DE102018103403A1

DE102018103403A1 - Einrichtung zur differentiellen Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopie

Info

Publication number: DE102018103403A1
Application number: DE102018103403.2A
Authority: DE
Inventors: Alice Autuori; Christian Schumann
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2018-02-15
Filing date: 2018-02-15
Publication date: 2019-08-22

Abstract

Beschrieben ist eine Einrichtung (10) zur differenziellen Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopie, umfassend eine Beleuchtungseinheit (12), die eine Probe durch eine Beleuchtungspupille (24) beleuchtet, die eine Unterteilung in eine erste Teilpupille (48) und eine zweite Teilpupille (50) aufweist, eine Detektionseinheit (16), die durch Abbilden der allein durch die erste Teilpupille (48) beleuchteten Probe ein erstes Einzelbild und durch Abbilden der allein durch die zweite Teilpupille (50) beleuchteten Probe ein zweites Einzelbild erzeugt, und eine Steuereinheit (18), die durch Bilden der Differenz des ersten Einzelbildes und des zweiten Einzelbildes ein Differenzbild der Probe erzeugt. Die Detektionseinheit (18) erzeugt durch Abbilden der ersten Teilpupille (48) ein erstes Pupillenbild (56) und durch Abbilden der zweiten Teilpupille (50) ein zweites Pupillenbild (58). Die Steuereinheit (18) steuert die Unterteilung der Beleuchtungspupille (24) in die erste Teilpupille (48) und die zweite Teilpupille (50) in Abhängigkeit des ersten Pupillenbildes (56) und des zweiten Pupillenbildes (58).

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur differentiellen Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopie, umfassend eine Beleuchtungseinheit, die ausgebildet ist, eine Probe durch eine Beleuchtungspupille zu beleuchten, die eine Unterteilung mindestens in eine erste Teilpupille und eine zweite Teilpupille aufweist, eine Detektionseinheit, die ausgebildet ist, durch Abbilden der allein durch die erste Teilpupille beleuchteten Probe ein erstes Einzelbild und durch Abbilden der allein durch die zweite Teilpupille beleuchteten Probe ein zweites Einzelbild zu erzeugen, und eine Steuereinheit, die ausgebildet ist, durch Bilden der Differenz des ersten Einzelbildes und des zweites Einzelbildes ein Differenzbild der Probe zu erzeugen. Ferner betrifft die Erfindung ein entsprechendes differentielles Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopieverfahren.
Auf dem Gebiet der Lichtmikroskopie sind verschiedene Phasenkontrast-Verfahren bekannt, die darauf abzielen, den Bildkontrast insbesondere bei der Abbildung biologischer Proben zu verbessern.
Das klassische Phasenkontrast-Verfahren nach Zernike sieht eine Überdeckung eines beleuchtungsseitigen Lichtrings mit einem Phasenring vor, der sich in der Objektivpupille befindet. Die Notwendigkeit einer solchen Überdeckung ist insbesondere dann von Nachteil, wenn probeninduzierte Pupillenaberrationen auftreten. So ergibt sich beispielsweise in flüssigkeitsgefüllten Probenbehältern kleinen Querschnitts, wie sie etwa die einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte darstellen, infolge der Oberflächenspannung der Flüssigkeit ein deutlich ausgeprägter Flüssigkeitsmeniskus, der zu einem Versatz der Beleuchtungspupille bei Transmission durch die Probe führt. Eine dauerhafte Überdeckung von Licht- und Phasenring ist unter diesen Umständen nicht möglich.
Bei dem differentiellen Interferenzkontrastverfahren nach Nomarski, kurz DIC, wird das Beleuchtungslicht durch ein Wollaston-Prisma in zwei zueinander kohärente, aber in der Probe seitlich zueinander versetzte Teilbündel aufgespalten. Diese beiden Teilbündel werden objektivseitig durch ein weiteres Wollaston-Prisma zur Überlagerung und Interferenz gebracht. Diese polarisationsbedingte Aufspaltung der beiden Teilbündel beim DIC-Verfahren hat zur Folge, dass eine Doppelbrechung, wie sie etwa durch den Boden eines üblichen aus Kunststoff gefertigten Probengefäßes auftritt, infolge der damit einhergehenden Beeinflussung der Polarisation zu einer deutlichen Kontrastverschlechterung führt. Da sich diese unerwünschte Doppelbrechung in der Fertigung herkömmlicher Kunststoff-Probengefäße nicht vermeiden lässt, ist das DIC-Verfahren nach Nomarski z.B. in Kunststoff-Petrischalen oder Kunststoff-Mikrotiterplatten nicht anwendbar.
