CN103477209B - 用于荧光显微镜中照明相位控制的系统和方法 - Google Patents

用于荧光显微镜中照明相位控制的系统和方法 Download PDF

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Abstract

描述了照明相位控制，其对在结构照明显微镜中使用的构造的照明模式提供精确和快速的相位控制。相干光源用于生成相干光束，其分裂成至少三个相干光束。在一个方面，照明相位控制由至少一对可旋转窗组成以对束中的至少一个施加至少一个相移。物镜用于接收束并且使至少三个束聚焦来形成干涉模式。相位控制可以用于通过改变施加于至少一个束的至少一个相移而改变干涉模式的位置。

Description

用于荧光显微镜中照明相位控制的系统和方法
相关申请的相交引用
该申请要求2011年3月1日提交的临时申请号61/447,707的权益。
技术领域
本公开涉及荧光显微镜，并且特别地涉及用于控制照亮样本的激发光的相位的系统。
背景技术
显微镜仪器中光源的精确相位控制对于牵涉分开的束干涉的各种光学技术以及偏振光学器件是重要的。例如，相位控制在相衬显微镜、微分干涉显微镜和偏振光显微镜中使用。特别地，精确和快速相位控制在构造的照明显微镜中使用，其中干涉束的相位控制利用大约分数波长的分开的束路径的路径长度中的精确变化（其对于可见光是对应于10纳米或更少的路径长度中的变化）而实现。典型地，具有安装镜的压电平移装置可以用于产生精确的相位控制。当镜平行于束路径平移时，束的路径延长或缩短了近似镜行进距离的2倍。尽管镜的位置可在大约1-2毫秒变化，装置是昂贵的并且产生可检测的束平移量，但0°入射角除外。备选方法使用电子可变形窗来调制相位。施加到窗的电压使窗的厚度改变了分数波长，这导致传输通过窗的光的有效路径长度中的变化。与压电装置不同，可变形窗在没有束平移的情况下传输束。然而，可变形窗转换时间相当慢（大约几十至几百毫秒）并且因为窗正经历物理变形而难以实现极其低的光学畸变。由于上文描述的原因，工程师、科学家和显微镜制造商一直在搜寻用于改变用于照亮样本的光的相位的更快的系统和方法。
发明内容
描述了对在结构照明显微镜中使用的构造的照明模式提供精确和快速的相位控制的照明相位控制。相干光源用于产生相干光束，其分裂成至少三个相干光束。在一个方面，照明相位控制由至少一对可旋转窗组成以对束中的至少一个施加至少一个相移。物镜用于接收束并且使至少三个束聚焦来形成干涉模式。相位控制可以用于通过改变施加于至少一个束的至少一个相移而改变干涉模式的位置。
附图说明
图1示出示例三维构造的照明显微镜仪器的示意表示。
图2A-2C示出使用三个相干束的三维构造的照明模式的表示。
图3A-3E示出步进通过五个空间间隔周期的干涉模式的亮线。
图4A-4C示出物镜和干涉模式的三个角位置的俯视图。
图5A-5C示出用于使三个大致上平行的束旋转的干涉模式旋转器的示例表示。
图6示出干涉模式旋转器的示例实现的轴测图。
图7A示出示例照明相位控制的放大图。
图7B示出示例可旋转窗的轴测图。
图8A-8B示出两个可旋转窗的一对透明板。
图9示出由传输通过照明控制的两个光束获得的示例相移的快照。
图10A-10C示出照明相位控制，其重新配置成改变结构照明模式的位置。
图11示出用单对可旋转窗实现的示例照明相位控制。
图12示出用两个分开的可旋转窗实现的示例照明相位控制。
具体实施方式
