DE102022125117A1

DE102022125117A1 - Lichtblattmikroskop

Info

Publication number: DE102022125117A1
Application number: DE102022125117.9A
Authority: DE
Inventors: Richard Hollinger; Jörg Siebenmorgen; Helmut Lippert; Ralf Wolleschensky
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2022-09-29
Filing date: 2022-09-29
Publication date: 2024-04-04
Also published as: US20240111141A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Lichtblattmikroskop zur Beleuchtung einer Probe (1) mit einem Probenvolumen (1.3), die in einer Objektebene (1.1) auf einem Probenträger (1.2) angeordnet ist, umfassend eine Beleuchtungseinrichtung (2) mit einem Beleuchtungsobjektiv (2.1) zum Beleuchten der Probe (1) über einen Beleuchtungsstrahlengang mit einem ersten Lichtblatt (3), welches das Probenvolumen (1.3) in einer ersten Lichtblattebene (3.1) schneidet, wobei die erste Lichtblattebene (3.1) die Objektebene (1.1) in einem schiefen ersten Beleuchtungswinkel (α) schneidet, und eine Detektionseinrichtung (4) zum Abbilden von der Probe (1) kommenden Lichts, mit einem Detektionsobjektiv (4.1), dessen Fokusebene (4.1.1) in dem Probenvolumen (1.3) parallel zur oder in der Objektebene (1.1) liegt, und einem Flächendetektor (4.2) mit einer Detektorebene (4.2.1), wobei der Flächendetektor (4.2) eine erste Schlitzblende (4.2.2) umfasst, welche im Detektionsstrahlengang so vor dem Flächendetektor (4.2) angeordnet ist, dass solche Bereiche des Probenvolumens (1.3), die von dem ersten Lichtblatt (3) beleuchtet werden, jedoch außerhalb der Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektivs (4.1) liegen, ausgeblendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Lichtblattmikroskopie.

Description

Die Erfindung betrifft ein Lichtblattmikroskop zur Beleuchtung einer Probe mit einem Probenvolumen, die in einer Objektebene auf einem Probenträger angeordnet ist. Der Probenträger kann beispielsweise als Multiwellplatte, Petrischale, Objektträger oder als jeder beliebige im Stand der Technik zur Lichtblattmikroskopie übliche Probenträger ausgeführt sein. Das Probenvolumen kann ein Volumen einer Probe sein oder in dem Probenvolumen kann eine Vielzahl von Proben angeordnet sein. Das Lichtblattmikroskop umfasst eine Beleuchtungseinrichtung mit einem Beleuchtungsobjektiv zum Beleuchten der Probe über einen Beleuchtungsstrahlengang mit einem ersten Lichtblatt, welches das Probenvolumen in einer ersten Lichtblattebene schneidet. Die erste Lichtblattebene schneidet die Objektebene in einem schiefen ersten Beleuchtungswinkel. Schief ist jeder Winkel, der größer als 0° und kleiner als 90° ist. Das Lichtblattmikroskop umfasst weiterhin eine Detektionseinrichtung zum Abbilden von der Probe kommenden Lichts, mit einem Detektionsobjektiv, dessen Fokusebene in dem Probenvolumen parallel zur oder in der Objektebene liegt, und einem Flächendetektor mit einer Detektorebene. Unter der Fokusebene wird dabei derjenige entlang der optischen Achse des Detektionsobjektivs ausgedehnte Bereich verstanden, der unter Einbezug der Schärfentiefe des Detektionsobjektivs scharf abgebildet wird. Das von der Probe kommende Licht ist vorzugsweise durch die Beleuchtung mit dem ersten Lichtblatt in der Probe angeregtes Fluoreszenzlicht, dessen Wellenlängen oder dessen Wellenlängenbereiche verschieden von einer ersten Wellenlänge von Anregungslicht, welches für die Erzeugung des ersten Lichtblatts verwendet wird, ist. Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Lichtblattmikroskopie.
Bei der Lichtblattmikroskopie wird mittels eines von einer Beleuchtungseinrichtung erzeugtem Lichtblatts eine dünne Schicht, typischerweise einige Mikrometer einer mit Fluoreszenzmarkern markierten Probe, beleuchtet. Dadurch wird die Probe in der Schicht angeregt und aus der Schicht Fluoreszenzlicht emittiert. Das Fluoreszenzlicht kann durch eine Detektionseinrichtung abgebildet werden, wodurch eine Fluoreszenzabbildung der Schicht auf einem Detektor erfasst wird. Werden mehrere Schichten einer Probe sequentiell aufgenommen, können auch größere Probenvolumen abgebildet werden.
Die Lichtblattmikroskopie wird insbesondere bei der Untersuchung von biologischen Proben eingesetzt. Üblicherweise ist das Lichtblatt, das das Probenvolumen in einer Lichtblattebene schneidet, dabei parallel zu der Objektebene ausgerichtet oder schließt mit der Objektebene einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel ein. Mit dieser auch als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichneten Technik lassen sich in relativ kurzer Zeit räumliche Aufnahmen auch dickerer Proben erstellen. Auf der Basis von optischen Schnitten kombiniert mit einer Relativbewegung in einer Richtung senkrecht zu einer Lichtblattebene ist eine bildliche, räumlich ausgedehnte Darstellung der Probe möglich.
Die SPIM-Technik wird bevorzugt in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, in diesem Zusammenhang bezeichnet man sie auch als LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy). Die Probe wird dabei in lateraler Richtung gleichmäßig ausgeleuchtet. In der Richtung senkrecht zur Lichtblattebene ist dann eine selektive, d.h. mit einer geringen Schärfentiefe verbundene, Abbildung möglich. Gegenüber anderen etablierten Verfahren, wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen-Mikroskopie, weist die LSFM-Technik mehrere Vorzüge auf: Da die Detektion im Weitfeld erfolgen kann, lassen sich größere Probenbereiche erfassen. Zwar ist die Auflösung etwas geringer als bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, jedoch lassen sich mit der LSFM-Technik dickere Proben analysieren, da die Eindringtiefe höher ist. Darüber hinaus ist die Lichtbelastung der Proben bei diesem Verfahren am geringsten, was unter anderem die Gefahr des Ausbleichens der Probe reduziert, da die Probe nur durch ein dünnes Lichtblatt in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung beleuchtet wird.
Die SPIM-Technik ist in der Literatur inzwischen vielfach beschrieben, so beispielweise in der DE 102 57 423 A1 und der darauf aufbauenden WO 2004/052558 A1 oder in dem Übersichtartikel „Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in Developmental Biology" von J. Huisken et al., erschienen in der Zeitschrift Development Bd. 336, S.63 im Jahr 2009.
Eine der Hauptanwendungen der Lichtblattmikroskopie liegt in der Bildgebung mittelgroßer Organismen mit einer Größe von einigen 100 µm bis hin zu wenigen Millimetern. In der Regel werden diese Organismen in ein Agarose-Gel eingebettet, welches sich wiederum in einer Glaskapillare befindet. Diese Glaskapillare wird in eine wassergefüllte Probenkammer eingebracht und die Probe wird dann ein Stück aus der Kapillare herausgedrückt. Die Probe in der Agarose wird anschließend mit einem Lichtblatt beleuchtet und die Fluoreszenz mit einem Detektionsobjektiv, welches senkrecht zum Lichtblatt steht, auf eine Kamera abgebildet.
Diese Vorgehensweise hat jedoch einige Nachteile. Zum einen sind die zu untersuchenden Proben relativ groß, sie stammen aus der Entwicklungsbiologie. Ihre Präparation in speziellen Zylinderröhrchen, die mit Agarose-Gel gefüllt sind, ist aufwendig und stört die normalen Laborabläufe. Sie ist nicht kompatibel zu Standard-Proben-Präparationen und zu Standard-Proben-Halterungen. Der unvermeidbare Brechungsindexunterschied zwischen dem Zylinderröhrchen aus Glas oder Kunststoff und dem Agarose-Gel führt außerdem zu optischen Aberrationen, die das Auflösungsvermögen beeinträchtigen können. Außerdem ist aufgrund der Probenpräparation und der Abmessungen der Probenkammer das Lichtblatt relativ dick und somit die erzielbare axiale Auflösung eingeschränkt.
