法。
19. 時間分解イメージングが、観察体積を通してサンプルの少なくとも２つのパッセージから検出されたシグナルを比較することによって実施される、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. サンプルがフルオロフォアを使用して標識され、そして、画像化が、前記フルオロフォアからの蛍光を検出することによって実施される、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. サンプルが１若しくは複数の生細胞を含有する、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。

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