EP3953684A1 - Lichtblattmikroskop und verfahren zuur bestimmung der brechungsindices von objekten im probenraum - Google Patents

Lichtblattmikroskop und verfahren zuur bestimmung der brechungsindices von objekten im probenraum

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EP3953684A1
EP3953684A1 EP20719335.0A EP20719335A EP3953684A1 EP 3953684 A1 EP3953684 A1 EP 3953684A1 EP 20719335 A EP20719335 A EP 20719335A EP 3953684 A1 EP3953684 A1 EP 3953684A1
Authority
EP
European Patent Office
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light sheet
light
cover
designed
support glass
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20719335.0A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Weiss
Christian Schumann
Ronja CAPELLMANN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP3953684A1 publication Critical patent/EP3953684A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to a light sheet microscope.
  • the invention also relates to a method for acquiring a measured variable by means of a light sheet microscope.
  • the thickness of the cover glass since this determines the length of the optical path which the detection light to be detected by the objective traverses when passing through the cover glass.
  • Another optical parameter is the distance between the cover or support glass and the imaging lens. Knowledge of this distance is necessary, for example, to implement an autofocus system.
  • the document US Pat. No. 8,5082,203 B2 discloses a light sheet microscope with an illumination device for generating a light sheet and an objective.
  • the light sheet is arranged in a sample in such a way that the direction of propagation of the illuminating light that forms the light sheet is not perpendicular to the optical axis of the objective of the microscope.
  • Such light sheet microscopes are therefore also referred to as oblique plane microscopes (OPM: oblique plane microscope).
  • the document DE 10 2016 119 268 B3 discloses a light sheet microscope with a lighting device that generates a light sheet in an intermediate image space, and a transport optics that images the light sheet into the sample.
  • the documents WO 2017/210159 A1 and WO 2015/109323 A2 each disclose a light sheet microscope with an illumination device which is designed to generate a light sheet and move it laterally through a sample. Such light sheet microscopes are also referred to as SCAPE microscopes (SCAPE: swept confocally-aligned planar excitation).
  • the light sheet microscope comprises a sample space in which a cover or support glass can be arranged which has a surface that defines a partially reflective interface, an optical system with an objective facing the cover or support glass, an illumination device that is designed, a light sheet to generate a sensor, and a processor.
  • the two boundary surfaces are formed by the fact that two optical media can be attached to the sample space, which media adjoin the two surfaces of the cover or support glass.
  • the light sheet microscope is designed in such a way that it forms a measuring device for detecting a measured variable.
  • the measuring device is designed to direct the light sheet through the optics system at an oblique incidence onto the cover or support glass, to generate a reflected light bundle by partially reflecting the light sheet at the interface, and to receive and receive the reflected light bundle through the optics system to steer towards the sensor.
  • the sensor is designed to detect the intensity and / or the point of incidence of the reflected light bundle.
  • the processor is designed to determine the measured variable on the basis of the detected intensity and / or the location of incidence of the reflected light bundle.
  • cover or support glass is understood to mean, in particular, a cover glass covering a sample, a slide, the bottom of a Petri dish or the bottom of a cavity of a microtiter plate.
  • the surface of the cover or support glass which forms the interface can be either a surface facing the objective or a surface of the cover or support glass facing away from the objective.
  • the sensor is preferably designed as a position-sensitive sensor, i.e. as a sensor that is suitable for detecting the intensity and the point of incidence.
  • the light sheet microscope uses the reflected light beam, i. a partial reflection of the light sheet on the surface of the cover or support glass in order to record the measured variable.
  • the reflected light bundle used to determine the measured variable therefore has a wavelength that generally differs by a few nanometers, the so-called Stokes shift, from the wavelength of the detection light emanating from the sample.
  • the Stokes shift is about 5 to 20 nm, and even more in the case of unusual fluorophores. This means in particular that when a wavelength-dependent measured variable is determined, no conversion of the measured variable to the wavelength of the detection light is required and no assumption about the dispersion needs to be made. This enables a particularly reliable determination of the measured variable.
  • those measured variables are wavelength-dependent that are required to determine an imaging error, for example the length of an optical path through the cover or support glass or a refractive index.
  • the proposed light sheet microscope can thus be used to improve the imaging quality of the light sheet microscope by setting suitable manipulated variables of the light sheet microscope on the basis of the measured value determined.
  • the partial reflection of the light sheet also occurs in previously known light sheet microscopes. It represents a disturbance that is separated from the detection light by means of a blocking filter.
  • the proposed light sheet microscope thus makes particularly advantageous use of a disturbance variable that is disadvantageous per se to improve the image quality.
  • the solution described here can therefore be implemented with little effort by appropriately configuring an existing light sheet microscope.
  • the light sheet thus fulfills the same function as a measuring light beam formed by means of a slit diaphragm in known autofocus devices, for example according to DE 10 2010 0S0 430
  • the processor is designed to determine the distance of the cover or support glass from the objective along its optical axis as a measured variable on the basis of the detected point of incidence of the reflection light bundle.
  • the measuring device can be used as an autofocus device or as part of such.
  • Each of the at least three measuring points is determined by three coordinates, one of which indicates the distance to be determined between the measuring point and the lens along its optical axis, while the other two coordinates define the position of the respective measuring point on the surface of the cover glass .
  • the cover or support glass has a further surface which defines a further partially reflective interface.
  • the two boundary surfaces are arranged at different distances from the objective.
  • the measuring device in this embodiment is designed to generate a further bundle of reflected light by partially reflecting the light sheet at the further boundary surface and to receive the further bundle of reflected light through the objective and direct it onto the sensor.
  • the sensor is designed to detect the intensity and / or the location of incidence of the further reflected light bundle.
  • the processor is designed to determine the measured variable on the basis of the recorded intensities and / or incidence locations of the two reflected light bundles.
  • the measuring device is designed to direct the two reflected light bundles simultaneously onto the detector and to determine the thickness of the cover or support glass based on the mutual spacing of the different incidence locations of the two reflected light bundles.
  • This special embodiment is designed in particular for cover or support glasses which are relatively thin in relation to the lens magnification. In this case there is the spatial separation of the two The reflected light bundle is correspondingly small, so that both can be detected on the detector at the same time.
  • the measuring device is designed to direct the two reflected light bundles one after the other onto the detector. This means that the measuring device detects only one of the reflected light bundles on the detector at a given point in time.
  • Such an embodiment is designed in particular for cover or support glasses which are comparatively thick with respect to the objective magnification. In this case, the mutual distance between the two boundary surfaces at which the reflection light bundles arise is so great that the associated spatial separation of the reflection light bundles makes it impossible to receive both reflection light bundles at the same time on the detector.
  • the processor is preferably designed to set the distance between the cover or support glass and the objective as an operating parameter.
  • This distance, measured along the optical axis of the objective can be changed, for example, using a suitable adjustment device, such as a so-called z-drive.
  • a suitable adjustment device such as a so-called z-drive.
  • the measuring device is designed to set the position of a displaceable focusing lens provided in the light sheet microscope as an operating parameter. From the change in position of this displaceable focusing lens, the optical thickness of the cover or support glass can then be determined as the measured variable, taking into account the optical imaging conditions.
  • the processor is designed to use the optical thickness to determine a mechanical thickness of the cover or support glass, taking into account the refractive indices of the cover or support glass and an optical medium that is attached to both the objective and the cover. or glass is adjacent to be determined as a measured variable.
  • the aforementioned optical medium is, for example, an immersion medium that is located between the cover or support glass and the objective.
  • the numerical aperture of the main beam of the light sheet in the sample space is also taken into account. This is preferably done according to the following relationship: where NA denotes the numerical aperture of the main ray of the light sheet in the sample space.
  • the numerical aperture NA is given by the product of the refractive index ni m of the immersion medium and the angle of incidence at which the measuring light beam emerging from the objective falls on the cover or support glass with respect to the optical axis.
  • the usual imaging errors can be taken into account when calculating the mechanical thickness.
  • the two boundary surfaces are formed in that two optical media in the sample space adjoin the two surfaces of the cover or support glass.
  • the processor is designed to determine the refractive index of one of the two optical media as a measured variable on the basis of the recorded intensities of the two reflected light bundles.
  • the intensities of the two reflected light bundles depend on the reflection and the transmission of the light sheet at the two interfaces, which are defined by the cover or support glass and the two optical media that border the cover or support glass from opposite sides.
  • the reflection and transmission processes, on which the intensities of the two spatially separated reflection light bundles are ultimately based, are thus essentially determined by the refractive indices of the cover or support glass and the optical media adjoining the cover or support glass . If the refractive index of the cover or support glass and the refractive index of one of the two adjacent optical media are known, the refractive index of the other medium can be reliably determined from the intensities recorded by the detector and the knowledge of the angle of incidence of the measuring light beam in the sample space .
  • the spatial separation of the two reflected light bundles results from the fact that the measuring device directs the light sheet obliquely onto the cover or support glass.
  • the two partially reflective interfaces are axially offset from one another, ie are spaced apart along the optical axis of the lens, the oblique incidence of the light sheet on the two interfaces ensures that the two reflective light bundles are reflected back into the lens on different optical paths.
  • the two reflected light bundles on the detector are recorded separately from one another at different points of incidence.
  • the processor is preferably designed to determine the refractive index of the one optical medium on the basis of the ratio of the intensities of the two reflected light bundles as a measured variable.
  • the measurement of the refractive index is, as it were, self-referential. This means that the refractive index can be determined independently of the intensity of the measuring light beam, i.e. no knowledge of this intensity is required.