Um diese Einschränkungen zumindest teilweise umgehen zu können wurde in den letzten Jahren ein SPIM-Aufbau realisiert, bei dem das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv senkrecht zueinander stehen und unter einem Winkel von jeweils 45° von oben auf die Probe gerichtet sind. Zieht man als Bezugsfläche beispielsweise die Ebene eines Tisches heran, auf dem das Probengefäß gelagert ist, oder eine andere, meist horizontale Ebene, wie die eines Deckglases oder des Bodens des Probengefäßes, so betragen ein Beleuchtungswinkel und ein Detektionswinkel jeweils 45°. Ein solcher Aufbau wird beispielsweise in der WO 2012/110488 A1 und in der WO 2012/122027 A1 beschrieben.
Um typische Probenhalter, wie beispielsweise Multiwell-Platten, Petrischalen und Objektträger nutzen zu können, kann der SPIM-Aufbau in einer inversen Konfiguration ausgeführt werden. Dabei wird die 45°-Konfiguration beibehalten, die Probe von unten durch den transparenten Boden der Probenhalterung beleuchtet und die von der Probe emittierte Fluoreszenz detektiert. Diese Technik wurde unter dem Namen SCAPE unter anderem durch V. Voleti et al. in „Real-time volumetric microscopy of invivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0", erschienen in der Zeitschrift Nature Methods Jahrgang 16, S. 20306-20316 im Jahr 2008, beschrieben. In einer Weiterentwicklung wird ein schräges Lichtblatt durch Erzeugen eines elliptischen Gaußprofils in der Pupille des Beleuchtungsobjektivs generiert. Aufgrund der Aberrationen, die durch die Probe und die Detektionsoptiken induziert werden, ist eine aberrationsfreie Abbildung eines Probenvolumens nicht möglich.
Häufig sind Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv als zwei verschiedene Objektive ausgestaltet. Sie können aber auch als ein sogenanntes Doppelobjektiv ausgestaltet sein, wie es beispielsweise in der EP 0 866 993 B1 beschrieben ist. Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv sind dann in einer gemeinsamen Baueinheit zusammengefasst, die jeweiligen Optiken - d.h. die Objektive mit zugehörigen Strahlengängen und darin angeordneten optischen Elementen - teilen sich dann einige Elemente. Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang werden dann durch ein und dieselbe Baueinheit bzw. das Doppelobjektiv geleitet.
Ein Lichtblattmikroskop mit einer Beleuchtungsvorrichtung, die zur Erzeugung eines ersten Lichtblatts sowie mindestens eines zum ersten Lichtblatt parallel angeordneten weiteren Lichtblatts, zur Beleuchtung eines weiteren Streifens der Probe und zur Anregung einer Fluoreszenzstrahlung in diesem weiteren Streifen der Probe, eingerichtet ist, ist aus der DE 10 2015 209 756 A1 bekannt.
In dem wissenschaftlichen Artikel von C. Dunsby „Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy", erschienen in der Zeitschrift Optics Express Bd. 16, S. 1054-1062 im Jahr 2019, ist beschrieben, dass eine eins-zu-eins Relay-Abbildung mit angepasster Vergrößerung sowie anschließender Vergrößerung des schräg stehenden Zwischenbildes verwendet wird, um die Aberrationen, die durch die Probe und die Detektionsoptiken induziert werden, zu korrigieren.
Die Korrektur der Aberrationen sowie das Erreichen einer hohen lateralen Auflösung stellen die größten Schwierigkeiten bei der Abbildung der Tiefeninformation senkrecht zu einer Objektebene mit einem Lichtblattmikroskop dar. Um eine Volumenabbildung in dem Lichtblattmikroskop in inverser Konfiguration mit nur einem Doppelobjektiv aberrationsfrei durchzuführen, ist eine komplexe eins-zu-eins Relay-Abbildung mit angepasster Vergrößerung und einer anschließenden vergrößerten Abbildung des Zwischenbildes notwendig. Neben dem erhöhten Aufwand kann speziell in dem im vorangehend genannten wissenschaftlichen Artikel von C. Dunsby vorgeschlagenen Abbildungssystem nur ein Teil der numerischen Apertur (NA) des Objektives effektiv genutzt werden, was sich nachteilig auf die erreichbare laterale Auflösung des Mikroskops auswirkt.
Zudem werden durch probeninduzierte Lichtstreuung Photonen detektiert, die ihren Ursprung außerhalb des vom Lichtblatt angeregten Bereiches und außerhalb der Bildebene haben. Dies hat eine Verschlechterung der Bildqualität sowie der lateralen Auflösung zur Folge.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Lichtblattmikroskop bereitzustellen, mit dem ein großes Probenvolumen einer Probe oder mehrerer Proben schnell und mit einer sehr hohen Auflösung sowie einem sehr guten Kontrast abgebildet werden kann. Es ist weiterhin die Aufgabe der Erfindung ein entsprechendes Verfahren zur Lichtblattmikroskopie bereitzustellen.
Die Aufgabe wird durch ein Lichtblattmikroskop der eingangs beschriebenen Art gelöst. Der Flächendetektor umfasst eine erste Schlitzblende. Der Flächendetektor kann als CMOS-Chip, PAD-Detektor, SPAD-Detektor oder CCD ausgebildet sein. Die erste Schlitzblende kann ein Rolling Shutter des Flächendetektors sein. Während bei einem Global Shutter die gesamte Bildfläche zeitgleich belichtet wird, werden bei einem Rolling Shutter einzelne Zeilen des Flächendetektors zeitlich versetzt belichtet. Die erste Schlitzblende kann alternativ als mechanisch verschiebbare Schlitzblende ausgebildet sein. Sie kann unmittelbar an dem Flächendetektor angebracht oder ein Teil des Flächendetektors sein. Die erste Schlitzblende ist im Detektionsstrahlengang so vor dem Flächendetektor angeordnet, dass solche Bereiche des Probenvolumens, die von dem ersten Lichtblatt beleuchtet werden, jedoch außerhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs liegen, ausgeblendet werden. Bereiche des Probenvolumens, die von dem ersten Lichtblatt beleuchtet werden und in der Fokusebene liegen, werden durch eine Öffnung der ersten Schlitzblende auf dem Flächendetektor abgebildet. Dadurch gelangt Streulicht und von der Probe kommendes Licht aus Bereichen, die außerhalb der Fokusebene liegen, in geringerem Maße auf den Flächendetektor und ein Kontrast der Abbildung sowie eine laterale Auflösung werden gegenüber einem Lichtblattmikroskop ohne Schlitzblenden verbessert.
Vorteilhaft ist die erste Schlitzblende zur Detektion verschiedener Bereiche der Fokusebene parallel zur Detektorebene verschiebbar im Detektionsstrahlengang angeordnet. Die Detektionseinrichtung umfasst dann ein im Detektionsstrahlengang angeordnetes oder in diesen einbringbares adaptives optisches Detektionselement, das von einer Steuerungseinrichtung angesteuert wird und mit welchem die Fokusebene des Detektionsobjektives im Probenvolumen verschoben werden kann. Das adaptive optische Element kann zusätzlich zur Korrektur von durch den Probenhalter oder die Probe induzierten Aberrationen ausgelegt sein. Dadurch kann eine Aberrationsminimierung auch für aus Sicht des Detektionsobjektivs tiefliegende Ebenen in der Probe eingestellt werden. Darüber hinaus steuert die Steuerungseinrichtung die erste Schlitzblende derart an, dass bei einer Verschiebung der Fokusebene die Position der Öffnung der ersten Schlitzblende zu dem Bereich der Fokusebene, der von dem ersten Lichtblatt geschnitten wird, korrespondiert, sodass diejenigen Bereiche des Probenvolumens, die von dem ersten Lichtblatt beleuchtet werden und außerhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs liegen, ausgeblendet werden.
Darüber hinaus kann die Steuerungseinrichtung mit der Beleuchtungseinrichtung, dem Probenträger oder beiden zur ihrer Ansteuerung verbunden sein, um die Lage der ersten Lichtblattebene relativ zu der Objektebene zu ändern. Durch das Ändern der Lage der Lichtblattebene relativ zur Objektebene und durch sequentielles Abbilden unterschiedlicher Bereiche des Probenvolumens können große Probenvolumen vollständig erfasst werden. Die einzeln aufgenommenen Abbildungen der verschiedenen Lichtblattebenen können nach dem Abbilden zu einer dreidimensionalen Abbildung zusammengefügt werden.