描述各种照明相位控制（“IPC”）连同三维构造的照明显微镜（“3D-SIM”）的一般描述。与在细胞生物学中使用的常规宽场荧光显微镜相比，3D-SIM在横向和轴向分辨率上实现提高了1/2。与某些竞争超分辨率技术不同，3D-SIM不需要专门的荧光染料或蛋白质。生物学家用3D-SIM实现高的分辨率，但保留方便且熟悉的荧光标记技术。照明相位控制提供通过移位和旋转照明模式来捕获对象的多个图像。更高的分辨率可以通过对方程组求解来恢复通常由衍射而模糊的细微空间细节而实现。
图1示出示例3D-SIM仪器100的示意表示。存在许多不同类型的SIM仪器和对应的光路。仪器100不意在代表在SIM显微镜中使用的仪器的所有不同的众所周知的变化形式内的光路，而是意在图示包括IPC的SIM的一般原理。相干光的高强度、大致上单色束102从光源104（例如激光器）输出，并且传输通过一个透镜或一系列透镜106，其使束102准直。束102可以从具有特定偏振的源104输出。束102然后穿过分裂器108，其将束分裂成三个分开的相干束110-112。例如，分裂器108可以是一维透射的衍射光栅，其将光分裂成三个分散的共面（即，xz平面）的相干束110-112，分别称为第0、第+1和第-1级衍射束。分裂器108可以是多种不同类型的透射光栅中的任一个。例如，分裂器108可以是一维透射光栅，其由透明玻璃板（其中在光栅的一个表面中形成一系列大致上平行的凹槽）组成或分裂器108可以是具有一系列大致上平行的薄缝的不透明板。备选地，分裂器108可以是两个或以上的分束器，其布置成将从透镜106输出的光束分裂成三个或以上分开的相干束。三个束110-112穿过一个透镜或一系列透镜114，其使束110-112重新取向使得束位于xz平面中并且第+1和第-1级衍射束111和112几乎平行于第0级衍射束110。在图1的示例中，束111和112穿过IPC116，其控制束110-112中的一个或多个的相位。束110-112然后穿过照明模式旋转器（“IPR”）124并且从二向色镜126反射出以进入物镜128。在图1的示例中，束110-112在样本130内聚焦使得束彼此干涉以在样本103的体积内产生高对比度的三维构造的照明模式。
图2A-2C示出使用三个相干束产生三维构造的照明模式。如在图2A中示出的，束110-112被传输到物镜128的背面。因为束110-112源于相干光源102，束110-112具有平面波，其中束的分波的相位跨与束方向正交的任何平面（例如平面202）相同。尽管束110-112相干，每个束可具有与其他两个束不同的相位移。物镜128使入射束聚焦到焦点204，其改变两个非轴向束111和112的方向，如在图2A中示出的。因此，由于相长干涉，三个平面波不再与波矢量（其具有不同的方向）平行并且三组平面波相交来形成由暗区（由于相消干涉而引起）环绕的亮线的三维模式。也就是说，如在图2B的示例中示出的，固定干涉模式206位于物镜128的焦平面中。线208代表由较暗区分开的激发光的亮线。激发光的亮线的栅格包括干涉模式206，其促使来自样本130（未示出）中的荧光团的荧光发射光。图2C示出物镜128的侧视图和包括三维干涉模式206的亮线的端视图。开圆210代表由较暗区212分开的激发光的亮线的端视图。每个亮线激发附连到样本220的成分的、与亮线相交的荧光团的荧光。附连到样本220的成分的、位于亮线210之间的暗区212中的荧光团不发荧光。
回到图1，物镜128捕获从荧光团发射的荧光的一部分并且将其引导到二向色镜126。荧光穿过二向色镜126到滤波和成像光学器件132，其对杂散激发光滤波并且使荧光聚焦到检测器134的传感器上。例如，检测器134可以是光电检测器阵列、CCD摄像机或CMOS摄像机。