  • the optical medium, the refractive index of which is to be determined as a measured variable by means of the measuring device is preferably an embedding medium for a sample which borders on one of the two surfaces of the cover or support glass.
  • the other optical medium, the refractive index of which is known from the outset is preferably an immersion medium that is adjacent to the other surface of the cover or support glass on the one hand and the objective on the other.
  • the measuring device it is also possible to use the measuring device to determine the refractive index of any medium, provided that it is directly adjacent to one of the two surfaces of the cover or support glass and thereby forms a partially reflective interface.
  • the aforementioned intensity distribution is obtained by integrating the respective image on the detector over a direction that is parallel to the longitudinal orientation of the cross-section of the Light sheet lies.
  • the light sheet microscope includes a detection device with a further sensor for detecting the detection light emanating from the sample and a beam splitter unit which is designed to direct the reflected light bundle onto the sensor and the detection light onto the further sensor.
  • the light sheet microscope comprises two sensors, each of which has only one function. This allows the use of specialized sensors and thus a more reliable detection of both the reflected light bundle and the detection light. This makes the determination of the measured variable more reliable.
  • the light sheet microscope comprises a filter which can be connected upstream of the sensor and which is impermeable to the reflected light bundle. This prevents the reflected light bundle from influencing the detection of the detection light emanating from the sample.
  • the switchability of the filter means that the sensor can be used both to record the reflected light beam and the detection light.
  • the light sheet microscope preferably comprises a scanning element which is designed to move the light sheet along a scanning axis.
  • the scanning element is, for example, a movable raster mirror.
  • the light sheet microscope has an electronic focusing device which is designed to focus the light sheet on different planes in the sample space. This also allows the light sheet to be moved along the scanning axis.
  • the light sheet microscope is often also referred to as OPM (OPM: oblique plane microscope). If the scanning takes place laterally to the optical axis of the objective, the light sheet microscope is often referred to as a SCAPE microscope (SCAPE: swept confocally-aligned planar excitation).
  • SCAPE swept confocally-aligned planar excitation
  • the invention also relates to a method for acquiring a measured variable by means of a light sheet microscope.
  • the method has the advantages described above and can be developed in the same way, in particular by the features of the dependent claims related to the light sheet microscope.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a light sheet microscope which provides scanning lateral to the optical axis of the objective, according to an embodiment
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the light sheet microscope, which provides a scanning lateral to the optical axis of the objective, according to an embodiment with two sensors;
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the light sheet microscope, which provides a scanning along the optical axis of the objective, according to an embodiment
  • FIG. 4 shows a schematic representation of the light sheet microscope, which provides scanning along the optical axis of the objective, according to an embodiment with two sensors;
  • FIG. 5 shows a schematic illustration showing a sample space of the light sheet microscope
  • FIG. 6 shows an intensity distribution detected by a position-sensitive detector of the light sheet microscope with an intensity maximum
  • FIG. 7 shows a further schematic illustration which shows the sample space of the light sheet microscope.
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of a light sheet microscope 100 in a special embodiment which provides scanning lateral to the optical axis 02 of an objective 120.
  • the light sheet microscope 100 enables, in addition to imaging using light sheet microscopy, the acquisition of a measured variable that influences the imaging.
  • the light sheet microscope 100 at the same time forms a measuring device for this measured variable.
  • the light sheet microscope 100 comprises an illumination device 102, a transport optics 104 and a detection device 106, which together form an optics system 107.
  • the optical axis OB of the detection device 106 is tilted by a tilt angle ⁇ with respect to the optical axis 02 of the transport optics 104.
  • the optical Axis 01 of the lighting device 102 is perpendicular to the optical axis OB of the detection device 106, so that the optical axis 01 of the lighting device 102 is tilted by an angle of 90 ° with respect to the optical axis 02 of the transport optics 104.
  • the three aforementioned optical axes 01, 02, 03 intersect in an intermediate image space 108.
  • a cover or support glass which is simply referred to as cover glass 118 in the following, and two optical media 117, 119 arranged, each of which adjoins the cover glass 118.
  • the light sheet microscope 100 also has a processor 110.
  • the lighting device 102 comprises a light source 112 and an illuminating objective 114.
  • the light source 112 generates a light sheet, for example with the aid of a cylinder lens not explicitly shown in FIG. 1, the light sheet with reference to an oblique coordinate system shown in FIG a direction of light propagation A and a direction of expansion B perpendicular thereto.
  • the light source 112 can also generate a quasi-static light sheet by means of a scanning element specially provided for this purpose.
  • the lighting objective 114 images the light sheet in the intermediate image space 108.
  • the light sheet can also be coupled directly into the transport optics 104.
  • the transport optics 104 viewed from the sample space 116, comprise the objective 120 facing the cover glass 118, a first tube lens 122, a first eyepiece 124, a second eyepiece 126, a second tube lens 128 and a projection objective 130, which are positioned along the optical axis 02 the transport optics 104 are arranged.
  • a scanning device is arranged between the first eyepiece 124 and the second eyepiece 126, which in the embodiment shown is formed by a raster mirror 132 on which the optical axis 02 of the optical transport system 104 is deflected.
  • the processor 110 is connected to the light source 112, the raster mirror 132, the position-sensitive sensor 150 and a so-called z-drive 111 which, for example by moving a microscope table, determines the position of the cover glass 118 along the optical axis 02 of the Lens 120 can change.
  • the processor 110 is designed to determine the measured variable on the basis of the detected intensity and / or the location of incidence of the reflection light bundle 142.
  • the processor 110 also has a memory 154 in which parameters for determining the measured variable can be stored.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of a light sheet microscope 200 which provides scanning lateral to the optical axis 02 of the objective 120.
  • the light sheet microscope 200 represents a modified embodiment with two sensors 150, 202.
  • the light sheet microscope 200 according to FIG. 2 thus differs from the embodiment according to FIG. 1 essentially in the further sensor 202 and a beam splitter unit 204, which is designed to direct the reflection light bundle 142 onto the position-sensitive sensor 150 and detection light onto the further sensor 202.
  • Identical and identically acting elements are denoted by the same reference symbols in FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 3 shows a light sheet microscope 300 as a modified embodiment, which differs from the embodiment according to FIG. 1 essentially in that the scanning through the light sheet is axial, i.e. takes place along the optical axis 02 of the transport optics 104.
  • Identical and identically acting elements are denoted by the same reference symbols in FIGS. 1 to 3.
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a light sheet microscope 400 that provides scanning along the optical axis 02 of the objective 120, according to an embodiment with two sensors 150, 202.
  • the embodiment of the light sheet microscope 400 according to FIG. 4 differs from the embodiment of the light sheet microscope 300 according to FIG. 3 essentially by the further sensor 202 and the beam splitter unit 204.
  • Identical and identically acting elements are denoted by the same reference numerals in FIGS.
  • FIG. 5 is a schematic illustration which shows the sample space 116 of the light sheet microscope 100, 200, 300, 400.
  • FIG. 5 shows how the reflected light bundle 142 is generated by reflecting the light sheet 134 at first one of the surfaces 138, 140 of the cover glass 118.
  • the light sheet 134 which decentrally illuminates the entrance pupil 136 of the objective 120, is directed by the objective 120 at an angle ⁇ obliquely to the optical axis 02 onto the front surface of the cover glass 118 facing the objective 120 and denoted by 138 in FIG . Since the cover glass 118 and an immersion medium 119 adjoining its front surface 138 have different refractive indices, the front surface 138 of the cover glass 118 and the immersion medium 119 adjoining it form an interface at which the incident light sheet 134 is partly reflected. The part of the measuring light bundle 134 that is reflected at this interface generates the reflection light bundle 142, which is guided back into the objective 120.
  • the other part 152 of the light sheet 134 which transmits the first interface, is broken away from the optical axis 02 of the objective 120 when it enters the cover glass 118 and forms an angle g with this which is greater than the angle ⁇ .
  • This transmitted part 152 of the light sheet 134 is partly reflected at a second boundary surface which is defined by the rear surface 140 of the cover glass 118 and an adjoining embedding medium 117 which has a different refractive index than the cover glass 118.
  • This second partial reflection of the light sheet 134 at the second boundary surface generates the second reflection light bundle 142b, which passes through the front surface 138 of the cover glass 118 and then passes back into the objective 120.
  • the oblique incidence of the light sheet 134 into the sample space 116 ensures that the reflection light bundles 142a, 142b generated by the two partial reflections on the front surface 138 and the rear surface 140 of the cover glass 118 point to different optical paths back into the objective 120.
  • the two reflection light bundles 142a, 142b strike the position-sensitive detector 150 at different points of incidence, provided that it is ensured that both reflection light bundles 142a, 142b fall simultaneously on the detector 150.
  • the two images of the cross section of the light sheet 134 generated on the front surface 138 and the rear surface 140 of the cover glass 118 are mapped onto the position-sensitive detector 150 spatially separated from one another, as illustrated in the following diagram according to FIG.
  • the second partial reflection takes place on the rear surface 140 of the cover glass 188 at a point offset transversely to the optical axis O2.
  • the areas below the peaks PI, P2 shown in FIG. 8 are each a measure of the intensity of the respective reflection light bundle 142a, 142b. From their ratio, for example, the refractive index of one of the two optical media 117, 119 can be determined as a measured variable.
