CN113039471B - 显微的透射光对比方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种显微的透射光对比方法，其中：至少部分地通过非对称的第一照明光瞳来照明样本；至少部分地通过非对称的第一探测光瞳对所述样本成像，以便产生第一部分图像；其中，所述第一照明光瞳和所述第一探测光瞳在朝向垂直于光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置；至少部分地通过非对称的第二照明光瞳来照明所述样本；至少部分地通过非对称的第二探测光瞳对所述样本成像，以便产生第二部分图像；其中，所述第二照明光瞳和所述第二探测光瞳在朝向垂直于所述光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置；由所述第一部分图像和所述第二部分图像产生所述样本的图像。

Description

显微的透射光对比方法

技术领域

本发明涉及一种显微的透射光对比方法和一种用于实施显微的透射光对比方法的机构。

背景技术

在光学显微领域已知各种不同的旨在特别是在对生物样本成像时改善图像对比度的相衬方法。最知名的此类方法是也可在传统的透射光显微镜中使用的根据Zernike的相位对比和根据Nomarski的微分干涉对比。

传统的根据Zernike的相位对比法规定，照明侧的光环与位于物镜光瞳中的相环重叠。特别是当出现样本引发的光瞳像差时，这种重叠的必要性是不利的。因而例如在充满液体的样本容器中产生了小的横截面，其比如形成了微量滴定板的各个凹坑，由于液体的表面张力，形成了明显的液体弯月面，该液体弯月面在透过样本时导致照明光瞳的偏移。在这种情况下，光环与相环不会持久地重叠。

在根据Nomarski的微分干涉对比法(简称DIC)中，照明光被Wollaston棱镜分成两个彼此相干的但在样本中侧向地相互错开的部分光束。这两个部分光束在物镜侧通过另一Wollaston棱镜而重叠和干涉。在DIC方法中两个部分光束由偏光引起的这种分开造成如下结果：比如因通常由塑料制成的样本器皿的底部而出现的双重折射，由于由此带来的对偏光的影响，导致对比度明显恶化。由于在制造通常的塑料样本器皿中无法避免这种并非所愿的双重折射，根据Nomarski的DIC方法例如在塑料皮氏培养皿或塑料微量滴定板中无法应用。

此外，计算机实施的透射光对比方法的领域正在迅速扩大，例如在L.Tian&L.Waller,Opt.Exp.23(2015),11394中描述的称为微分相位对比的方法，在M.Teague,J.Opt.Soc.Am.73(1983),1434中描述的称为Transport-of-Intensity-Imaging(强度传递成像)的方法，在H.Lu等人的Opt.Exp.24(2016),23545中描述的称为光瞳调制对比的方法。这些方法基于的是，通过了解光学传递函数—例如参见Born&Wolf,Principles OfOptics,7th ed.ISBN 978-0-521-6422-4,10.6.3.“Imaging with partially coherentquasi-monochromatic illumination(部分相干准单色照明成像)”—或其线性近似—也称为Weak Object Transfer Function(弱对象传递函数)并且例如在N.Streibl,J.Opt.Soc.Am.A2(1985),121中描述过，可以实现定量地重构样本的相位信息和吸收信息。这既可以按两个维度进行，又可以按三个维度进行。这些方法的缺点是，它们需要照明孔径与探测孔径的一定的比例。因而在微分相位对比中，照明孔径必须大于或等于探测孔径。在光瞳调制对比中，照明孔径必须小于或等于探测孔径。

