CN111667548B - 一种多模式显微图像数值重建方法 - Google Patents

一种多模式显微图像数值重建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多模式显微图像数值重建方法，首先利用K个不同的结构光照明样品，依次拍摄样品物光波的傅里叶谱亮斑，获取到K个数字化的傅里叶谱图像；然后利用数字化掩模板矩阵对每个傅里叶谱图像进行编码，获得对应的编码谱图像矩阵；接着将每个编码谱图像矩阵的所有矩阵元积分求和，获得K个傅里叶谱积分值；再将K个傅里叶谱积分值进行图像重建，重建得到的一幅数字图像即为一种模式的显微图像；最后还利用傅里叶谱图像进行不同模式显微图像的数值重建，最终获得多种模式的显微图像、一种及多种模式的差分相衬显微图像。本发明可以非常灵活地通过数值重建获得多种不同模式下的显微图像，具有重要的应用价值。

Description

一种多模式显微图像数值重建方法
技术领域
本发明涉及光学成像技术领域，特别涉及一种多模式显微图像数值重建方法。
背景技术
样品在不同显微成像模式(如明场、暗场、环形照明以及差分相衬)下得到的显微图像各具特色，能提供样品的不同信息。传统的显微成像方式通常是将光源光束均匀照明样品，在样品物光波的像面直接采集图像。然而，这种现有的显微成像方式，为了观察同一个样品的明场、暗场、环形照明以及差分相衬等多模式显微图像，通常需要更换不同的显微镜零部件和进行机械上的移动、调整，甚至需要在不同的显微镜下进行，导致操作繁琐，难于实现对同一个样品的同一个视场进行不同成像模式下显微成像观察。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种多模式显微图像数值重建方法，该方法可以非常方便地实现对同一个样品的同一个视场进行不同成像模式下显微成像观察，并可以获得传统显微成像下难于获得的显微成像效果。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种多模式显微图像数值重建方法，步骤如下：
S1、利用K个不同的结构光照明样品，依次拍摄样品物光波的傅里叶谱亮斑，获取到K个数字化的傅里叶谱图像；
S2、对于每个傅里叶谱图像，利用数字化掩模板矩阵进行编码，得到对应的编码谱图像矩阵；
S3、对于K个编码谱图像矩阵，分别将每个编码谱图像矩阵的所有矩阵元进行积分求和，得到K个傅里叶谱积分值；
S4、将获得的K个傅里叶谱积分值进行图像重建，重建得到的一幅数字图像即为一种模式的显微图像；
S5、不同模式显微图像的数值重建：
(1)重复步骤S2，其中利用另一个不同的数字化掩膜板矩阵对每个傅里叶谱图像进行编码，再重复步骤S3和S4即获得另一种模式的显微图像；
以此类推，对于多个不同数字化掩膜板矩阵中的每个数字化掩膜板矩阵，依次重复步骤S2～S4获得对应模式的显微图像，最终获得多种模式的显微图像；
(2)重复步骤S2，其中利用两个具有轴对称性的数字化掩模板矩阵分别进行编码，再重复步骤S3和S4即获得两种模式的显微图像Gas1和Gas2，并利用公式
Figure BDA0002536264150000021
进行计算，从而获得一种模式的差分相衬显微图像Gas12；
(3)重复步骤(2)，其中利用另外两个具有轴对称性的数字化掩模板矩阵分别进行编码，再重复步骤S3和S4即获得两种模式的显微图像G'as1和G'as2，并利用公式
Figure BDA0002536264150000022
进行计算，获得另一种模式的差分相衬显微图像G'as12；
以此类推，对于多对不同的数字化掩模板矩阵，将成对的具有轴对称性的数字化掩模板矩阵依次重复步骤(2)获得对应的一种模式的差分相衬显微图像，最终获得多种模式的差分相衬显微图像。
优选的，由结构光发生器产生K个空间分布不同的结构光依次照明样品，样品物光波经过一个包含物镜的光学显微成像系统形成一系列的傅里叶谱亮斑，并且一个结构光对应一个傅里叶谱亮斑；
利用相机拍摄得到K个傅里叶谱图像，并分别用谱图像矩阵A1、A2、…、Ak、…、AK表示傅里叶谱图像，每个谱图像矩阵大小为M×N，其中，k＝1,2,…,K，k和K为整数，表示结构光序号；M和N为整数，表示相机的像素数。
更进一步的，结构光发生器包括一个光源和一个空间光调制器，光源发出的均匀光束被空间光调制器生成空间分布不同的结构光，结构光的类型包括哈达玛基底结构光、傅里叶基底结构光以及随机分布结构光。
更进一步的，光学显微成像系统包括一个物镜、两个中继透镜和一个相机，并且第一个中继透镜的前焦面和物镜的后焦面重合，第一个中继透镜的后焦面和第二个中继透镜的前焦面重合，相机的光传感面和第二个中继透镜的后焦面重合。
更进一步的，在步骤S2中，傅里叶谱图像的编码过程如下：
S21、预先设计数字化掩模板矩阵B，其矩阵大小和谱图像矩阵相同，为M×N，B的矩阵元由0和1构成，掩模板中需要掩盖部分的矩阵元设置为0，不掩盖部分的矩阵元设置为1；
S22、对每个谱图像进行编码，获得K个不同的编码谱图像矩阵：