通过采取由干涉模式激发的荧光图像、使垂直于物镜128的光轴的干涉模式移动一个周期、接着采取另一个图像并且对总共n个图像重复这些步骤来获得3D-SIM图像数据。分裂器112可以在x方向上平移（在图1中示出）来使垂直于物镜的光轴的干涉模式步进一个周期。图3A-3E示出使干涉模式206步进通过以物镜128的光轴302为中心的五个空间间隔周期。在图3A-3E的示例中，干涉模式206的亮线被引导大致上垂直于z轴，如在上文参考图2描述的。在图3A-3E中标记1-5的记号代表以光轴302为中心的五个空间间隔周期。虚线304标识干涉模式206的中心。图3A-3E代表五个分立步骤，其中干涉模式206大致上垂直于光轴302地平移。例如，在图3A中，干涉模式处于由“1”指示的第一周期中，并且在图3B中，干涉模式206步进到由“2”指示的第二周期。在图3A-3E中表示的五个周期中的每个处，捕获由干涉模式206激发的荧光图像。最后的步骤倒退来对于下一个循环重设干涉模式。
干涉模式206然后在xy平面内旋转，并且重复n步图像过程，接着是另一个旋转并且对于总共3n个图像捕获另一n个图像。在获取3n个图像后，干涉模式206在z方向上移动并且获取另一组3n个图像。图4A-4C示出物镜128和干涉模式206的俯视图（即，xy平面）。在图4A中，干涉模式206的亮线初始成-60°角。干涉模式206步进通过五个空间间隔周期，如在上文参考图3描述的，其中在每个步骤处捕获荧光图像。在图4B中，干涉模式206旋转通过60°使得亮线成0°角。干涉模式206再次步进通过五个空间间隔周期，如在上文参考图3描述的，其中在每个步骤处捕获荧光图像。在图4C中，干涉模式206最后旋转通过额外的60°使得亮线成60°角。干涉模式206再次步进通过五个空间间隔周期，如在上文参考图3描述的，其中在每个步骤处捕获荧光图像。干涉模式206在xy平面内3次旋转了60°，其中每次旋转后接着对于总共15个图像捕获5个图像。这些荧光图像用于对线性方程组求解来恢复三维可选的分段图像，其中获取的分辨率是常规宽场显微镜的近似两倍。
IPR124用于使干涉模式在yz平面内绕光轴302旋转。图5A-5C示出用于使束110-112旋转的IPR124的使用以及与束110-112中的每个关联的偏振。在图5A中，IPR124维持束110-112的取向使得束110-112在具有与垂直于x轴而取向的每个束关联的偏振的xz平面内行进。在图5B中，IPR124使束110-112绕中心第0级衍射束轴（即，z轴）旋转通过角度Φ并且使与每个束关联的偏振旋转通过相同的角度。在图5C中，IPR124使束110-112绕中心第0级衍射束轴绕旋转通过角度θ并且使与每个束关联的偏振旋转通过相同的角度。
图6示出示例IPR600的轴测图。该IPR600包括扫描镜602和三个分开的镜群604-606。图6示出扫描镜602的示例，该扫描镜602包括附连到马达612的可旋转轴的平面镜610。马达612可以是检流计，在该情况下，扫描镜602是检流计镜，或马达612可以是将镜610的旋转划分成一系列旋转步骤的步进马达，或给予镜610精确旋转的任何其他种类的马达。备选地，扫描镜可以是压电控制的镜。如在图6中示出的，镜610的反射表面使用马达612而旋转以进而面向镜群604-606中的每个。三个平行线614代表从光栅（例如上文描述的分裂器304）输出的第0级和第±1级衍射束。如在图6中示出的，识别镜610的三个旋转位置1、2和3。位置1、2和3对应于镜610相对于镜群1、2和3的特定旋转位置。镜群中的每个给予束614不同的旋转角并且匹配与束关联的偏振中的旋转角。如下操作IPR600。当镜610旋转到位置1时，束614从镜610反射出、朝向镜群1604，如由方向箭头616表示的。镜群1604使束以及关联的束偏振旋转通过第一旋转角并且使束反射回到镜610，如由方向箭头617表示的。