Die Beleuchtungseinrichtung mit dem Beleuchtungsobjektiv ist vorteilhaft zum Beleuchten der Probe mit einem zweiten Lichtblatt ausgelegt, welches das Probenvolumen in einer zweiten Lichtblattebene schneidet. Eine zweite Wellenlänge für die Erzeugung des zweiten Lichtblatts kann mit der ersten Wellenlänge für die Erzeugung des ersten Lichtblatts übereinstimmen. Die zweite Wellenlänge kann aber auch von der ersten Wellenlänge verschieden sein. Das von der Probe kommende Licht ist vorzugsweise durch die Beleuchtung mit dem ersten Lichtblatt und dem zweiten Lichtblatt in der Probe angeregtes Fluoreszenzlicht, dessen Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche die erste Wellenlänge des ersten Lichtblatts und die zweite Wellenlänge des zweiten Lichtblatts nicht umfassen. Die zweite Lichtblattebene schneidet die Objektebene in einem schiefen zweiten Beleuchtungswinkel. Wenn die Probe mit einem zweiten Lichtblatt beleuchtet wird, umfasst der Flächendetektor eine zweite Schlitzblende, welche im Detektionsstrahlengang so vor dem Flächendetektor angeordnet ist, dass solche Bereiche des Probenvolumens, die von dem zweiten Lichtblatt beleuchtet werden, jedoch außerhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs liegen, ausgeblendet werden. Bereiche des Probenvolumens, die von dem zweiten Lichtblatt beleuchtet werden und in der Fokusebene liegen, werden durch eine Öffnung der zweiten Schlitzblende auf den Flächendetektor abgebildet.
Durch die Öffnung der ersten Schlitzblende und die Öffnung der zweiten Schlitzblende werden unterschiedliche Bereiche der Fokusebene oder unterschiedliche Wellenlängenbereiche des von der Probe kommenden Lichts aus einem Bereich der Fokusebene auf dem Flächendetektor abgebildet. Durch das erste Lichtblatt und das zweite Lichtblatt kann insbesondere dann Fluoreszenzlicht unterschiedlicher Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche in der Probe angeregt werden, wenn die erste Wellenlänge sich von der zweiten Wellenlänge unterscheidet.
Die erste Lichtblattebene und die zweite Lichtblattebene können einen von Null verschiedenen Schnittwinkel miteinander einschließen. Die erste Lichtblattebene und die zweite Lichtblattebene können beispielsweise einen Schnittwinkel von 90° miteinander einschließen.
Wenn die Detektionseinrichtung ein im Detektionsstrahlengang angeordnetes oder in diesen einbringbares adaptives optisches Detektionselement umfasst, das von einer Steuerungseinrichtung angesteuert wird und mit welchem die Fokusebene des Detektionsobjektives im Probenvolumen verschoben werden kann und die Probe mit dem zweiten Lichtblatt beleuchtet wird, kann die zweite Schlitzblende zur Detektion verschiedener Bereiche der Fokusebene ebenfalls parallel zur Detektorebene verschiebbar im Detektionsstrahlengang angeordnet sein. Die Steuerungseinrichtung steuert die zweite Schlitzblende in diesem Fall ebenfalls derart an, dass bei einer Verschiebung der Fokusebene die Position der Öffnung der zweiten Schlitzblende zu dem Bereich der Fokusebene, der von dem zweiten Lichtblatt geschnitten wird, korrespondiert, sodass diejenigen Bereiche des Probenvolumens, die von dem zweiten Lichtblatt beleuchtet werden und außerhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs liegen, ausgeblendet werden.
Besonders bevorzugt sind das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv als ein und das selbe Doppelobjektiv ausgeführt. Zum Einkoppeln des Beleuchtungsstrahlengangs und des Detektionsstrahlengangs in das Doppelobjektiv kann ein dichroitischer Spiegel im Detektionsstrahlengang angeordnet sein. Zum Einkoppeln des Beleuchtungsstrahlengangs und des Detektionsstrahlengangs in das Doppelobjektiv kann alternativ eine Glasplatte mit einer reflektierenden Beschichtung, die nur in den Bereichen der Glasplatte aufgebracht ist, auf die das erste Lichtblatt und/oder das zweite Lichtblatt treffen, im Detektionsstrahlengang angeordnet sein.
Vorteilhaft ist das Lichtblattmikroskop als inverses Mikroskop ausgeführt. Die Anordnung als inverses Mikroskop ist insbesondere bei der Mikroskopie von biologischen Proben vorteilhaft, da in diesem Fall herkömmliche Probenträger verwendet werden können.
Die Detektionseinrichtung kann einen im Detektionsstrahlengang angeordneten oder in diesen einbringbaren Bildfelddreher umfassen, mit welchem die Fokusebene des Detektionsobjektives in dem Probenvolumen gedreht werden kann. Der Bildfelddreher kann beispielsweise als Umkehrprisma bzw. Abbe-König-Prisma oder als Spiegelanordnung, wie sie in 6 der EP 2 681 533 B1 dargestellt ist, ausgebildet sein.
Das adaptive optische Detektionselement kann einen Alvarez-Manipulator, einen deformierbaren Spiegel, einen räumlichen Lichtmodulator (SLM), ein Mikro-Elektronisches-Mechanisches-System (MEMS), ein Mikrospiegel-Array-Linsen-System (MALS), eine verstellbare bzw. adaptive Linse und/oder ein adaptives Linsensystem, welches mehrere Linsen aufweist, umfassen. Zur Verschiebung der Fokusebene des Detektionsobjektivs ist vorzugsweise eine Brennweite des adaptiven optischen Elements variabel.
Eine erste Länge der ersten Schlitzblende korrespondiert bevorzugt mit einer in die Fokusebene projizierten ersten Breite des ersten Lichtblatts. Eine zweite Länge der zweiten Schlitzblende korrespondiert bevorzugt mit einer in die Fokusebene projizierten zweiten Breite des zweiten Lichtblatts. Das hat den Vorteil, dass alles von der Probe kommende Licht aus dem Bereich, in dem das erste Lichtblatt die Fokusebene schneidet und aus dem Bereich, in dem das zweite Lichtblatt die Fokusebene schneidet zu dem Flächendetektor gelangt, wohingegen Streulicht und Licht aus anderen Bereichen des Probenvolumens nicht zu dem Flächendetektor gelangt. Somit kann ein möglichst großer Bereich der Fokusebene abgebildet werden, ohne dass sich die laterale Auflösung oder der Kontrast verschlechtert.
Die zweite Schlitzblende kann analog zur ersten Schlitzblende als Rolling Shutter oder als mechanisch verschiebbare Schlitzblende ausgebildet sein.
Die Aufgabe wird weiterhin durch ein Verfahren zur Lichtblattmikroskopie gelöst. Bei dem Verfahren wird eine ein Probenvolumen aufweisende Probe, die in einer Objektebene auf einem Probenträger angeordnet ist, in einem ersten Schritt (a) mit einem ersten Lichtblatt, welches das Probenvolumen in einer ersten Lichtblattebene schneidet, beleuchtet. Durch das Beleuchten der Probe mit dem ersten Lichtblatt wird in der Probe vorzugsweise eine erste Fluoreszenz angeregt. Die erste Lichtblattebene schließt mit der Objektebene einen schiefen ersten Beleuchtungswinkel ein. Daraufhin wird in einem zweiten Schritt (b) eine Position einer Fokusebene eines Detektionsobjektivs im Probenvolumen eingestellt. Die Fokusebene des Detektionsobjektivs liegt dabei parallel zur oder in der Objektebene in dem Probenvolumen. Im Anschluss wird eine vor einem Flächendetektor angeordnete erste Schlitzblende in einem dritten Schritt (c) in eine Position verschoben, bei der die Öffnung der ersten Schlitzblende zu dem Bereich der Fokusebene, der von dem ersten Lichtblatt geschnitten wird, korrespondiert und diejenigen Bereiche des Probenvolumens, die von dem ersten Lichtblatt beleuchtet werden und außerhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs liegen, ausgeblendet. Dass die Öffnung der ersten Schlitzblende zu dem Bereich der Fokusebene, der von dem ersten Lichtblatt geschnitten wird, korrespondiert, bedeutet, dass die Schlitzblende so vor dem Detektor positioniert ist, dass nur derjenige Bereich der Fokusebene abgebildet wird, in dem das Lichtblatt die Fokusebene schneidet. Nach dem Verschieben der ersten Schlitzblende an die korrekte Position wird in einem vierten Schritt (d) Licht, welches von der Probe kommt, über das Detektionsobjektiv auf den Flächendetektor abgebildet. Anschließend werden in einem fünften Schritt (e) das Einstellen der Position der Fokusebene, das Verschieben der ersten Schlitzblende und das Abbilden des von der Probe kommenden Lichts solange wiederholt, bis ein interessierender Bereich des Probenvolumens vollständig abgebildet worden ist. Der interessierende Bereich, auch Region of Interest (ROI) genannt, ist der Bereich des Probenvolumens, der auf dem Flächendetektor abgebildet werden soll. Der interessierende Bereich kann nur einen Teil des Probenvolumens oder das gesamte Probenvolumen umfassen. Grundsätzlich können die Schritte (a) bis (d) auch zeitgleich oder in vertauschter Reihenfolge ausgeführt werden, solange beim Abbilden des von der Probe kommenden Lichts die Position der ersten Schlitzblende mit der Position der Fokusebene korrespondiert.
