CN103411936A - 一种三维纳米分辨定位方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明适用于分子定位技术领域，提供了一种三维纳米分辨定位方法，包括：对物品中的目标分子进行荧光激发；采用两个并行的探测通道进行荧光探测，在每个探测通道中，使荧光依次通过一物镜及一弯曲光栅采用两个并行的探测通道进行荧光探测，在每个探测通道中，使荧光依次通过一物镜及一弯曲光栅，成像于同一个探测器上的不同区域或分别成像于不同的探测器上；两个探测通道对应的成像面对应于物品中的共轭面错位分布，间距为1～3μm；采用双焦面法对图像进行分析，确定目标分子的三维定位信息。本发明将弯曲光栅多焦面并行成像与双焦面定位法有机结合，在突破现有显微系统景深的同时，实现对细胞厚度范围内运动分子的三维纳米定位和追踪。

Description

一种三维纳米分辨定位方法及装置

技术领域

本发明属于生物细胞分子定位领域，特别涉及一种三维纳米分辨定位方法及装置。

背景技术

细胞是生物体组织和器官的基本组成单元，也是生命体最小的结构单元和功能单元，人们对复杂生命体的认识必须从最小的生命组成单元—细胞开始。细胞生物学中，许多细胞功能相关的动态生命学过程都与细胞内的囊泡和/或单分子的运动相关联。细胞内生物学过程追踪（如分子运动轨迹的追踪）是理解细胞功能的重要基础。对于这些动态过程研究，用的最多的一种分析方法是单分子追踪（Single Particle Tracking,SPT）。SPT通过对单个分子信号进行分析，从而获得其纳米精度的位置信息。目前，利用宽场显微镜便可实现单分子的二维或者三维追踪。虽然SPT的发展非常迅速，但当前的研究工作主要集中在对发生在细胞膜或细胞内的运输事件的理解上，但是由于目前成像方法上的限制，使得对于分子从细胞膜到细胞内部的整个3D运输路线并没能很好地进行研究。SPT方法虽然客服了大范围追踪的问题，但只能实现对一个单一分子的追踪，因此应用十分有限。

由于目前的SPT方法无法满足获得细胞内多个分子的实时快速高精度追踪。因此，目前细胞内动态功能成像的一个亟待解决的难题就是如何实现全细胞内分子的三维纳米分辨定位追踪。随着荧光超衍射极限分辨显微成像方法的发展，目前已经发展了多种三维纳米分辨定位方法，例如点扩展函数改造法、像散法（柱面镜法）等。但是单纯的这些三维纳米分辨定位方法也同样存在成像深度范围的限制，无法实现对整个细胞范围内的分子进行同时的定位分析。一种景深扩展方法是采用多焦面探测景深堆栈的方法，使用多台探测器对细胞内不同深度进行成像，总的有效景深可扩展到整个细胞范围，但这种方式存在光能利用率低，且结构复杂，成本太高等问题。

综上所述，需要提出一种全细胞内分子的三维纳米分辨定位追踪解决途径，为在分子水平上对动态生命过程相关的生物大分子动态行为进行实时观测和分析提供新的方法与手段，这将对生物医学、生命信息科学等诸多研究领域都有着非常重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三维纳米分辨定位方法，旨在突破现有光学显微系统成像景深的限制，对全细胞范围内的分子进行高精度的三维纳米定位分析。

