CN102539400A - 一种高精度荧光各向异性显微成像装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高精度荧光各向异性显微成像装置及方法。在反射式荧光显微镜上，光源发出的光通过起偏器、激发滤波片和分光镜后，被显微物镜聚焦于样品上；样品反射的荧光通过物镜、分光镜和发射滤波片后，又通过一个可调角度检偏器，在CCD相机的像平面上成像；计算机控制可调角度检偏器绕成像光路的光轴步进回转，每旋转一个角度，CCD拍摄一帧偏振荧光图像，共计拍摄M幅图像；最后利用傅里叶变换，从M幅图像中计算出荧光各向异性的图像。本发明的特点是建立一种单通道荧光检偏光路，使荧光各向异性的测量分辨率大幅度提高，并且该显微成像系统具有更高的稳定性和更好的抗干扰能力。

Description

一种高精度荧光各向异性显微成像装置及方法
 技术领域
本发明涉及到荧光显微成像的方法和仪器，特别是借助反射式宽场荧光显微镜，对生物样品进行高精度荧光各向异性显微成像的装置及方法。
背景技术
光学显微成像技术可以在样品正常状态下，进行活体细胞的观察，最大程度地保持样品真实环境。但是，由于Abbe原则的限制，因此无法使用常规的宽场显微成像技术对纳米尺度下分子之间相互作用进行研究。荧光各向异性显微成像技术，是基于荧光偏振的光学现象，可以对纳米尺度的荧光分子间的相互作用进行功能成像，信号选择性强，与其他功能显微成像方法比，系统造价低。
荧光各向异性的测量原理如图1所示，通过测得的荧光水平发射光强度和垂直发射光强，计算出荧光分子的偏振度进而推导出荧光各向异性图像                                                
Figure 737113DEST_PATH_IMAGE001
。而在"Imaging lifetime and anisotropy spectra in the frequency domain," in Journal of Microscopy-Oxford. vol. 234, 2009, pp. 80-88所述，采用传统荧光偏振显微成像方法对不同样品进行观测可知：罗丹明6G和59%甘油溶液的光强光谱分布均匀，但是在荧光偏振的荧光各向异性图上，可以明显看出噪声。而对于观察罗丹明6G和50%甘油溶液和670nm的荧光球的一维空间分布光强光谱，从光强光谱上可以明显分辨出各自对应的谱线位置，但是在各向异性光谱上，噪声极其明显，对荧光球位置的辨识有一定的困难。在"Wide-field time-resolved fluorescence anisotropy imaging (TR-FAIM): Imaging the rotational mobility of a fluorophore," in Review of Scientific Instruments. vol. 74, 2003, pp. 182-192中所述，对于CHO 细胞表达erbB1–eGFP荧光图像和各向异性图像谱，在光强度图像上可以分辨细胞的内部细节，而在荧光偏振的各向异性图像上，基本分辨不出细胞的内部细节，预示着现有的荧光各向异性显微成像方法的分辨率还不足于支持对细胞内进行更精细的观测。
发明内容
针对困扰荧光各向异性显微成像分析的“低分辨率难题”，本发明提出一种新型高精度荧光各向异性显微成像装置及方法，可以大幅度提高荧光各向异性的偏振参数——各向异性值 r的测量分辨率，并且装置具有更高的稳定性和更好的抗干扰能力。
为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
一种高精度荧光各向异性显微成像装置，依次包括激发光源、透镜组、反射式荧光显微镜、相机、计算机，所述反射式荧光显微镜包括激发滤波片、物镜、分光镜、发射滤波片；所述透镜组和激发滤波片之间包括一个起偏器，发射滤波片和相机之间包括一个可调角度检偏器，相机与计算机连接。
所述起偏器与可调角度检偏器均为线偏振片。
所述激发光源、透镜组以及起偏器组成荧光激发光路，可调角度检偏器、相机组成荧光成像光路。在荧光激发光路中不包含任何光学波片；在荧光成像光路中不包含任何光学波片，在发射滤波片和相机像平面之间的光路中，不包含任何光束分数装置。
所述可调角度检偏器与计算机连接。
所述透镜组由两个透镜组成，相机为CCD相机。
本项发明的可调角度检偏器的回转中心与反射荧光光路的光轴中心重合；通过计算机控制线偏振光旋转控制器，每回转一个角度，相机拍下一帧样品反射的荧光显微图像，并将荧光显微图像转换成为显微图像数据，经过图像采集卡送入计算机处理。
一种高精度荧光各向异性显微成像装置的成像方法，包括以下步骤：
1）激发光源发出的照明光通过透镜组转化为高斯光强分布，经线起偏器、激发滤波片、分光镜后，由物镜聚焦于样品上；
2）样品反射的荧光经过物镜、分光镜、发射滤波片及可调角度检偏器后，在相机上成像；
3）可调角度检偏器回转一个角度，相机拍下一帧荧光显微图像，并保存在计算机中；
4）计算可调角度检偏器P2角度变化的光强分布
Figure 893288DEST_PATH_IMAGE002
为：
，