假设第k个谱图像矩阵Ak的矩阵元用akmn表示，掩模板矩阵B的矩阵元用bmn表示，编码谱图像矩阵用E1、E2、…、Ek、…、EK表示，且第k个编码谱图像矩阵Ek的矩阵元用ekmn表示；
然后将掩模板矩阵B和谱图像矩阵进行哈达玛乘积，将谱图像矩阵中部分元素的值设置为0，剩余元素的值设置为1：
ekmn＝akmnbmn
其中，m＝1,2,…,M和n＝1,2,…,N为整数，表示矩阵元序数；
在步骤S3中，第k个编码谱图像矩阵Ek的所有矩阵元之和表示为：
Figure BDA0002536264150000031
对K个编码谱图像矩阵的所有矩阵元积分求和得到的K个傅里叶谱积分值分别表示为：I1、I2、…、Ik、…、IK。
更进一步的，在步骤S4中，一种模式的显微图像的重建过程如下：
将第k个傅里叶谱积分值Ik看成一个单像素探测器在第k个结构光照明样品时探测到的光强值，然后采用单像素成像图像重建算法将K个傅里叶谱积分值重建成一幅数字图像，即获得一种模式的显微图像G。
更进一步的，单像素成像图像重建算法包括哈达玛单像素成像图像重建算法、傅里叶单像素成像图像重建算法，以及压缩感知单像素成像图像重建算法；
单像素成像图像重建算法根据结构光类型选取，当结构光为哈达玛基底结构光时，采用哈达玛单像素成像图像重建算法；当结构光为傅里叶基底结构光时，采用傅里叶单像素成像图像重建算法；当结构光为随机分布结构光，采用压缩感知单像素成像图像重建算法。
优选的，在步骤S5中，具有轴对称性的数字化掩模板矩阵具体是指：在两个数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2中，它们的数值为1的矩阵元是关于轴对称的；这两个数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2的对称轴线通过傅里叶谱亮斑中心。
更进一步的，多对具有轴对称性的数字化掩模板矩阵的设计，具体是：
基于一对具有轴对称性的数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2，通过改变轴对称性的轴线方向或掩模板矩阵元，从而形成多对具有轴对称性的数字化掩模板矩阵。
优选的，样品类型包括反射式样品和透射式样品，对于反射式样品，结构光通过显微成像系统的成像物镜照明样品；对于透射式样品，结构光通过一个聚光镜照明样品。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明多模式显微图像数值重建方法，通过对傅里叶频谱图像的数字编码，可以非常灵活地实现多种编码，也就可以非常灵活地通过数值重建获得多种不同模式下的显微图像，因此，无需更换不同的显微镜零部件和进行机械上的移动、调整，就可实现对同一个样品的同一个视场进行不同成像模式下显微成像观察，操作非常简单方便，操作效率能够大大提高。
(2)本发明多模式显微图像数值重建方法可以获得传统显微成像下难于获得的显微成像效果，如任意方向的环形差分相衬图像、数字化地调节显微图像的景深、对比度和分辨率，因此显微成像更灵活多样，适用范围更广。
附图说明
图1是本发明多模式显微图像数值重建方法的流程图。
图2为反射式多模式显微成像系统的示意图。
图3为反射样品的明场显微图像重建示意图。
图4为反射样品的暗场显微图像和环形编码明场显微图像的重建示意图。
图5为反射样品的圆形差分相衬显微图像重建示意图。
图6为在改变数字掩膜板中半圆的尺寸之后，反射样品的圆形差分相衬显微图像重建示意图。
图7为反射样品的环形差分相衬显微图像重建示意图。
图8为在改变数字掩膜板中半圆环的尺寸之后，反射样品的环形差分相衬显微图像重建示意图。
图9为透射式多模式显微成像系统的示意图。
图10为透射式样品的明场显微图像重建示意图。
图11为透射样品的暗场显微图像和环形编码明场显微图像的重建示意图。
图12为透射样品的圆形差分相衬显微图像重建示意图。
图13为在改变数字掩膜板中半圆的尺寸之后，透射样品的圆形差分相衬显微图像重建示意图。
图14为透射样品的环形差分相衬显微图像重建示意图。
图15为在改变数字掩膜板中半圆环的尺寸之后，透射样品的环形差分相衬显微图像重建示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
本实施例公开了一种多模式显微图像数值重建方法，如图1所示，步骤如下：
S1、由结构光发生器产生K个空间分布不同的结构光，利用这K个不同的结构光依次照明样品，并使用相机依次拍摄样品物光波的傅里叶谱亮斑，获取到K个数字化的傅里叶谱图像，并分别用谱图像矩阵A1、A2、…、Ak、…、AK表示傅里叶谱图像，每个谱图像矩阵大小为M×N，其中，k＝1,2,…,K，k和K为整数，表示结构光序号；M和N为整数，表示相机的像素数。
其中，结构光发生器包括一个光源和一个空间光调制器，光源发出的均匀光束被空间光调制器生成空间分布不同的结构光。光源例如可以是LED光源，空间光调制器例如可以是DMD数字微镜。