当镜610旋转到位置2时，束614从镜610反射出、朝向镜群2605，如由方向箭头618表示的。镜群2605使束旋转通过第二旋转角并且使束反射回到镜610，如由方向箭头619表示的。当镜610旋转到位置3时，束614从镜610反射出、朝向镜群3606，如由方向箭头620表示的。镜群3606使束旋转通过第三旋转角并且使束反射回到镜610，如由方向箭头621表示的。方向箭头622代表从镜610反射出的旋转束。图6包括镜610的反射表面的视图624，其代表从镜610的表面反射出的旋转束的调准装置。虚线626-628代表当从镜610的反射表面查看时由镜群604-606在三个束上给予的三个不同的旋转。虚线626代表由镜群1604生成的束的取向，虚线627代表由镜群2605生成的束的取向，并且虚线628代表由镜群3606生成的束的取向。IPR600还可包括退出路径镜，其位于束622的路径中以在束从IPR600输出所在的方向上提供额外的控制。
图7A示出位于透镜114与IPR124（如在图1中示出的）之间的IPC700的示例实现的放大图。束110-112分别沿大致上平行的路径从透镜114输出，并且束由透镜114聚焦到焦点701-703。如在图7A的示例中示出的，系统700由四个分开的可旋转窗705-708组成。可旋转窗中的两个705和706与外部束111相交并且位于焦点702的相对侧上。其他两个可旋转窗707和708与另一外部束112相交并且也位于焦点703的相对侧上。图7B示出示例可旋转窗710的轴测图，该示例可旋转窗710包括附连到马达714的可旋转轴的平的透明板712。该透明板712可以由玻璃或另一个适合的透明材料组成，并且马达714可以是将板712的旋转划分成一系列旋转步骤的检流计或步进马达或可以用于使板712快速旋转的任何其他种类的马达。
每对可旋转窗的透明板与束中的一个相交并且在旋转时改变束的路径长度，这进而导致聚焦来形成干涉模式的束的相对相位中的变化。一对可旋转窗的透明板以相同的角幅度但在相反的方向上旋转以便维持束的路径。图8A-8B示出两个可旋转窗的一对透明板801和802。在图8A的示例中，当板801和802平行并且垂直于从点A传输到点B的光的准直束（由虚线射线804表示）而取向。束行进总距离D，其具有行进通过板801和802中的每个的最小距离d。在图8B的示例中，相同的板801和802在相反的方向上以相同的角幅度θ旋转。虚线806代表束行进直到束到达旋转板801的初始路径。束通过旋转板801折射并且被置于大致上平行于初始路径806的路径808上。束然后再次通过旋转板802折射并且被置于与初始路径806对齐的路径810上。也就是说，通过使板以相同的角幅度但在相反方向上旋转，维持束的初始路径。然而，因为板801和802旋转，束被折射。因此，束行进更长的距离d’通过板801和802中的每个（即，d’>d），这导致比在束行进通过平行板801和802时相对更大的相移，如在图8A中示出的。也就是说，当束从点A行进到点B、通过平行取向的板801和802（在图8A中示出的）时，束的相位被延迟的量取决于板801和802的折射率以及距离d。因此，束获得与2d和板的折射率成比例的相移。然而，当板801和802旋转（如在图8B中示出的）时，束行进通过板801和802中的每个的较长距离d’导致甚至更长的相移。例如，图8A-8B还代表在初始时间t0和以后的时间t1处具有波长λ的电磁波的放大段812的快照。在图8A中，在时间t0处，段812的最小值814位于点A处，并且在以后的时间t1处，相同的最小值814到达点B。另一方面，在图8B中，在初始时间t0处，段812的最小值位于点A处，但在以后的时间t1处，相同的最小值814是离点B的λ/4，其对应于φ=π/2的相移。