Aus dem Stand der Technik ist ferner ein rechnergestütztes differentielles Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopieverfahren bekannt, bei dem die Beleuchtungspupille längs einer Pupillenteilungsachse in zwei Teilpupillen unterteilt wird und die Probe alternierend mit den beiden Teilpupillen beleuchtet wird. Auf diese Weise werden jeweils zwei Einzelbilder der Probe generiert und diese beiden Einzelbilder digital durch Differenzbildung zur Kontrasterzeugung genutzt. Diese gemeinhin als DPC (Differential Phase Contrast) bezeichnete Verfahren ist beispielsweise beschrieben in Tian et al., „Quantitative differential phase contrast imaging in an LED-array microscope“, Optic Express, Seiten 11394 - 11403.
Um bei dem DPC-Verfahren einen guten Kontrasteindruck zu erzielen, sollte die Beleuchtungsapertur die Apertur des Detektionsobjektivs möglichst vollständig und symmetrisch ausfüllen. Falls nun aber infolge probeninduzierter Pupillenaberrationen, wie sie beispielsweise infolge eines in einem Probengefäß vorhandenen Flüssigkeitsmeniskus auftreten, die Objektivpupille nur zum Teil asymmetrisch von der Beleuchtungspupille ausgefüllt ist, führt dies zu unterschiedlichen Bildhelligkeiten in den beiden Einzelbildern und dadurch zu einem verminderten Kontrast in dem aus den beiden Einzelbildern generierten Differenzbild. Weiterhin ist so die aufgrund der Differenzbildung gegebene Separation von Phasen- und Amplitudeneinflüssen der Probe auf das erzeugte Bild nicht mehr gegeben.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Einrichtung zur differentiellen Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopie anzugeben, die auch beim Auftreten von probeninduzierten Pupillenaberrationen eine kontrastreiche Bildgebung ermöglicht. Ferner ist Aufgabe der Erfindung, ein entsprechendes differentielles Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopieverfahren anzugeben.
Die Erfindung löst diese Aufgaben durch die Einrichtung nach Anspruch 1 bzw. das Verfahren nach Anspruch 11. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die erfindungsgemäße Einrichtung zur differenziellen Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopie umfasst eine Beleuchtungseinheit, die ausgebildet ist, eine Probe durch eine Beleuchtungspupille zu beleuchten, die eine Unterteilung mindestens in eine erste Teilpupille und eine zweite Teilpupille aufweist, eine Detektionseinheit, die ausgebildet ist, durch Abbilden der allein durch die erste Teilpupille beleuchteten Probe ein erstes Einzelbild und durch Abbilden der allein durch die zweite Teilpupille beleuchteten Probe ein zweites Einzelbild zu erzeugen, und eine Steuereinheit, die ausgebildet ist, durch Bilden der Differenz des ersten Einzelbildes und des zweiten Einzelbildes ein Differenzbild der Probe zu erzeugen. Die Detektionseinheit ist ferner ausgebildet, durch Abbilden der ersten Teilpupille ein erstes Pupillenbild und durch Abbilden der zweiten Teilpupille ein zweites Pupillenbild zu erzeugen. Die Steuereinheit ist ausgebildet, die Unterteilung der Beleuchtungspupille in die erste Teilpupille und die zweite Teilpupille in Abhängigkeit des ersten Pupillenbildes und des zweiten Pupillenbildes zu steuern.
Die erfindungsgemäße Einrichtung ermöglicht es, das eingangs erläuterte DPC-Verfahren auch dann anzuwenden, wenn es infolge von probeninduzierten Pupillenaberrationen zu einem Versatz der Beleuchtungspupille relativ zur Detektionspupille kommt. Letztere ist üblicherweise durch die Pupille eines in der Detektionseinheit enthaltenen Detektionsobjektivs gegeben ist. Somit ist es insbesondere möglich, das DPC-Verfahren auch bei Verwendung von Probengefäßen anzuwenden, bei denen ein Flüssigkeitsmeniskus dazu führt, dass die Objektivpupille nur teilweise von der Beleuchtungspupille ausgefüllt wird. Eine solche nicht vollständige Ausfüllung der Objektivpupille durch die Beleuchtungspupille wird erfindungsgemäß anhand der beiden Pupillenbilder erkannt. Insbesondere kann dann, wenn die beiden Pupillenbilder unterschiedliche Größen aufweisen, auf eine unsymmetrische Ausleuchtung der Objektivpupille geschlossen werden, die ohne die erfindungsgemäße Pupilleneinstellung zu unterschiedlichen Bildhelligkeiten in den dem Differenzbild zugrunde gelegten Einzelbildern führen würde. Auch die Zuordnung der Einzelbilder zu deren Beleuchtungswinkelspektrum für eine nachfolgende Verarbeitung ist bei einer unsymmetrischen Ausleuchtung der Objektivpupille nicht mehr gegeben. Das Auftreten unterschiedlicher Bildhelligkeiten kann erfindungsgemäß dadurch vermieden werden, dass die Unterteilung der Beleuchtungspupille in die beiden Teilpupillen so gesteuert wird, dass sich im Ergebnis gleich große Pupillenbilder ergeben. Somit ist sichergestellt, dass die Objektivpupille durch die beiden Teilpupillen symmetrisch ausgeleuchtet ist.