结构光的类型包括哈达玛基底结构光、傅里叶基底结构光以及随机分布结构光。所谓哈达玛基底结构光，就是空间分布为哈达玛(Hadamard)变换基底图案的结构光；所谓傅里叶基底结构光，就是空间分布为傅里叶(Fourier)变换基底图案的结构光；所谓随机分布结构光，就是空间分布随机的结构光。
样品类型包括反射式样品和透射式样品，反射式样品例如可以是集成电路芯片，透射式样品例如可以是洋葱表皮细胞。
样品物光波经过一个包含物镜的光学显微成像系统形成一系列的傅里叶谱亮斑，并且一个结构光对应一个傅里叶谱亮斑。这里，光学显微成像系统具体包括一个物镜、两个中继透镜和一个相机，并且第一个中继透镜的前焦面和物镜的后焦面重合，第一个中继透镜的后焦面和第二个中继透镜的前焦面重合，相机的光传感面和第二个中继透镜的后焦面重合。
在实际应用中，对于反射式样品，步骤S1可在反射式多模式显微成像系统(如图2)中进行，对于透射式样品，步骤S1可在透射式多模式显微成像系统(如图9)中进行，这两种系统的区别主要在于：在反射式多模式显微成像系统中，结构光通过显微成像系统的成像物镜照明反射式样品；而在透射式多模式显微成像系统中，结构光通过一个聚光镜照明透射式样品。
S2、对于每个傅里叶谱图像，利用数字化掩模板矩阵进行编码，得到对应的编码谱图像矩阵：
S21、预先设计数字化掩模板矩阵B，其矩阵大小和谱图像矩阵相同，为M×N，B的矩阵元由0和1构成，掩模板中需要掩盖部分的矩阵元设置为0，不掩盖部分的矩阵元设置为1；
S22、对每个谱图像进行编码，获得K个不同的编码谱图像矩阵：
假设第k个谱图像矩阵Ak的矩阵元用akmn表示，掩模板矩阵B的矩阵元用bmn表示，编码谱图像矩阵用E1、E2、…、Ek、…、EK表示，且第k个编码谱图像矩阵Ek的矩阵元用ekmn表示；
然后将掩模板矩阵B和谱图像矩阵进行哈达玛乘积，将谱图像矩阵中部分元素的值设置为0，剩余元素的值设置为1：
ekmn＝akmnbmn
其中，m＝1,2,…,M和n＝1,2,…,N为整数，表示矩阵元序数；
S3、对于K个编码谱图像矩阵，分别将每个编码谱图像矩阵的所有矩阵元进行积分求和，第k个编码谱图像矩阵Ek的所有矩阵元之和表示为：
Figure BDA0002536264150000071
积分求和得到K个傅里叶谱积分值，分别表示为：I1、I2、…、Ik、…、IK。
S4、将获得的K个傅里叶谱积分值进行图像重建，重建得到的一幅数字图像即为一种模式的显微图像，具体来说，将第k个傅里叶谱积分值Ik看成一个单像素探测器在第k个结构光照明样品时探测到的光强值，然后采用单像素成像图像重建算法将K个傅里叶谱积分值重建成一幅数字图像，即获得一种模式的显微图像G。
其中，单像素成像图像重建算法包括哈达玛单像素成像图像重建算法、傅里叶单像素成像图像重建算法，以及压缩感知单像素成像图像重建算法，可根据结构光类型选取合适的重建算法，例如，当结构光为哈达玛基底结构光时，采用哈达玛单像素成像图像重建算法；当结构光为傅里叶基底结构光时，采用傅里叶单像素成像图像重建算法；当结构光为随机分布结构光，采用压缩感知单像素成像图像重建算法。
S5、不同模式显微图像的数值重建：
(1)重复步骤S2，其中利用另一个不同的数字化掩膜板矩阵对每个傅里叶谱图像进行编码，再重复步骤S3和S4即获得另一种模式的显微图像；
以此类推，对于多个不同数字化掩膜板矩阵中的每个数字化掩膜板矩阵，依次重复步骤S2～S4获得对应模式的显微图像，最终获得多种模式的显微图像。
(2)重复步骤S2，其中利用两个具有轴对称性的数字化掩模板矩阵(两个具有轴对称性的数字化掩模板矩阵即成对)分别进行编码，再重复步骤S3和S4即获得两种模式的显微图像Gas1和Gas2，并利用公式
Figure BDA0002536264150000081
进行计算，从而获得一种模式的差分相衬显微图像Gas12。
具有轴对称性的数字化掩模板矩阵具体是指：在两个数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2中，它们的数值为1的矩阵元是关于轴对称的，可参见图5中的(b1)图和(b2)图，并且这两个掩膜版矩阵是由同一个矩阵按照这个轴对称性生成。此外，两个数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2中数值为1的矩阵元的对称轴线通过傅里叶谱亮斑中心。
(3)重复步骤(2)，其中利用另外两个具有轴对称性的数字化掩模板矩阵分别进行编码，再重复步骤S3和S4即获得两种模式的显微图像G'as1和G'as2，并利用公式
Figure BDA0002536264150000082
进行计算，获得另一种模式的差分相衬显微图像G'as12；
以此类推，对于多对不同的数字化掩模板矩阵，将成对的具有轴对称性的数字化掩模板矩阵依次重复步骤(2)获得对应的一种模式的差分相衬显微图像，最终获得多种模式的差分相衬显微图像。
其中，可以基于一对具有轴对称性的数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2，通过改变轴对称性的轴线方向或掩模板矩阵元，从而设计出多对具有轴对称性的数字化掩模板矩阵。