本发明是这样实现的，一种三维纳米分辨定位方法，包括下述步骤：

对物品中的目标分子进行荧光激发；

采用两个并行的探测通道进行荧光探测，在每个探测通道中，使荧光依次通过一物镜及一弯曲光栅，最终成像于同一个探测器上的不同区域或分别成像于两个不同的探测器上；

并且，两个探测通道的成像面对应于所述物品中的共轭面错位分布，间距为1～3μm；

采用双焦平面定位法对所述探测器所成的图像进行分析，确定目标分子的三维纳米定位信息。

本发明的另一目的在于提供一种三维纳米分辨定位装置，包括：

照明光源；

在所述照明光源的出射光路上设有：

第一物镜、第二物镜，所述第一物镜与第二物镜之间用于放置含有目标分子的物品；

在所述第一物镜的荧光输出方向依次设有第一弯曲光栅及第一探测器；

在所述第二物镜的荧光输出方向依次设有第二弯曲光栅及第二探测器；

所述第一探测器和第二探测器的像平面对应于所述物品中的共轭面错位分布且相距1～3μm。

本发明还提供另一种三维纳米分辨定位装置，包括：

照明光源；

在所述照明光源的出射光路上设有：

第一物镜、第二物镜，所述第一物镜与第二物镜之间用于放置含有目标分子的物品；

在所述第一物镜的荧光输出方向设有第一弯曲光栅；

在所述第二物镜的荧光输出方向设有第二弯曲光栅；

在所述第一弯曲光栅和第二弯曲光栅的输出光路上设有一探测器，用于将第一弯曲光栅和第二弯曲光栅输出的荧光分别成像于同一像面上的不同区域；

与两路荧光对应的像平面对应于所述物品中的共轭面交互交错且相距1～3μm。

本发明将弯曲光栅多焦面并行成像与双物镜双焦面三维纳米定位方法有机结合，搭建了可突破现有光学显微系统景深限制的三维纳米分辨成像系统，在突破现有显微系统景深的同时，实现对细胞厚度范围内运动分子的三维纳米定位和追踪，同时双物镜的探测方式实现了对荧光信号的充分利用，提高了光能利用率。

附图说明

图1是本发明第一实施例提供的三维纳米分辨定位方法的流程图；

图2是弯曲光栅与双焦平面定位法相结合的原理图；

图3是本发明第一实施例提供的三维纳米分辨定位装置的结构图；

图4是本发明第二实施例提供的三维纳米分辨定位方法的流程图；

图5是本发明第二实施例提供的三维纳米分辨定位装置的结构图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述：

实施例一：

图1示出了本发明第一实施例提供的三维纳米分辨定位方法的流程图，为了便于说明，仅示出了与本实施例相关的部分。

该方法主要包括下述步骤：

在步骤S101中，对物品中的目标分子进行荧光激发；

在步骤S102中，采用两个并行的探测通道进行荧光探测，在每个探测通道中，使荧光依次通过一物镜及一弯曲光栅，分别成像于两个不同的探测器上；

并且，两个探测通道的成像面对应于物品中的共轭面错位分布，且间距为1～3μm；

当然，在每个探测通道中，可在物镜和弯曲光栅之间设置荧光滤光片，在弯曲光栅与探测器之间设置管镜，还可以设置反射镜来改变光传输方向等。

进一步的，在步骤S101中，可通过激光器产生激光，然后对激光进行准直扩束后，经由一管镜和第一物镜或第二物镜对物品进行宽场照明。

在步骤S102中，弯曲光栅用于扩大成像景深，其原理如图3所示，见图3中的右半部分，当探测光路中增加了一个一维弯曲光栅时，由于它具有分光以及对不同衍射级光束不同的聚焦能力，可以将物空间中位于不同深度位置（z1、z1、z3）上的三个目标（C、B、A）分别清晰成像到同一轴向位置平面上的不同区域上（分别对应+1、0、-1阶衍射方向），从而可以在同一成像平面上同时获得三个不同深度位置上物体的像（C’、B’、A’），使光学系统的景深增大到原来的三倍，足以覆盖整个细胞厚度。采用二维弯曲光栅时可将景深扩大为原来的9倍，其可探测范围更大。

在步骤S102中，在扩大景深的同时，还将荧光分为两路，通过两个并行探测通道进行探测，且两个探测器的成像面的共轭面错位分布，间距为1～3μm，且优选为1～2μm，如此设计探测器的位置，是为满足采用双焦平面定位法对分子进行精确定位的要求，即：

在步骤S103中，采用双焦平面定位法对探测器所成的图像进行分析，确定目标分子的三维纳米定位信息。

具体的，双焦平面定位方法的原理如下：两个探测通道中的探测器分别对样品内部错位分布（优选相隔1～2μm，以保证定位精度）的两个物平面（假设为第一物平面和第二物平面）进行聚焦，获得两幅图像，分别称为第一平面像和第二平面像，其中，第二平面像中，分子的图像为内接一个高斯分布亮斑的亮环，亮环的直径与分子离焦距离相关，所谓“离焦距离”为物品内目标分子与第一物平面之间的距离，而该第一物平面的位置由预先设定为已知，因此可以由这两幅图像来进行轴向定位。横向定位可由第一平面像高斯拟合得到，此处不进行详细描述。因此，采用双焦平面法即可确定第一物平面和第二物平面之间的分子的三维坐标，双焦面法对于荧光的三维定位精度可以达到10nm以内。