图9示出基于使可旋转窗705和706的板在相反的方向上以角幅度α旋转并且使可旋转窗707和708的板在相反的方向上以角幅度β旋转而施加于束110-112的示例相移的快照。在图9的示例中，为了图示在束111和112中具有不同相对相移的可旋转窗705-708的创建，与束110-112关联的电磁波的段901-903示出为进入没有相位分离的IPC700，如由在相同的点处与段中的每个相交的虚线904指示的。在以后的时间，当段901和903穿过可旋转窗705-708（如在上文参考图8描述的）时，相对于束110，段901获得φ’的相对相移，并且段903获得得φ’’的相对相移。
上文描述的IPC（例如IPC700）提供大约0.2毫秒的转换时间。当透明板在垂直入射的近似1°的高精度范围内时，可以以大约0.1纳米的精度调整有效路径长度。
可旋转窗的透明板旋转到特定角度以使干涉模式沿空间间隔步进通过几个周期，如在上文参考图3描述的。图10A-10C示出可旋转窗的透明板（其旋转来使干涉模式206在周期1、2和3中定中心）的三组假设角度的示例，如在上文参考图3描述的。在图10A的示例中，窗705和706的板在0°，并且窗707和708的板分别以最大旋转角-β和β旋转，来使干涉模式206在周期1内定中心。在图10B的示例中，窗705和706的板分别以角度α和-α旋转，并且窗707和708的板分别以较小角度-γ和γ旋转，这在束110-112之间创建相对相位差来使干涉模式206在周期2内定中心。在图10C的示例中，窗705和706的板分别旋转到角度Φ和-Φ，并且窗707和708的板旋转到0°，这在束110-112之间创建相对相位差来使干涉模式206在周期3内定中心。
IPC不限于沿两个外部束定位的两对可旋转窗，如在上文参考图7描述的。在备选实施例中，IPC可以用三对可旋转窗来实现，其中每对可旋转窗沿三个束中的一个而定位。例如，IPC700可以修改成包括第三对可旋转窗，其采用可旋转窗705-708定位成与束111和112相交的相同方式而与束110相交。备选地，IPC可以用沿透镜114与IPR124之间的束中的任一个而定位的少至单对可旋转窗来实现，如在图11的示例（其中单对可旋转窗1102和1104与束111相交）中示出的。备选地，IPC可以用与中心束110相交的一对可旋转窗以及与外部束111和112中的任何一个相交的第二对来实现。在备选实施例中，IPC可以用置于束路径中的每一个、两个或全部三个中的仅单个可旋转窗而实现。例如，在图12中，IPC由与束111和112相交的可旋转窗1202和1204组成。注意当仅一个可旋转窗设置在束路径中来控制束的相对相位时，随着透明板旋转到越来越深的入射角，灵敏度增加并且相位控制的精度可降级。另外，存在少量的束平移，如在上文参考图8B描述的。
前面的描述为了说明的目的使用特定命名法来提供本公开的全面理解。然而，为了实践本文描述的系统和方法而不需要特定细节，这对于本领域内技术人员将是明显的。为了图示和描述的目的呈现特定示例的前面的描述。它们不意在为全面的或将本公开局限于描述的确切形式。明显地，鉴于上文的教导，许多修改和变化是可能的。示出并且描述这些示例以便最大程度地说明本公开的原理和实际应用，由此使本领域内其他技术人员能够最大程度地利用本公开和具有如适合于预想的特定使用的各种修改的各种示例。规定本公开的范围由随附权利要求和它们的等同物限定。

Claims (18)

1.一种显微镜仪器，包括：
分裂器，用于接收单色光束并且使所述束分裂成至少三个分开的相干束；