为了验证上述多模式显微图像数值重建方法，本实施例还分别对反射式样品和透射式样品进行实验：
(1)反射式样品的多模式显微图像数值重建：
如图2所示，在反射式多模式显微成像系统中进行步骤S1。其中，被测样品7为一集成电路芯片。组成结构光发生器的光源为一LED光源1，空间光调制器为一DMD数字微镜3。反射式多模式显微成像系统中各元器件设置在相应的光传播路径上。
LED光源1发出的光束经反射镜2后照射到DMD数字微镜3(像素数：1920×1080，像元尺寸：10.8μm)上，生成一系列不同的哈达码基底图案结构光，用于照明样品。该结构光依次通过管镜4(焦距200mm)、分光镜5和物镜6(放大倍数：20倍，数值孔径：0.4，fOL是指物镜6的焦距)后照射样品7上，样品7反射的光经物镜6收集，然后通过中继透镜8(焦距f为150mm)和中继透镜9(焦距f为150mm)构成的4f中继系统，最后被设置在透镜9的后焦面上的相机10(像素数：2736×2192，像元尺寸：4.54μm)记录，得到一幅的圆形傅里叶频谱亮斑。一个结构光对应一个亮斑，用相机10依次拍摄样品在不同的结构光照明下产生的一系列数字化的圆形傅里叶谱图像(用谱图像矩阵A1、A2、…、Ak、…、AK表示)。实验中，为了减少存储空间，还将相机记录的图像下采样2倍，因此，实际保存的傅里叶谱图像的像素数是1368×1096。
如图3所示为反射样品的明场显微图像重建过程。在图3中，(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。为了重建获得明场显微图像，设计一个数字化圆形掩模板矩阵B，矩阵B大小和相机10记录的傅里叶谱图像矩阵Ak相同，数字化圆形掩模板B如(b1)图所示，圆的半径为400像素，圆内的矩阵元的值为1，圆外的矩阵元的值为0。将数字化掩模板矩阵B与相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak进行哈达玛乘积，也就是相同序数的矩阵元相乘，获得如(c1)图所示编码谱图像Ek。对编码后的傅里叶谱图像矩阵Ek的所有矩阵元素求和，得到1个傅里叶谱积分值Ik。
采用上述相同的方法处理相机拍摄到的所有傅里叶谱图像，可以获得K个傅里叶谱积分值：I1、I2、…、Ik、…、IK。每一个傅里叶谱积分值相当于使用一个圆形单像素探测器，在每一个结构光照明样品时所探测到的光强值。根据这组傅里叶谱积分值，采用傅里叶单像素成像图像重建方法，就可以得到一个明场显微图像G1，如图3中的(d1)图所示。图3中的(e1)图为(d1)图中白色小框部分的放大图。
改变数字化圆形掩模板矩阵B中圆的半径，如图3中的(b2)图和(b3)图所示，采用相同的方法得到编码后的傅里叶谱图像矩阵，如图3中的(c2)图和(c3)图，同理可以获得不同景深和对比度的明场显微图像，如图3中的(d2)、(d3)图所示。图3中的(e2)图为(d2)图中白色小框部分的放大图，(e3)图为(d3)图中白色小框部分的放大图。这些不同半径的圆形掩模板矩阵得到的显微图像，如图3中的(d1)图、(d2)图和(d3)图所示，这些图具有不同的景深、对比度和成像分辨率，因此，通过改变圆形掩模板矩阵的圆形半径，就可以数字化调节明场显微图像的景深、对比度和成像分辨率。
图4为反射样品的暗场显微图像和环形编码明场显微图像的重建过程。在图4中，(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。为了获得暗场显微图像，设计一个数字化环形掩模板矩阵B，矩阵B大小和相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak相同，如图4中的(b1)图所示，圆环内的傅里叶谱不包含所有照明光束产生的零级衍射谱，圆环的内径为430像素，圆环的宽度为10像素。圆环的矩阵元的值为1，圆外的矩阵元的值为0。采用与上述明场显微成像相同的图像重建步骤，得到的一个编码后的傅里叶谱图像矩阵Ek，如图4中的(c1)图所示，得到的暗场显微图像如图4中的(d1)图所示。图4中的(e1)图为(d1)图中白色小框部分的放大图。
设计一个数字化环形掩模板矩阵，圆环的傅里叶谱包含部分照明光束产生的零级衍射谱。如图4中的(b2)图和(b3)图所示，为两种不同半径的环形掩模板矩阵。采用上述相同的图像重建步骤，得到的编码后的傅里叶谱图像矩阵如图4中的(c2)图和(c3)图所示，获得的具有不同分辨率的明场显微图像如图4中的(d2)图和(d3)图所示。该明场显微图像相当于环形照明下的传统明场显微图像。图4中的(e2)图为(d2)图中白色小框部分的放大图，(e3)图为(d3)图中白色小框部分的放大图。
