CN107272178B - 基于半环状led照明的差分相衬显微成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法，首先利用弱物体近似，推导在部分相干照明成像系统中弱物体的光学传递函数表达式；计算半环状照明下差分相衬成像的相位传递函数；在LED阵列上依次显示两个不同方向上的环状照明图案，并且产生同步触发信号至相机；改变环状照明图案方向，并且产生同步触发信号至相机，在不同方向上的环状照明图案对应的触发信号下，相机采集一系列强度图像；由差分相衬成像计算公式即可计算出在不同方向下的差分相衬图像，从而实现在上下左右及各个不同方向上实现差分相衬成像。本发明可对差分相衬图像中相位的低频进行提升，使差分相衬图像的凹凸感更强，增强了图像的成像质量。

Description

基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法

技术领域

本发明属于光学显微测量、成像技术，特别是一种基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法。

背景技术

在生物医学显微成像领域，大部分活细胞和未染色的生物标本都是无色透明的，这是因为细胞内各部份细微结构的折射率和厚度的不同，当光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化，但这种相位差人眼无法观察。这就需要通过一些化学或者生物手段来对细胞进行染色，从而使其在显微镜下可见。由于生物细胞内部不同物质对有色染料吸收的吸收率不同，故最终在显微镜下就可以看见生物细胞内部的结构和表现出不同的生物特性(龚志锦,詹熔洲.病理组织制片和染色技术[M].上海科学技术出版社,1994)。但由于这种染色手段会对细胞和组织的正常生理活动造成影响，更有可能会杀死细胞。其中荧光标记成像可以提高显微成像的分辨率，但是同样由于荧光蛋白剂进入细胞之后会给细胞的正常代谢和生长带来影响，不利于细胞的长时间观察(Sarder P,NehoraiA.Deconvolution methods for 3-D fluorescence microscopy images[J].IEEE SignalProcessing Magazine,2006,23(3):32-45)。

无标记成像对长时间的活细胞观察是一种有效的成像方式，其中最常见的成像模式是相差显微成像与差分相衬显微成像。1935年荷兰科学家Zernike利用相差显微成像技术发明了相差显微镜，并将其用于观察未染色标本。相差显微镜利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测。该显微镜主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ(波长)，如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差，从而实现对未染色细胞和生物组织的相位进行观察。

而差分相衬成像也是一种常见的显微成像方法，类似于微分干涉显微成像的成像效果。该成像方法利用非对称照明，并采集每种非对称照明图案下对应的多幅强度图像，并计算得到差分相衬图像。最终可使样品的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，类似大理石上的浮雕，这样便人为地造成了待测样品的三维立体感。2015年，田磊等人详细的从理论上推导和解释了基于LED阵列的差分相衬显微成像系统中的传递函数(Tian L,Waller L.Quantitative differential phase contrast imaging in anLED array microscope[J].Optics express,2015,23(9):11394-11403)，并且分析了在科勒照明(illumination)中圆形照明孔径在不同的相干系数下差分相衬成像的传递函数响应等问题，其中相干系数的定义为照明数值孔径与物镜数值孔径之比，σ＝NA_ill/NA_obj；当σ≈0时成像系统为相干照明系统如图1(a)所示，而当σ≤1时成像系统为部分相干照明系统如图1(b)所示。虽然该方法能够实现基于LED阵列的差分相衬成像，但是基于传统半圆形照明孔径对差分相衬图像中相位低频成分的成像效果依旧有待提升，也为后续从差分相衬图像中恢复相位带来了困难。所以如何在保证差分相衬成像效果的前提下对图像中相位的低频进行提升成为差分相衬成像技术对无标记样品观察中的一个技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法，在保证差分相衬成像分辨率为两倍物镜成像分辨率的前提下，对相衬图像中相位的低频成分进行提升；使最终的相衬图像的凹凸感更强，提高了定量相位成像质量和重构结果，并且可高度兼容传统显微镜结构。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法，步骤如下：

步骤一，对部分相干成像系统的光学传递函数进行推导，利用弱物体近似，推导在部分相干照明成像系统中弱物体的光学传递函数表达式；

步骤二，计算半环状LED照明的差分相衬成像的相位传递函数，当照明模式由圆形部分相干照明图案退化为单个倾斜相干点光源，得到相干倾斜照明成像系统的相位传递函数，此时相干点光源分别内切在物镜光瞳的边缘，再由倾斜相干点光源扩展到半环状离散相干点光源，即可推导出半环状LED照明模式下的相位传递函数；再利用差分相衬成像计算公式得到半环状照明下差分相衬成像的相位传递函数；