Die Erfindung sieht eine Unterteilung der Beleuchtungspupille in mindestens zwei Teilpupillen vor, wobei die Angabe „mindestens“ verdeutlicht, dass auch mehr als zwei Teilpupillen und dementsprechend mehr als zwei Einzelbilder und mehr als zwei Pupillenbilder generiert werden können.
Vorzugsweise steuert die Steuereinheit die Unterteilung der Beleuchtungspupille derart, dass das erste Pupillenbild und das zweite Pupillenbild symmetrisch zueinander sind.
Vorzugsweise weist die Beleuchtungspupille eine durch die Steuereinheit einstellbare Pupillenteilungsachse auf. In diesem Fall ist die Steuereinheit ausgebildet, das erste Pupillenbild und das zweite Pupillenbild zu einem effektiven Pupillengesamtbild zusammenzusetzen, in dem Pupillengesamtbild eine Sollachse zu bestimmen, die das Pupillengesamtbild in zwei gleich große Bildbereiche unterteilt, und die Pupillenteilungsachse entsprechend der Sollachse einzustellen. Die Sollachse bildet dabei eine Symmetrieachse, die eine symmetrische Unterteilung des Pupillengesamtbildes bewirkt und anhand der eine besonders einfache Einstellung der Pupillenteilungsachse möglich ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Beleuchtungseinheit eine am Ort der Beleuchtungspupille angeordnete Lichtquelle. Eine solche Lichtquelle kann beispielsweise als ein durch die Steuereinheit steuerbares LED-Array ausgeführt sein. Indem die Leuchtdioden dieses LED-Arrays einzeln angesteuert werden, lässt sich die Pupillenteilungsachse nach Belieben variieren.
Die vorgenannte Lichtquelle kann auch in Form eines räumlichen Lichtmodulators, kurz SLM, oder eines digitalen Mikrospiegel-Arrays, kurz DMD, ausgebildet sein.
Vorzugsweise enthält die Beleuchtungseinheit eine Kondensorlinse, in deren Brennebene die Lichtquelle angeordnet ist.
In einer ganz bevorzugten Ausführungsform enthält die Detektionseinheit ein optisches Element, z.B. eine Bertrand-Linse, zur konoskopischen Abbildung der ersten Teilpupille und der zweiten Teilpupille. Auf diese Weise lassen sich die beiden Pupillenbilder, die der erfindungsgemäßen Pupilleneinstellung zugrunde gelegt werden, auf besonders einfache Weise generieren.
Die Detektionseinheit weist vorzugsweise ein erstes Bildaufnahmegerät zum Erzeugen der beiden Einzelbilder und ein zweites Bildaufnahmegerät zum Erzeugen der beiden Pupillenbilder auf. Als Bildaufnahmegeräte lassen sich beispielsweise CCD- oder CMOS-Kameras verwenden.
Die Detektionseinheit enthält vorzugsweise einen Strahlteiler, der einen Detektionsstrahlengang in einen auf das erste Bildaufnahmegerät führenden ersten Teilstrahlengang und einen auf das zweite Bildaufnahmegerät führenden zweiten Teilstrahlengang aufspaltet. Auf diese Weise lassen sich die beiden unterschiedlichen Bildgebungen, nämlich die Erzeugung der dem Differenzbild zugrunde gelegten Einzelbilder einerseits und die Erzeugung der die Anpassung der Beleuchtungspupille bestimmenden Pupillenbilder andererseits, in besonders einfacher Weise realisieren.