图5为反射样品的圆形差分相衬显微图像重建过程。在图5中，(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。为了获得圆形差分相衬显微图像，我们设计两个数字化半圆形掩模板矩阵Bas1和Bas2，矩阵大小和相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak相同，如图5中的(b1)图和(b2)图所示，半圆的半径为100像素，这两个半圆具有轴对称性。半圆内的矩阵元的值为1，其它的矩元的值为0。采用上述相同的图像重建步骤，得到的两个编码后的傅里叶谱图像矩阵，如图5中的(c1)图和(c2)图所示，并可获得两幅显微图像Gas1和Gas2，再利用公式
Figure BDA0002536264150000101
进行图像重建，获得差分相衬显微图像Gas12，如图5中的(d1)图所示。
改变数字化半圆形掩模板矩阵中的对称轴的角度，如图5中的(b3)图和(b4)图、(b5)图和(b6)图、(b7)图和(b8)图所示，采用上述相同的方法，可以获得编码谱图像矩阵，如图5中的(c3)～(c8)图所示，获得不同角度的圆形差分相衬显微图像，如图5中的(d2)图、(d3)图和(d4)图所示。从图5中的(d1)图、(d2)图、(d3)图和(d4)图可以看出，改变数字化半圆形掩模板矩阵的对称轴的角度，重建的图像是有差异的，例如图中箭头所指示的相同位置，其图像灰度值是不同的。
图6为在改变数字掩膜板中半圆的尺寸之后，反射样品的圆形差分相衬显微图像重建过程。在图6中，(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。
改变数字化半圆形掩模板矩阵Bas1和Bas2中的半圆形的半径，如图6中的(b1)图和(b2)图、(b3)图和(b4)图、(b5)图和(b6)图所示，采用上述相同的方法，可以获得编码谱图像矩阵，如图6中的(c1)～(c6)图所示，获得不同景深、对比度和分辨率的圆形差分相衬显微图像，如图6中的(d1)图、(d2)图和(d3)图所示。
图7为反射样品的环形差分相衬显微图像重建过程。在图7中，(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。为了获得环形差分相衬显微图像，设计两个数字化半圆环掩模板矩阵Bas1和Bas2，矩阵大小和相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak相同，如图7中的(b1)图和(b2)图所示，半圆环的内径为300像素，宽度为10像素，这两个半圆环具有轴对称性。半圆环内的矩阵元的值为1，其它的矩阵元的值为0。采用和半圆形差分相衬相同的数据处理步骤，可获得编码谱图像矩阵，如图7中的(c1)和(c2)图所示，获得环形差分相衬显微图像Gas12，如图7中的(d1)图所示。
改变数字化半圆环形掩模板矩阵Bas1和Bas2中的对称轴的角度，如图7中的(b3)图和(b4)图、(b5)图和(b6)图、(b7)图和(b8)图所示，采用上述相同的方法步骤，可以获得编码谱图像矩阵，如图7中的(c3)～(c8)图所示，获得不同角度的环形差分相衬显微图像，如图7中的(d2)图、(d3)图和(d4)图所示。从图7中的(d1)图、(d2)图、(d3)图和(d4)图可以看出，改变数字化半圆环形掩模板矩阵的对称轴的角度，重建的图像是有差异的，例如图中箭头所指示的相同位置，其图像灰度值是不同的。
图8为在改变数字掩膜板中半圆环的尺寸之后，反射样品的环形差分相衬显微图像重建过程。在图8中，(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。设计的两个数字化半圆环形掩模板矩阵Bas1和Bas2，如图8中的(b1)图和(b2)图所示。改变数字化半圆环形掩模板矩阵Bas1和Bas2中的环形半径，如图8中的(b3)图和(b4)图、(b5)图和(b6)图所示。采用和半圆形差分相衬相同的方法，可以获得编码谱图像矩阵，如图8中的(c1)～(c6)图所示，获得不同景深、对比度和分辨率的环形差分相衬显微图像，如图8中的(d1)图、(d2)图和(d3)图所示。
(2)透射式样品的多模式显微图像数值重建：
如图9所示，在透射式多模式显微成像系统中进行步骤S1。其中，被测样品16为一洋葱表皮细胞。透射式多模式显微成像系统中各元器件设置在相应的光传播路径上。
LED光源11发出的光束经反射镜12后照射到DMD数字微镜13(像素数：1024×768，像元尺寸：13.6μm)上，DMD上生成一系列不同的傅里叶基底图案，用于产生照明结构光，该结构光通过管镜14(焦距200mm)、聚光镜15(放大倍数：10倍，数值孔径：0.25)后照射样品16上，光线穿过样品16后经物镜17(放大倍数：20倍，数值孔径0.4，fOL是指物镜17的焦距)收集，然后通过中继透镜18(焦距f1为100mm)和中继透镜19(焦距f2为150mm)构成的4f中继系统，最后被设置在透镜19后焦面上的相机20(参数与反射式样品数值重建使用的相机相同)记录，得到一幅傅里叶频谱亮斑。一个结构光对应一个傅里叶频谱亮斑，用相机依次拍摄该系列傅里叶频谱亮斑，获得一系列数字化的傅里叶谱图像(用A1、A2、…、Ak、…、AK表示)。