步骤三，在LED阵列上依次显示两个不同方向上的环状照明图案，并且产生同步触发信号至相机，使相机采集对应方向上半环状图案下的强度图像；

步骤四，改变显示的环状照明图案方向，并采集一系列强度图像，即依次显示左右、上下、左下右上及左上右下四个方向上的半环状LED照明图案，并且依次产生同步触发信号至相机，在不同方向上的环状照明图案对应的触发信号下，相机采集一系列强度图像I₁,I₂,I₃,I₄...；

步骤五，由差分相衬成像计算公式即可计算出在不同方向下的差分相衬图像和从而实现在上下左右及各个不同方向上实现差分相衬成像。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)离散半环状照明仅需更少的LED单元个数即可实现差分相衬相位成像，甚至可以不需要一整块LED阵列作为差分相衬成像的照明光源，既保证了成像质量又降低了整个装置的成本。(2)将半环状照明引入显微成像系统中，并且在成像系统中加入了聚光镜，不仅提升了系统的光能利用率，而且使系统照明数值孔径达0.95以上。(3)在整个光学系统参数已经确定和保证成像分辨率的前提下，可对差分相衬图像中相位的低频进行提升，使差分相衬图像的凹凸感更强，增强了图像的成像质量。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是相干照明、部分相干照明、半圆形照明和离散半环状照明成像系统的光源图案示意图。

图2是基于半环状LED照明的差分相衬显微成像的显微镜光路示意图。

图3为本发明基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法的流程图。

图4为采用LED照明的离散环状照明和连续照明环状差分相衬显微成像相位传递函数的对比结果示意图。

图5为上下、左右、左上右下及左下右上方向上的半环状照明图案。

具体实施方式

如图2所示，本发明是基于半环状LED照明的差分相衬显微成像系统，该成像系统的实际硬件平台包括LED阵列、载物台、聚光镜、待测样品、显微物镜、成像筒镜、相机，本系统采用了环状照明图案并在光路中加入了聚光镜。其中LED阵列放置在聚光镜的前焦面位置，并且LED阵列的中心处于显微物镜的光轴上，显微物镜的后焦面与成像筒镜的前焦面重合，相机的成像平面放置在成像筒镜的后焦面位置；成像时载物台上的待测样品调节到显微物镜的前焦面位置，构成无穷远校正成像系统。半环状照明图案显示在所述LED阵列上，每个被点亮的LED单元发出的光经过聚光镜汇聚变成部分相干光线照射在待测样品上，该待测样品被放置在载物台上，光线透过待测样品，经过成像筒镜汇聚后照射相机的成像平面，改变半环状照明图案的方向，产生同步触发信号到相机并且采集一系列强度图像。

为了满足成像方法所需的最小频域采样率，所述的显微物镜数值孔径为NA_obj，半环状照明图案上每个被点亮的LED单元到LED阵列中心的距离为l，且满足其中f为聚光镜的焦距，一般在10-20mm之间。显微物镜放大率为Mag，相机像元尺寸为Δx_cam，照明光线的波长为λ，且满足本发明中为了满足不同数值孔径的显微物镜的需求，半环状照明图案半径大小可通过重新编程的方法来改变大小，即满足条件此时照明半环半径大小始终与物镜数值孔径相匹配，如图1(d)所示。

LED阵列中包括若干个(至少261个)LED单元，它们等间隔排布形成一个二维阵列。其中每个LED单元均为红绿蓝三色LED单元，其典型波长为红光633nm、绿光525nm和蓝光465nm。每个LED单元之间中心间距d典型值1-4mm。LED阵列并不需要进行单独加工，一般在市场上可直接购置。表1给出了一个市面上可购置的LED阵列的产品参数。在此LED阵列中，LED单元共有32行、32列，一共1024个，每个LED单元的亮度在2000cd/m2以上。