然而，前述的计算机实施的透射光对比方法具有一些缺点。因而，如果相位传递函数的量值在空间频率低时不应小至消失，则微分相位对比需要通过透射光照明系统对物镜光瞳进行完全照明。因此，尤其在使用大孔径的浸没物镜时，这种方法不能以合理的代价广泛地应用在组装的显微镜中，因为在这里，完全照明物镜光瞳牵涉到高昂的成本。对于Transport-of-Intensity-Imaging(强度传递成像)，必须摄取在样本的不同散焦情况下的图像。无论这些散焦现在通过经典的聚焦驱动来实现，即通过载物台或物镜旋座的移动来实现，通过可聚焦的透镜例如基于液体的透镜、波前操控器例如空间光调制器—也称为“Spatial Light Modulator(空间光调制器)”(SLM)—或者可变形的反射镜来实现，必须在时间上前后相继地摄取多个图像。这降低了图像摄取率，并且在动态样本的情况下可能会产生图像伪影。虽然可考虑采用多个不同地聚焦的摄像机来实现，但很麻烦，并且不能充分利用组装的显微镜的整个放大范围。光瞳调制对比需要相干的光源，该光源成本高昂，并且需要采取额外的安全措施来保证激光器安全。此外，由于相干的照明，减小了可实现的分辨率。

此外，对于现有技术，参见Z.Phillips等人的PLoS ONE 12(2017),e0171228；W.Lee等人的Opt.Exp.25(2017),8398，其中公开了一种用于微分相位对比的方法，在该方法中同时摄取多个图像。这通过对照明光瞳的光谱编码来实现。但该方法同样具有结合微分相位对比所提到的缺点。

发明内容

本发明的目的是，提出一种显微的透射光对比方法，其可在组装的显微镜的可达到的放大和孔径范围内使用。此外，本发明的目的是，提出一种可用于实施相应的显微的透射光对比方法的机构。

该目的通过以下描述的方法和机构来实现。

在根据本发明的显微的透射光对比方法中，至少部分地通过非对称的第一照明光瞳来照明样本，并且至少部分地通过非对称的第一探测光瞳对该样本成像，以便产生第一部分图像，其中，第一照明光瞳和第一探测光瞳在朝向垂直于光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置，从而至少角度空间的第一区域位于明场中，而角度空间的不同于第一区域的第二区域位于暗场中。此外，至少部分地通过非对称的第二照明光瞳来照明样本，并且至少部分地通过非对称的第二探测光瞳对样本成像，以便产生第二部分图像，其中，第二照明光瞳和第二探测光瞳在朝向垂直于光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置，从而至少角度空间的第三区域位于明场中，而角度空间的不同于第三区域的第四区域位于暗场中。由第一部分图像和第二部分图像产生样本的图像。

在本申请中，角度空间是指两个部分图像的位置频谱的空间，该位置频谱尤其在平面波光学中也称为角谱。因此，角度空间形成了两个部分图像的傅里叶变换的空间。

在本申请中，术语“非对称”是以指配给两个探测光瞳的物镜的光学轴线为参照的，也就是说，称为“非对称”的光瞳并非如同否则在透射光显微术中常见的那样参照指配给两个探测光瞳的物镜的光学轴线旋转对称。例如，两个照明光瞳和两个探测光瞳分别具有圆扇形、圆弧段或圆弧的形状。两个照明光瞳和两个探测光瞳彼此相对的相应转动在下面也称为极转动。在此，术语“极”是以极坐标系统为参照的，其极方向通过物镜的光学轴线来规定。

从物镜观察，一方面，第一照明光瞳和第一探测光瞳分别部分地搭叠，另一方面，第二照明光瞳和第二探测光瞳分别部分地搭叠。由此实现，第一或第二部分图像分别具有明场部分即明亮的背景和暗场部分即灰暗的背景。这些照明光瞳因而实现了对样本的非对称照明。