图10为透射式样品的明场显微图像重建过程。在图10中，(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。为了获得明场显微图像，设计一个数字化圆形掩模板矩阵B，矩阵B大小和相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak相同，圆的半径为380像素，圆内的矩阵元的值为1，圆外的矩阵元的值为0，如图10中的(b1)图所示。将数字化掩模板矩阵B与相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak进行哈达玛乘积，获得编码后的傅里叶谱图像Ek，如图10中的(c1)图所示。对编码后的傅里叶谱图像矩阵Ek的所有矩阵元素求和，得到1个傅里叶谱积分值Ik。采用相同的方法处理相机拍摄到的所有傅里叶谱图像，可获得K个傅里叶谱积分值：I1、I2、…、Ik、…、IK。上述每一个傅里叶谱积分值相当于使用一个圆形单像素探测器，在每一个结构光照明样品时，探测到的光强值。根据这组傅里叶谱积分值，采用单像素重建方法，就可得到明场图像G，如图10中的(d1)图所示。图10中的(e1)图为(d1)图中白色小框部分的放大图。
改变数字化圆形掩模板矩阵B中圆的半径，如图10中的(b2)图和(b3)图所示。采用相同的方法，可以获得编码谱图像矩阵，如图10中的(c2)和(c3)图所示，获得数字化调节景深、对比度和分辨率的明场显微图像，如图10中的(d2)图和(d3)图所示。图10中的(e2)图为(d2)图中白色小框部分的放大图，(e3)图为(d3)图中白色小框部分的放大图。
图11为透射样品的暗场显微图像和环形编码明场显微图像的重建过程。图11中的(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。为了获得暗场显微图像，设计一个数字化环形掩模板矩阵B，矩阵B大小和相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak相同，如图11中的(b1)图所示，圆环的内径为420像素，圆环的宽度为10像素。圆环的矩阵元的值为1，圆环外的矩阵元的值为0。圆环内的傅里叶谱不包含所有照明光束产生的零级衍射谱。将数字化掩模板矩阵B与相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak进行哈达玛乘积，获得编码后的傅里叶谱图像Ek，如图11中的(c1)图所示。采用与明场成像相同的数据处理步骤，就可得到暗场显微图像，如图11中的(d1)图所示。图11中的(e1)图为(d1)图中白色小框部分的放大图。
改变数字化环形掩模板矩阵B中圆环的半径，如图11中的(b2)图和(b3)图所示，采用相同的方法，可以获得编码谱图像矩阵，如图11中的(c2)和(c3)图所示，获得不同景深、对比度和分辨率的明场显微图像，如图11中的(d2)图11和(d3)图所示。图11中的(e2)图为(d2)图中白色小框部分的放大图，(e3)图为(d3)图中白色小框部分的放大图。
图12为透射样品的圆形差分相衬显微图像重建过程。图12中的(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。为了获得圆形差分相衬显微图像，设计两个数字化半圆形掩模板矩阵Bas1和Bas2，矩阵大小和相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak相同，如图12中的(b1)图和(b2)图所示，半圆的半径为410像素，这两个半圆具有轴对称性。半圆内的矩阵元的值为1，其他的矩阵元的值为0。将数字化掩模板矩阵与相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak进行哈达玛乘积，获得两组编码后的傅里叶谱图像，如图12中的(c1)图和(c2)图所示。对每一幅编码后的傅里叶谱图像矩阵的所有矩阵元求和，得到两组傅里叶谱积分值。上述每一组傅里叶谱积分值相当于使用一个半圆形单像素探测器，在每一个结构光照明样品时，探测到的光强值。根据这每两组傅里叶谱积分值，采用单像素重建方法，可得到两幅图像：Gas1、Gas2，再利用公式
Figure BDA0002536264150000131
进行图像重建，获得差分相衬显微图像Gas12，如图12中的(d1)图所示。
改变数字化半圆形掩模板矩阵Bas1和Bas2中对称轴的角度，如图12中的(b3)～(b8)图所示。采用相同的方法，可以获得编码谱图像矩阵，如图12中的(c2)～(c4)图所示，获得不同角度的圆形差分相衬显微图像，如图12中的(d2)～(d4)图所示。从图12中的(d1)图、(d2)图、(d3)图和(d4)图可以看出，改变数字化半圆形掩模板矩阵的对称轴的角度，重建的图像是有差异的，例如图中箭头所指示的相同位置，其图像灰度值是不同的。