Figure 236861DEST_PATH_IMAGE004
；
式中：m 表示第m次采样，
Figure 597304DEST_PATH_IMAGE005
表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，
表示可调角度检偏器的初始相位角，
表示在采样点m时，可调角度检偏器回转的一个角度，
Figure 609757DEST_PATH_IMAGE008
表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，
M是相机拍下的图像总帧数；
5）对步骤4）的光强分布进行离散傅里叶变换：
Figure 55782DEST_PATH_IMAGE009
，
Figure 376429DEST_PATH_IMAGE010
，
其中：
Figure 515286DEST_PATH_IMAGE011
为信号频率，m表示第m次采样，
Figure 36398DEST_PATH_IMAGE005
表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，表示可调角度检偏器的初始相位角，
Figure 271387DEST_PATH_IMAGE007
表示在采样点m时，可调角度检偏器回转的一个角度，
Figure 768096DEST_PATH_IMAGE008
表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，M是相机拍下的图像总帧数；
6）当可调角度检偏器共回转
Figure 838820DEST_PATH_IMAGE012
°时，根据计算机采集到的显微图像数据，计算荧光偏振度显微图像为： 
式中，当频率k取
Figure 669690DEST_PATH_IMAGE014
时，
Figure 150350DEST_PATH_IMAGE015
在频率k>0上取到最大值；；
7）根据荧光偏振度，计算荧光各向异性显微图像为
Figure 442791DEST_PATH_IMAGE016
。
其中荧光激发源发出的照明光为Lambertian分布。
所述步骤3）的可调角度检偏器回转角度由计算机控制的，计算机控制可调角度检偏器的回转角度大小。
所述步骤4）中所述可调角度检偏器每回转一个角度相机拍下一帧图像，相机拍下一帧图像。
CCD相机拍下的样品荧光显微图像通过单通道、可调角度的线偏振检偏通道和傅里叶变换，由计算机计算出荧光各向异性的显微图像，使测量分辨率从 ±0.01提高到 ±0.001。
本发明提出这种新型荧光各向异性显微成像装置和方法，特点是结构简单，荧光各向异性的测量分辨率高。
附图说明
图1为荧光各向异性的测量原理；
图2 为本发明的高精度荧光各向异性显微成像装置的结构简图；
图3 为发明部分偏振光的旋转检偏原理； 
图4 (a) 为可调角度检偏器的旋转角度
Figure 486839DEST_PATH_IMAGE017
与输出光强I(
Figure 181126DEST_PATH_IMAGE017
)之间的关系；
图4(b) 为可调角度检偏器的旋转角度
Figure 832687DEST_PATH_IMAGE017
与输出光强实测误差△I(
Figure 815687DEST_PATH_IMAGE017
)之间的关系。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述：
本发明提出的高精度荧光各向异性显微成像装置的结构如图2所示，本装置依次包括激发光源1、透镜组2、反射式荧光显微镜3、相机4、计算机5，在实施例中相机4采用的是CCD相机，透镜组2由两个透镜组成。核心部分是反射式荧光显微镜。光源可以是高亮度LED、汞灯或氙灯。激发光源1发出的Lambertian分布的照明光强通过透镜组2转换为高斯光强分布，并接入反射式荧光显微镜3。高斯光强分布的光源经起偏器34、激发滤波片31及分光镜36，被显微物镜32聚焦于样品上；荧光经过物镜32、分光镜36及发射滤波片33以及可调角度检偏器35，在CCD相机的相平面上成像，并将荧光反射在CCD相机上得图像转换成为显微图像数据，经过图像采集卡送入计算机处理。
如图3所示，可调角度检偏器35上安装有步进电机，并且可调角度检偏器35的回转中心与荧光成像光路的光轴中心重合，计算机5控制步进电机转动，控制可调角度检偏器35绕荧光成像光路的光轴中心步进回转，从而带动可调角度检偏器35的以等角间距或不等角间距旋转。本发明的成像系统中，可调角度检偏器35每旋转一个角度，CCD相机拍摄一幅图像，图像序列存储在计算机5内。
此时，测得的光强分布的最大值和最小值分别为和
Figure 759689DEST_PATH_IMAGE019
，则偏振度为：
Figure 301714DEST_PATH_IMAGE021
，                                                         (1)
在上式中，(x,y)代表显微图像的空间坐标。
那么，荧光各向异性的图像为：
，                                                                         (2)