  • FIG. 8 shows a situation in which the two reflection light bundles 142a, 142b fall simultaneously on the position-sensitive detector 150. This means that the spatial splitting of the two reflection light bundles 142a,
  • the thickness of the cover glass 118 to be detected as a measured variable is relatively small in relation to the objective magnification.
  • the spatial splitting of the reflection light bundles 142a, 142b, corresponding to the thickness of the cover glass 118 to be detected is so great that a simultaneous detection of the two reflection light bundles 142a, 142b by the position-sensitive detector 150 is not possible is.
  • aspects have been described in the context of a device, it is clear that these aspects also represent a description of the corresponding method, with a block or a device corresponding to a method step or a function of a method step. Analogously, aspects that are described in the context of a method step also represent a description of a corresponding block or element or a property of a corresponding device.
  • Some or all of the method steps can be carried out by (or using) a hardware device, as described in FIG Example can be a processor, a microprocessor, a programmable computer or an electronic circuit.
  • one or more of the most important method steps can be carried out by such a device.
  • embodiments of the invention can be implemented in hardware or software.
  • the implementation can be carried out with a non-volatile storage medium such as a digital storage medium such as a floppy disk, a DVD, a Blu-Ray, a CD, a ROM, a PROM and EPROM, an EEPROM or a FLASH memory, are carried out on the electronically readable control signals are stored, which interact (or can cooperate) with a programmable computer system so that the respective method is carried out. Therefore, the digital storage medium can be computer readable.
  • Some exemplary embodiments according to the invention comprise a data carrier with electronically readable control signals which can interact with a programmable computer system so that one of the methods described herein is carried out.
  • exemplary embodiments of the present invention can be implemented as a computer program product with a program code, the program code being effective for executing one of the methods when the computer program product is running on a computer.
  • the program code can, for example, be stored on a machine-readable carrier.
  • Another exemplary embodiment of the invention is therefore a data stream or a signal sequence which represents the computer program for carrying out one of the methods described herein.
  • the data stream or the signal sequence can for example be configured in such a way that they are transmitted via a data communication connection, for example via the Internet.
  • Another embodiment comprises a processing means, for example a computer or a programmable logic device, which is configured or adapted to carry out one of the methods described herein.
  • a processing means for example a computer or a programmable logic device, which is configured or adapted to carry out one of the methods described herein.
  • Another exemplary embodiment comprises a computer on which the computer program for carrying out one of the methods described herein is installed.
  • a further exemplary embodiment according to the invention comprises a device or a system which is configured to transmit (for example electronically or optically) a computer program for carrying out one of the methods described herein to a receiver.
  • the receiver can for example be a computer, a mobile device, a storage device or the like.
  • the device or the system can for example comprise a file server for transmitting the computer program to the recipient.
  • a programmable logic device eg, a field programmable gate array, FPGA
  • FPGA field programmable gate array
  • a field programmable gate arrangement can cooperate with a microprocessor to perform any of the methods described herein. In general, the methods are preferably performed by any hardware device.

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Abstract

Lichtblattmikroskop umfassend einen Probenraum in dem ein Deck-oder Tragglas anordenbar ist, das Oberfläche hat, die eine teilreflektierende Grenzfläche definiert; ein Optiksystem mit einem dem Deck-oder Tragglas zugewandten Objektiv; eine Beleuchtungseinrichtung, die ausgebildet ist, ein Lichtblatt zu erzeugen; einen Sensor; und einen Prozessor. Das Lichtblattmikroskop bildet eine Messvorrichtung zum Erfassen einer Messgröße. Die Messvorrichtung ist ausgebildet, das Lichtblatt durch das Optiksystem unter schrägem Einfall auf das Deck-oder Tragglas zu lenken, ein Reflexionslichtbündel zu erzeugen, indem das Lichtblatt zum Teil an der Grenzfläche reflektiert wird, und das Reflexionslichtbündel durch das Optiksystem zu empfangen und auf den Sensor zu lenken. Der Sensorist ausgebildet, die Intensität und/oder den Einfallsort des Reflexionslichtbündels zu erfassen. Der Prozessor ist ausgebildet, auf Grundlage der erfassten Intensität und/oder des Einfallsorts des Reflexionslichtbündels die Messgröße zu ermitteln.

Description

LICHTBLATTMIKROSKOP UND VERFAHREN ZUUR BESTIMMUNG DER
BRECHUNGSINDICES VON OBJEKTEN IM PROBENRAUM
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Lichtblattmikroskop. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfah- ren zum Erfassen einer Messgröße mittels eines Lichtblattmikroskops.
Hintergrund
In einem Lichtblattmikroskop ist die Abbildung einer Probe durch ein Deck- oder Trag- glas beeinflusst, falls ein solches zwischen der Probe und dem abbildenden Objektiv in einem Probenraum des Lichtblattmikroskops angeordnet ist. Die Abbildung der Probe wird ferner durch zwei optische Medien beeinflusst, die von entgegengesetzten Seiten her an das Deck- oder Tragglas grenzen. Diese optischen Medien sind beispielsweise durch ein Immersionsmedium, das sowohl an das Deckglas als auch an das Objektiv grenzt, und ein die Probe umgebendes Einbettmedium gebildet, das an die von dem Objektiv abgewandte Oberfläche des Deckglases grenzt.
Insbesondere im Hinblick auf eine wirksame Korrektion von Abbildungsfehlern ist es zum einen wünschenswert, die Dicke des Deckglases zu kennen, da diese die Länge des optischen Weges bestimmt, den das durch das Objektiv zu erfassende Detektionslicht beim Durchtritt durch das Deckglas durchläuft. Zum anderen ist es wünschenswert, die Brechungsindizes der verschiedenen optischen Medien zu kennen, die in einem Pro- benraum des Mikroskops aneinandergrenzen. Diese optischen Medien bilden infolge ihrer unterschiedlichen Brechungsindizes Grenzflächen, an denen sich der Brechungs- index sprunghaft ändert. Jede dieser Grenzflächen wirkt sich abhängig davon, wie groß der Sprung des Brechungsindex dort ist, unterschiedlich auf die optische Abbildung aus. Einen weiteren optischen Parameter stellt der Abstand zwischen dem Deck- oder Trag- glas und dem abbildenden Objektiv dar. Die Kenntnis dieses Abstands ist beispiels- weise zur Realisierung eines Autofokussystems erforderlich.
Das Dokument US 8 5082 203 B2 offenbart ein Lichtblattmikroskop mit einer Beleuch- tungseinrichtung zum Erzeugen eines Lichtblatts und einem Objektiv. Das Lichtblatt ist derart in einer Probe angeordnet, dass die Ausbreitungsrichtung des das Lichtblatt for- menden Beleuchtungslichts nicht senkrecht zur optischen Achse des Objektivs des Mik- roskops ist. Derartige Lichtblattmikroskope werden daher auch als Schiefebenenmikro- skope (OPM: oblique plane microscope) bezeichnet.
Das Dokument DE 10 2016 119 268 B3 offenbart ein Lichtblattmikroskop mit einer Be- leuchtungseinrichtung, die in einem Zwischenbildraum ein Lichtblatt zu erzeugt, und einer Transportoptik, die das Lichtblatt in die Probe abbildet.
Die Dokumente WO 2017/210159 Al und WO 2015/109323 A2 offenbaren jeweils ein Lichtblattmikroskop mit einer Beleuchtungseinrichtung, die ausgebildet ist, ein Licht- blatt zu erzeugen und lateral durch eine Probe zu bewegen. Derartige Lichtblattmikro- skope werden auch als SCAPE-Mikroskope (SCAPE: swept confocally-aligned planar excitation) bezeichnet.
Das Dokument DE 10 2010 030 430 Al offenbart eine triangulierende Autofokusein- richtung für ein Mikroskop. Diese Autofokuseinrichtung erzeugt mittels eines Mess- lichtstrahls aus nahinfrarotem Licht ein Spaltbild auf der Probe, das auf einen positi- onssensitiven Detektor abgebildet wird. Über die durch den Detektor erfasste Einfalls- position wird der Autofokus gesteuert.
Auf dem Gebiet der Lichtblattmikroskopie ist es also wünschenswert, auf besonders einfache Weise eine Messgröße zu erfassen, welche die Bestimmung eines optischen Parameters vorstehend erläuterter Art erlaubt. Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, ein Lichtblattmikroskop und ein Verfahren anzu- geben, die eine einfache und präzise Bestimmung einer solchen Messgröße ermögli- chen.
Kurzdarstellung
Diese Aufgabe wird durch das Lichtblattmikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 17 gelöst. Vorteilhafte Weiter- bildungen sind jeweils in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Das Lichtblattmikroskop umfasst einen Probenraum, in dem ein Deck- oder Tragglas anordenbar ist, das eine Oberfläche hat, die eine teilreflektierende Grenzfläche defi- niert, ein Optiksystem mit einem dem Deck- oder Tragglas zugewandten Objektiv, eine Beleuchtungseinrichtung, die ausgebildet ist, ein Lichtblatt zu erzeugen, einen Sensor, und einen Prozessor. Die beiden Grenzflächen sind dadurch gebildet, dass zwei opti- sche Medien in den Probenraum anbringbar sind, die an die beiden Oberflächen des Deck- oder Tragglases grenzen. Das Lichtblattmikroskop ist so ausgeführt, dass es eine Messvorrichtung zum Erfassen einer Messgröße bildet. Insbesondere ist die Messvor- richtung ausgebildet, das Lichtblatt durch das Optiksystem unter schrägem Einfall auf das Deck- oder Tragglas zu lenken, ein Reflexionslichtbündel zu erzeugen, indem das Lichtblatt zum Teil an der Grenzfläche reflektiert wird, und das Reflexionslichtbündel durch das Optiksystem zu empfangen und auf den Sensor zu lenken. Der Sensor ist ausgebildet, die Intensität und/oder den Einfallsort des Reflexionslichtbündels zu er- fassen. Der Prozessor ist ausgebildet, auf Grundlage der erfassten Intensität und/oder des Einfallsorts des Reflexionslichtbündels die Messgröße zu ermitteln. Unter Deck- oder Tragglas wird in dieser Anmeldung insbesondere ein eine Probe be- deckendes Deckglas, ein Objektträger, ein Boden einer Petrischale oder ein Boden ei- ner Kavität einer Mikrotiterplatte verstanden. Bei der Oberfläche des Deck- oder Tragglases, welche die Grenzfläche bildet, kann es sich sowohl um eine dem Objektiv zugewandte Oberfläche oder eine dem Objektiv abgewandte Oberfläche des Deck- o- der Tragglases handeln.