第一或第二部分图像的明场部分对样本的对比度强的彩色细节—所谓的幅度对象或结构—予以成像。而在暗场部分中，分别对样本的透明的或几乎透明的细节—所谓的相位对象或结构—予以成像，这些细节仅改变透过它们的光线的相位。相应地，暗场部分保证了该方法的相位敏感性。通过第一和第二部分图像的明场部分和暗场部分的组合，在由这些部分图像产生的图像中既可以显示样本的相位信息，又可以显示其幅度信息。通过相位信息和幅度信息的组合，可以产生样本的对比度腔的图像。由于样本的图像仿佛由多个部分图像组成，因而无需照明整个物镜光瞳，所以根据本发明的方法既可以采用大孔径的物镜，又可以采用小孔径的物镜。特别地，照明孔径是大于还是小于物镜孔径，这在根据本发明的方法中是无所谓的。这尤其在组装的具有可更换物镜的显微镜中是有利的。此外，根据本发明的方法只采用一个唯一的传感器部件就能实现，从而可以充分利用组装显微镜的整个放大范围。

不言而喻，在根据本发明的方法中也可以产生多于两个的部分图像，由这些部分图像产生样本的图像。在此给每个其它的部分图像都指配另一非对称的照明光瞳和另一非对称的探测光瞳，这些光瞳相互间适当布置，使得角度空间的至少一个区域位于明场中，并且角度空间的不同于该区域的另一个区域位于暗场中。

在一种有利的改进中，至少部分地利用透过第一照明光瞳的第一照明光来照明样本，并且至少部分地利用透过第二照明光瞳的第二照明光来照明样本，其中，第一照明光和第二照明光具有不同的光谱组成。优选地，第一部分图像和第二部分图像同时摄取。这防止尤其在样本中摄取动态过程时因时间错开地摄取第一部分图像和第二部分图像而产生图像伪影。在这种情况下，人们还谈到了对相应照明光瞳的光谱编码。这允许通过两个照明光瞳将两个部分图像中的角空间区域彼此分开。这种分开例如可以通过在CCD或CMOS-摄像机之前的拜耳阵列来实现，或者通过在多个单色CCD或CMOS摄像机之前的光谱分离棱镜总成来实现，但也可以通过使用二色性分光板来实现。

在另一有利的改进中，针对第一部分图像和/或第二部分图像，对采样即采样率进行调整，减小噪声，或者进行光谱重新划分。在进行用于产生样本图像的后续处理之前，可以将各种不同的图像处理操作应用于第一部分图像和/或第二部分图像，以便改善两个部分图像和由此产生的样本图像的图像质量。

优选地，通过数字地由第一部分图像和第二部分图像重构样本的复杂的传递函数，来产生样本的图像。样本的复杂的传递函数也称为复杂的散射函数，包括样本的相位信息和幅度信息。该传递函数可以借助用于成像的机构的相位和幅度传递函数，采用在现有技术中已知的方法数字地计算，例如借助维纳滤波器，或者借助比如在M.Chen等人的Biomed.Opt.Exp.7(2016),3940中描述的迭代方法。

在一种有利的改进中，针对样本的不同层，重复用于产生图像的步骤，并且由如此产生的多个图像产生图像堆栈。

在另一有利的改进中，检测第一照明光瞳的照明轮廓和/或第二照明光瞳的照明轮廓。这允许通过照明轮廓给定值与照明轮廓的所检测的实际值的比较，并且通过调整第一照明光瞳和/或第二照明光瞳，来适配性地调整非对称的照明，特别是角谱。

在一种有利的改进中，在传输经过样本之后，产生第一照明光瞳和/或第二照明光瞳的图像，并且借助于该图像来动态地计算相位和幅度传递函数。动态地产生的相位和幅度传递函数—也叫光学传递函数—尤其可以用作用来重构样本的复杂传递函数的基础。相比于采用预定的相位和幅度传递函数，采用动态地产生的相位和幅度传递函数具有如下优点：重构独立于用来成像的光学系统的短期变化。产生动态的传递函数也可以包括对暗场中的照明光谱进行外推或建模，因为该暗场不能为了例如通过伯特兰透镜系统测量照明光谱而被成像。