在本发明中：由Stockes矢量和Poincare球对部分偏振光的描述可知，部分偏振光可以等效为完全偏振光I p 和自然光I n 的叠加。偏振光检测原理如图3所示，以偏振光B的传播方向为z轴，垂直z轴的平面为xoy面，建立直角坐标系。由于线偏振光符合马吕斯定律，而在任何角度，自然光都只有一半能量透过检偏器，则通过可调角度检偏器35的光强分布与
Figure 841597DEST_PATH_IMAGE017
的关系为：
Figure 100540DEST_PATH_IMAGE022
，                                        (3)
其中，
Figure 589290DEST_PATH_IMAGE005
表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，
Figure 770043DEST_PATH_IMAGE006
是可调角度检偏器的初始相位角，
Figure 293428DEST_PATH_IMAGE017
为可调角度检偏器的偏振主轴与x轴夹角，
Figure 457693DEST_PATH_IMAGE008
表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强。
在实际情况下，
Figure 637002DEST_PATH_IMAGE017
是通过步进电机带动可调角度检偏器35回转产生的等间距或不等间距离散值，因此式(3)变为：
Figure 177705DEST_PATH_IMAGE023
，
Figure 555597DEST_PATH_IMAGE024
，    (4)
其中，m 表示第m次采样，
Figure 343293DEST_PATH_IMAGE005
表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，
Figure 806635DEST_PATH_IMAGE006
表示可调角度检偏器的初始相位角，表示在采样点m时，可调角度检偏器回转的一个角度，表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，M是相机拍下的图像总帧数。
在本实施例中，可调角度检偏器35等间距回转共计
Figure 92757DEST_PATH_IMAGE012
°。
式(4)的离散傅里叶变换为：
Figure 308975DEST_PATH_IMAGE025
,
Figure 378431DEST_PATH_IMAGE010
                                                                 (5)
其中，
Figure 730915DEST_PATH_IMAGE011
为信号频率，m表示第m次采样，表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，
Figure 783501DEST_PATH_IMAGE006
表示可调角度检偏器的初始相位角，
Figure 469698DEST_PATH_IMAGE007
表示在采样点m时，可调角度检偏器回转的一个角度，
Figure 863639DEST_PATH_IMAGE008
表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，M是相机拍下的图像总帧数。
则当可调角度检偏器回旋共计
Figure 914771DEST_PATH_IMAGE012
°时，根据计算机采集到的显微图像数据，计算荧光偏振度为：
Figure 840002DEST_PATH_IMAGE013
,                                                              (6)
式中，当频率k取k max时，在频率k>0上取到最大值。
将式(6)代入式(2)得出样品荧光各向异性的显微图像为：
Figure 581267DEST_PATH_IMAGE026
                                                         (7)
由于光电探测器的噪声分布是泊松噪声，且与信号强度成正比，式(6)和式(1)计算偏振度的两种方法相比，前者的噪声比后者低，是后者的
Figure 865617DEST_PATH_IMAGE027
倍。如图4（a）所示，如果I p = 0.2018，I n = 0.8072，β每隔等间距回转，共回转
Figure 978247DEST_PATH_IMAGE029
步即
Figure 159830DEST_PATH_IMAGE012
°，测得的光强值为图上的黑方点点序列，根据式(7)，此时的荧光各向异性为r = 0.18181；图
Figure 701855DEST_PATH_IMAGE031
是噪声光强和理想值之间的偏差。如果根据式
Figure 267966DEST_PATH_IMAGE032