图13为在改变数字掩膜板中半圆的尺寸之后，透射样品的圆形差分相衬显微图像重建过程。图13中的(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。改变数字化半圆形掩模板矩阵Bas1和Bas2中的半圆的半径，如图13中的(b1)～(b6)图所示，然后采用相同的方法，可以获得编码谱图像矩阵，如图13中的(c1)～(c6)图所示，获得不同景深和对比度的圆形差分相衬显微图像，如图13中的(d1)～(d3)图所示。
图14为透射样品的环形差分相衬显微图像重建过程。图14中的(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。为了获得环形差分相衬显微图像，设计两个数字化半圆环掩模板矩阵Bas1和Bas2，矩阵大小和相机记录的傅里叶谱图像矩阵Ak相同，如图14中的(b1)和(b2)图所示，半圆环的内径为290像素，宽度为10像素，这两个半圆环具有轴对称性。半圆环内的矩阵元的值为1，其它的矩阵元的值为0。编码后的傅里叶谱图像矩阵如图14中的(c1)和(c2)图所示，采用与上述半圆形差分相衬显微图像重建相同的处理步骤，就可获得环形差分相衬显微图像Gas12，如图14中的(d1)图所示。
改变数字化半圆环形掩模板矩阵Bas1和Bas2中的对称轴的角度，如图14中的(b3)～(b8)图所示。采用相同的方法，可以获得编码谱图像矩阵，如图14中的(c3)～(c8)图所示，获得不同角度的环形差分相衬显微图像，如图14中的(d2)～(d4)图所示。从图14中的(d1)图、(d2)图、(d3)图和(d4)图可以看出，改变数字化半圆环形掩模板矩阵的对称轴的角度，重建的图像是有差异的，例如图中箭头所指示的相同位置，其图像灰度值是不同的。
图15为在改变数字掩膜板中半圆环的尺寸之后，透射样品的环形差分相衬显微图像重建过程。图15中的(a)图为其中一个结构光照明样品时，相机拍摄到的一个傅里叶谱图像Ak。设计的两个数字化半圆环形掩模板矩阵Bas1和Bas2，如图15中的(b1)图和(b2)图所示。改变数字化半圆环形掩模板矩阵Bas1和Bas2中的环形半径，如图15中的(b1)～(b6)图所示，采用上述相同的步骤，可以获得编码谱图像矩阵，如图15中的(c1)～(c6)图所示，获得不同景深、对比度和分辨率的环形差分相衬显微图像，如图15中的(d1)～(d3)图所示。
本实施例方法和传统显微成像在以下几方面显著不同：1)光源照明样品的方式不同。传统显微成像的光源光束均匀照明样品，而本实施例方法采用空间分布不均匀的结构光束照明样品；2)采集图像信号的方式和传统显微成像不同。传统显微成像在样品物光波的像面直接采集图像，而本实施例方法在样品物光波的傅里叶频谱面采集图像；3)获取图像的方式不同。传统显微成像直接获取显微图像，而本实施例方法利用采集到的傅里叶频谱图像，采用图像重建算法，通过数值计算的方法获取图像；4)为了观察同一个样品的明场、暗场、环形照明以及差分相衬等多模式显微图像，传统显微成像，通常需要更换不同的显微镜零部件和进行机械上的移动、调整，甚至需要在不同的显微镜下进行，而本实施例方法只需对采集到的傅里叶频谱图像进行数字编码，通过对不同的编码图像进行数值重建，就可以获得对同一个样品同一视场的明场、暗场、环形照明以及差分相衬等不同模式的显微图像。因此，本实施例方法具有非常重要的应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，步骤如下：
S1、利用K个不同的结构光照明样品，依次拍摄样品物光波的傅里叶谱亮斑，获取到K个数字化的傅里叶谱图像；
S2、对于每个傅里叶谱图像，利用数字化掩模板矩阵进行编码，得到对应的编码谱图像矩阵；
S3、对于K个编码谱图像矩阵，分别将每个编码谱图像矩阵的所有矩阵元进行积分求和，得到K个傅里叶谱积分值；
S4、将获得的K个傅里叶谱积分值进行图像重建，重建得到的一幅数字图像即为一种模式的显微图像；
S5、不同模式显微图像的数值重建：
(1)重复步骤S2，其中利用另一个不同的数字化掩模 板矩阵对每个傅里叶谱图像进行编码，再重复步骤S3和S4即获得另一种模式的显微图像；
以此类推，对于多个不同数字化掩模 板矩阵中的每个数字化掩模 板矩阵，依次重复步骤S2～S4获得对应模式的显微图像，最终获得多种模式的显微图像；
(2)重复步骤S2，其中利用两个具有轴对称性的数字化掩模板矩阵分别进行编码，再重复步骤S3和S4即获得两种模式的显微图像Gas1和Gas2，并利用公式
Figure FDA0002536264140000011
进行计算，从而获得一种模式的差分相衬显微图像Gas12；
(3)重复步骤(2)，其中利用另外两个具有轴对称性的数字化掩模板矩阵分别进行编码，再重复步骤S3和S4即获得两种模式的显微图像G'as1和G'as2，并利用公式
Figure FDA0002536264140000012
进行计算，获得另一种模式的差分相衬显微图像G'as12；
以此类推，对于多对不同的数字化掩模板矩阵，将成对的具有轴对称性的数字化掩模板矩阵依次重复步骤(2)获得对应的一种模式的差分相衬显微图像，最终获得多种模式的差分相衬显微图像。