Beim Beleuchten der Probe kann die Probe zusätzlich mit einem zweiten Lichtblatt beleuchtet werden, welches das Probenvolumen in einer zweiten Lichtblattebene schneidet. Durch das Beleuchten der Probe mit dem zweiten Lichtblatt wird in der Probe vorzugsweise eine zweite Fluoreszenz angeregt. Die zweite Lichtblattebene kann mit der Objektebene einen schiefen zweiten Beleuchtungswinkel einschließen. Wenn die Probe mit dem zweiten Lichtblatt beleuchtet wird, wird zusätzlich zur ersten Schlitzblende eine vor einem Flächendetektor angeordnete zweite Schlitzblende so verschoben, dass die Öffnung der zweiten Schlitzblende zu dem Bereich der Fokusebene, der von dem zweiten Lichtblatt geschnitten wird, korrespondiert und diejenigen Bereiche des Probenvolumens, die von dem zweiten Lichtblatt beleuchtet werden und außerhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs liegen, ausgeblendet werden.
Nach Schritt (d) kann die Lage der ersten Lichtblattebene relativ zu der Objektebene geändert werden. Wenn die Probe mit dem zweiten Lichtblatt beleuchtet wird, kann nach dem Abbilden des von der Probe kommenden Lichts auf dem Flächendetektor die Lage der zweiten Lichtblattebene relativ zu der Objektebene geändert werden. Vorzugsweise wird jedes Mal, wenn die Lage der ersten Lichtblattebene und/oder der zweiten Lichtblattebene geändert wird, der gesamte von dem ersten Lichtblatt und/oder dem zweiten Lichtblatt beleuchtete Bereich des Probenvolumens auf den Flächendetektor abgebildet. Es ist von dem Probenvolumen der Probe abhängig, wie oft die Lage der ersten Lichtblattebene und/oder der zweiten Lichtblattebene relativ zu der Objektebene geändert werden muss, bis das gesamte Probenvolumen auf dem Flächendetektor abgebildet worden ist. Nach Schritt (d) kann außerdem die Fokusebene des Detektionsobjektives in dem Probenvolumen gedreht werden.
Als erste Schlitzblende und/oder als zweite Schlitzblende kann bei dem Verfahren ein Rolling Shutter des Flächendetektors verwendet werden. Bei einem Rolling Shutter werden einzelne Zeilen des Flächendetektors zeitlich versetzt belichtet. Der Rolling Shutter hat eine festgelegte Breite und bewegt sich innerhalb einer Belichtungszeit über den Flächendetektor. Der Flächendetektor ist während der Belichtungszeit nur an den von dem Rolling Shutter nicht abgedeckten Pixelreihen sensitiv.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, die ebenfalls erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Diese Ausführungsbeispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sind nicht als einschränkend auszulegen. Beispielsweise ist eine Beschreibung eines Ausführungsbeispiels mit einer Vielzahl von Elementen oder Komponenten nicht dahingehend auszulegen, dass alle diese Elemente oder Komponenten zur Implementierung notwendig sind. Vielmehr können andere Ausführungsbeispiele auch alternative Elemente und Komponenten, weniger Elemente oder Komponenten oder zusätzliche Elemente oder Komponenten enthalten. Elemente oder Komponenten verschiedener Ausführungsbespiele können miteinander kombiniert werden, sofern nichts anderes angegeben ist. Modifikationen und Abwandlungen, welche für eines der Ausführungsbeispiele beschrieben werden, können auch auf andere Ausführungsbeispiele anwendbar sein. Zur Vermeidung von Wiederholungen werden gleiche oder einander entsprechende Elemente in verschiedenen Figuren mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet und nicht mehrmals erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Seitenansicht einer ersten Ausführung eines Lichtblattmikroskops mit einer Beleuchtungseinrichtung mit einem Beleuchtungsobjektiv zur Beleuchtung einer Probe mit einem ersten Lichtblatt und einer Detektionseinrichtung mit einem Detektionsobjektiv,
2 eine schematische Seitenansicht einer zweiten Ausführung des Lichtblattmikroskops mit der Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung der Probe mit dem ersten Lichtblatt und der Detektionseinrichtung mit einem gemeinsamen Doppelobjektiv für Beleuchtung und Detektion,
3a eine schematische Seitenansicht einer dritten Ausführung des Lichtblattmikroskops mit der Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung der Probe mit dem ersten Lichtblatt und einem zweiten Lichtblatt sowie der Detektionseinrichtung mit dem gemeinsamen Doppelobjektiv für Beleuchtung und Detektion, wobei eine Fokusebene des Doppelobjektivs unterhalb eines Schnittbereichs des ersten Lichtblatts und des zweiten Lichtblatts in dem Probenvolumen positioniert ist,
3b eine schematische Seitenansicht der dritten Ausführung des Lichtblattmikroskops mit einer Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung der Probe mit dem ersten Lichtblatt und dem zweiten Lichtblatt und der Detektionseinrichtung mit einem gemeinsamen Doppelobjektiv, wobei die Fokusebene des Doppelobjektivs in dem Schnittbereich des ersten Lichtblatts und des zweiten Lichtblatts in dem Probenvolumen positioniert ist,
3c eine schematische Seitenansicht der dritten Ausführung des Lichtblattmikroskops mit einer Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung der Probe mit dem ersten Lichtblatt und dem zweiten Lichtblatt und der Detektionseinrichtung mit einem gemeinsamen Doppelobjektiv, wobei die Fokusebene des Doppelobjektivs oberhalb des Schnittbereichs des ersten Lichtblatts und des zweiten Lichtblatts in dem Probenvolumen positioniert ist.

Eine erste Ausführung eines Lichtblattmikroskops zur Beleuchtung einer Probe 1 ist in 1 dargestellt. Die Probe 1 ist in einer Objektebene 1.1 auf einem Probenträger 1.2 angeordnet und weist ein Probenvolumen 1.3 auf.
Das Lichtblattmikroskop umfasst eine Beleuchtungseinrichtung 2 mit einem Beleuchtungsobjektiv 2.1 zum Beleuchten der Probe 1 über einen Beleuchtungsstrahlengang mit einem ersten Lichtblatt 3, welches das Probenvolumen 1.3 in einer ersten Lichtblattebene 3.1 schneidet. Die erste Lichtblattebene 3.1 schneidet die Objektebene 1.1 in einem schiefen ersten Beleuchtungswinkel a. Die Beleuchtungseinrichtung 2 verfügt dazu über eine Lichtquelle 2.2, die Beleuchtungslicht emittiert, das von dem Beleuchtungsobjektiv 2.1 zu dem ersten Lichtblatt 3 geformt wird. Als Lichtquelle 2.2 kann beispielsweise eine Laserlichtquelle verwendet werden. Es können jedoch grundsätzlich auch inkohärente Lichtquellen, beispielsweise übliche Lampen, insbesondere im UV-Bereich, oder LEDs, verwendet werden.
Das Lichtblattmikroskop umfasst weiterhin eine Detektionseinrichtung 4 zum Abbilden des von der Probe 1 kommenden Lichts, mit einem Detektionsobjektiv 4.1 und einem Flächendetektor 4.2. Eine Fokusebene 4.1.1 der Detektionseinrichtung 4 liegt in dem Probenvolumen 1.3 parallel zur Objektebene 1.1. Der Flächendetektor 4.2 weist eine Detektorebene 4.2.1, die in 1 schematisch als Matrix mehrerer Pixel des Flächendetektors 4.2 dargestellt ist, sowie eine erste Schlitzblende 4.2.2, auf.
Zwischen dem Detektionsobjektiv 4.1 und dem Flächendetektor 4.2 ist vorteilhaft, wie bei der ersten Ausführung des Lichtblattmikroskops, ein Umlenkspiegel 4.3 angeordnet. Durch das Umlenken des von der Probe 1 kommenden Lichts auf den Flächendetektor 4.2 kann der Detektionsstrahlengang kompakter gestaltet werden.