在另一有利的改进中，把第一照明光瞳、第二照明光瞳、第一探测光瞳和/或第二探测光瞳遮暗。

优选地，针对第一照明光瞳、第二照明光瞳、第一探测光瞳和/或第二探测光瞳的不同的遮暗，重复用于产生图像的步骤。通过这种顺序的摄像，减小了彩色编码的信道的串扰，并且改善了对所产生的样本图像的质量具有决定性影响的信噪比。

优选地，第一照明光瞳、第二照明光瞳、第一探测光瞳和/或第二探测光瞳分别具有圆扇形或圆弧段的形状。

有利的是，第一照明光瞳和第二照明光瞳相互间适当布置，使得它们能够通过转动而重叠，和/或第一探测光瞳和第二探测光瞳相互间适当布置，使得它们能够通过转动而重叠。第一部分图像和第二部分图像由此彼此间具有简单的几何关系，因而由第一部分图像和第二部分图像来产生样本图像是特别简单的。

本发明还涉及一种用于实施显微的透射光对比方法的机构。该机构包括：照明单元，其被设计用来至少部分地通过非对称的第一照明光瞳来照明样本，并且至少部分地通过非对称的第二照明光瞳来照明样本；探测单元，其被设计用来至少部分地通过非对称的第一探测光瞳来对样本成像，以便产生第一部分图像，并且至少部分地通过非对称的第二探测光瞳来对样本成像，以便产生第二部分图像，其中，第一照明光瞳和第一探测光瞳在朝向垂直于光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置，从而至少角度空间的第一区域位于明场中，而角度空间的不同于第一区域的第二区域位于暗场中，并且第一部分图像具有第一明场部分和第一暗场部分，其中，第二照明光瞳和第二探测光瞳在朝向垂直于光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置，从而至少角度空间的第三区域位于明场中，而角度空间的不同于第三区域的第四区域位于暗场中，并且第二部分图像具有第二明场部分和第二暗场部分；和控制单元，其被设计用来由第一部分图像和第二部分图像产生样本的图像。

优选地，照明单元包括用于产生第一照明光瞳和第二照明光瞳的第一调制器部件，探测单元包括用于产生第一探测光瞳和第二探测光瞳的第二调制器部件。第一和第二调制器部件以光圈的方式物理地产生第一和第二照明光瞳或者第一和第二探测光瞳。第一调制器部件和/或第二调制器部件可以是不同的光圈、可更换光圈的系统、微镜总成或空间光调制器—简称SLM。替代地，第一照明光瞳和第二照明光瞳也可以通过LED阵列来产生。

在一种有利的改进中，该机构包括伯特兰(Bertrand)透镜系统，用于探测第一探测光瞳的照明轮廓和/或第二探测光瞳的照明轮廓。伯特兰透镜系统允许锥光地观察第一探测光瞳和/或第二探测光瞳。由此可以实现通过调整第一照明光瞳和/或第二照明光瞳，例如通过控制第一调制器部件，适配性地调整非对称的照明。

优选地，照明单元包括不相干的光源。不相干的光源比相干光源即激光光源更成本低廉。此外省去了用于保证激光器安全的繁琐的措施。

本发明还涉及一种显微镜，特别是透射光显微镜，其带有按照前述类型的机构。该显微镜既可以设计成直立式显微镜，又可以设计成倒置式显微镜。

附图说明

下面借助附图介绍本发明。其中：

图1为作为第一实施例的透射光显微镜的示意图；

图2为在根据图1的透射光显微镜中第一照明光瞳和第一探测光瞳彼此相对的位置的示意图；

图3示出根据图1的透射光显微镜的幅度传递函数；

图4示出根据图1的透射光显微镜的相位传递函数；

图5示出由部分图像组成的图像的相位传递函数；

图6示出样本的借助于根据图1的透射光显微镜摄取的三个部分图像；

图7示出了样本的借助于维纳滤波器由三个部分图像重构的幅度结构和相位结构；

图8为作为第二实施例的透射光显微镜的示意图；

图9为作为第三实施例的带有伯特兰透镜系统的透射光显微镜的示意图；

图10为流程图，其示出了根据本发明的显微的透射光对比方法的一种具体的实施方式。

具体实施方式

图1所示为作为第一实施例的透射光显微镜10的示意图。该透射光显微镜10包括用于实施显微的透射光对比方法的机构12和朝向样本16的物镜14。机构12包括用于照明样本16的照明单元18、探测单元20和控制单元22。