表1 LED阵列的物理参数

LED阵列中每个LED单元均可通过单独点亮，点亮LED单元的具体方法为现有常规技术，实现电路可以采用(但不限于)单片机、ARM、或者可编程逻辑器件等现有技术即可实现，具体实现方法可参考相关文献(如郭宝增,邓淳苗：基于FPGA的LED显示屏控制系统设计[J].液晶与显示,2010,25(3):424-428)。

结合图3，本发明利用上述装置实现的差分相衬成像方法包括以下五个步骤：

步骤一，对部分相干照明系统的光学传递函数进行推导。在照明光源与显微物镜的光瞳函数是关于光轴对称情况下，利用弱物体近似，推导在部分相干照明成像系统中弱物体的光学传递函数表达式。

具体实施过程为：在基于半环状LED照明的差分相衬成像装置构成的无穷远校正成像系统中，对于非相干照明来说相机所处的成像平面上所采集的强度图像为

其中，r为空域中的二维变量，h(r)为成像系统的振幅点扩散函数，t(r)为物体的复振幅，I_u(r)表示在光源面上所有点光源产生的强度的叠加。其中t(r)＝a(r)exp[iφ(r)]，a(r)为物体的吸收，φ(r)则为物体的相位。而对于相干成像系统来说光强图像则可表示为

对于一个部分相干成像系统来说，通过引入弱物体近似，在相机的成像平面所采集的光强的傅里叶变换与成像系统之间的数学关系可表示为

其中表示傅里叶变换，u表示在频域极坐标系中的二维变量，δ表示单位冲激函数。上式中的第一项表示背景光强，即透射光线总能量，其达表示为：

B＝∫∫S(u')|P(u')|²du'

其中，S(u)为在聚光镜的前焦面上的光源分布，P(u)为显微物镜的光瞳函数，其绝对值可表达为

其中ρ_P为显微物镜光瞳的归一化截止频率。而后面两项分别表示系统的吸收分量和相位分量，其中H_A(u)和a(u)分别表示系统的振幅传递函数和物体振幅的傅里叶变换，H_P(u)和φ(u)表示系统的相位传递函数和物体相位的傅里叶变换。对样品吸收成分的频率响应可以用振幅传递函数表示为：

H_A(u)＝-[∫∫S(u')P^*(u')P(u'+u)du'+∫∫S(u')P^*(u')P(u'-u)du']

而对相位成分的频率响应则可表达为相位传递函数：

H_P(u)＝i[∫∫S(u')P^*(u')P(u'+u)du'-∫∫S(u')P^*(u')P(u'-u)du']

以上公式即为引入弱物体近似后的成像系统振幅与相位的传递函数，上述u'为频域中临时积分变量。

步骤二，计算半环状LED照明的差分相衬成像的相位传递函数。当照明模式由圆形部分相干照明图案退化为单个倾斜相干点光源，可得到相干倾斜照明成像系统的相位传递函数，此时相干点光源分别内切在物镜光瞳的边缘。再由倾斜相干点光源扩展到半环状离散相干点光源，即可推导出半环状LED照明模式下的相位传递函数；再利用差分相衬成像计算公式可得到半环状照明下差分相衬成像的相位传递函数。

具体实施过程为：如果光源分布S(u)为非轴对称函数，在LED阵列所处的光源面引入一个倾斜相干点光源，其光源分布S(u)为

S(u)＝δ(u-ρ_s)

其中δ表示单位冲激函数，ρ_s为点光源到光源中心的频率归一化距离。将S(u)代入相位传递函数中，即可得到在在聚焦位置处对非对称点光源的相位传递函数为：

H_P(u)＝P(u+ρ_s)-P(u-ρ_s)

此时倾斜相干点光源是内切于显微物镜光瞳，故有|ρ_s|＝|ρ_p|，其中ρ_p为物镜光瞳空间截止归一化频率。利用相干模式分解理论，半环状LED照明图案可被分解为许多倾斜干点光源，其光学传递函数可以被当成是每一个倾斜相干点光源的非相干叠加。最终显示在LED阵列上的半环状光源S(u)表示为：

其中N为被点亮的LED数量，且半环状照明图案上的每个点光源的空间频率等于物镜光瞳的空间频率，即|ρ_s|＝|ρ_p|。最终可以推导出半环状LED照明模式下的相位传递函数：