Der Sensor ist vorzugsweise als positionssensitiver Sensor ausgebildet, d.h. als Sensor, der geeignet ist, die Intensität und den Einfallsort zu erfassen.
Das Lichtblattmikroskop verwendet das Reflexionslichtbündel, d.h. eine Teilreflektion des Lichtblatts an der Oberfläche des Deck- oder Tragglases, um die Messgröße zu er- fassen. Das zum Ermitteln der Messgröße verwendete Reflexionslichtbündel hat somit eine Wellenlänge, die sich im Allgemeinen um wenige Nanometer, den sogenannten Stokes-Shift, von der Wellenlänge von Detektionslicht unterscheidet, das von der Probe ausgeht. Der Stokes-Shift beträgt etwa 5 bis 20 nm, bei außergewöhnlichen Flu- orophoren auch mehr. Dies bedeutet insbesondere, dass beim Ermitteln einer wellen- längenabhängigen Messgröße keine Umrechnung der Messgröße auf die Wellenlänge des Detektionslichts erforderlich ist und keine Annahme über die Dispersion gemacht werden muss. Hierdurch wird ist eine besonders zuverlässige Ermittlung der Mess- größe möglich.
Insbesondere sind solche Messgrößen wellenlängenabhängig, die zur Bestimmung ei- nes Abbildungsfehlers benötigt werden, beispielsweise die Länge eines optischen Wegs durch das Deck- oder Tragglas oder ein Brechungsindex. Somit kann das vorge- schlagene Lichtblattmikroskop zur Verbesserung der Abbildungsqualität des Lichtblatt- mikroskops genutzt, indem passende Stellgrößen des Lichtblattmikroskops anhand des ermittelten Messwerts eingestellt werden. Die Teilreflektion des Lichtblatts tritt auch in bisher bekannten Lichtblattmikroskopen auf. Dabei stellt sie eine Störgröße dar, die mittels eines Sperrfilters von dem Detekti- onslicht getrennt wird. Das vorgeschlagene Lichtblattmikroskop nutzt somit in beson- ders vorteilhafterweise eine an sich nachteilige Störgröße zur Verbesserung der Abbil- dungsqualität aus. Die hier beschriebene Lösung ist deshalb mit geringem Aufwand re- alisierbar, indem ein schon vorhandenes Lichtblattmikroskop entsprechend konfigu- riert wird.
Da der Querschnitt des Lichtblatts senkrecht zu seiner Ausbreitungsrichtung im We- sentlichen linienförmig ist, erscheint auch die Reflektion des Lichtblatts an dem Deck- oder Tragglas linienförmig. In dem vorliegenden Lichtblattmikroskop erfüllt das Licht- blatt somit die gleiche Funktion, wie ein mittels einer Spaltblende geformter Messlicht- strahl in bekannten Autofokuseinrichtungen, beispielsweise nach DE 10 2010 0S0 430
Al.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Prozessor ausgebildet, auf Grundlage des erfassten Einfallsorts des Reflexionslichtbündels den Abstand des Deck- oder Tragglases von dem Objektiv längs dessen optischer Achse als Messgröße zu ermitteln. In dieser Ausführungsform kann die Messvorrichtung als Autofokusvorrichtung oder als Teil einer solchen verwendet werden.
Insbesondere kann mittels dieser Ausführungsform auch eine Verkippung des Deck- o- der Tragglases als Messgröße bestimmt werden. Hierzu werden auf der Oberfläche des Deck- oder Tragglases mindestens drei Messpunkte, die eine Ebene aufspannen, defi- niert. Für jeden der drei Messpunkte wird der Abstand des jeweiligen Messpunktes von dem Objektiv längs dessen optischer Achse ermittelt. Anschließend wird auf Grundlage der ermittelten Abstände eine Verkippung der durch die drei Messpunkte aufgespannten Ebene relativ zur optischen Achse des Objektivs als Verkippung der Oberfläche des Deckglases bestimmt. Hierbei wird angenommen, dass die durch die mindestens drei Messpunkte aufge- spannte Ebene koplanar zur genannten Oberfläche des Deck- oder Tragglases ist. Die Verkippung dieser Ebene relativ zur optischen Achse des Objektivs spiegelt daher die Verkippung des Deck- oder Tragglases wider. Jeder der mindestens drei Messpunkte ist jeweils durch drei Koordinaten bestimmt, von denen eine den zu bestimmenden Ab- stand des Messpunktes von dem Objektiv längs dessen optischer Achse angibt, wäh- rend die beiden anderen Koordinaten die Lage des jeweiligen Messpunktes auf der Oberfläche des Deckglases festlegen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat das Deck- oder Tragglas eine wei- tere Oberfläche, die eine weitere teilreflektierende Grenzfläche definiert. Die beiden Grenzflächen sind dabei in unterschiedlichen Abständen von dem Objektiv angeord- net. Ferner ist die Messvorrichtung in dieser Ausführungsform ausgebildet, ein weite- res Reflexionslichtbündel zu erzeugen, indem das Lichtblatt zum Teil an der weiteren Grenzfläche reflektiert wird, und das weitere Reflexionslichtbündel durch das Objektiv zu empfangen und auf den Sensor zu lenken. Der Sensor ist ausgebildet, die Intensität und/oder den Einfallsort des weiteren Reflexionslichtbündels zu erfassen. Der Prozes- sor ist ausgebildet, auf Grundlage der erfassten Intensitäten und/oder Einfallsorte der beiden Reflexionslichtbündel die Messgröße zu ermitteln.
Hierdurch können Messgrößen ermittelt werden, deren Ermittlung nur auf Grundlage der erfassten Intensität und/oder des Einfallsorts eines einzigen Reflexionslichtbündels nicht möglich wäre. Solche Messgrößen sind insbesondere die Dicke des Deck- oder Tragglases und die Brechungsindizes von an das Deck- oder Tragglas grenzenden opti- schen Medien. Dies erhöht die Flexibilität des Lichtblattmikroskops.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Prozessor ausgebildet, auf Grundlage der erfassten Einfallsorte der beiden Reflexionslichtbündel die Dicke des Deck- oder Tragglases als Messgröße zu bestimmen. Hierbei ist die ermittelte Dicke des Deck- oder Tragglases durch den Abstand der beiden teilreflektierenden Grenzflächen längs der optischen Achse des Objektivs gegeben. Zur Bestimmung dieses Abstands werden die beiden Teilreflektionen genutzt, die durch die Messvorrichtung das auf das Deck- oder Tragglas gelenkte Lichtblatt an den beiden Grenzflächen erfährt, die durch die einan- der entgegengesetzten Oberflächen des Deck- oder Tragglases sowie daran angren- zende optische Medien gebildet sind. Da sich der Brechungsindex des Deck- oder Tragglases von den Brechungsindizes der beiden angrenzenden optischen Medien un- terscheidet, tritt an den beiden Grenzflächen jeweils ein Sprung im Brechungsindex auf, der zu den Teilreflexionen führt. Da die beiden Grenzflächen voneinander beab- standet sind und das Lichtblatt bezüglich der optischen Achse des Objektivs schräg auf die Grenzflächen fällt, erfolgt eine räumliche Trennung der beiden an den Grenzflä- chen entstehenden Reflexionslichtbündel. Diese räumliche Trennung spiegelt sich in den Einfallsorten wider, an denen die beiden Reflexionslichtbündel auf den Detektor treffen. Somit korrelieren die erfassten Einfallsorte der Reflexionslichtbündel eindeutig mit dem Abstand, den die beiden teilreflektierenden Grenzflächen längs der optischen Achse des Objektivs aufweisen, was zur Dickenmessung genutzt wird.
Zu beachten ist hierbei, dass in dieser bevorzugten Ausführungsform dasjenige der bei- den Reflexionslichtbündel, das an der von dem Objektiv abgewandten Grenzfläche ent- steht, zunächst das Deck- oder Tragglas selbst durchläuft und an der dann durchlaufe- nen, dem Objektiv zugewandten Grenzfläche gebrochen wird, bevor es in das Objektiv gelangt. Daraus resultiert eine Fokusverschiebung, was bedeutet, dass die optische Di- cke des Deck- oder Tragglases als Messgröße bestimmt wird.