照明相位控制，其包括至少一个可旋转窗，所述至少一个可旋转窗用于向至少一个束施加至少一个相移；
物镜，用于使至少三个束聚焦来形成干涉模式，其中所述照明相位控制用于利用要相对于所述至少一个束的至少一个路径旋转的至少一个可旋转窗来改变所述干涉模式的位置；以及
设置在所述照明相位控制与所述物镜之间的照明模式旋转器，所述照明模式旋转器用于使从所述照明相位控制输出的至少三个束旋转，这导致所述干涉模式旋转通过相同的角度。
2.如权利要求1所述的仪器，其中，所述分裂器进一步包括一维光栅。
3.如权利要求1所述的仪器，其中，所述分裂器进一步包括至少两个分束器。
4.如权利要求1所述的仪器，其中，包括至少一个可旋转窗的所述照明相位控制进一步包括至少一对可旋转窗，每对定位成与所述至少三个束中的一个相交。
5.如权利要求4所述的仪器，其中，该对可旋转窗进一步包括：第一透明板，其附连到第一马达来使所述第一透明板旋转；和第二透明板，其附连到第二马达来使所述第二透明板旋转，其中第一透明板和第二透明板与所述束相交。
6.如权利要求5所述的仪器，其中，第一透明板和第二透明板在相反的方向上相对于相干束路径以几乎相同的角幅度旋转。
7.如权利要求1所述的仪器，其中，包括至少一个可旋转窗的所述照明相位控制进一步包括定位成与所述至少三个束中的一个相交的单个可旋转窗。
8.如权利要求1或7所述的仪器，其中，所述可旋转窗进一步包括透明板，其附连到马达来使所述透明板旋转，其中所述透明板与所述束相交。
9.如权利要求8所述的仪器，其中，所述马达进一步包括检流计马达、压电装置和步进马达中的一个。
10.如权利要求1所述的仪器，进一步包括：
二向色镜，用于使所述至少三个束反射到所述物镜并且传输从要由所述干涉模式照亮的样本发射的荧光；
光电检测器阵列；以及
滤波和成像光学器件，其设置在所述二向色镜与所述光电检测器阵列之间，其中所述滤波和成像光学器件使所述荧光聚焦到所述光电检测器阵列上。
11.一种用于使构造的照明显微镜仪器中的干涉模式移位的方法，所述方法包括：
使用分裂器将单色光束分裂成至少三个分开的相干束；
使用包括至少一个可旋转窗的照明相位控制来向至少一个束施加至少一个相移；
使用物镜来使至少三个束聚焦以形成干涉模式，其中所述至少一个可旋转窗相对于所述至少一个束的至少一个路径而旋转来改变所述干涉模式的位置；以及
使从所述照明相位控制输出的所述至少三个束旋转，这导致使用设置在所述照明相位控制与所述物镜之间的照明模式旋转器使所述干涉模式旋转通过相同的角度。
12.如权利要求11所述方法，其中，所述分裂器进一步包括一维光栅。
13.如权利要求11所述方法，其中，所述分裂器进一步包括至少两个分束器。
14.如权利要求11所述方法，其中，包括至少一个可旋转窗的所述照明相位控制进一步包括至少一对可旋转窗，每对定位成与所述至少三个束中的一个相交。
15.如权利要求14所述的方法，其中，该对可旋转窗进一步包括：第一透明板，其附连到第一马达来使所述第一透明板旋转；和第二透明板，其附连到第二马达来使所述第二透明板旋转，其中第一透明板和第二透明板与所述束相交。
16.如权利要求15所述的方法，其中，第一透明板和第二透明板在相反的方向上相对于相干束路径以几乎相同的角幅度旋转。
17.如权利要求11所述的方法，其中，包括至少一个可旋转窗的所述照明相位控制进一步包括定位成与所述至少三个束中的一个相交的单个可旋转窗。
18.如权利要求11或17所述的方法，其中，所述可旋转窗进一步包括透明板，其附连到马达来使所述透明板旋转，其中所述透明板与所述束相交。
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