通过计算不同方向的光源分布S(u)下的强度，并且利用差分相衬成像计算公式：

其中I₁和I₂分别表示两个半径相同方向相反的半环状光源所采集的光强。最终可以消去强度图像中的吸收项，即H_A(u)＝0，得到基于半环状LED照明的差分相衬成像的相位传递函数为：

为了满足成像方法所需的最小频域采样率，所采用的显微物镜数值孔径为NA_obj，其放大倍率为Mag，相机像元尺寸为Δx_cam，这几者之间满足当使用不同数控孔径的显微物镜时，通过对LED阵列重新编程改变环状照明图案使其重新内切与显微物镜光瞳，满足条件此时照明半环半径大小始终与物镜数值孔径相匹配，即可实现适用于不同数值孔径的显微物镜的半环状可编程照明。

如图4所示，通过推导半环状LED照明与传统的半圆形照明的差分相衬成像的二维相位传递函数，选取一组低频与高频剖线进行对比，其中图4中只推导了在上下两个方向上的相位传递函数。低频归一化频率值选取0.12NA_obj，高频归一化频率值选取1.7NA_obj，这两组照明方式的相干系数均为0.99，所以基于这两种照明方式的成像系统相位传递函数的最大截止频率均能拓展到2倍物镜数值孔径分辨率。尽管离散半环状的相位传递函数为阶跃状，但其在低频处的频率响应明显大于半圆形照明方式，如图4中阶跃状点画线所示。在高频处两种照明方式的频率响应是比较接近的，所以由对比结果可以看出基于半环状LED照明的差分相衬成像系统的相位传递函数不仅可以保证成像分辨率可拓展至2倍物镜数值孔径分辨率，还可以提升差分相衬成像中的低频响应，使最终的差分相衬图像使最终的相衬图像的凹凸感更强，成像效果更明显。

步骤三，显示离散半环状照明图像，并采集强度图像。

具体实施过程为：在LED阵列上依次显示两个不同方向上的环状照明图案，并且产生同步触发信号至相机，使相机采集对应方向上半环状图案下的强度图像。

步骤四，改变显示的环状照明图案方向，并采集一系列强度图像。

具体实施过程为：依次显示左右、上下、左下右上及左上右下四个方向上的半环状LED照明图案，如图5所示，并且依次产生同步触发信号至相机。在不同方向上的环状照明图案对应的触发信号下，相机采集一系列强度图像I₁,I₂,I₃,I₄...；

步骤五，由差分相衬成像计算公式即可计算出在不同方向下的差分相衬图像和从而实现在上下左右及各个不同方向上实现差分相衬成像。

最终通过对比本发明所提出的基于半环状LED照明模式与连续半环状照明模式和传统的半圆形照明图案的相位传递函数的二维与一维数据，可以看出本发明所提出的差分相衬成像方法的相位传递函数在高频处的响应与连续半环状情况是接近的，且比半圆状的响应要高。在低频处的相位传递函数响应远比传统的半圆形差分相衬照明的响应大，说明了基于半环状LED照明的差分相衬相位成像方法不仅保证了成像分辨率，而且在低频和高频的响应对比传统的差分相衬成像方法均有所提高。本发明不仅减少了所使用的LED单元个数，降低照明光源的成本，还增强了差分相衬图像中的低频成分，提升了成像质量。

Claims (3)

1.一种基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法，其特征在于步骤如下：

步骤一，对部分相干成像系统的光学传递函数进行推导，利用弱物体近似，推导在部分相干照明成像系统中弱物体的光学传递函数表达式；

步骤二，计算半环状LED照明的差分相衬成像的相位传递函数，当照明模式由圆形部分相干照明图案退化为单个倾斜相干点光源，得到相干倾斜照明成像系统的相位传递函数，此时相干点光源分别内切在物镜光瞳的边缘，再由倾斜相干点光源扩展到半环状离散相干点光源，即可推导出半环状LED照明模式下的相位传递函数；再利用差分相衬成像计算公式得到半环状照明下差分相衬成像的相位传递函数；

步骤三，在LED阵列上依次显示两个不同方向上的环状照明图案，并且产生同步触发信号至相机，使相机采集对应方向上半环状图案下的强度图像；

步骤四，改变显示的环状照明图案方向，并采集一系列强度图像，即依次显示左右、上下、左下右上及左上右下四个方向上的半环状LED照明图案，并且依次产生同步触发信号至相机，在不同方向上的环状照明图案对应的触发信号下，相机采集一系列强度图像I₁,I₂,I₃,I₄...；