Die Erfindung sieht ferner ein differentielles Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopieverfahren vor, bei dem eine Probe durch eine Beleuchtungspupille beleuchtet wird, die eine Unterteilung in eine erste Teilpupille und eine zweite Teilpupille aufweist, durch Abbilden der allein durch die erste Teilpupille beleuchteten Probe ein erstes Einzelbild und durch Abbilden der allein durch die zweite Teilpupille beleuchteten Probe ein zweites Einzelbild erzeugt wird, und durch Bilden der Differenz des ersten Einzelbildes und des zweiten Einzelbildes ein Differenzbild der Probe erzeugt wird. Erfindungsgemäß wird durch Abbilden der ersten Teilpupille ein erstes Pupillenbild und durch Abbilden der zweiten Teilpupille ein zweites Pupillenbild erzeugt. Die Unterteilung der Beleuchtungspupille in die erste Teilpupille und die zweite Teilpupille wird in Abhängigkeit des ersten Pupillenbildes und des zweiten Pupillenbildes gesteuert.
Vorzugsweise wird die Probe abwechselnd allein durch die erste Teilpupille und allein die zweite Teilpupille beleuchtet. Eine unterscheidbare Generierung der beiden Einzelbilder ist jedoch nicht nur auf zeitsequentieller Basis, sondern beispielsweise auch auf spektraler Basis möglich.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:

1 den schematischen Aufbau eines Phasenkontrast-Durchlichtmikroskops gemäß Ausführungsbeispiel;
2 eine schematische Darstellung, welche die ungleiche Ausleuchtung der Objektivpupille durch die beiden Teilpupillen der Kondensorpupille bei nicht korrigierter Pupillenteilungsachse zeigt;
3 eine schematische Darstellung, welche die durch die erfindungsgemäße Korrektur der Pupillenteilungsachse bewirkte gleichmäßige Ausleuchtung der Objektivpupille durch die beiden Teilpupillen der Kondensorpupille zeigt; und
4 ein Flussdiagramm, das den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Pupilleneinstellung anhand eines Ausführungsbeispiels darstellt.

1 zeigt schematisch den Aufbau eines Phasenkontrast-Durchlichtmikroskops 10 als Ausführungsbeispiel. Der Einfachheit halber sind in 1 nur diejenigen Komponenten des Phasenkontrast-Durchlichtmikroskops 10 gezeigt, die für das Verständnis der erfindungsgemäßen Pupilleneinstellung erforderlich sind.
Das Phasenkontrast-Durchlichtmikroskop 10 umfasst eine in 1 allgemein mit 12 bezeichnete Beleuchtungseinheit, die eine in einer Objektebene 14 angeordnete Probe im Durchlichtmodus beleuchtet. An die Objektebene 14 schließt in Lichtausbreitungsrichtung eine in 1 allgemein mit 16 bezeichnete Detektionseinheit an, die der Abbildung der durch die Beleuchtungseinheit 12 beleuchteten Probe dient. Das Phasenkontrast-Durchlichtmikroskop 10 weist ferner eine Steuereinheit 18 auf, die den gesamten Mikroskopbetrieb steuert und im vorliegenden Kontext insbesondere die Funktion hat, die im weiteren erläuterte Pupilleneinstellung innerhalb des Phasenkontrast-Durchlichtmikroskops 10 zu steuern.
Die Beleuchtungseinheit 12 weist ein LED-Array 20 und eine Kondensorlinse 22 auf. Das LED-Array 20 enthält eine Vielzahl von Beleuchtungslicht emittierenden Leuchtdioden, die nach Art einer Matrix angeordnet und durch die Steuereinheit 18 einzeln zur Lichtabgabe ansteuerbar sind. Das LED-Array 20 befindet sich in der hinteren Brennebene der Kondensorlinse 22 und damit am Ort der die Beleuchtungspupille bildenden, in 1 mit dem Bezugszeichen 24 bezeichneten Pupille der Kondensorlinse 22. Die Lage des LED-Arrays 20 am Ort der Kondensorpupille 24 ist in 1 durch die Darstellung des Beleuchtungsstrahlengangs in Form eines mit durchgezogenen Linien gezeigten Pupillenstrahlengangs 26 und eines mit gestrichelten Linien gezeigten Feldstrahlengangs 28 veranschaulicht.
Die Detektionseinheit 16 umfasst ein der Objektebene 14 zugewandtes Detektionsobjektiv 30 und daran in Lichtausbreitungsrichtung anschließend eine Tubuslinse 32 sowie einen Strahlteiler 34. Durch den Strahlteiler 34 wird der Detektionsstrahlengang in einen Reflexionsstrahlengang, der (in 1 nach rechts) auf eine erste Kamera 36 führt, und einen Transmissionsstrahlengang aufgespalten, der (in 1 nach unten) durch eine Bertrand-Linse 38 auf eine zweite Kamera 40 führt. Die beiden Kameras 36, 40 sind wie auch das LED-Array 20 jeweils über eine Steuerleitung 42, 44 bzw. 46 zur Durchführung der erfindungsgemäßen Pupilleneinstellung mit der Steuereinheit 18 verbunden.