In einer speziellen Ausführungsform ist die Messvorrichtung ausgebildet, die beiden Reflexionslichtbündel gleichzeitig auf den Detektor zu lenken und die Dicke des Deck- oder Tragglases anhand des gegenseitigen Abstandes der unterschiedlichen Einfalls- orte der beiden Reflexionslichtbündel zu ermitteln. Diese spezielle Ausführungsform ist insbesondere auf Deck- oder Traggläser ausgelegt, die bezogen auf die Objektivvergrö- ßerung relativ dünn sind. In diesem Fall ist nämlich die räumliche Trennung der beiden Reflexionslichtbündel entsprechend gering, so dass sich beide gleichzeitig auf dem De- tektor erfassen lassen.
In einer alternativen Ausführungsform ist die Messvorrichtung ausgebildet, die beiden Reflexionslichtbündel nacheinander auf den Detektor zu lenken. Dies bedeutet, dass die Messvorrichtung zu einem gegebenen Zeitpunkt nur jeweils eines der Reflexions- lichtbündel auf dem Detektor erfasst. Eine solche Ausführungsform ist insbesondere auf Deck- oder Traggläser ausgelegt, die bezogen auf die Objektivvergrößerung ver- gleichsweise dick sind. In diesem Fall ist der gegenseitige Abstand der beiden Grenzflä- chen, an denen die Reflexionslichtbündel entstehen, so groß, dass die damit einherge- hende räumliche Trennung der Reflexionslichtbündel es unmöglich macht, beide Refle- xionslichtbündel gleichzeitig auf dem Detektor zu empfangen.
Lenkt die Messvorrichtung die beiden Reflexionslichtbündel nacheinander auf den De- tektor, so ist es vorteilhaft, wenn die Messvorrichtung ausgebildet ist, den Einfallsort des zuerst auf den Detektor geleiteten Reflexionslichtbündels zu erfassen, anschlie- ßend einen Betriebsparameter des Lichtblattmikroskops so einzustellen, dass der Ein- fallsort des nachfolgend auf den Detektor geleiteten Reflexionslichtbündels mit dem zuvor erfassten Einfallsort übereinstimmt, und dann die Dicke des Deck- oder Traggla- ses anhand des Betriebsparameters zu ermitteln.
In der vorgenannten Ausführungsform ist der Prozessor vorzugsweise ausgebildet, den Abstand zwischen dem Deck- oder Tragglas und dem Objektiv als Betriebsparameter einzustellen. Dieser längs der optischen Achse des Objektivs bemessene Abstand kann beispielsweise über eine geeignete Verstellvorrichtung, etwa einen sogenannten z- Trieb, verändert werden. In diesem Fall ergeben sich zwei Einstellwerte des z-Triebs, aus deren Differenz sich die optische Dicke des Deck- oder Tragglases ermitteln lässt. Alternativ ist die Messvorrichtung ausgebildet, die Position einer in dem Lichtblattmik- roskop vorgesehenen, verschiebbaren Fokussierlinse als Betriebsparameter einzustel- len. Aus der Positionsänderung dieser verschiebbaren Fokussierlinse kann dann unter Berücksichtigung der optischen Abbildungsverhältnisse die optische Dicke des Deck- oder Tragglases als die Messgröße ermittelt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Prozessor ausgebildet, anhand der opti- schen Dicke eine mechanische Dicke des Deck- oder Tragglases unter Berücksichtigung der Brechungsindizes des Deck- oder Tragglases und eines optischen Mediums, das so- wohl an das Objektiv als auch an dem Deck- oder Tragglas angrenzt, als Messgröße zu ermitteln. Das vorgenannte optische Medium ist beispielsweise ein Immersionsme- dium, das sich zwischen dem Deck- oder Tragglas und dem Objektiv befindet. Sind die Brechungsindizes des Deck- oder Tragglases und des Immersionsmediums bekannt, so lässt sich die mechanische Dicke des Deck- oder Tragglases auf Basis der zuvor ermit- telten optischen Dicke nach der folgenden Beziehung berechnen: worin dmech die mechanische Dicke, dopt die optische Dicke, ng den Brechungsindex des Deck- oder Tragglases und nim den Brechungsindex des Immersionsmediums bezeich- net.
Soll die mechanische Dicke des Deck- oder Tragglases besonders präzise ermittelt wer- den, so wird zusätzlich die numerische Apertur des Hauptstrahls des Lichtblatts im Pro- benraum berücksichtigt. Dies erfolgt vorzugsweise gemäß der folgenden Beziehung: worin NA die numerische Apertur des Hauptstrahls des Lichtblatts im Probenraum be- zeichnet.
Die numerische Apertur NA ist gegeben durch das Produkt aus dem Brechungsindex nim des Immersionsmediums und dem Einfallswinkel, unter dem das aus dem Objektiv austretende Messlichtbündel gegenüber der optischen Achse auf das Deck- oder Trag- glas fällt. Im Übrigen können in der Berechnung der mechanischen Dicke die üblichen Abbildungsfehler berücksichtigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die beiden Grenzflächen dadurch gebildet, dass zwei optische Medien in dem Probenraum an die beiden Oberflächen des Deck- oder Tragglases grenzen. Ferner ist der Prozessor ausgebildet, auf Grundlage der er- fassten Intensitäten der beiden Reflexionslichtbündel den Brechungsindex eines der beiden optischen Medien als Messgröße zu bestimmen.
Die Intensitäten der beiden Reflexionslichtbündel hängen von der Reflexion und der Transmission des Lichtblatts an den beiden Grenzflächen ab, die durch das Deck- oder Tragglas und die beiden optischen Medien, die von entgegengesetzten Seiten her an das Deck- oder Tragglas grenzen, definiert sind. Die Reflexions- und Transmissionsvor- gänge, auf denen letztlich die Intensitäten der beiden räumlich voneinander getrenn- ten Reflexionslichtbündel beruhen, werden somit wesentlich durch die Brechungsindi- zes des Deck- oder Tragglases sowie der an das Deck- oder Tragglas grenzenden opti- schen Medien bestimmt. Sind der Brechungsindex des Deck- oder Tragglases sowie der Brechungsindex eines der beiden daran angrenzenden optischen Medien bekannt, so lässt sich der Brechungsindex des anderen Mediums zuverlässig aus den durch den De- tektor erfassten Intensitäten und der Kenntnis des Einfallswinkels des Messlichtbün- dels im Probenraum bestimmen.
Die räumliche Trennung der beiden Reflexionslichtbündel ergibt sich dabei dadurch, dass die Messvorrichtung das Lichtblatt schräg auf das Deck- oder Tragglas lenkt. Da die beiden teilreflektierenden Grenzflächen axial zueinander versetzt, d.h. entlang der optischen Achse des Objektivs voneinander beabstandet sind, sorgt der schräge Einfall des Lichtblatts auf die beiden Grenzflächen dafür, dass die beiden Reflexionslichtbün- del auf unterschiedlichen optischen Wegen zurück in das Objektiv reflektiert werden. Im Ergebnis werden so die beiden Reflexionslichtbündel auf dem Detektor an verschie- denen Einfallsorten getrennt voneinander erfasst.
Vorzugsweise ist der Prozessor ausgebildet, den Brechungsindex des einen optischen Mediums auf Grundlage des Verhältnisses der Intensitäten der beiden Reflexionslicht- bündel als Messgröße zu ermitteln. Dadurch ist die Messung des Brechungsindex gleichsam selbstrefentiell. Dies bedeutet, dass der Brechungsindex unabhängig von der Intensität des Messlichtbündels bestimmt werden kann, d.h. keine Kenntnis dieser In- tensität erforderlich ist.
Vorzugsweise ist das optische Medium, dessen Brechungsindex mittels der Messvor- richtung als Messgröße zu bestimmen ist, ein Einbettmedium für eine Probe, das an eine der beiden Oberflächen des Deck- oder Tragglases grenzt. In diesem Fall ist das andere optische Medium, dessen Brechungsindex von vorneherein bekannt ist, vor- zugsweise ein Immersionsmedium, das einerseits an die andere Oberfläche des Deck- oder Tragglases und andererseits an das Objektiv grenzt. Es ist jedoch auch möglich, mittels der Messvorrichtung den Brechungsindex jedes beliebigen Mediums zu ermit- teln, sofern dieses unmittelbar an eine der beiden Oberflächen des Deck- oder Traggla- ses grenzt und dadurch eine teilreflektierende Grenzfläche bildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Messvorrichtung ausgebildet, durch das Lichtblatt an der Grenzfläche ein Messmuster zu erzeugen und das Messmuster durch das Reflexionslichtbündel auf den Sensor abzubilden. Ferner ist der Sensor ausgebildet, das Messmuster in Form einer räumlichen Intensitätsverteilung zu erfassen, und die Messvorrichtung ist ausgebildet, aus der räumlichen Intensitätsverteilung die Intensi- tät des Reflexionslichtbündels zu bestimmen. Vorzugsweise wird das auf den Detektor abgebildete Messmuster in Form einer räum- lichen Intensitätsverteilung erfasst, aus der die Intensität des Reflexionslichtbündels bestimmt wird. Ist das auf den Detektor abgebildete Messmuster beispielsweise durch das Bild des Querschnitts des Lichtblatts senkrecht zu seiner Ausbreitungsrichtung ge- geben, so erhält man die vorgenannte Intensitätsverteilung, indem das jeweilige Bild auf dem Detektor über eine Richtung integriert wird, die parallel zur Längsausrichtung des Querschnitts des Lichtblatts liegt.
