CN104765138B - 基于led阵列的多模式显微成像系统及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LED阵列的多模式显微成像系统及其方法，将LED阵列作为显微系统光源，产生可控多角度照明光、可控照明孔径，实现明场成像、暗场成像和差分相衬成像。本发明可实现的多模式成像包括明场、暗场和差分相衬成像三种成像模式，且实现明场成像、暗场成像和差分相衬成像的同时无需往传统显微镜的成像光路中加入任何附加光学元件，从而大大简化了光学系统，利用LED阵列使得显微镜具有照明孔径、照明角度和光源相干性灵活可调的能力。

Description

基于LED阵列的多模式显微成像系统及其方法

技术领域

本发明属于光学成像技术，特别是一种基于LED阵列的多模式显微成像系统及其方法。

背景技术

明场成像、暗场成像和差分相衬成像是比较常见的三种显微成像方法，目前多数显微镜都具备这三种成像模式。明场成像和暗场成像是最常用的两种显微成像方法，两者的区别在于：照明方式不同。如果只允许透射光束通过物镜光阑成像，称其为明场像；如果只允许衍射光束通过物镜光阑成像，则称为暗场像。所以明场是让照明孔径在物镜数值孔径以内，视场是明亮的；而暗场是则是让照明孔径在物镜数值孔径以外，而不让照明光束通过物镜光阑成像，但是标本中的结构能够衍射光线，这些衍射光有一部分通过物镜光阑成像，所以在黑暗的背景上能够看到表现标本中细微结构的亮点和亮线(1、刘晓云，龙兴武，黄云，周宁平，高伯龙.相衬显微镜衬比的分析[N].光子学报，1999，28(1))。

还有一种常见的成像方式是相差显微成像。1935年荷兰科学家Zernike利用相差显微成像技术发明了相差显微镜，并将其用于观察未染色标本。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化，这种相位差人眼无法观察。而相差显微镜利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测。该显微镜主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ(波长)，如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜3个特殊之处：1.环形光阑(annulardiaphragm)位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上；2.相位板(phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ；3.合轴调节望远镜：用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合(2、朱晓辉，朱忠勇.相差显微镜的原理、结构和临床应用[J].临床检验杂志，2007，24(4)：308-310.)。

类似于相差显微成像的成像效果，差分相衬成像也是一种常见的显微成像方法，使用该方法可使样品的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，类似大理石上的浮雕，这样便人为地造成了样品的三维立体感。

但是这些显微镜有一个共同的缺点就是都需要在成像光路中加入附加的光学元件(例如环形光阑、相位板等)，而这无形中增加了光路调节的复杂度。这些传统的显微镜使用固定的柯勒照明系统，难以实现照明孔径、照明角度、光源相干性灵活可调。传统显微镜一般需要熟练的显微镜工作者进行操作，并需要针对标本的差异和物镜的不同进行实践、校正(3、刘溪、张志恒、李越敏.显微镜的使用及维护[J].教学仪器与实验：中学版，2005(9)：30-30.)。

在很多情况下，一台设计精良的显微镜并不一定会获得良好的成像质量。其主要原因多半是光源未调校好，使标本不能获得充分的照明所致。所以对于显微镜的照明光源的改进不仅需要设计好光源与载物台之间的距离，而且需要使得显微镜标本的照明状态明亮、无眩光、且视场照度均匀；调节光路的操作简便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于LED阵列的多模式显微成像系统及其方法，从而实现在无复杂光学结构前提下的明场成像、暗场成像和差分相衬成像。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于LED阵列的多模式显微成像系统及其方法，包括成像系统，该成像系统包括相机、筒镜、物镜、样品、样品载物台，其中相机和物镜安装在筒镜的两端，距离固定；物镜与样品之间的距离可调，样品放置在可平移的样品载物台上；LED阵列设置在样品载物台下方，并距离载物台上表面50-70mm的位置，该LED阵列的中心处于成像系统的光轴上。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)解决传统显微镜在明场、暗场、差分相衬成像时光路复杂，操作难度大的问题，采用LED阵列作为显微系统的照明光源，从而实现明场、暗场和差分相衬成像时无需在传统显微镜的成像光路中加入任何附加光学元件(例如环形光阑、相位板等)，大大简化了光学系统。(2)放弃了传统显微镜使用固定柯勒照明系统，利用LED阵列使得显微镜简便获得多角度照明光、多照明孔径、光源相干性多变可控。(3)无需机械的移动光源位置，从而实现实时准确的测量。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是LED阵列的明场、暗场、差分相衬显微成像系统构成示意图。