Zum Abbilden des von der Probe 1 kommenden Lichts kann außerdem eine Abbildungsoptik 4.4 zwischen dem Detektionsobjektiv 4.1 und dem Flächendetektor 4.2 angeordnet sein. In 1 sind die Strahlengänge des von der Probe 1 kommenden Lichts nur schematisch dargestellt, sodass das Licht nur an einer optischen Achse der Abbildungsoptik 4.4 gebrochen wird.
Der Flächendetektor 4.2 kann beispielsweise als CMOS-Chip, PAD-Detektor, SPAD-Detektor oder CCD ausgebildet sein.
Durch die erste Schlitzblende 4.2.2 können Bereiche des Probenvolumens 1.3, die nicht mit der Öffnung der ersten Schlitzblende 4.2.2 korrespondieren, ausgeblendet werden. Dabei ist die erste Schlitzblende 4.2.2 so angeordnet, dass solche Bereiche des Probenvolumens 1.3, die von dem ersten Lichtblatt 3 beleuchtet werden, jedoch außerhalb der Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 liegen, ausgeblendet werden und Licht aus den Bereichen des Probenvolumens 1.3, die aus der Sicht des Detektionsobjektives 4.1 vor und hinter den Bereichen, die von dem ersten Lichtblatt 3 beleuchtet werden und in der Fokusebene 4.1.1 liegen, auf den Flächendetektor 4.2 gelangt. Dadurch gelangt weniger Streulicht und weniger von der Probe 1 kommendes Licht aus den Bereichen, die außerhalb der Fokusebene 4.1.1 liegen, auf den Flächendetektor 4.2. Somit werden ein Kontrast der Abbildung sowie eine laterale Auflösung gegenüber einem Lichtblattmikroskop ohne erste Schlitzblende 4.2.2 verbessert.
In 1 ist ein Strahlengang des von der Probe 1 kommenden Lichts gezeigt, der aus dem Bereich, in dem das erste Lichtblatt 3 die Fokusebene 4.1.1 schneidet, kommt. Das Licht aus dem Bereich, in dem das erste Lichtblatt 3 die Fokusebene 4.1.1 schneidet, gelangt durch eine Öffnung der ersten Schlitzblende 4.2.2 zu dem Flächendetektor 4.2 und wird auf diesen abgebildet.
In 1 ist darüber hinaus ein weiterer Strahlengang des von der Probe 1 kommenden Lichts gezeigt, der aus dem Bereich, in dem das erste Lichtblatt 3 das Probenvolumen 1.3 schneidet, jedoch außerhalb der Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 liegt, kommt. Der weitere Strahlengang ist gestrichelt dargestellt. Das Licht des weiteren Strahlengangs wird durch die erste Schlitzblende 4.2.2 ausgeblendet. Die durch die erste Schlitzblende 4.2.2 auf dem Flächendetektor 4.2 ausgeblendeten Bereiche sind in 1 sowie in 2 schraffiert dargestellt.
Die erste Ausführung des Lichtblattmikroskops beschränkt sich auf eine statische Anordnung. Da die erste Schlitzblende 4.2.2 nicht im Detektionsstrahlengang verschiebbar ist, kann nur eine Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektives 4.1 scharf auf dem Flächendetektor 4.2 abgebildet werden. Um dennoch die gesamte Fokusebene 4.1.1 abzubilden, kann das erste Lichtblatt 3 entlang der Fokusebene 4.1.1 verschoben werden.
Da das Detektionsobjektiv 4.1 eine endliche Schärfentiefe aufweist, entspricht der Fokusebene 4.1.1 grundsätzlich ein entlang der optischen Achse des Detektionsobjektivs 4.1 ausgedehnter, scharf abgebildeter Bereich. Da bei der Abbildung des von der Probe 1 kommenden Lichts möglichst die gesamte numerische Apertur des Detektionsobjektivs 4.1 genutzt werden soll, um eine bestmögliche laterale Auflösung zu erreichen, ist die Schärfentiefe des Detektionsobjektivs 4.1 in der Regel klein. Daher sind bei Proben 1 mit einem verhältnismäßig großen Probenvolumen 1.3 viele Abbildungen in unterschiedlichen Fokusebenen 4.1.1 notwendig, um den gesamten Bereich, in dem das erste Lichtblatt 3 das Probenvolumen 1.3 schneidet, abzubilden.
2 zeigt eine zweite Ausführung des Lichtblattmikroskops. Auch die zweite Ausführung des Lichtblattmikroskops umfasst eine Beleuchtungseinrichtung 2 mit einem Beleuchtungsobjektiv 2.1 und eine Detektionseinrichtung 4 mit einem Detektionsobjektiv 4.1. Bei der zweiten Ausführung des Lichtblattmikroskops sind das Beleuchtungsobjektiv 2.1 und das Detektionsobjektiv 4.1 ein und das selbe Doppelobjektiv 6, d.h. Beleuchtung und Detektion erfolgen durch ein einziges Doppelobjektiv 6 und nehmen unterschiedliche Lichtwege im Doppelobjektiv 6. Der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang können sich dabei einige Elemente des Doppelobjektivs 6 teilen.
Die Probe 1 wird über das Doppelobjektiv 6 mit dem ersten Lichtblatt 3 beleuchtet. Die erste Lichtblattebene 3.1 schließt auch hier einen ersten Beleuchtungswinkel α mit der Objektebene 1.1 ein. Gleichzeitig wird das von der Probe 1 kommende Licht durch das Doppelobjektiv 6 bzw. das Detektionsobjektiv 4.1 auf dem Flächendetektor 4.2 abgebildet.
Im Unterschied zu der Ausgestaltung nach 1 ist die erste Schlitzblende 4.2.2 zur Detektion verschiedener Bereiche der Fokusebene 4.1.1 parallel zur Detektorebene 4.2.1 verschiebbar im Detektionsstrahlengang angeordnet und umfasst die Detektionseinrichtung 4 ein im Detektionsstrahlengang angeordnetes oder in diesen einbringbares adaptives optisches Detektionselement 4.5. Das adaptive optische Detektionselement 4.5 ist mit einer Steuerungseinrichtung 4.7 verbunden und dazu ausgelegt, die Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektives 4.1 in dem Probenvolumen 1.3 senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs 4.1 bzw. zur Objektebene 1.1 zu verschieben bzw. einzustellen. Dazu wird das adaptive optische Detektionselement 4.5 von der Steuerungseinrichtung 4.7 angesteuert. Das adaptive optische Element 4.5 umfasst vorteilhaft einen Alvarez-Manipulator, einen deformierbaren Spiegel, einen räumlichen Lichtmodulator, ein Mikro-Elektronisches-Mechanisches-System (MEMS), ein Mikrospiegel-Array-Linsen-System (MALS), eine verstellbare bzw. adaptive Linse und/oder ein adaptives Linsensystem, welches mehrere solcher Linsen aufweist, wie kommerziell verfügbar unter anderem bei den Anbietern Optotune AG, Phaseform GmbH oder DYNAMIC OPTICS srl. Das Verschieben der Fokusebene 4.1.1 kann beispielsweise durch eine Innenfokussierung durch das adaptive optische Element 4.5 erfolgen.
Die erste Schlitzblende 4.2.2 kann als mechanisch verschiebbare Schlitzblende oder als sogenannter Rolling Shutter ausgebildet sein. Die erste Schlitzblende 4.2.2 kann unmittelbar an dem Flächendetektor 4.2 angebracht oder ein Teil des Flächendetektors 4.2 sein. Während bei einem Global Shutter die gesamte Bildfläche zeitgleich belichtet wird, werden bei einem Rolling Shutter einzelne Zeilen des Flächendetektors 4.2 zeitlich versetzt belichtet.
Auch in 2 sind zwei Strahlengänge des von der Probe 1 kommenden Lichts dargestellt, von denen ein aus dem Schnittbereich von erstem Lichtblatt 3 und Fokusebene 4.1.1 kommender Strahlengang durch die Öffnung der ersten Schlitzblende 4.2.2 auf dem Flächendetektor 4.2 abgebildet wird und ein weiterer, gestrichelt dargestellter Strahlengang, durch die erste Schlitzblende 4.2.2 ausgeblendet wird.