2.根据权利要求1所述的多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，在步骤S1中，由结构光发生器产生K个空间分布不同的结构光依次照明样品，样品物光波经过一个包含物镜的光学显微成像系统形成一系列的傅里叶谱亮斑，并且一个结构光对应一个傅里叶谱亮斑；
利用相机拍摄得到K个傅里叶谱图像，并分别用谱图像矩阵A1、A2、…、Ak、…、AK表示傅里叶谱图像，每个谱图像矩阵大小为M×N，其中，k＝1,2,…,K，k和K为整数，表示结构光序号；M和N为整数，表示相机的像素数。
3.根据权利要求2所述的多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，结构光发生器包括一个光源和一个空间光调制器，光源发出的均匀光束被空间光调制器生成空间分布不同的结构光，结构光的类型包括哈达玛基底结构光、傅里叶基底结构光以及随机分布结构光。
4.根据权利要求2所述的一种多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，光学显微成像系统包括一个物镜、两个中继透镜和一个相机，并且第一个中继透镜的前焦面和物镜的后焦面重合，第一个中继透镜的后焦面和第二个中继透镜的前焦面重合，相机的光传感面和第二个中继透镜的后焦面重合。
5.根据权利要求2所述的多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，在步骤S2中，傅里叶谱图像的编码过程如下：
S21、预先设计数字化掩模板矩阵B，其矩阵大小和谱图像矩阵相同，为M×N，B的矩阵元由0和1构成，掩模板中需要掩盖部分的矩阵元设置为0，不掩盖部分的矩阵元设置为1；
S22、对每个谱图像进行编码，获得K个不同的编码谱图像矩阵：
假设第k个谱图像矩阵Ak的矩阵元用akmn表示，掩模板矩阵B的矩阵元用bmn表示，编码谱图像矩阵用E1、E2、…、Ek、…、EK表示，且第k个编码谱图像矩阵Ek的矩阵元用ekmn表示；
然后将掩模板矩阵B和谱图像矩阵进行哈达玛乘积，将谱图像矩阵中部分元素的值设置为0，剩余元素的值设置为1：
ekmn＝akmnbmn
其中，m＝1,2,…,M和n＝1,2,…,N为整数，表示矩阵元序数；
在步骤S3中，第k个编码谱图像矩阵Ek的所有矩阵元之和表示为：
Figure FDA0002536264140000031
对K个编码谱图像矩阵的所有矩阵元积分求和得到的K个傅里叶谱积分值分别表示为：I1、I2、…、Ik、…、IK。
6.根据权利要求5所述的多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，在步骤S4中，一种模式的显微图像的重建过程如下：
将第k个傅里叶谱积分值Ik看成一个单像素探测器在第k个结构光照明样品时探测到的光强值，然后采用单像素成像图像重建算法将K个傅里叶谱积分值重建成一幅数字图像，即获得一种模式的显微图像G。
7.根据权利要求6所述的一种多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，单像素成像图像重建算法包括哈达玛单像素成像图像重建算法、傅里叶单像素成像图像重建算法，以及压缩感知单像素成像图像重建算法；
单像素成像图像重建算法根据结构光类型选取，当结构光为哈达玛基底结构光时，采用哈达玛单像素成像图像重建算法；当结构光为傅里叶基底结构光时，采用傅里叶单像素成像图像重建算法；当结构光为随机分布结构光，采用压缩感知单像素成像图像重建算法。
8.根据权利要求1所述的一种多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，在步骤S5中，具有轴对称性的数字化掩模板矩阵具体是指：在两个数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2中，它们的数值为1的矩阵元是关于轴对称的；这两个数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2的对称轴线通过傅里叶谱亮斑中心。
9.根据权利要求8所述的一种多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，多对具有轴对称性的数字化掩模板矩阵的设计，具体是：
基于一对具有轴对称性的数字化掩模板矩阵Bas1和Bas2，通过改变轴对称性的轴线方向或掩模板矩阵元，从而形成多对具有轴对称性的数字化掩模板矩阵。
10.根据权利要求1所述的一种多模式显微图像数值重建方法，其特征在于，样品类型包括反射式样品和透射式样品，对于反射式样品，结构光通过显微成像系统的成像物镜照明样品；对于透射式样品，结构光通过一个聚光镜照明样品。
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