图2是明场成像原理示意图。

图3是明场成像原理示意图。

图4是差分相衬成像原理示意图。

图5是明场、暗场成像流程图。

图6是差分相衬成像流程图。

具体实施方式

结合图1，本发明基于LED阵列的多模式显微成像系统，利用LED阵列作为显微成像系统的照明光源、多角度照明光、多照明孔径、光源相干性多变可控，从而实现在无复杂光学结构前提下的明场成像、暗场成像和差分相衬成像，包括传统的成像系统1，该成像系统1包括相机2、筒镜3、物镜4、样品5、样品载物台6，其中相机2和物镜4安装在筒镜3的两端，距离固定；物镜4与样品5之间的距离可调，样品5放置在可平移的样品载物台6上；其特征在于LED阵列7设置在样品载物台6下方，并距离载物台上表面50-70mm的位置，该LED阵列7的中心处于成像系统1的光轴上。

本发明基于LED阵列的多模式显微成像系统的LED阵列7采用三基色LED阵列作为系统光源，三基色LED阵列中的每个LED像素能够分别发出红、绿、蓝三种单色光，波长依次为635nm、525nm和475nm，每个LED像素之间中心间距为d，d＝2-6mm，整个LED阵列共有n行、m列，一共n*m个像素，n、m的取值可以相同也可以不同，其值可以为大于等于8的自然数，亮度在2000cd/m²以上；每个LED像素均单独点亮，或让多个LED像素同时点亮从而完成多个角度的照明。像素点亮为现有技术，是通过FPGA、逻辑芯片或微控制器及其驱动程序来实现控制，如潘茂盛.基于FPGA驱动的高速点阵板驱动系统及相关接口研制[D].中国贵州：贵州民族学院，2006：1-58；龚成荣，赵又新，马宏锋.基于FPGA的LED点阵书写显示屏的设计[J].自动化与仪器仪表，2010(3)：123-125。

结合图5、图6，本发明基于LED阵列的多模式显微成像方法，包含明场、暗场、差分相衬三种显微成像模式，具体步骤如下：

第一步，采用LED阵列7作为显微成像系统光源，根据明场、暗场或差分成像模式，LED阵列7产生快速变化的编码照明光；

明场成像时，LED阵列7以中心像素为圆心，产生半径R1可调的整圆，该圆内所有LED灯均被点亮；暗场成像时相反，以中心像素为圆心，产生半径R2可调的整圆，该圆内所有LED灯均被熄灭，其余灯均点亮；差分成像时，LED阵列7以中心像素为圆心，先产生半径R3可调的半圆，只点亮该半圆内所有的LED灯作为第一个差分照明光，然后产生半径与R3相同的另一个半圆，只点亮该半圆内所有的LED灯作为第二个差分照明光。R1、R2、R3可以相同，也可以不同，具体取值为LED阵列的n、m中最小值的一半。

第二步，产生可控多角度照明光，即θ_i表示第i个LED像素8的照明角度(第i个LED像素8与成像系统1的光轴的夹角)，假设θ_max表示最大的照明角度，D表示中心LED像素与最外边LED像素的中心间距，得到又因为tanθ_max＝D/H，所以在该处实现θ＝0°～θ_max的不同照明角度；

第三步，产生可控照明孔径，即照明孔径的大小取决于被点亮的LED像素的半径，LED阵列7以中心像素为圆心，半径可调的圆，将该圆内所有LED像素均点亮，此处调节该圆半径大小则可实现照明孔径的调节，所述半径为明场成像模式时的R1、为暗场成像模式时的R2、或为差分成像模式时的R3；