照明单元18包括用于产生不相干的照明光26的光源24、第一调制器部件28以及聚光器30，该第一调制器部件布置在照明单元18的光瞳平面中并且例如由可更换光圈系统、微镜总成或空间光调制器形成。由光源24产生的照明光26在经过第一调制器部件28之后射到聚光器30上，该聚光器使得照明光26转向至样本16。

样本16使得照明光26散射和/或弱化，由此由照明光26产生用来使得样本16成像的探测光27。由样本16发出的探测光27经由物镜14转向到探测单元20中。

探测单元20包括第二调制器部件32，该第二调制器部件布置在物镜14的光瞳平面中并且例如由可更换光圈系统、微镜总成或空间光调制器形成。如果物镜14没有位于物镜14之外的光瞳平面，则位于物镜14之内的光瞳平面可以通过合适的中继系统实际朝向物镜14之外成像，并且第二调制器部件32可以位于该实际的中间光瞳平面中。探测单元20还包括镜筒透镜34和位置分辨的探测器部件36例如CDD或CMOS部件。

由样本16发出的探测光27经由物镜14首先转向到第二调制器部件32上。在经过第二调制器部件32之后，探测光27经由镜筒透镜34射到探测器部件36上。对于采用针对最终管长度矫正的物镜14的单级成像的情况，也可以省去镜筒透镜。

控制单元22控制第一调制器部件28产生图2中详细示出的第一照明光瞳38和产生第二照明光瞳。由此通过控制单元22动态地控制由照明光26照明角度空间的哪些区域。控制单元22还控制第二调制器部件32以受控的方式产生图2中详细示出的第一探测光瞳40和产生第二探测光瞳。由此通过控制单元22动态地控制由探测单元20来成像角度空间的哪些区域。此外，控制单元22控制探测器部件36，从而产生指配给第一照明光瞳38和第一探测光瞳40的第一部分图像与指配给第二照明光瞳和第二探测光瞳的第二部分图像，并且由第一部分图像与第二部分图像产生样本16的图像。

在第一实施例中只摄取两个部分图像，用来产生样本16的图像。但也可以摄取多于两个的部分图像。控制单元22为此控制第一调制器部件28产生其它照明光瞳，并控制第二调制器部件32产生其它探测光瞳。此外，控制单元22控制探测器部件36，从而产生分别指配给其它照明光瞳和其它探测光瞳的其它部分图像，并且由第一部分图像、第二部分图像与其它部分图像产生样本16的图像。

图2所示为在根据图1的透射光显微镜中第一照明光瞳38和第一探测光瞳40彼此相对的位置的示意图。图2中的视图从物镜14观察示出了光瞳38、40。

第一照明光瞳38和第一探测光瞳40布置成使得它们部分地搭叠。由此产生实现暗场照明的第一照明区域42和实现明场照明的第二照明区域44。通过第一探测光瞳40成像的第一部分图像因而具有明场部分和暗场部分。

在图2所示的实施例中，第一探测光瞳40的孔径大小为第一照明光瞳38的孔径的双倍。在一种替代的实施例中，第一探测光瞳40的孔径也可以小于第一照明光瞳38的孔径。第一照明光瞳38和第一探测光瞳40分别具有圆扇形状，其中，中心角的值是120°。因此可以通过转动120°，以简单的方式由第一照明光瞳38和第一探测光瞳40产生第二照明光瞳和第二探测光瞳。在图2所示的实施例中，第一照明光瞳38和第一探测光瞳40彼此相对地极性地转动了60°的角度。