Vorzugsweise ist der Sensor ein Flächendetektor oder ein Zeilendetektor. Ein Zeilende- tektor erlaubt es, die Messvorrichtung besonders kostengünstig herzustellen. Ein Flä- chendetektor erhöht die Flexibilität der Messvorrichtung, und kann beispielsweise schon als Detektionseinheit des Lichtblattmikroskops vorhanden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Lichtblattmikroskop eine Detekti- onseinrichtung mit einem weiteren Sensor zum Erfassen des von der Probe ausgehen- den Detektionslichts und einer Strahlteilereinheit, die ausgebildet ist, dass Reflexions- lichtbündel auf den Sensor und das Detektionslicht auf den weiteren Sensor zu lenken. Das Lichtblattmikroskop umfasst in dieser Ausführungsform zwei Sensoren, die jeweils nur eine Funktion haben. Dies erlaubt den Einsatz von spezialisierten Sensoren und da- mit eine zuverlässigere Erfassung sowohl des Reflexionslichtbündels als auch des De- tektionslichts. Hierdurch wird die Ermittlung der Messgröße zuverlässiger.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Lichtblattmikroskop ein dem Sensor vorschaltbares Filter, das für das Reflexionslichtbündel undurchlässig ist. Dies verhindert, dass das Reflexionslichtbündel eine Erfassung des von der Probe aus- gehenden Detektionslichts beeinflusst. Durch die Schaltbarkeit des Filters kann der Sensor sowohl zur Erfassung des Reflexionslichtbündels als auch des Detektionslichts verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Lichtblattmikroskop ein Abtastelement, das ausgebildet ist, das Lichtblatt längs einer Abtastachse zu bewegen. Bei dem Abtastelement handelt es sich beispielsweise um einen beweglichen Rasterspiegel.
Alternativ oder zusätzlich weist das Lichtblattmikroskop eine elektronische Fokussier- einrichtung auf, die ausgebildet ist, das Lichtblatt auf verschiedene Ebenen in dem Pro- benraum zu fokussieren. Auch hierdurch kann das Lichtblatt längs der Abtastachse be- wegt werden.
Erfolgt eine Abtastung längs zur optischen Achse des Objektivs, wird das Lichtblattmik- roskop häufig auch als OPM (OPM: oblique plane microscope) bezeichnet. Erfolgt die Abtastung lateral zur optischen Achse des Objektivs, wird das Lichtblattmikroskop häu- fig auch als SCAPE-Mikroskop (SCAPE: swept confocally-aligned planar excitation) be- zeichnet. Diese Bezeichnungen werden jedoch nicht immer eindeutig verwendet. So existieren auch sogenannte Stage-Scanning-Mikroskope (ssOPM), bei denen ein Ob- jekttisch die Probe lateral zur optischen Achse bewegt.
Vorzugsweise ist die Messvorrichtung ausgebildet, das Lichtblatt durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deck- oder Tragglas zu lenken, und/oder das Reflexions- lichtbündel durch das Objektiv zu empfangen und auf den Sensor zu lenken. In dieser Ausführungsform bildet das Objektiv ein gemeinsames Objektiv für Beleuchtung und Detektion. Alternativ umfasst das Optiksystem ein weiteres Objektiv, und die Messvor- richtung ist ausgebildet, das Lichtblatt durch dieses weitere Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deck- oder Tragglas zu lenken. In dieser alternativen Ausführungsform bildet das weitere Objektiv ein separates Beleuchtungsobjektiv.
Vorzugsweise umfasst das Lichtblattmikroskop eine Transportoptik, die ausgebildet ist, das von der Beleuchtungseinrichtung in einem Zwischenbildraum erzeugte Lichtblatt in die Probe abzubilden. Vorzugsweise umfasst der Prozessor einen Speicher, in dem Parameter zur Ermittlung der Messgröße speicherbar sind.
Vorzugsweise sind die beiden Oberflächen des Deck- oder Tragglases planparallel zuei- nander ausgebildet.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Erfassen einer Messgröße mittels eines Lichtblattmikroskops. Das Verfahren hat die vorstehend beschriebenen Vorteile und kann auf die gleiche Weise, insbesondere durch die auf das Lichtblattmikroskop bezo- genen Merkmale der abhängigen Ansprüche, weitergebildet werden.
Kurzbeschreibung der Figuren
Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die mehrere Ausführungsformen in Verbindung mit den beigefügten Figuren näher erläu- tert.
Es zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines Lichtblattmikroskops, das eine Ab- tastung lateral zur optischen Achse des Objektivs vorsieht, gemäß einer Ausführungsform;
Figur 2 eine schematische Darstellung des Lichtblattmikroskops, das eine Abtas- tung lateral zur optischen Achse des Objektivs vorsieht, gemäß einer Ausführungsform mit zwei Sensoren;
Figur 3 eine schematische Darstellung des Lichtblattmikroskops, das eine Abtas- tung längs der optischen Achse des Objektives vorsieht, gemäß einer Ausführungsform; Figur 4 eine schematische Darstellung des Lichtblattmikroskops, das eine Abtas- tung längs der optischen Achse des Objektives vorsieht, gemäß einer Ausführungsform mit zwei Sensoren;
Figur 5 eine schematische Darstellung, die einen Probenraum des Lichtblattmik- roskops zeigt;
Figur 6 eine durch einen positionssensitiven Detektor des Lichtblattmikroskops erfasste Intensitätsverteilung mit einem Intensitätsmaximum;
Figur 7 eine weitere schematische Darstellung, die den Probenraum des Licht- blattmikroskops zeigt; und
Figur 8 eine durch den positionssensitiven Detektor des Lichtblattmikroskops erfasste Intensitätsverteilung mit zwei Intensitätsmaxima.
Detaillierte Beschreibung
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Lichtblattmikroskops 100 in einer speziellen Ausführungsform, die eine Abtastung lateral zur optischen Achse 02 eines Objektivs 120 vorsieht. Wie aus der folgenden Beschreibung ersichtlich wird, ermög- licht das Lichtblattmikroskop 100 zusätzlich zu einer lichtblattmikroskopischen Bildge- bung die Erfassung einer die Bildgebung beeinflussenden Messgröße. Insoweit bildet das Lichtblattmikroskop 100 zugleich eine Messvorrichtung für diese Messgröße.
Das Lichtblattmikroskop 100 umfasst eine Beleuchtungseinrichtung 102, eine Trans- portoptik 104 und eine Detektionseinrichtung 106, die gemeinsam ein Optiksystem 107 bilden. Die optische Achse OB der Detektionseinrichtung 106 ist gegenüber der op- tischen Achse 02 der Transportoptik 104 um einen Kippwinkel a verkippt. Die optische Achse 01 der Beleuchtungseinrichtung 102 steht senkrecht auf der optischen Achse OB der Detektionseinrichtung 106, so dass die optische Achse 01 der Beleuchtungseinrich- tung 102 gegenüber der optischen Achse 02 der Transportoptik 104 um einen Winkel 90° - a verkippt ist. Die drei vorgenannten optischen Achsen 01, 02, 03 schneiden sich in einem Zwischenbildraum 108. In einem Probenraum 116 des Lichtblattmikroskop 100 sind ein Deck- oder Tragglas, das im Folgenden einfach als Deckglas 118 bezeich- net wird, und zwei optische Medien 117, 119 angeordnet, die jeweils an das Deckglas 118 angrenzen. Ferner weist das Lichtblattmikroskop 100 einen Prozessor 110 auf.
Die Beleuchtungseinrichtung 102 umfasst eine Lichtquelle 112 und ein Beleuchtungs- objektiv 114. Die Lichtquelle 112 erzeugt ein Lichtblatt, beispielsweise mit Hilfe einer in Figur 1 nicht explizit gezeigten Zylinderlinse, wobei sich das Lichtblatt unter Bezug- nahme auf ein in Figur 1 dargestelltes schiefwinkliges Koordinatensystem in einer Lichtausbreitungsrichtung A und einer hierzu senkrechten Ausdehnungsrichtung B er- streckt. Alternativ kann die Lichtquelle 112 mittels eines eigens hierfür vorgesehenen Abtastelements auch ein quasistatisches Lichtblatt erzeugen. Das Beleuchtungsobjek- tiv 114 bildet das Lichtblatt in den Zwischenbildraum 108 ab. Alternativ kann das Licht- blatt auch direkt in die Transportoptik 104 eingekoppelt werden.
Die Transportoptik 104 umfasst von dem Probenraum 116 her gesehen das dem Deck- glas 118 zugewandte Objektiv 120, eine erste Tubuslinse 122, ein erstes Okular 124, ein zweites Okular 126, eine zweite Tubuslinse 128 und ein Projektionsobjektiv 130, die längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 104 angeordnet sind. Zwischen dem ersten Okular 124 und dem zweiten Okular 126 ist eine Abtastvorrichtung ange- ordnet, die in der gezeigten Ausführungsform durch einen Rasterspiegel 132 gebildet ist, an dem die optische Achse 02 der Transportoptik 104 umgelenkt wird. Mit Hilfe des beweglichen Rasterspiegels 132 kann das Lichtblatt längs einer Abtastrichtung C, die senkrecht zur optischen Achse 02 der Transportoptik 104 liegt, bewegt werden. Die Transportoptik 104 bildet das Lichtblatt aus dem Zwischenbildraum 108 in den Pro- benraum 116 ab. Das Lichtblatt verläuft dabei mit einem Parallelversatz zur optischen Achse 02 der Transportoptik 104. Auf diese Weise wird das Lichtblatt 134 in einen Teil- bereich einer Eintrittspupille 136 des Objektivs 120 geleitet, der gegenüber optischen Achse 02 der Transportoptik 104 und damit gegenüber der Mitte der Eintrittspupille 136 seitlich versetzt ist (vgl. Figuren 5 und 7). Die Eintrittspupille 136 des Objektivs 120 wird somit dezentral unterleuchtet, was dazu führt, dass das Lichtblatt unter einem Winkel ß schräg zur optischen Achse 02 in den Probenraum 116 gelenkt wird. Die Transportoptik 104 bildet den Zwischenbildraum 108 winkeltreu in den Probenraum 116 ab. Dies bedeutet insbesondere, dass ß = 90° - a gilt.