第四步，实现明场成像、暗场成像或差分相衬成像，当进行明场或者暗场成像时，通过LED阵列7产生所需照明孔径的照明光后，利用CCD拍摄图像，即完成了明场或者暗场成像；当进行差分相衬成像时，先产生第一个差分照明光，用CCD拍摄第一帧图像I₁，然后产生第二个差分照明光，CCD拍摄第二帧图像I₂，由实现差分相衬成像，其中I_DPC表示差分相衬成像后的图像。

下面以实施例来说明本发明的实现过程。

结合图1，本发明基于LED阵列的多模式显微成像系统包括传统成像系统1、LED阵列7。其中传统成像系统1包括相机2、筒镜3、物镜4、样品5、样品载物台6。其中相机2与物镜4安装在筒镜3两端，距离固定；物镜4与样品5之间的距离可调；样品载物台6可以平移；LED阵列7被安置在载物台下方距离载物台上表面60mm(H＝60mm)的位置，并且LED阵列7的中心像素处于成像系统1的光轴上。

多模式显微成像包含了明场、暗场、差分相衬三种显微成像模式。为了实现基于多角度照明、可调照明孔径的明场、暗场、差分相衬成像，本发明采用三基色LED阵列作为系统光源。每个LED像素能够分别发出红、绿、蓝三种单色光，波长依次为635nm、525nm和475nm。每个LED像素之间中心间距d为3mm，整个LED阵列共有32行、32列，一共1024个像素，亮度在2000cd/m²以上。

表1 LED阵列的物理参数

利用LED阵列7作为照明光源，极其简便的调节照明的孔径、照明角度、光源相干性。

多照明角度的实现：在图1中，H表示LED阵列到载物台上表面之间的距离，为60mm(H＝60mm)。d表示每个LED像素之间中心间距，为3mm(d＝3mm)。θ_i表示第i个LED像素的照明角度。假设θ_max表示最大的照明角度，D表示中心LED像素到最外边的LED像素之间中心间距，得到因为tanθ_max＝D/H＝0.49，所以θ_max＝26.33°，sinθ_max＝0.44。在此处可实现照明角度范围为θ＝0°～26.33°。

多照明孔径的实现：每个LED像素均可单独点亮，也可以多个LED像素同时点亮从而同时完成多个角度的照明。以LED阵列7中心像素为圆心，半径可调，将该圆内所有LED像素均点亮，此时调节该圆半径大小则可实现照明孔径的调节。

传统显微系统1配合LED阵列7实现明场、暗场、差分相衬成像。成像原理示意图如图2～图4所示。

明场成像原理示意图如图2所示。从下到上依次LED阵列、载物台、物镜，其中LED阵列与载物台上表面的距离为60mm，并且LED阵列的中心像素处于显微系统的光轴上。在明场成像时，LED阵列7以中心像素为圆心，半径可调，该圆内所有LED灯均被点亮。

明场成像流程图如图5所示，首先确定成像模式(这边是明场成像模式)，LED阵列7产生照明光(该处照明光由LED阵列7以中心像素为圆心，半径可调，该圆内所有LED灯均被点亮来实现)，然后CCD拍摄图像，此时就完成了明场成像。

暗场成像原理示意图如图3所示。其装置与明场成像时一样。在暗场成像时，LED阵列7以中心像素为圆心，半径可调，该圆内所有LED灯均熄灭，其余LED灯均点亮。

暗场成像流程图如图5所示，首先确定成像模式(这边是暗场成像模式)，LED阵列7产生照明光(该处照明光由LED阵列7以中心像素为圆心，半径可调，该圆内所有LED灯均熄灭，其余LED灯均点亮来实现)，然后CCD拍摄图像，此时就完成了暗场成像。

差分相衬成像原理图如图4所示。其装置与明场成像时一样。差分相衬成像时，LED阵列7先产生第一个差分照明光(LED阵列7以中心像素为圆心，半径可调，该圆内只有其中一半的LED灯均被点亮，即该半圆内所有的LED灯均被点亮)(图4(a))，然后再产生第二个差分照明光(点亮另一半圆内所有LED灯)(图4(b))。