以下对采用弯曲光栅结合双焦平面探测法实现三维纳米定位的原理进行详细说明：

参考图2，以一维弯曲光栅为例，探测通道1中的弯曲光栅使三个不同物平面（物平面A、物平面B、物平面C）成像于探测器上的像平面上三个不同的区域，分别形成图像A’、图像B’、图像C’。探测通道1中聚焦的三个物平面的深度分别为Z1，Z2，Z3。探测通道2中的弯曲光栅使三个不同物平面（物平面a、物平面b、物平面c）成像于探测器上的像平面上三个不同的区域形成图像a’、图像b’、图像c’，探测通道2中聚焦的三个物平面的深度分别为z1，z2，z3。其中，物平面A与物平面a对应，物平面B与物平面b对应，物平面C与物平面c对应，相对应的物平面在样品中的深度相差1～3μm，每一弯曲光栅的三个物方焦平面的间距根据细胞的大小设定，例如，直径为10μm的细胞，可将三个物方焦平面的间距设计为4μm，而两组焦平面（6个）交错排布后，可以将厚度均分为2μm的5层，如图2，借助双焦面法就可以实现对Z1与z1平面之间的分子进行三维纳米定位。同理的，可对z1与Z2平面之间的分子进行三维纳米定位，对Z2与z2平面之间的分子进行三维纳米定位。以此类推，可以对物面Z1与z3之间10μm范围内的分子进行精确的三维纳米定位。由此可以通过一次成像实现对细胞厚度范围内所有运动分子的定位。可以理解，相邻焦平面之间的距离不需严格控制，只要满足1～3μm就可以实现精确定位，当细胞较大时，可以采用二维弯曲光栅将物方分为9个焦平面进行探测。

该方法三维空间定位精度可达到20nm以内，对全细胞范围内三维动态成像的速度将达到50HZ。

本实施例将弯曲光栅多焦面并行成像与双物镜双焦面三维纳米定位方法有机结合，在突破现有显微系统景深的同时，实现对细胞厚度范围内运动分子的三维纳米定位和追踪，同时双物镜的探测方式实现了对荧光信号的充分利用，提高了光能利用率。

作为本实施例优选的实现方式，可选用聚合物量子点作为目标分子的荧光标记。一个合适的荧光标记应当具有以下几个特点：1）荧光标记对目标分子自身运动的影响小，这样对于追踪结果的分析才尽可能与实际情况相符；2）亮度高，以便在尽量短的时间内采集到足够多的光子数用于后续的定位分析，从而提高成像速度；3）高稳定性，由于单个荧光分子闪烁效应或者光漂白，经常导致被追踪分子的运动轨迹部分丢失，从而给结果分析带来不确定性，因此选择不闪烁的、发光稳定性高的标记物对于保证分子追踪信息的完整性来说非常重要。本实施例采用聚合物量子点作为荧光标记物，可同时满足上述要求。聚合物量子点具有非常高的发光亮度，单个聚合物量子点（尺寸10nm左右）的荧光亮度是CdSe/ZnS无机量子点和荧光抗体的30倍。聚合物量子点发光稳定，大于10nm的聚合物量子点没有光闪烁特性。另外，由于涉及活细胞成像，对于荧光标记的选择还需考虑生物兼容性、毒性等问题。本实施例选用的聚合物量子点不含有重金属离子等潜在的毒性成分，因此具有良好的生物相容性。综合以上因素，本项目中选择聚合物量子点作为活细胞分子追踪中目标分子的荧光标记。通过在端位引入功能基团，获得可用于生物功能化的官能团；量子点与细胞内的目标分子通过生物耦联反应来实现共价特异性链接；优化耦联条件以减小表面生物分子修饰带来的对目标分子自身运动的影响；利用生物耦联技术确保在成像过程中观测到来自于各个单目标分子的运动。

本发明利用聚合物量子点的高亮度和高稳定性特点，采用它作为荧光标记物对与动态生命过程相关的分子进行标记，利用弯曲光栅多焦面并行成像突破现有光学系统景深，利用双物镜双焦面探测在提高光能利用率的同时，实现对分子的三维纳米分辨。利用该方法构建的纳米分辨活细胞动态功能分析平台可以实现对细胞内动态生命过程的实时高精度分析。