Das Phasenkontrast-Durchlichtmikroskop 10 ist darauf ausgelegt, die in der Objektebene 14 angeordnete Probe nach Art des eingangs erläuterten rechnergestützten, differentiellen Phasenkontrastverfahrens (DPC) auf die erste Kamera 36 abzubilden. Hierzu wird die Kondensorpupille 24 durch eine entsprechende Ansteuerung des LED-Arrays 20 hälftig in eine erste Teilpupille 48 und eine zweite Teilpupille 50 aufgespalten. In der Darstellung gemäß 1 ist der vorgenannten ersten Teilpupille 48 ein erstes Teilbündel des von dem LED-Array 20 abgegebenen Beleuchtungslichts zugeordnet, das durch den linken Randstrahl des Feldstrahlengangs 28 und die mittig liegende optische Achse O der Beleuchtungseinheit 12 begrenzt ist. Entsprechend ist der vorgenannten zweiten Teilpupille 50 ein zweites Teilbündel des Beleuchtungslichts zugeordnet, das durch den rechten Randstrahl des Feldstrahlengangs 28 und die optische Achse O begrenzt ist. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die beiden Teilbündel dadurch erzeugt, dass jeweils nur diejenigen Leuchtdioden des LED-Arrays 20 zur Abgabe von Beleuchtungslicht aktiviert werden, die in dem Querschnitt nach 1 links bzw. rechts der optischen Achse O angeordnet sind. Dabei erfolgt die Aktivierung der den beiden Teilbündeln jeweils zugeordneten Leuchtdioden in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel alternierend, d.h. die Probe wird zu einem gegebenen Zeitpunkt entweder nur mit dem einen oder dem anderen Teilbündel beleuchtet.
Diese Ansteuerung des LED-Arrays 20 führt im Ergebnis also dazu, dass die Kondensorpupille 24 längs einer Teilungsachse 52, die in 1 in dem auf dem LED-Array 20 liegenden hinteren Brennpunkt der Kondensorlinse 22 senkrecht zur Seitenebene verläuft, in die beiden vorgenannten Teilpupillen 48, 50 unterteilt wird, mit denen dann die in der Objektebene 14 angeordnete Probe alternierend beleuchtend wird. Wie in 1 gezeigt, ist durch die den beiden Teilpupillen 48, 50 zugeordneten Teilbündel in der Objektebene 14 jeweils eine schiefe Beleuchtung realisiert, die dazu führt, dass die Abbildung der mit der jeweiligen Teilpupille 48, 50 beleuchteten Probe auf der ersten Kamera 36 sowohl Phaseninformation als auch Amplitudeninformation enthält.
Das vorliegende Kontrastierverfahren zielt nun darauf ab, die Amplitudeninformation zu verwerfen und allein die Phaseninformation in der Bildgebung zur Kontraststeigerung zu nutzen. Hierzu bildet das aus dem Detektionsobjektiv 30, der Tubuslinse 32 und dem Strahlteiler 34 gebildete Teilsystem der Detektionseinheit 16 die durch die jeweilige Teilpupille 48, 50 beleuchtete Probe auf die erste Kamera 36 ab. Die erste Kamera 36 generiert so eine alternierende Folge von Einzelbildern der Probe, von denen ein erstes Einzelbild die Phasen- und Amplitudeninformation bei Beleuchtung der Probe mit der Teilpupille 48 und ein darauffolgendes zweites Einzelbild die Phasen- und Amplitudeninformation bei Beleuchtung der Probe mit der Teilpupille 50 beinhaltet. Unter der Kontrolle der Steuereinheit 18 werden nun das erste Einzelbild und das zweite Einzelbild im Wege einer Differenzbildung nach dem DPC-Verfahren so miteinander verrechnet, dass sich daraus ein Differenzbild ergibt, das im Idealfall nur mehr die Phaseninformation enthält, wohingegen die Amplitudeninformation in Folge der Differenzbildung weitgehend beseitigt ist.
Der vorgenannte Idealfall, in dem innerhalb des resultierenden Differenzbildes die Phaseninformation maximiert und die Amplitudeninformation minimiert ist, liegt insbesondere dann vor, wenn sich die in der Beleuchtungseinheit 12 vorgenommene Unterteilung der Kondensorpupille 24 in die beiden gleich großen Teilpupillen 48, 50 unter dem Einfluss der Pupille des Detektionsobjektivs 30 in eine entsprechend gleiche Pupillenteilung am Ort der Bildgebung, d.h. auf der ersten Kamera 36 niederschlägt. Idealerweise sollte deshalb das in der Detektionseinheit 30 erzeugte Bild der Kondensorpupille 24, d.h. die Kondensorapertur, die Pupille bzw. die Apertur des Detektionsobjektivs 30 symmetrisch ausfüllen. Dann ist nämlich gewährleistet, dass die beiden zur Erzeugung des Differenzbildes genutzten Einzelbilder gleiche Bildhelligkeiten aufweisen.