差分相衬成像流程图如图6所示。首先确定成像模式(这边是差分相衬成像模式)，LED阵列7产生第一个差分照明光，然后CCD拍摄第一帧图像I₁，然后产生第二个差分照明光，CCD拍摄第二帧图像I₂，最后通过计算实现差分相衬成像，其中I_DPC表示差分相衬成像后的图像。

Claims (1)

1.一种基于LED阵列的多模式显微成像系统，包括成像系统(1)，该成像系统(1)包括相机(2)、筒镜(3)、物镜(4)、样品(5)、样品载物台(6)，其中相机(2)和物镜(4)安装在筒镜(3)的两端，距离固定；物镜(4)与样品(5)之间的距离可调，样品(5)放置在可平移的样品载物台(6)上；其特征在于LED阵列(7)设置在样品载物台(6)下方，并距离载物台上表面50-70mm的位置，该LED阵列(7)的中心处于成像系统(1)的光轴上；

所述LED阵列(7)采用三基色LED阵列作为系统光源，三基色LED阵列中的每个LED像素能够分别发出红、绿、蓝三种单色光，波长依次为635nm、525nm和475nm，相邻LED像素之间中心间距为d，d为2-6mm，整个LED阵列共有n行、m列，一共n*m个像素，n≥8，m≥8，亮度在2000cd/m²以上；每个LED像素均可单独点亮，或多个LED像素同时点亮从而完成多个角度的照明；

所述的基于LED阵列的多模式显微成像系统在明场、暗场、差分相衬三种显微成像模式的成像过程步骤如下：

第一步，采用LED阵列(7)作为显微成像系统光源，根据明场、暗场或差分相衬成像模式，LED阵列(7)产生快速变化的编码照明光；

明场成像时，LED阵列(7)以中心像素为圆心，产生半径R1可调的整圆，该圆内所有LED灯均被点亮；暗场成像时相反，以中心像素为圆心，产生半径R2可调的整圆，该圆内所有LED灯均被熄灭，其余灯均点亮；差分相衬成像时，LED阵列(7)以中心像素为圆心，先产生半径R3可调的半圆，只点亮该半圆内所有的LED灯作为第一个差分照明光，然后产生半径与R3相同的另一个半圆，只点亮该半圆内所有的LED灯作为第二个差分照明光；

第二步，产生可控多角度照明光，即θ_i表示第i个LED像素(8)的照明角度，假设θ_max表示最大的照明角度，D表示中心LED像素与最外边LED像素的中心间距，得到又因为tanθ_max＝D/H，所以在该步实现θ＝0°～θ_max的不同照明角度，H表示LED阵列到载物台上表面之间的距离；θ是指照明角度；

第三步，产生可控的照明半径，在明场模式下照明半径的大小取决于被点亮的LED像素的半径，照明区域是以LED阵列(7)中心像素为圆心，半径可调的整圆，将该圆内所有LED像素均点亮，此处调节该圆半径大小则可实现照明半径的调节，所述该圆半径为明场成像模式时的R1；在暗场模式下照明半径的大小取决于被熄灭的LED像素的半径，以LED阵列(7)中心像素为圆心，产生半径可调的整圆，该圆内所有LED灯均被熄灭，其余LED灯被点亮，此处调节该圆半径大小则可实现照明半径的调节，所述该圆半径为暗场成像模式时的R2；在差分相衬成像模式时，取决于被点亮的LED像素的半径，LED阵列(7)以中心像素为圆心，产生半径可调的半圆，将半圆内所有LED像素均点亮，此处调节该半圆半径大小则可实现照明半径的调节，所述该半圆半径为差分相衬成像模式时的R3；

第四步，实现明场成像、暗场成像或差分相衬成像，当进行明场或者暗场成像时，通过LED阵列(7)产生所需照明孔径的照明光后，利用CCD拍摄图像，即完成了明场或者暗场成像；当进行差分相衬成像时，先产生第一个差分照明光，用CCD拍摄第一帧图像I₁，然后产生第二个差分照明光，CCD拍摄第二帧图像I₂，由实现差分相衬成像，其中I_DPC表示差分相衬成像后的图像。