和式计算，一般测量方法测得的荧光各向异性为r=0.19691，测量误差为 r=0.0151；如果根据式计算，测量荧光各向异性r=0.18177，误差仅为
Figure 546183DEST_PATH_IMAGE034
r=0.00004；由此可见，本发明提出的可调角度检偏和傅里叶变换方法可以大幅度提高荧光各向异性显微成像的分辨率。

Claims (8)

1.一种高精度荧光各向异性显微成像装置，依次包括激发光源（1）、透镜组（2）、反射式荧光显微镜（3）、相机（4）、计算机（5），所述反射式荧光显微镜（3）包括激发滤波片（31）、物镜（32）、分光镜（36）、发射滤波片（33）；其特征在于所述透镜组（2）和激发滤波片（31）之间包括一个起偏器（34），发射滤波片（33）和相机（4）之间包括一个可调角度检偏器（35），相机（4）与计算机（5）连接。
2.根据权利要求1所述荧光各向异性显微成像装置，其特征是在于所述起偏器（34）与可调角度检偏器（35）均为线偏振片。
3.根据权利要求1所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述激发光源（1）、透镜组（2）以及起偏器（34）组成荧光激发光路，可调角度检偏器（35）、相机（4）组成荧光成像光路。
4.根据权利要求1所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述可调角度检偏器（35）与计算机（5）连接。
5.根据权利要求1所述荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述透镜组（2）由两个透镜组成，相机（4）为CCD相机。
6.一种高精度荧光各向异性显微成像装置的成像方法，其特征在于包括以下步骤：
1）激发光源（1）发出的照明光通过透镜组（2）转化为高斯光强分布，经线起偏器（34）、激发滤波片（31）、分光镜（36）后，由物镜（32）聚焦于样品上；
2）样品反射的荧光经过物镜（32）、分光镜（36）、发射滤波片（33）及可调角度检偏器（35）后，在相机（4）上成像；
3）可调角度检偏器（35）回转一个角度，相机（4）拍下一帧荧光显微图像，并保存在计算机（5）中；
4）计算可调角度检偏器（35）角度变化的光强分布为：
Figure 2011104585218100001DEST_PATH_IMAGE001
，
Figure 572794DEST_PATH_IMAGE002
；
式中：m    表示第m次采样，
Figure 2011104585218100001DEST_PATH_IMAGE003
表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，
Figure 64955DEST_PATH_IMAGE004
表示可调角度检偏器（35）的初始相位角，
Figure 2011104585218100001DEST_PATH_IMAGE005
表示在采样点m时，可调角度检偏器（35）回转的一个角度，
Figure 306581DEST_PATH_IMAGE006
表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，
M是相机（4）拍下的图像总帧数；
5）对步骤4）的光强分布进行离散傅里叶变换：
Figure 644021DEST_PATH_IMAGE007
，
其中：k为信号频率，m表示第m次采样，表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，
Figure 413897DEST_PATH_IMAGE004
表示可调角度检偏器（35）的初始相位角，
Figure 492711DEST_PATH_IMAGE005
表示在采样点
Figure 53006DEST_PATH_IMAGE010
时，可调角度检偏器（35）回转的一个角度，表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，M是相机（4）拍下的图像总帧数；
6）当可调角度检偏器（35）共回转360°时，根据计算机（5）采集到的显微图像数据，计算荧光偏振度显微图像为：
Figure 775291DEST_PATH_IMAGE012
式中，当频率k取
Figure 720113DEST_PATH_IMAGE013
时，
Figure DEST_PATH_IMAGE015A
在频率k>0上取到最大值；
7）根据荧光偏振度，计算荧光各向异性显微图像为
Figure 134914DEST_PATH_IMAGE016
。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤3）的可调角度检偏器（35）回转角度由计算机（5）控制的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述可调角度检偏器（35）每回转一个角度，相机（4）拍下一帧图像。
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