Wie eingangs erläutert, kommt es nun insbesondere bei Verwendung von flüssigkeitsgefüllten Probenbehältern häufig zu einem lateralen Versatz der Kondensorpupille 24 bei Transmission durch die Probe, wodurch nicht mehr gewährleistet ist, dass die Kondensorpupille 24 die Pupille des Detektionsobjektivs 30 vollständig ausfüllt. Dieses Problem ist in 2 veranschaulicht.
2 zeigt eine beispielhafte Pupillenausleuchtung, die sich aus der Überlagerung der Objektivpupille 54 und der Kondensorpupille 24 ergibt, wenn letztere gegenüber der Objektivpupille 54 seitlich versetzt ist. Wie in 1 dargestellt, wird die kreisförmige Kondensorpupille 24 durch die Pupillenteilungsachse 52 hälftig in die erste Teilpupille 48 und die zweite Teilpupille 50 geteilt. Dabei sind jeweils nur diejenigen Bereiche der Teilpupillen 48, 50 abbildungswirksam, die der Objektivpupille 54 überlagert sind. In 1 sind diese der Objektivpupille 54 überlagerten Bereiche der Teilpupillen 48, 50 unterschiedlich schraffiert dargestellt und mit 56 bzw. 58 bezeichnet. Dabei stellt der Pupillenbereich 56 das in der Detektionseinheit 16 generierte Bild der ersten Teilpupille 48 und der Pupillenbereich 58 das in der Detektionseinheit 16 generierte Bild der zweiten Teilpupille 50 dar. Die beiden Pupillenbilder 56, 58 bestimmen die Pupillenausleuchtungen, auf deren Grundlage die beiden zu dem Differenzbild verrechneten Einzelbilder generiert werden. In dem Beispiel nach 2 sind diese Pupillenausleuchtungen infolge der bezüglich der Pupillenbilder 48, 50 unsymmetrischen Lage der Pupillenteilungsachse 52 deutlich unterschiedlich. Im Ergebnis erhält man so deutlich unterschiedliche Bildhelligkeiten in den beiden dem Differenzbild zugrundeliegenden Einzelbildern.
Zur Vermeidung des vorstehend erläuterten Problems ist in dem Phasenkontrast-Durchlichtmikroskop 10 nach 1 vorgesehen, mittels der Bertrand-Linse 38 die beiden Teilpupillen 48, 50 auf die zweite Kamera 40 abzubilden. Auf der zweiten Kamera 40 ergibt sich dadurch eine der 2 entsprechende effektive Ausleuchtung der Objektivpupille 54, wobei sich diese Ausleuchtung gleichsam aus den beiden Pupillenbildern 56, 58 zusammensetzt, die durch die Pupillenteilungsachse 52 der Kondensorpupille 24 voneinander getrennt sind. Dabei versteht es sich von selbst, dass in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel, in dem die Teilpupillen 48, 50 alternierend beleuchtet werden, zu einem gegebenen Zeitpunkt auf der zweiten Kamera 40 jeweils nur eines der beiden Pupillenbilder 56, 58 generiert wird.
Die Steuereinheit 18 setzt die beiden Pupillenbilder 56, 58 zu einem der effektiven Pupillenausleuchtung entsprechenden Gesamtbild zusammen und berechnet dessen Symmetrieachse als Sollachse. Ist die Symmetrieachse bestimmt, so sorgt die Steuereinheit 18 dann durch eine entsprechende Ansteuerung des LED-Arrays 20 dafür, dass die ursprüngliche Pupillenteilungsachse 52 der Kondensorpupille 24 in eine dieser Symmetrieachse entsprechende Pupillenteilungsachse 52' geändert wird, wie in 3 gezeigt ist. Die neu eingestellte Pupillenteilungsachse 52' bewirkt, dass die beiden zunächst unterschiedlich großen Teilpupillenbilder 56, 58 (vgl. 2) in gleich große Pupillenteilbilder 56', 58' überführt werden. Durch die nunmehr erreichte symmetrische Pupillenausleuchtung ist dafür gesorgt, dass die beiden auf der ersten Kamera 36 generierten Einzelbilder im Wesentlichen gleiche Helligkeiten aufweisen. Somit ist dann auch in dem aus den beiden Einzelbildern gewonnenen Differenzbild der Kontrast maximiert.