如果要利用借助图1和2所示的透射光显微镜10对整个角度空间成像，则必须产生指配给第三照明光瞳和第三探测光瞳的第三部分图像，这些光瞳由第一照明光瞳38或第一探测光瞳40分别通过转动240°而产生。

图3示出用于部分图像的根据图1的透射光显微镜10的幅度传递函数46。幅度传递函数46是角度空间内的函数，并且说明了如何通过透射光显微镜10传递空间频率的量值。

图4示出用于部分图像的根据图1的透射光显微镜10的相位传递函数48。如同幅度传递函数46，相位传递函数48是角度空间内的函数，并且说明了如何通过透射光显微镜10传递空间频率的相位。它具有对于非对称的照明来说常见的过零点50。

图5示出样本16的由部分图像产生的图像的相位传递函数52。由图5可以得知，通过样本16的多个部分图像的组合，通过透射光显微镜10成像的空间频率的范围增大了，除了角度空间的原点外，去除了部分图像的相位传递函数的过零点50，这导致改善了样本16的图像对比度。

图6示出了通过光学模拟而产生的三个部分图像54a、54b、54c，这些部分图像是借助根据图1的透射光显微镜10摄取的。

三个部分图像54a、54b、54c中的第一部分图像54a通过图2中所示的第一照明光瞳38予以照明，并且通过同样在图2中示出的第一探测光瞳40予以成像。三个部分图像54a、54b、54c中的第二部分图像54b通过第二照明光瞳予以照明，并且通过第二探测光瞳予以成像，第二照明光瞳是通过使得第一照明光瞳38围绕物镜14的光学轴线转动120°而产生的，第二探测光瞳是通过使得第一探测光瞳40围绕物镜14的光学轴线转动120°而产生的。三个部分图像54a、54b、54c中的第三部分图像54c通过第三照明光瞳予以照明，并且通过第三探测光瞳予以成像，第三照明光瞳是通过使得第一照明光瞳38围绕物镜14的光学轴线转动240°而产生的，第三探测光瞳是通过使得第一探测光瞳40围绕物镜14的光学轴线转动240°而产生的。

三个部分图像54a、54b、54c中的每一个都示出了样本16，该样本既有幅度结构56，又有透明的相位结构58。

图7示出了样本16的借助于维纳滤波器由三个部分图像54a、54b、54c重构的幅度结构56和相位结构58。

图8所示为作为第二实施例的透射光显微镜60的示意图。图8中所示的透射光显微镜60与图1中所示的透射光显微镜10的区别主要在于，控制单元22并非动态地控制第一调制器部件66和第二调制器部件70。

根据图8的透射光显微镜60包括用于实施根据本发明的透射光对比方法的机构62。该机构62包括用于照明样本16的照明单元64和探测单元68。相同的或相同作用的部件在图1和8中标有相同的标号。

照明单元64包括第一调制器部件66，该第一调制器部件布置在照明机构18的光瞳平面中，并且被设计用来根据第一照明光瞳38和第二照明光瞳对由光源24发出的照明光26进行光谱编码。这例如可以借助于多个光谱滤波器来进行，这些滤波器分别设计成第一照明光瞳38或第二照明光瞳的形式。

探测单元68包括第二调制器部件70以及位置分辨的探测器部件72，该第二调制器部件布置在物镜14的光瞳平面中，并且被设计用来根据第一探测光瞳40和第二探测光瞳对由样本16发出的探测光27进行光谱编码。位置分辨的探测器部件72被设计用来把探测光27分开成两个部分图像。这种分开通过拜耳阵列来进行。

控制单元22控制探测器部件72，从而同时产生指配给第一照明光瞳38和第一探测光瞳40的第一部分图像与指配给第二照明光瞳和第二探测光瞳的第二部分图像，并且由第一部分图像与第二部分图像产生样本16的图像。