Die Steuerungseinrichtung 4.7 ist zudem mit der ersten Schlitzblende 4.2.2 verbunden und dazu ausgelegt, die erste Schlitzblende 4.2.2 derart ansteuern, dass bei einer Verschiebung der Fokusebene 4.1.1 die Position der ersten Schlitzblende 4.2.2 mit dem Bereich der Fokusebene 4.1.1, der von dem ersten Lichtblatt 3 geschnitten wird, korrespondiert. Durch die Ansteuerung wird die Fokusebene 4.1.1 entlang des ersten Lichtblatt 3 senkrecht zur Objektebene 1.1 verschoben. Durch die Ansteuerung der ersten Schlitzblende 4.2.2 folgt die erste Schlitzblende 4.2.2 der Fokusebene 4.1.1 und wird analog zu der Position der Fokusebene 4.1.1 und des Lichtblatts 3 positioniert.
Die Steuerungseinrichtung 4.7 ist darüber hinaus mit der Beleuchtungseinrichtung 2 bzw. der Lichtquelle 2.1 verbunden und dazu ausgelegt, die die Lichtquelle 2.1 anzusteuern, um die Lage der ersten Lichtblattebene 3.1 relativ zu der Objektebene 1.1 zu ändern.
Zum Einkoppeln des Beleuchtungsstrahlengangs in den Detektionsstrahlengang ist bei der zweiten Ausführung des Lichtblattmikroskops ein dichroitischer Spiegel 4.8 im Detektionsstrahlengang angeordnet. Durch den dichroitischen Spiegel 4.8 wird das von der Lichtquelle 2.2 kommende Licht zu dem Beleuchtungsobjektiv 2.1 umgelenkt. Gleichzeitig wird das von der Probe 1 kommende Licht, bei dem es sich beispielsweise um emittiertes Fluoreszenzlicht handelt und das daher eine andere Wellenlänge als eine erste Wellenlänge des ersten Lichtblatts 3 aufweist, durch den dichroitischen Spiegel 4.8 transmittiert. Alternativ ist auch die Verwendung einer Glasplatte 4.9 statt des dichroitischen Spiegels 4.8 möglich.
Außerdem ist hier im Detektionsstrahlengang ein optionaler Bildfelddreher 4.6 angeordnet, mit welchem die Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektives 4.1 in dem Probenvolumen 1.3 gedreht werden kann. Der Bildfelddreher kann beispielsweise als Umkehrprisma bzw. Abbe-König-Prisma oder als Spiegelanordnung, wie sie in 6 der EP 2 681 533 B1 dargestellt ist, ausgebildet sein. Wenn der Bildfelddreher als Spiegelanordnung ausgebildet ist, dann umfasst die Spiegelanordnung einen verstellbaren Abtastspiegel sowie mehrere Spiegelgruppen. Der Abtastspiegel kann so gedreht werden, dass er einer der Spiegelgruppen zugewandt ist und einfallende Lichtstrahlen in Richtung einer der Spiegelgruppen reflektiert. Jede der Spiegelgruppen dreht einfallende Lichtstrahlen um einen anderen festgelegten Winkel und reflektiert die Lichtstrahlen zurück zu dem Abtastspiegel, von wo aus die Lichtstrahlen erneut in eine Austrittsrichtung reflektiert werden können. Somit kann das Bildfeld gedreht werden, indem beispielsweise der Weg der einfallenden Lichtstrahlen invertiert wird.
Eine dritte Ausführung des Lichtblattmikroskops ist in den 3a-3c dargestellt. Bei der dritten Ausführung des Lichtblattmikroskops ist die Beleuchtungseinrichtung 2 mit dem Beleuchtungsobjektiv 2.1 zum Beleuchten der Probe 1 mit einem zweiten Lichtblatt 5 ausgelegt. Das zweite Lichtblatt 5 schneidet das Probenvolumen 1.3 in einer zweiten Lichtblattebene 5.1. Die zweite Lichtblattebene 5.1 schneidet die Objektebene 1.1 in einem schiefen zweiten Beleuchtungswinkel β. Das erste Lichtblatt 3 und das zweite Lichtblatt 5 schneiden sich im Probenvolumen 1.3 unter einem Schnittwinkel γ, wodurch ein Schnittbereich des ersten Lichtblatts 3 und des zweiten Lichtblatts 5 entsteht.
Der Flächendetektor 4.2 weist bei der dritten Ausführung eine zweite Schlitzblende 4.2.3 auf, welche im Detektionsstrahlengang so vor dem Flächendetektor 4.2 angeordnet ist, dass solche Bereiche des Probenvolumens 1.3, die von dem zweiten Lichtblatt 5 beleuchtet werden, jedoch außerhalb der Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 liegen, ausgeblendet werden. Die zweite Schlitzblende 4.2.3 kann analog zu der ersten Schlitzblende 4.2.2 ausgestaltet sein. Die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 sind parallel zur Detektorebene 4.2.1 verschiebbar im Detektionsstrahlengang angeordnet. Die von der ersten Schlitzblende 4.2.2 und der zweiten Schlitzblende 4.2.3 auf dem Flächendetektor 4.2 ausgeblendeten Bereiche sind in den 3a-3c schraffiert dargestellt.
Zum Einkoppeln des Beleuchtungsstrahlengangs in den Detektionsstrahlengang ist bei der dritten Ausführung des Lichtblattmikroskops eine Glasplatte 4.9 im Detektionsstrahlengang angeordnet. Durch die Glasplatte 4.9 wird das von der Lichtquelle 2.2 kommende Licht zu dem Beleuchtungsobjektiv 2.1 umgelenkt. Gleichzeitig wird das von der Probe 1 kommende Licht, das eine andere Wellenlänge als das erste Lichtblatt 3 aufweist, durch die Glasplatte 4.9 transmittiert. Die Glasplatte 4.9 weist in den Bereichen, auf die das erste Lichtblatt 3 und/oder das zweite Lichtblatt 5 treffen, eine im Bereich der ersten Wellenlänge des ersten Lichtblatts 3 bzw. im Bereich einer zweiten Wellenlänge des zweiten Lichtblatts 5 reflektierende Beschichtung auf. Alternativ ist auch die Verwendung eines dichroitischen Spiegels 4.8 statt der Glasplatte 4.9 möglich, wie im zweiten Ausführungsbeispiel.
Des Weiteren ist im Detektionsstrahlengang ein Filter 4.10 angeordnet, der dazu ausgelegt ist, Anregungslicht aus dem von der Probe 1 kommenden Licht zu filtern, sodass kein Anregungslicht zu dem Flächendetektor 4.2 gelangt.
In 3a liegt die Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 unterhalb des Schnittbereichs des ersten Lichtblatts 3 und des zweiten Lichtblatts 5 in dem Probenvolumen 1.3. Die Bereiche, in denen das erste Lichtblatt 3 und das zweite Lichtblatt 5 die Fokusebene 4.1.1 schneiden, werden auf dem Flächendetektor 4.2 abgebildet. Die Bereiche links und rechts der Bereiche, in denen das erste Lichtblatt 3 und das zweite Lichtblatt 5 die Fokusebene 4.1.1 schneiden, werden durch die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 ausgeblendet.
Die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 befinden sich in 3a jeweils an den äußeren Rändern des Flächendetektors 4.2. Sie werden vor, während oder nach dem Einstellen der Fokusebene 4.1.1 verschoben. Wenn die Fokusebene 4.1.1 nach oben in Richtung des Schnittbereichs des ersten Lichtblatts 3 und des zweiten Lichtblatts 5 verschoben wird, wie in der 3b, werden die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 zunächst in Richtung der Mitte des Flächendetektors 4.2 verschoben.
In 3b liegt die Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 im des Schnittbereichs des ersten Lichtblatts 3 und des zweiten Lichtblatts 5. Die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 befinden sich in der Mitte des Flächendetektors 4.2. Wenn die Fokusebene 4.1.1 weiter nach oben verschoben wird, wie in der 3c, werden die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 in Richtung der Ränder des Flächendetektors 4.2 verschoben. Wenn die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 in unterschiedlichen Abständen zu dem Flächendetektor 4.2 angeordnet sind, können sie aneinander vorbei verschoben werden. Wenn die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 in demselben Abstand zu dem Flächendetektor 4.2 angeordnet sind, können die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 jeweils nur bis zu der Mitte des Flächendetektor 4.2 verschoben werden. Durch die Öffnung der ersten Schlitzblende 4.2.2 wird dann, wenn die Fokusebene 4.1.1 oberhalb des Schnittbereichs des ersten Lichtblatts 3 und des zweiten Lichtblatts 5 positioniert ist, der Bereich, in dem das zweite Lichtblatt 5 die Fokusebene 4.1.1 schneidet, abgebildet. Durch die Öffnung der zweiten Schlitzblende 4.2.3 wird dann der Bereich, in dem das erste Lichtblatt 3 die Fokusebene 4.1.1 schneidet, abgebildet. Die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 werden im Anschluss wieder in die in 3a gezeigten Positionen verschoben. Während des Verschiebens der ersten Schlitzblende 4.2.2 und der zweiten Schlitzblende 4.2.3 wird gleichzeitig die Fokusebene 4.1.1 verschoben und jeweils die Bereiche, in denen das erste Lichtblatt 3 die Fokusebene 4.1.1 schneidet, abgebildet.