步骤五，由差分相衬成像计算公式即可计算出在不同方向下的差分相衬图像和从而实现在上下左右及各个不同方向上实现差分相衬成像。

2.根据权利要求1所述的基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法，其特征在于在步骤一中：在基于半环状LED照明的差分相衬成像装置构成的无穷远校正成像系统中，对于非相干照明来说相机所处的成像平面上所采集的强度图像为

其中，r为空域中的二维变量，h(r)为成像系统的振幅点扩散函数，t(r)为物体的复振幅，I_u(r)表示在光源面上所有点光源产生的强度的叠加；其中t(r)＝a(r)exp[iφ(r)]，a(r)为物体的吸收，φ(r)则为物体的相位；

而对于相干成像系统来说光强图像则可表示为

对于一个部分相干成像系统来说，通过引入弱物体近似，在相机的成像平面所采集的光强的傅里叶变换与成像系统之间的数学关系可表示为

其中表示傅里叶变换，u表示在频域极坐标系中的二维变量，δ表示单位冲激函数；上式中的第一项表示背景光强，即透射光线总能量，其达表示为：

B＝∫∫S(u')|P(u')|²du'

其中，S(u)为在聚光镜的前焦面上的光源分布，P(u)为显微物镜的光瞳函数，其绝对值可表达为

其中ρ_P为显微物镜光瞳的归一化截止频率；而后面两项分别表示系统的吸收分量和相位分量，其中H_A(u)和分别表示系统的振幅传递函数和物体振幅的傅里叶变换，H_P(u)和表示系统的相位传递函数和物体相位的傅里叶变换；对样品吸收成分的频率响应可以用振幅传递函数表示为：

H_A(u)＝-[∫∫S(u')P^*(u')P(u'+u)du'+∫∫S(u')P^*(u')P(u'-u)du']

而对相位成分的频率响应则可表达为相位传递函数：

H_P(u)＝i[∫∫S(u')P^*(u')P(u'+u)du'-∫∫S(u')P^*(u')P(u'-u)du']

以上公式即为引入弱物体近似后的成像系统振幅与相位的传递函数，上述u'为频域中临时积分变量。

3.根据权利要求1所述的基于半环状LED照明的差分相衬显微成像方法，其特征在于在步骤二中：

如果光源分布S(u)为非轴对称函数，在LED阵列所处的光源面引入一个倾斜相干点光源，其光源分布S(u)为

S(u)＝δ(u-ρ_s)

其中δ表示单位冲激函数，ρ_s为点光源到光源中心的频率归一化距离；将S(u)代入相位传递函数中，即可得到在聚焦位置处对非对称点光源的相位传递函数为：

H_P(u)＝P(u+ρ_s)-P(u-ρ_s)

此时倾斜相干点光源是内切于显微物镜光瞳，故有|ρ_s|＝|ρ_p|，其中ρ_p为物镜光瞳空间截止归一化频率；利用相干模式分解理论，半环状LED照明图案可被分解为许多倾斜干点光源，其光学传递函数可以被当成是每一个倾斜相干点光源的非相干叠加；最终显示在LED阵列上的半环状光源S(u)表示为：

其中N为被点亮的LED数量，且半环状照明图案上的每个点光源的空间频率等于物镜光瞳的空间频率，即|ρ_s|＝|ρ_p|；最终可以推导出半环状LED照明模式下的相位传递函数：

通过计算不同方向的光源分布S(u)下的强度，并且利用差分相衬成像计算公式：

其中I₁和I₂分别表示两个半径相同方向相反的半环状光源所采集的光强；最终可以消去强度图像中的吸收项，即H_A(u)＝0，得到基于半环状LED照明的差分相衬成像的相位传递函数为：

为了满足成像方法所需的最小频域采样率，所采用的显微物镜数值孔径为NA_obj，其放大倍率为Mag，相机像元尺寸为Δx_cam，这几者之间满足当使用不同数控孔径的显微物镜时，通过对LED阵列重新编程改变环状照明图案使其重新内切与显微物镜光瞳，满足条件此时照明半环半径大小始终与物镜数值孔径相匹配，即可实现适用于不同数值孔径的显微物镜的半环状可编程照明。