本发明实施例进一步提供一种可实施上述方法的装置，如图3，该三维纳米分辨定位装置包括：

照明光源101，在照明光源101的出射光路上设有：

第一物镜111、第二物镜121，第一物镜111与第二物镜121之间用于放置含有目标分子的物品S；

在第一物镜111的荧光输出方向依次设有第一弯曲光栅112及第一探测器113；

在第二物镜121的荧光输出方向依次设有第二弯曲光栅122及第二探测器123；

第一探测器113和第二探测器123的像平面对应于物品中的共轭面错位分布且相距1～3μm。

上述装置通过两条并行的探测通道对荧光进行探测。进一步的，在照明光源101和第一物镜111之间还可设置中性滤光片102、准直扩束镜组103及照明管镜104，在照明管镜104的输出方向可设置一能够反射照明光并透射荧光的光学元件105，照明光源101可以采用激光器，具体可以采用488nm激光器。激光器101-中性滤光片102-准直扩束镜组103-照明管镜104-光学元件105-第一物镜111构成了照明光路。激光先通过中性滤光片102控制光的强度，再经准直扩束镜组103扩束准直后，经照明管镜104和第一物镜111实现对样品的宽场照明。

进一步的，第一物镜111-第一弯曲光栅112至第一探测器113构成第一探测通道，第二物镜121-光学元件105-第二弯曲光栅122至第二探测器123构成第二探测通道。在第一物镜111和第一弯曲光栅112之间还可以设置第一荧光滤光片114，在第一弯曲光栅112之后还可以设置第一管镜115。同样的，在第二物镜121和第二弯曲光栅122之间还可以设置第二荧光滤光片124，在第二弯曲光栅122之后还可以设置第二管镜125。

探测物品被激发后产生的荧光由第一物镜111和第二物镜121收集，荧光信号经两个物镜后分别经过第一探测通道和第二探测通道，且两通道基本组成一致，均通过一荧光滤光片、一弯曲光栅、一管镜，最后由一探测器探测。当然，还可以在一个或两个探测通道中增加反射镜，来改变光传输方向等。需要注意的是，第一探测器113和第二探测器123的位置需要满足：两探测器的像平面对应于物品中的共轭面是错位的，且相隔1～3μm（优选为1～2μm），以满足双焦面定位法的成像要求。

该装置用于实施上述方法，在搭建探测光路时，需根据上述探测原理设置各光学构件（特别是探测器）的位置，在光路搭建完成后，由于弯曲光栅形成的三个（采用二维弯曲光栅时为九个）物方焦平面的位置即以确定，在采用双焦平面探测法计算出分子的离焦距离后，便可结合已知的焦平面位置确定分子的三维坐标，进而实现纳米级的三维定位。可以理解，通过该装置实施上述方法需编写可实现探测器曝光控制、图像采集、密集分子定位分析以及图像重构等功能的集成软件，通过探测器获得图像后，通过计算机处理即可获得定位信息。

实施例二：

图4示出了本发明第二实施例提供的三维纳米分辨定位方法的流程图，为了便于说明，仅示出了与本实施例相关的部分。

该方法主要包括下述步骤：

在步骤S201中，对物品中的目标分子进行荧光激发；

在步骤S202中，采用两个并行的探测通道进行荧光探测，在每个探测通道中，使荧光依次通过一物镜及一弯曲光栅，且成像于同一个探测器上的不同区域；

并且，两个探测通道的成像面对应于物品中的共轭面错位分布，间距为1～3μm；

在步骤S203中，采用双焦平面定位法对探测器所成的图像进行分析，确定目标分子的三维纳米定位信息。

本实施例提供的方法与实施例一中所述方法的探测原理相同，而操作方法中的区别仅在于：探测器的数量。实施例一中，每条探测通道对应一台探测器，而本实施例中的两条探测通道共用同一台探测器，将两路荧光成像于探测器的成像面上的不同区域。

另外，该定位方法可以具有其他同上述实施例一相同的特征，如探测通道的组成，荧光标记的选择，弯曲光栅的设置等等，此处不再赘述。

同样的，本实施例进一步提供一种三维纳米分辨定位装置，用于实施本实施例的方法，对应的，该装置与实施例一所述装置的主要区别在于探测器的数量。

如图5，该装置包括：

照明光源201；

在照明光源201的出射光路上设有：

第一物镜211、第二物镜221，第一物镜211与第二物镜221之间用于放置含有目标分子的物品S；

在第一物镜211的荧光输出方向设有第一弯曲光栅212；

在第二物镜221的荧光输出方向设有第二弯曲光栅222；

在第一弯曲光栅212和第二弯曲光栅222的输出光路上设有一探测器231，用于将第一弯曲光栅212和第二弯曲光栅222输出的荧光分别成像于同一像面上的不同区域；

与两路荧光对应的像平面对应于物品中的共轭面交互交错且相距1～3μm。

本实施例采用一台探测器同时探测两路荧光，在搭建光路时，预先设计好每路荧光的成像区域即可实现。该装置与实施例一所述装置的工作原理相同，另外，还可以具有其他组成元件，如中性滤光片、荧光滤光片、准直镜组、管镜等等，可参考实施例一，本实施例不再一一赘述。