Das unter schrägem Einfall geleitete in den Probenraum 116 geleitete Lichtblatt wird, wie weiter unten unter Bezugnahme auf die Figuren 5 und 7 genauer erläutert ist, an einer oder zwei Oberflächen 138, 140 des Deckglases 118 reflektiert, wodurch ein in das Objektiv 120 zurückgeleitetes Reflexionslichtbündel 142 entsteht. Das Reflexions- lichtbündel 142 wird durch die Transportoptik 104 aus dem Probenraum 116 in den Zwischenbildraum 108 abgebildet.
Die Detektionseinrichtung 106 umfasst von dem Zwischenbildraum 108 her gesehen ein Detektionsobjektiv 144, eine Tubuslinse 146, ein vorschaltbares Filter 148 und ei- nen vorzugsweise positionssensitiven Sensor 150. Das in dem Zwischenbildraum 108 liegende Zwischenbild des Reflexionslichtbündels 142 wird durch das Detektionsobjek- tiv 144 und die Tubuslinse 146 auf den positionssensitiven Sensor 150 abgebildet. Das vorschaltbare Filter 148 kann in den Strahlengang der Detektionseinrichtung 106 ein- gebracht und so dem positionssensitiven Sensor 150 vorgeschaltet werden. Hierdurch kann verhindert werden, dass das Reflexionslichtbündel 142 auf den positionssensiti- ven Sensor 150 fällt, wenn dieser für die Erfassung von Detektionslicht genutzt werden soll, das von einer Probe in dem Probenraum 116 ausgeht. Hierdurch werden durch das Reflexionslichtbündel 142 erzeugte unerwünschte Störreflexe vermieden. Der Prozessor 110 ist mit der Lichtquelle 112, dem Rasterspiegel 132, dem positions- sensitiven Sensor 150 und mit einem sogenannten z-Trieb 111 verbunden, der, bei- spielsweise durch bewegen eines Mikroskoptisches, die Position des Deckglases 118 längs der optischen Achse 02 des Objektivs 120 verändern kann. Der Prozessor 110 ist ausgebildet, auf Grundlage der erfassten Intensität und/oder des Einfallsorts des Refle- xionslichtbündels 142 die Messgröße zu ermitteln. Der Prozessor 110 hat ferner einen Speicher 154, in dem Parameter zur Ermittlung der Messgröße speicherbar sind.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Lichtblattmikroskops 200, das eine Abtastung lateral zur optischen Achse 02 des Objektivs 120 vorsieht. Das Lichtblatt- mikroskop 200 stellt eine abgewandelte Ausführungsform mit zwei Sensoren 150, 202 dar. Das Lichtblattmikroskop 200 nach Figur 2 unterscheidet sich von der Ausführungs- form gemäß Figur 1 somit im Wesentlichen durch den weiteren Sensor 202 sowie eine Strahlteilereinheit 204, die ausgebildet ist, dass Reflexionslichtbündel 142 auf den po- sitionssensitiven Sensor 150 und Detektionslicht auf den weiteren Sensor 202 zu len- ken. Gleiche und gleichwirkende Elemente sind in den Figuren 1 und 2 mit den glei- chen Bezugszeichen bezeichnet.
Bei den in den Figuren 1 und 2 gezeigten Ausführungsformen erfolgt eine Abtastung mittels des Lichtblatts in der Weise, dass das Lichtblatt in Abtastrichtung C quer zur op- tischen Achse 02 des Objektivs 120 bewegt wird. Demgegenüber ist in Figur 3 ein Lichtblattmikroskops 300 als modifizierte Ausführungsform gezeigt, die sich von der Ausführungsform nach Figur 1 im Wesentlichen dadurch unterscheidet, dass die Abtas- tung durch das Lichtblatt axial, d.h. längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 104 erfolgt. Gleiche und gleichwirkende Elemente sind in den Figuren 1 bis 3 mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet.
In der in Figur 3 gezeigten Ausführungsform umfasst die Transportoptik 104 von dem Zwischenbildraum 108 her gesehen das Projektionsobjektiv 130, die beiden Tubuslin- sen 122, 128 und das dem Deckglas 118 zugewandte Objektiv 120. Das Projektionsob- jektiv 130 weist eine elektronische Fokussiereinrichtung 302 auf, die ausgebildet ist, das Lichtblatt 134 auf verschiedene Ebenen in dem Probenraum 116 zu fokussieren.
In der Ausführungsform nach Figur 3 ist die Abtastvorrichtung durch die elektronische Fokussiereinrichtung 302 gebildet. Durch die elektronische Fokussiereinrichtung 302 sind das Lichtblatt und gleichzeitig die dazu koplanare Detektionsebene längs der opti- schen Achse 02 der Transportoptik 104 bewegbar.
Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung eines Lichtblattmikroskops 400, das eine Abtastung längs der optischen Achse 02 des Objektivs 120 vorsieht, gemäß einer Aus- führungsform mit zwei Sensoren 150, 202. Die Ausführungsform des Lichtblattmikro- skops 400 nach Figur 4 unterscheidet sich von der Ausführungsform des Lichtblattmik- roskops 300 nach Figur 3 im Wesentlichen durch den weiteren Sensor 202 und die Strahlteilereinheit 204. Gleiche und gleichwirkende Elemente sind in den Figuren 1 bis 4 mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet.
Figur 5 ist eine schematische Darstellung, die den Probenraum 116 des Lichtblattmik- roskops 100, 200, 300, 400 zeigt. In Figur 5 ist gezeigt, wie durch Reflexion des Licht- blatt 134 an zunächst einer der Oberflächen 138, 140 des Deckglases 118 das Reflexi- onslichtbündel 142 erzeugt wird.
Gemäß Figur 5 wird das die Eintrittspupille 136 des Objektivs 120 dezentral unter- leuchtende Lichtblatt 134 durch das Objektiv 120 unter einem Winkel ß schräg zur op- tischen Achse 02 auf die dem Objektiv 120 zugewandte, in Figur 5 mit 138 bezeichnete Vorderfläche des Deckglases 118 gelenkt. Da das Deckglas 118 und ein an dessen Vor- derfläche 138 grenzendes Immersionsmedium 119 unterschiedliche Brechungsindizes aufweisen, bilden die Vorderfläche 138 des Deckglases 118 und das daran angren- zende Immersionsmedium 119 eine Grenzfläche, an der das einfallende Lichtblatt 134 zum Teil reflektiert wird. Der an dieser Grenzfläche reflektierte Teil des Messlichtbün- dels 134 erzeugt das Reflexionslichtbündel 142, das zurück in das Objektiv 120 geleitet wird.
Figur 6 zeigt eine Intensitätsverteilung V, die das Reflexionslichtbündel 54 auf dem po- sitionssensitiven Detektor 150 erzeugt. Dabei gibt die Abszisse des Diagramms nach Fi- gur 6 den Einfallsort auf dem Detektor 150 und die Ordinate die an dem jeweiligen Ein- fallsort gemessene Intensität wieder. Die Intensitätsverteilung V nach Figur 6 zeigt ei- nen Peak P, dessen Lage X, die auf dem positionssensitiven Detektor 150 bezüglich ei- ner Referenzlage Xref bestimmbar ist, ein Maß für den als Messgröße zu bestimmen- den Abstand z ist, den die Oberfläche 138, 140 des Deckglases 118 längs der optischen Achse 02 von dem Objektiv 120 aufweist. Weiterhin ist die Fläche unter P ein Maß für die Intensität des an der Oberfläche 138, 140 reflektierten Lichtes.
Figur 7 ist eine schematische Darstellung, die den Probenraum 116 des Lichtblattmik- roskops 100, 200, 300, 400 zeigt. In Figur 7 ist nun gezeigt, wie durch Reflexion des Lichtblatt 134 an beiden Oberflächen 138, 140 des Deckglases 118 das Reflexionslicht- bündel 142 erzeugt wird.
Demnach wird das die Eintrittspupille 136 des Objektivs 120 dezentral unterleuch- tende Lichtblatt 134 durch das Objektiv 120 unter dem Winkel ß schräg zur optischen Achse 02 auf die dem Objektiv 120 zugewandte Vorderfläche 138 des Deckglases 118 gelenkt. Ein erster Teil des Lichtblattes, der in Figur 7 mit 134a bezeichnet ist, wird an der von der Vorderfläche 138 des Deckglases 118 und dem daran angrenzenden Im- mersionsmedium 119 gebildeten ersten Grenzfläche zum Teil reflektiert. Der an dieser ersten Grenzfläche reflektierte Teil des Messlichtbündels erzeugt ein erstes Reflexions- lichtbündel 142a, das zurück in das Objektiv 120 geleitet wird. Der andere Teil 152 des Lichtblatts 134, der die erste Grenzfläche transmittiert, wird beim Eintritt in das Deckglas 118 von der optischen Achse 02 des Objektivs 120 wegge- brochen und schließt mit dieser einen Winkel g ein, der größer als der Winkel ß ist. Die- ser transmittierte Teil 152 des Lichtblatts 134 wird zum Teil an einer zweiten Grenzflä- che reflektiert, die durch die Rückfläche 140 des Deckglases 118 und ein daran angren- zendes Einbettmedium 117 definiert ist, das einen anderen Brechungsindex als das Deckglas 118 aufweist. Durch diese zweite Teilreflexion des Lichtblatts 134 an der zweiten Grenzfläche wird das zweite Reflexionslichtbündel 142b erzeugt, das durch die Vorderfläche 138 des Deckglases 118 tritt und dann zurück in das Objektiv 120 gelangt.