In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die Bestimmung der Symmetrieachse der Pupillenausleuchtung und die darauf basierende Anpassung der Pupillenteilungsachse 52 in einem kontinuierlichen Prozess durchgeführt, so dass die Symmetrieachse bzw. die Pupillenteilungsachse 52 während der Anwendung des Kontrastierverfahrens kontinuierlich verfolgt werden. Dabei wird zu jedem aus zwei Einzelbildern bestehenden Bildpaar die zugehörige Symmetrieachse gespeichert, um für eine spätere weitere Auswertung, z.B. eine Phasenbestimmung, zur Verfügung zu stehen. Diese kontinuierliche Verfolgung der Symmetrieachse hat zudem den Vorteil, dass sich die Symmetrieachse aus Gründen der Stetigkeit besonders zuverlässig bestimmen lässt, etwa unter Anwendung eines Kalman-Filterverfahrens.
In 4 ist ein beispielhaftes Ablaufdiagramm zur Durchführung des differentiellen Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopieverfahrens nach der Erfindung dargestellt.
In diesem Beispiel wird zunächst in Schritt S1 auf der ersten Kamera 36 das erste Einzelbild der Probe erzeugt. Zugleich wird auf der zweiten Kamera 40 das zugehörige Pupillenbild 56 der ersten Teilpupille 48 generiert, mit der die Probe bei Aufnahme des ersten Einzelbildes beleuchtet wird.
In Schritt 52 wird dann auf der ersten Kamera 36 das zweite Einzelbild der Probe erzeugt. Zugleich wird auf der zweiten Kamera 40 das zugehörige Pupillenbild 58 der zweiten Teilpupille 50 generiert, mit der die Probe bei Aufnahme des zweiten Einzelbildes beleuchtet wird.
In Schritt S3 werden das erste Einzelbild und das zweite Einzelbild durch Differenzbildung miteinander zu einem Differenzbild verrechnet, das in Schritt S4 dem Benutzer als kontrastiertes Bild zur Verfügung gestellt wird.
In Schritt S5 wird die Symmetrieachse der Pupillenausleuchtung bestimmt, die sich gleichsam aus der Summe, d.h. der flächigen Zusammensetzung der beiden auf der zweiten Kamera 40 erzeugten Pupillenbilder 56, 58 ergibt. Die Steuereinheit 18 nutzt die so bestimmte Symmetrieachse dann zur nächsten Ansteuerung des LED-Arrays 20, um die die Pupillenachse 52 in Korrespondenz mit der ermittelten Symmetrieachse nachzustellen. Dabei ist zu berücksichtigen, dass der beispielhafte Ablauf nach 4 als Teilprozess eines Mikroskopdauerbetriebs zu verstehen ist, während dessen die Symmetrieachse kontinuierlich bestimmt und darauf basierend die Pupillenteilungsachse 52 kontinuierlich angepasst wird.
In dem Verfahren nach 4 wird vorzugsweise die in Schritt S5 gewonnene Pupilleninformation in Zuordnung zu dem zugehörigen Probenbild abgespeichert, um eine nachträgliche quantitative Rekonstruktion zu ermöglichen.
Bezugszeichenliste

10: Phasen kontrast-Durchlichtmikroskop
12: Beleuchtungseinheit
14: Objektebene
16: Detektionseinheit
18: Steuereinheit
20: LED-Array
22: Kondensorlinse
24: Kondensorpupille
26: Pupillenstrahlengang
28: Feldstrahlengang
30: Detektionsobjektiv
32: Tubuslinse
34: Strahlteiler
36: erste Kamera
38: Bertrand-Linse
40: zweite Kamera
42: Steuerleitung
44: Steuerleitung
46: Steuerleitung
48: Teilpupille
50: Teilpupille
52: Pupillenteilungsachse
54: Objektivpupille
56: Pupillenbild
58: Pupillenbild
O: optische Achse

Claims

Einrichtung (10) zur differentiellen Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopie, umfassend: eine Beleuchtungseinheit (12), die ausgebildet ist, eine Probe durch eine Beleuchtungspupille (24) zu beleuchten, die eine Unterteilung mindestens in eine erste Teilpupille (48) und eine zweite Teilpupille (50) aufweist, eine Detektionseinheit (16), die ausgebildet ist, durch Abbilden der allein durch die erste Teilpupille (48) beleuchteten Probe ein erstes Einzelbild und durch Abbilden der allein durch die zweite Teilpupille (50) beleuchteten Probe ein zweites Einzelbild zu erzeugen, und eine Steuereinheit (18), die ausgebildet ist, durch Bilden der Differenz des ersten Einzelbildes und des zweiten Einzelbildes ein Differenzbild der Probe zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinheit (16) ausgebildet ist, durch Abbilden der ersten Teilpupille (48) ein erstes Pupillenbild (56) und durch Abbilden der zweiten Teilpupille (50) ein zweites Pupillenbild (58) zu erzeugen, und dass die Steuereinheit (18) ausgebildet ist, die Unterteilung der Beleuchtungspupille (24) in die erste Teilpupille (48) und die zweite Teilpupille (50) in Abhängigkeit des ersten Pupillenbildes (56) und des zweiten Pupillenbildes (58) zu steuern.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (18) die Unterteilung der Beleuchtungspupille (24) derart steuert, dass das erste Pupillenbild (56) und das zweite Pupillenbild (58) symmetrisch zueinander sind.