另外，为了使两束光同时被一台探测器探测，可以对光路进行微小改变，如图5，在两条探测光路中的第一管镜215和第二管镜225之后，分别采用两片反射镜来反射光束，最终使两束光平行入射至探测器231的不同区域，然后探测器231将数据输出至计算机进行处理。

本发明提供的三维纳米分辨定位方法及装置通过弯曲光栅克服成像景深问题，使景深扩大到10μm或更大，完全满足全细胞分子定位的成像深度的要求，结合双探测通道采用双焦平面探测法对可探测深度内的分子进行精确定位，进而实现全细胞范围分子的三维纳米分辨定位分析，对生物医学、生命信息科学等诸多研究领域都有着非常重大的意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三维纳米分辨定位方法，其特征在于，包括下述步骤：

对物品中的目标分子进行荧光激发；

采用两个并行的探测通道进行荧光探测，在每个探测通道中，使荧光依次通过一物镜及一弯曲光栅，最终成像于同一个探测器上的不同区域或分别成像于两个不同的探测器上；

并且，两个探测通道的成像面对应于所述物品中的共轭面错位分布，间距为1～3μm；

采用双焦平面定位法对所述探测器所成的图像进行分析，确定目标分子的三维纳米定位信息。

2.如权利要求1所述的三维纳米分辨定位方法，其特征在于，选用聚合物量子点作为目标分子的荧光标记。

3.如权利要求1所述的三维纳米分辨定位方法，其特征在于，两个探测通道的成像面对应于所述物品中的共轭面的间距为1～2μm。

4.如权利要求1所述的三维纳米分辨定位方法，其特征在于，所述弯曲光栅为一维或二维弯曲光栅，用于将所述物品中的多个不同深度的物平面同时成像于同一像平面上。

5.一种三维纳米分辨定位装置，其特征在于，包括：

照明光源；

在所述照明光源的出射光路上设有：

第一物镜、第二物镜，所述第一物镜与第二物镜之间用于放置含有目标分子的物品；

在所述第一物镜的荧光输出方向依次设有第一弯曲光栅及第一探测器；

在所述第二物镜的荧光输出方向依次设有第二弯曲光栅及第二探测器；

所述第一探测器和第二探测器的像平面对应于所述物品中的共轭面错位分布且相距1～3μm。

6.如权利要求5所述的三维纳米分辨定位装置，其特征在于，所述第一探测器和第二探测器的像平面对应于所述物品中的共轭面相距1～2μm。

7.如权利要求5所述的三维纳米分辨定位装置，其特征在于，所述第一弯曲光栅和第二弯曲光栅均为一维或二维弯曲光栅，分别将所述物品中的多个不同深度的物平面同时成像于所述第一探测器和第二探测器之成像面上的不同区域。

8.一种三维纳米分辨定位装置，其特征在于，包括：

照明光源；

在所述照明光源的出射光路上设有：

第一物镜、第二物镜，所述第一物镜与第二物镜之间用于放置含有目标分子的物品；

在所述第一物镜的荧光输出方向设有第一弯曲光栅；

在所述第二物镜的荧光输出方向设有第二弯曲光栅；

在所述第一弯曲光栅和第二弯曲光栅的输出光路上设有一探测器，用于将第一弯曲光栅和第二弯曲光栅输出的荧光分别成像于同一像面上的不同区域；

与两路荧光对应的像平面对应于所述物品中的共轭面交互交错且相距1～3μm。

9.如权利要求8所述的三维纳米分辨定位装置，其特征在于，所述第一弯曲光栅和第二弯曲光栅均为一维或二维弯曲光栅，分别将所述物品中的多个不同深度的物平面同时成像于所述探测器上的不同区域。

10.如权利要求8所述的三维纳米分辨定位装置，其特征在于，与两路荧光对应的像平面对应于所述物品中的共轭面相距1～2μm。

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