图9所示为作为第三实施例的透射光显微镜74的示意图。图9中所示的透射光显微镜74与图1中所示的透射光显微镜10的区别主要在于，用于实施根据本发明的透射光对比方法的机构78附加地包括伯特兰透镜系统76。相同的或相同作用的部件在图1和9中标有相同的标号。

伯特兰透镜系统76包括布置在物镜14的焦点平面中的分光器80，借助于该分光器使得照明光26的一部分转向至另一位置分辨的探测器部件82。通过伯特兰透镜系统76，可以实现检测探测光瞳的照明轮廓。这又允许控制单元22通过控制调制器部件28来适配地调整照明单元18的照明的角度光谱。

相同的或相同作用的特征在图1和9中标有相同的标号。

图10为流程图，其示出了根据本发明的显微的透射光对比方法的一种具体的实施方式。

在第一步骤S1中，总共摄取N个部分图像。这些部分图像分别恰好指配给一个照明光瞳和一个探测光瞳。照明光瞳和探测光瞳相互间适当布置，使得角度空间的至少一个区域位于明场中，并且角度空间的不同于该区域的另一个区域位于暗场中。由此，N个部分图像中的每一个都具有一个明场部分和一个暗场部分。对N个部分图像的摄取可以顺序地即在时间上前后相继地进行，或者同步地即同时地进行。如果摄取同步地进行，就必须分别对照明光瞳进行光谱编码，这比如在上面结合图8详述。

在第二步骤S2中，预先处理N个部分图像，也就是说，针对每个部分图像都例如调整采样，进行减噪和/或进行光谱重新划分。这用于改善样本16的由N个部分图像重构的图像的图像质量。

在第二步骤S3中，由N个部分图像和相关的转移函数即光学的转移函数，重构样本16的复杂的转移函数即复杂的散射势，作为样本16的图像。这例如可以通过维纳滤波器来进行，或者通过比如在M.Chen等人的Biomed.Opt.Exp.7(2016),3940中描述的迭代方法来进行。在图6和7中示出了这种重构的一个例子。样本16的复杂的转移函数尤其可以表示为单独的幅度分布和相位分布。

附图标记清单

10 透射光显微镜

12 机构

14 物镜

16 样本

18 照明单元

20 探测单元

22 控制单元

24 光源

26 照明光

27 探测光

28 调制器部件

30 聚光器

32 调制器部件

34 镜筒透镜

36 探测器部件

38 照明光瞳

40 探测光瞳

42、44 区域

46、48 传递函数

50 过零点

52 传递函数

54a、54b、54c 部分图像

56 幅度对象

58 相位对象

60 透射光显微镜

62 机构

64 照明单元

66 调制器部件

68 探测单元

70 调制器部件

72 探测器部件

74 透射光显微镜

76 伯特兰透镜系统

78 机构

80 分光器

82 探测器部件

Claims (16)

1.一种显微的透射光对比方法，其中：

至少部分地通过非对称的第一照明光瞳(38)来照明样本(16)；

至少部分地通过非对称的第一探测光瞳(40)对所述样本(16)成像，以便产生第一部分图像(54a)；

其中，所述第一照明光瞳(38)和所述第一探测光瞳(40)在朝向垂直于光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置，从而至少角度空间的第一区域位于明场中，而所述角度空间的不同于所述第一区域的第二区域位于暗场中，并且所述第一部分图像(54a)具有第一明场部分和第一暗场部分；

至少部分地通过非对称的第二照明光瞳来照明所述样本(16)；

至少部分地通过非对称的第二探测光瞳对所述样本(16)成像，以便产生第二部分图像(54b)；

其中，所述第二照明光瞳和所述第二探测光瞳在朝向垂直于所述光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置，从而至少所述角度空间的第三区域位于明场中，而所述角度空间的不同于所述第三区域的第四区域位于暗场中，并且所述第二部分图像具有第二明场部分和第二暗场部分；