In 3c liegt die Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 oberhalb des Schnittbereichs des ersten Lichtblatts 3 und des zweiten Lichtblatts 5. Die erste Schlitzblende 4.2.2 und die zweite Schlitzblende 4.2.3 sind wieder in die in 3a gezeigten Positionen verschoben. Es kann der gesamte Bereich, in dem das erste Lichtblatt 3 und das zweite Lichtblatt 5 das Probenvolumen 1.3 schneiden, oder nur ein Teil des Bereichs, in dem das erste Lichtblatt 3 und das zweite Lichtblatt 5 das Probenvolumen 1.3 schneiden, auf dem Flächendetektor 4.2 abgebildet werden.
Mit dem Lichtblattmikroskop gemäß der zweiten und der dritten Ausführung kann das Verfahren zur Lichtblattmikroskopie durchgeführt werden. Die zweite und die dritte Ausführung des Lichtblattmikroskops können dynamisch betrieben werden. Das bedeutet, dass die Fokusebene 4.1.1 hier eingestellt und die erste Schlitzblende 4.2.2 in eine mit der Fokusebene 4.1.1 korrespondierende Position verschoben werden kann. Dabei wird die Probe 1 zunächst mit dem ersten Lichtblatt 3, welches das Probenvolumen 1.3 in der ersten Lichtblattebene 3.1 schneidet, beleuchtet. Daraufhin wird die Position der Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 im Probenvolumen 1.3 eingestellt. Die Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 liegt dabei parallel zur oder in der Objektebene 1.1 in dem Probenvolumen 1.3. Außerdem wird die vor dem Flächendetektor 4.2 angeordnete erste Schlitzblende 4.2.2 in eine Position, bei der die Öffnung der ersten Schlitzblende 4.2.2 zu dem Bereich der Fokusebene 4.1.1, der von dem ersten Lichtblatt 3 geschnitten wird, korrespondiert, verschoben. Dadurch werden die Bereiche des Probenvolumens 1.3, die von dem ersten Lichtblatt 3 beleuchtet werden und außerhalb der Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 liegen, ausgeblendet. Danach wird das Licht, welches von der Probe 1 kommt, über das Detektionsobjektiv 4.1 auf den Flächendetektor 4.2 abgebildet. Nach der Aufnahme eines Bildes mittels der Abbildung werden das Einstellen der Position der Fokusebene 4.1.1, das dazu synchrone Verschieben der ersten Schlitzblende 4.2.2 und das Abbilden des von der Probe 1 kommenden Lichts solange wiederholt, bis ein interessierender Bereich des Probenvolumens 1.3 abgebildet worden ist. Der interessierende Bereich kann nur einen Teil des Probenvolumens 1.3 oder das gesamte Probenvolumen 1.3 umfassen.
Die Probe 1 kann mit der zweiten und der dritten Ausführung des Lichtblattmikroskops zusätzlich mit dem zweiten Lichtblatt 5 beleuchtet werden, welches das Probenvolumen 1.3 in der zweiten Lichtblattebene 5.1 schneidet. In diesem Fall wird die zusätzlich vor einem Flächendetektor 4.2 angeordnete zweite Schlitzblende 4.2.3 so verschoben, dass die Öffnung der zweiten Schlitzblende 4.2.3 zu dem Bereich der Fokusebene 4.1.1, der von dem zweiten Lichtblatt 5 geschnitten wird, korrespondiert und diejenigen Bereiche des Probenvolumens 1.3, die von dem zweiten Lichtblatt 5 beleuchtet werden und außerhalb der Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektivs 4.1 liegen, ausgeblendet werden.
Nach dem Abbilden kann die Lage der ersten Lichtblattebene 3.1 und/oder der zweiten Lichtblattebene 5.1 relativ zu der Objektebene 1.1 geändert werden. Durch das Ändern der Lage der ersten Lichtblattebene 3.1 und/oder der zweiten Lichtblattebene 5.1 können größere Probenvolumen 1.3 auf dem Flächendetektor 4.2 abgebildet werden. Vorzugsweise wird jedes Mal, wenn die Lage der ersten Lichtblattebene 3.1 und/oder der zweiten Lichtblattebene 5.1 geändert wird, der gesamte von dem ersten Lichtblatt 3 und/oder dem zweiten Lichtblatt 5 beleuchtete Bereich des Probenvolumens 1.3 auf dem Flächendetektor 4.2 abgebildet. Es ist von dem Probenvolumen 1.3 der Probe 1 abhängig, wie oft die Lage der ersten Lichtblattebene 3.1 und/oder der zweiten Lichtblattebene 5.1 relativ zu der Objektebene 1.1 geändert werden muss, damit das gesamte Probenvolumen 1.3 auf dem Flächendetektor 4.2 abgebildet worden ist.
Nach dem Abbilden des von der Probe 1 kommenden Lichts kann zudem die Fokusebene 4.1.1 des Detektionsobjektives 4.1 in dem Probenvolumen 1.3 durch den Bildfelddreher 4.6 gedreht werden.
Bezugszeichenliste

1: Probe
1.1: Objektebene
1.2: Probenträger
1.3: Probenvolumen
2: Beleuchtungseinrichtung
2.1: Beleuchtungsobjektiv
2.2: Lichtquelle
3: erstes Lichtblatt
3.1: erste Lichtblattebene
4: Detektionseinrichtung
4.1: Detektionsobjektiv
4.1.1: Fokusebene
4.2: Flächendetektor
4.2.1: Detektorebene
4.2.2: erste Schlitzblende
4.2.3: zweite Schlitzblende
4.3: Umlenkspiegel
4.4: Abbildungsoptik
4.5: adaptives optisches Detektionselement
4.6: Bildfelddreher
4.7: Steuerungseinrichtung
4.8: dichroitischer Spiegel
4.9: Glasplatte
4.10: Filter
5: zweites Lichtblatt
5.1: zweite Lichtblattebene
6: Doppelobjektiv
α: erster Beleuchtungswinkel
β: zweiter Beleuchtungswinkel
γ: Schnittwinkel

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 10257423 A1 [0005]
WO 2004052558 A1 [0005]
WO 2012110488 A1 [0008]
WO 2012122027 A1 [0008]
EP 0866993 B1 [0010]
DE 102015209756 A1 [0011]
EP 2681533 B1 [0025, 0054]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in Developmental Biology" von J. Huisken et al., erschienen in der Zeitschrift Development Bd. 336, S.63 [0005]
V. Voleti et al. in „Real-time volumetric microscopy of invivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0“, erschienen in der Zeitschrift Nature Methods Jahrgang 16, S. 20306-20316 [0009]
C. Dunsby „Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy“, erschienen in der Zeitschrift Optics Express Bd. 16, S. 1054-1062 [0012]

Claims

Lichtblattmikroskop zur Beleuchtung einer Probe (1) mit einem Probenvolumen (1.3), die in einer Objektebene (1.1) auf einem Probenträger (1.2) angeordnet ist, umfassend - eine Beleuchtungseinrichtung (2) mit einem Beleuchtungsobjektiv (2.1) zum Beleuchten der Probe (1) über einen Beleuchtungsstrahlengang mit einem ersten Lichtblatt (3), welches das Probenvolumen (1.3) in einer ersten Lichtblattebene (3.1) schneidet, wobei die erste Lichtblattebene (3.1) die Objektebene (1.1) in einem schiefen ersten Beleuchtungswinkel (α) schneidet, und - eine Detektionseinrichtung (4) zum Abbilden von der Probe (1) kommenden Lichts, mit einem Detektionsobjektiv (4.1), dessen Fokusebene (4.1.1) in dem Probenvolumen (1.3) parallel zur oder in der Objektebene (1.1) liegt, und einem Flächendetektor (4.2) mit einer Detektorebene (4.2.1), dadurch gekennzeichnet, dass - der Flächendetektor (4.2) eine erste Schlitzblende (4.2.2) umfasst, welche im Detektionsstrahlengang so vor dem Flächendetektor (4.2) angeordnet ist, dass solche Bereiche des Probenvolumens (1.3), die von dem ersten Lichtblatt (3) beleuchtet werden, jedoch außerhalb der Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektivs (4.1) liegen, ausgeblendet werden.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass - die erste Schlitzblende (4.2.2) zur Detektion verschiedener Bereiche der Fokusebene (4.1.1) parallel zur Detektorebene (4.2.1) verschiebbar im Detektionsstrahlengang angeordnet ist, - die Detektionseinrichtung (4) ein im Detektionsstrahlengang angeordnetes oder in diesen einbringbares adaptives optisches Detektionselement (4.5) umfasst, das von einer Steuerungseinrichtung (4.7) angesteuert wird und mit welchem die Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektives (4.1) im Probenvolumen (1.3) verschoben werden kann, und - die Steuerungseinrichtung (4.7) die erste Schlitzblende (4.2.2) derart ansteuert, dass bei einer Verschiebung der Fokusebene (4.1.1) die Position der Öffnung der ersten Schlitzblende (4.2.2) zu dem Bereich der Fokusebene (4.1.1), der von dem ersten Lichtblatt (3) geschnitten wird, korrespondiert, sodass diejenigen Bereiche des Probenvolumens (1.3), die von dem ersten Lichtblatt (3) beleuchtet werden und außerhalb der Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektivs (4.1) liegen, ausgeblendet werden.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerungseinrichtung (4.7) mit der Beleuchtungseinrichtung (2), dem Probenträger (1.2) oder beiden zur ihrer Ansteuerung verbunden ist, um die Lage der ersten Lichtblattebene (3.1) relativ zu der Objektebene (1.1) zu ändern.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (2) mit dem Beleuchtungsobjektiv (2.1) zum Beleuchten der Probe (1) mit einem zweiten Lichtblatt (5) ausgelegt ist, welches das Probenvolumen (1.3) in einer zweiten Lichtblattebene (5.1) schneidet, wobei die zweite Lichtblattebene (5.1) die Objektebene (1.1) in einem schiefen zweiten Beleuchtungswinkel (β) schneidet, und dass der Flächendetektor (4.2) eine zweite Schlitzblende (4.2.3) aufweist, welche im Detektionsstrahlengang so vor dem Flächendetektor (4.2) angeordnet ist, dass solche Bereiche des Probenvolumens (1.3), die von dem zweiten Lichtblatt (5) beleuchtet werden, jedoch außerhalb der Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektivs (4.1) liegen, ausgeblendet werden.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Lichtblattebene (3.1) und die zweite Lichtblattebene (5.1) einen von Null verschiedenen Schnittwinkel (γ) miteinander einschließen.
Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei die Detektionseinrichtung (4) ein im Detektionsstrahlengang angeordnetes oder in diesen einbringbares adaptives optisches Detektionselement (4.5) umfasst, das von einer Steuerungseinrichtung (4.7) angesteuert wird und mit welchem die Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektives (4.1) im Probenvolumen (1.3) verschoben werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass - die zweite Schlitzblende (4.2.3) zur Detektion verschiedener Bereiche der Fokusebene (4.1.1) parallel zur Detektorebene verschiebbar im Detektionsstrahlengang angeordnet ist, und - die Steuerungseinrichtung (4.7) die zweite Schlitzblende (4.2.3) derart ansteuert, dass bei einer Verschiebung der Fokusebene (4.1.1) die Position der Öffnung der zweiten Schlitzblende (4.2.3) zu dem Bereich der Fokusebene (4.1.1), der von dem zweiten Lichtblatt (5) geschnitten wird, korrespondiert, sodass diejenigen Bereiche des Probenvolumens (1.3), die von dem zweiten Lichtblatt (5) beleuchtet werden und au ßerhalb der Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektivs (4.1) liegen, ausgeblendet werden.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsobjektiv (2.1) und das Detektionsobjektiv (4.1) ein und das selbe Doppelobjektiv (6) sind.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in den Beleuchtungsstrahlengang ein dichroitischer Spiegel (4.8) oder eine Glasplatte (4.9) mit einer reflektierenden Beschichtung zum Einkoppeln des Beleuchtungsstrahlengangs und des Detektionsstrahlengangs in das Doppelobjektiv (6) eingebracht ist.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtblattmikroskop als inverses Mikroskop ausgeführt ist.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (4) einen im Detektionsstrahlengang angeordneten oder in diesen einbringbaren Bildfelddreher (4.6) umfasst, mit welchem die Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektives (4.1) in dem Probenvolumen (1.3) gedreht werden kann.
Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 2 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das adaptive optische Detektionselement (4.5) einen Alvarez-Manipulator, einen deformierbaren Spiegel, einen räumlichen Lichtmodulator, ein Mikro-Elektronisches-Mechanisches-System (MEMS), ein Mikrospiegel-Array-Linsen-System (MALS), eine verstellbare bzw. adaptive Linse und/oder ein adaptives Linsensystem umfasst.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Länge der ersten Schlitzblende (4.2.2) mit einer in die Fokusebene (4.1.1) projizierten ersten Breite des ersten Lichtblatts (3) korrespondiert.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Länge der zweiten Schlitzblende (4.2.3) mit einer in die Fokusebene (4.1.1) projizierten zweiten Breite des zweiten Lichtblatts (5) korrespondiert.
Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Schlitzblende (4.2.2) und/oder die zweite Schlitzblende (4.2.3) ein Rolling Shutter des Flächendetektors (4.2) sind.
Verfahren zur Lichtblattmikroskopie, umfassend die Schritte a) Beleuchten einer ein Probenvolumen (1.3) aufweisenden Probe (1), die in einer Objektebene (1.1) auf einem Probenträger (1.2) angeordnet ist, mit einem ersten Lichtblatt (3), welches das Probenvolumen (1.3) in einer ersten Lichtblattebene (3.1) schneidet, wobei die erste Lichtblattebene (3.1) mit der Objektebene (1.1) einen schiefen ersten Beleuchtungswinkel (α) einschließt, b) Einstellen einer Position einer Fokusebene (4.1.1) eines Detektionsobjektivs (4.1) im Probenvolumen (1.3), wobei die Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektivs (4.1) parallel zur oder in der Objektebene (1.1) in dem Probenvolumen (1.3) liegt, c) Verschieben einer vor einem Flächendetektor (4.2) angeordneten ersten Schlitzblende (4.2.2) in eine Position, bei der die Öffnung der ersten Schlitzblende (4.2.2) zu dem Bereich der Fokusebene (4.1.1), der von dem ersten Lichtblatt (3) geschnitten wird, korrespondiert und diejenigen Bereiche des Probenvolumens (1.3), die von dem ersten Lichtblatt (3) beleuchtet werden und außerhalb der Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektivs (4.1) liegen, ausgeblendet werden, und d) Abbilden von Licht, welches von der Probe (1) kommt, über das Detektionsobjektiv (4.1) auf den Flächendetektor (4.2), und e) Wiederholen der Schritte b) bis d), wobei die Position der Fokusebene (4.1.1) senkrecht zur Objektebene (1.1) verschoben wird, bis ein interessierender Bereich des Probenvolumens (1.3) abgebildet worden ist.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Probe (1) im Schritt a) zusätzlich mit einem zweiten Lichtblatt (5) beleuchtet wird, welches das Probenvolumen (1.3) in einer zweiten Lichtblattebene (5.1) schneidet, wobei die zweite Lichtblattebene (5.1) mit der Objektebene (1.1) einen schiefen zweiten Beleuchtungswinkel (β) einschließt und in Schritt c) zusätzlich eine vor einem Flächendetektor (4.2) angeordnete zweite Schlitzblende (4.2.3) so verschoben wird, dass die Öffnung der zweiten Schlitzblende (4.2.3) zu dem Bereich der Fokusebene (4.1.1), der von dem zweiten Lichtblatt (5) geschnitten wird, korrespondiert und diejenigen Bereiche des Probenvolumens (1.3), die von dem zweiten Lichtblatt (5) beleuchtet werden und au ßerhalb der Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektivs (4.1) liegen, ausgeblendet werden.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem im Schritt d) nach dem Abbilden die Lage der ersten Lichtblattebene (3.1) relativ zu der Objektebene (1.1) geändert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem im Schritt d) nach dem Abbilden die Lage der zweiten Lichtblattebene (5.1) relativ zu der Objektebene (1.1) geändert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem im Schritt d) nach dem Abbilden die Fokusebene (4.1.1) des Detektionsobjektives (4.1) in dem Probenvolumen (1.3) gedreht wird.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, bei dem als erste Schlitzblende (4.2.2) und/oder als zweite Schlitzblende (4.2.3) ein Rolling Shutter des Flächendetektors (4.2) verwendet wird.