Einrichtung (10) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungspupille (24) eine durch die Steuereinheit (18) einstellbare Pupillenteilungsachse (52) aufweist, und die Steuereinheit (18) ausgebildet ist, das erste Pupillenbild (56) und das zweite Pupillenbild (58) zu einem effektiven Pupillengesamtbild zusammenzusetzen, in dem effektiven Pupillengesamtbild eine Sollachse zu bestimmen, die das Pupillengesamtbild in zwei gleich große Bildbereiche unterteilt, und die Pupillenteilungsachse (52) entsprechend der Sollachse einzustellen.
Einrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (12) eine am Ort der Beleuchtungspupille (24) angeordnete Lichtquelle (20) enthält.
Einrichtung (10) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (20) ein durch die Steuereinheit (18) steuerbares LED-Array ist.
Einrichtung (10) nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (12) eine Kondensorlinse (22) enthält, in deren Brennebene die Lichtquelle (20) angeordnet ist.
Einrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinheit (12) ein Objektiv (30) mit einer Objektivpupille (54) enthält, durch welche die erste Teilpupille (48) zum Erzeugen des ersten Pupillenbildes (56) und die zweite Teilpupille (50) zum Erzeugen des zweiten Pupillenbildes (58) abbildbar ist.
Einrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinheit (16) ein optisches Element (38) zur konoskopischen Abbildung der ersten Teilpupille (48) und der zweiten Teilpupille (50) enthält.
Einrichtung (10) nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (38) ein Bertrand-Linse ist.
Einrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinheit (16) ein erstes Bildaufnahmegerät (36) zum Erzeugen der beiden Einzelbilder und ein zweites Bildaufnahmegerät (40) zum Erzeugen der beiden Pupillenbilder (56, 58) enthält.
Einrichtung (10) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinheit (16) einen Strahlteiler (34) enthält, der einen Detektionsstrahlengang in einen auf das erste Bildaufnahmegerät (36) führenden ersten Teilstrahlengang und einen auf das zweite Bildaufnahmegerät (40) führenden zweiten Teilstrahlengang aufspaltet.
Differenzielles Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopieverfahren, bei dem eine Probe durch eine Beleuchtungspupille (24) beleuchtet wird, die eine Unterteilung mindestens in eine erste Teilpupille (48) und eine zweite Teilpupille (50) aufweist, durch Abbilden der allein durch die erste Teilpupille (48) beleuchteten Probe ein erstes Einzelbild und durch Abbilden der allein durch die zweite Teilpupille (50) beleuchteten Probe ein zweites Einzelbild erzeugt wird, und durch Bilden der Differenz des ersten Einzelbildes und des zweiten Einzelbildes ein Differenzbild der Probe erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet, dass durch Abbilden der ersten Teilpupille (48) ein erstes Pupillenbild (56) und durch Abbilden der zweiten Teilpupille (50) ein zweites Pupillenbild (58) erzeugt wird, und die Unterteilung der Beleuchtungspupille (24) in die erste Teilpupille (48) und die zweite Teilpupille (50) in Abhängigkeit des ersten Pupillenbildes (56) und des zweiten Pupillenbildes (58) gesteuert wird.
Differenzielles Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopieverfahren, bei dem die Probe abwechselnd allein durch die erste Teilpupille (48) und allein durch die zweite Teilpupille (50) beleuchtet wird.
Differenzielles Phasenkontrast-Durchlichtmikroskopieverfahren, nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterteilung der Beleuchtungspupille (24) in die erste Teilpupille (48) und die zweite Teilpupille (50) kontinuierlich gesteuert wird.