由所述第一部分图像(54a)和所述第二部分图像(54b)产生所述样本的图像。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少部分地利用透过所述第一照明光瞳(38)的第一照明光来照明所述样本(16)，至少部分地利用透过所述第二照明光瞳的第二照明光来照明所述样本(16)，并且所述第一照明光和所述第二照明光具有不同的光谱组成。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，同时产生所述第一部分图像(54a)和所述第二部分图像(54b)。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，针对所述第一部分图像(54a)和/或所述第二部分图像(54b)，对采样进行调整，减小噪声，或者进行光谱重新划分。

5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，通过数字地由所述第一部分图像(54a)和所述第二部分图像(54b)重构所述样本(16)的复杂的传递函数，来产生所述样本(16)的图像。

6.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，针对所述样本(16)的不同层，重复用于产生图像的步骤，并且由如此产生的多个图像产生图像堆栈。

7.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，检测所述第一照明光瞳(38)的照明轮廓和/或所述第二照明光瞳的照明轮廓。

8.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，在传输经过所述样本(16)之后，产生所述第一照明光瞳(38)和/或所述第二照明光瞳的图像，并且借助于该图像来计算相位和幅度传递函数(46、48)。

9.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，把所述第一照明光瞳(38)、所述第二照明光瞳、所述第一探测光瞳(40)和/或所述第二探测光瞳遮暗。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，针对所述第一照明光瞳(38)、所述第二照明光瞳、所述第一探测光瞳(40)和/或所述第二探测光瞳的不同的遮暗，重复用于产生所述图像的步骤。

11.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一照明光瞳(38)、所述第二照明光瞳、所述第一探测光瞳(40)和/或所述第二探测光瞳分别具有圆扇形或圆弧段的形状。

12.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一照明光瞳(38)和所述第二照明光瞳相互间适当布置，使得它们能够通过转动而重叠，和/或所述第一探测光瞳(40)和所述第二探测光瞳相互间适当布置，使得它们能够通过转动而重叠。

13.一种用于实施显微的透射光对比方法的机构，包括：

照明单元(18、64)，其被设计用来至少部分地通过非对称的第一照明光瞳(38)来照明样本(16)，并且至少部分地通过非对称的第二照明光瞳来照明所述样本(16)；

探测单元(20、68)，其被设计用来至少部分地通过非对称的第一探测光瞳(40)来对所述样本(16)成像，以便产生第一部分图像(54a)，并且至少部分地通过非对称的第二探测光瞳来对所述样本(16)成像，以便产生第二部分图像(54b)，

其中，所述第一照明光瞳(38)和所述第一探测光瞳(40)在朝向垂直于光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置，从而至少角度空间的第一区域位于明场中，而所述角度空间的不同于所述第一区域的第二区域位于暗场中，并且所述第一部分图像(54a)具有第一明场部分和第一暗场部分，

其中，所述第二照明光瞳和所述第二探测光瞳在朝向垂直于所述光学轴线的平面的投影中彼此相对转动，并且相互间部分地彼此搭叠地布置，从而至少所述角度空间的第三区域位于明场中，而所述角度空间的不同于所述第三区域的第四区域位于暗场中，并且所述第二部分图像(54b)具有第二明场部分和第二暗场部分；和

控制单元(22)，其被设计用来由所述第一部分图像(54a)和所述第二部分图像(54b)产生所述样本(16)的图像。

14.如权利要求13所述的机构，其特征在于，所述照明单元(18、64)包括用于产生所述第一照明光瞳(38)和所述第二照明光瞳的第一调制器部件(28、66)，所述探测单元(20、68)包括用于产生所述第一探测光瞳和所述第二探测光瞳的第二调制器部件(32、70)。

15.如权利要求13或14所述的机构，其特征在于伯特兰透镜系统(76)，用于探测所述第一探测光瞳(40)的照明轮廓和/或所述第二探测光瞳的照明轮廓。

16.一种显微镜，带有根据权利要求13～15中任一项所述的机构。