Wie in der Darstellung nach Figur 7 veranschaulicht ist, sorgt der schräge Einfall des Lichtblatts 134 in den Probenraum 116 dafür, dass die durch die beiden Teilreflexionen an der Vorderfläche 138 bzw. der Rückfläche 140 des Deckglases 118 erzeugten Refle- xionslichtbündel 142a, 142b auf unterschiedlichen optischen Wegen zurück in das Ob- jektiv 120 gelangen. Auf diese Weise treffen die beiden Reflexionslichtbündel 142a, 142b an verschiedenen Einfallsorten auf den positionssensitiven Detektor 150, sofern sichergestellt ist, dass beide Reflexionslichtbündel 142a, 142b gleichzeitig auf den De- tektor 150 fallen. Mit anderen Worten, werden die beiden an der Vorderfläche 138 bzw. der Rückfläche 140 des Deckglases 118 generierten Bilder des Querschnitts des Lichtblatts 134 räumlich voneinander getrennt auf den positionssensitiven Detektor 150 abgebildet, wie in dem folgenden Diagramm nach Figur 8 veranschaulicht ist.
Figur 8 zeigt eine beispielhafte Intensitätsverteilung V, welche die beiden Reflexions- lichtbündel 142a, 142b gemeinsam auf dem positionssensitiven Detektor 150 erzeu- gen. Dabei gibt die Abszisse des Diagramms den Einfallsort auf dem Detektor 150 und die Ordinate die an dem jeweiligen Einfallsort gemessene Intensität wider. Die Intensi- tätsverteilung V nach Figur 8 zeigt zwei Peaks, von denen der mit PI bezeichnete Peak dem ersten Reflexionslichtbündel 142a und der mit P2 bezeichnete Peak dem zweiten Reflexionslichtbündel 142b zugeordnet ist. Aus dem Umstand, dass der Peak PI höher und schärfer als der Peak P2 ist, lässt sich erkennen, dass in dem Beispiel nach Figur 7 das Lichtblatt 134 auf die Vorderfläche 138 des Deckglases 118 fokussiert ist. Demge- genüber findet die zweite Teilreflexion an der Rückfläche 140 des Deckglases 188 an einem hierzu quer zur optischen Achse O2 versetzten Punkt statt. Die Flächen unter- halb der in Figur 8 gezeigten Peaks PI, P2 sind jeweils ein Maß für die Intensität des je- weiligen Reflexionslichtbündels 142a, 142b. Aus deren Verhältnis lässt sich beispiels- weise der Brechungsindex eines der beiden optischen Medien 117, 119 als Messgröße bestimmen.
In dem Beispiel nach Figur 8 ist eine Situation gezeigt, in der die beiden Reflexionslicht- bündel 142a, 142b gleichzeitig auf den positionssensitiven Detektor 150 fallen. Dies bedeutet, dass die räumliche Aufspaltung der beiden Reflexionslichtbündel 142a,
142b, die mit der Dicke des Deckglases 118 korrespondiert, vergleichsweise gering ist. Mit anderen Worten ist in dem Beispiel nach Figur 8 die als Messgröße zu erfassende Dicke des Deckglases 118 bezogen auf die Objektivvergrößerung relativ gering. Es ist jedoch auch eine Situation denkbar, in der die mit der zu erfassenden Dicke des Deck- glases 118 korrespondierende räumliche Aufspaltung der Reflexionslichtbündel 142a, 142b so groß ist, dass eine gleichzeitige Erfassung der beiden Reflexionslichtbündel 142a, 142b durch den positionssensitiven Detektor 150 nicht möglich ist.
Obwohl einige Aspekte im Rahmen einer Vorrichtung beschrieben wurden, ist es klar, dass diese Aspekte auch eine Beschreibung des entsprechenden Verfahrens darstellen, wobei ein Block oder eine Vorrichtung einem Verfahrensschritt oder einer Funktion ei- nes Verfahrensschritts entspricht. Analog dazu stellen Aspekte, die im Rahmen eines Verfahrensschritts beschrieben werden, auch eine Beschreibung eines entsprechenden Blocks oder Elements oder einer Eigenschaft einer entsprechenden Vorrichtung dar. Einige oder alle Verfahrensschritte können durch (oder unter Verwendung) einer Hard- warevorrichtung ausgeführt werden, wie es zum Beispiel ein Prozessor, ein Mikropro- zessor, ein programmierbarer Computer oder eine elektronische Schaltung sein kann.
In einigen Ausführungsbeispielen können ein oder mehrere der wichtigsten Verfah- rensschritte durch eine solche Vorrichtung ausgeführt werden. Abhängig von bestimmten Implementierungsanforderungen können Ausführungsbei- spiele der Erfindung in Hardware oder Software implementiert werden. Die Implemen- tierung kann mit einem nicht-flüchtigen Speichermedium wie einem digitalen Spei- chermedium, wie beispielsweise einer Diskette, einer DVD, einem Blu-Ray, einer CD, einem ROM, einem PROM und EPROM, einem EEPROM oder einem FLASH-Speicher, durchgeführt werden, auf dem elektronisch lesbare Steuersignale gespeichert sind, die mit einem programmierbaren Computersystem so Zusammenwirken (oder Zusammen- wirken können), dass das jeweilige Verfahren durchgeführt wird. Daher kann das digi- tale Speichermedium computerlesbar sein.
Einige Ausführungsbeispiele gemäß der Erfindung umfassen einen Datenträger mit elektronisch lesbaren Steuersignalen, die mit einem programmierbaren Computersys- tem Zusammenwirken können, so dass eines der hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt wird.
Im Allgemeinen können Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung als Compu- terprogrammprodukt mit einem Programmcode implementiert werden, wobei der Programmcode für die Ausführung eines der Verfahren wirksam ist, wenn das Compu- terprogrammprodukt auf einem Computer läuft. Der Programmcode kann beispiels- weise auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert werden.
Weitere Ausführungsbeispiele umfassen das Computerprogramm zur Durchführung ei- nes der hierin beschriebenen Verfahren, das auf einem maschinenlesbaren Träger ge- speichert ist.
Mit anderen Worten, ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist daher ein Computerprogramm mit einem Programmcode zur Durchführung eines der hierin be- schriebenen Verfahren, wenn das Computerprogramm auf einem Computer läuft. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist daher ein Speicherme- dium (oder ein Datenträger oder ein computerlesbares Medium), das ein darauf ge- speichertes Computerprogramm zum Ausführen eines der hierin beschriebenen Ver- fahren umfasst, wenn es von einem Prozessor ausgeführt wird. Der Datenträger, das digitale Speichermedium oder das aufgezeichnete Medium sind in der Regel greifbar und/oder nicht übergangslos. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfin- dung ist eine Vorrichtung, wie hierin beschrieben, die einen Prozessor und das Spei- chermedium umfasst.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist daher ein Datenstrom oder eine Sig- nalfolge, die das Computerprogramm zur Durchführung eines der hierin beschriebenen Verfahren darstellt. Der Datenstrom oder die Signalfolge kann beispielsweise so konfi- guriert werden, dass sie über eine Datenkommunikationsverbindung, beispielsweise über das Internet, übertragen werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel umfasst ein Verarbeitungsmittel, zum Beispiel einen Computer oder eine programmierbare Logikvorrichtung, das konfiguriert oder ange- passt ist, um eines der hierin beschriebenen Verfahren auszuführen.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel umfasst einen Computer, auf dem das Computerpro- gramm zum Ausführen eines der hierin beschriebenen Verfahren installiert ist.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel gemäß der Erfindung umfasst eine Vorrichtung oder ein System, das konfiguriert ist, um (zum Beispiel elektronisch oder optisch) ein Com- puterprogramm zum Ausführen eines der hierin beschriebenen Verfahren an einen Empfänger zu übertragen. Der Empfänger kann beispielsweise ein Computer, eine mo- bile Vorrichtung, eine Speichervorrichtung oder dergleichen sein. Die Vorrichtung oder das System kann beispielsweise einen Dateiserver zum Übertragen des Computerpro- gramms an den Empfänger umfassen. In einigen Ausführungsbeispielen kann eine programmierbare logische Vorrichtung (z.B. eine feldprogrammierbare Gatteranordnung, FPGA) verwendet werden, um einige oder alle Funktionalitäten der hierin beschriebenen Verfahren auszuführen. In einigen Ausführungsbeispielen kann eine feldprogrammierbare Gatteranordnung mit einem Mikroprozessor Zusammenarbeiten, um eines der hierin beschriebenen Verfahren durchzuführen. Im Allgemeinen werden die Verfahren vorzugsweise von jedem Hard- waregerät durchgeführt.
Bezugszeichenliste

Claims

Ansprüche
1. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400), umfassend:
einen Probenraum (116) in dem ein Deck- oder Tragglas (118) anordenbar ist, das eine Oberfläche (138, 140) hat, die eine teilreflektierende Grenzfläche defi- niert, und das eine weitere Oberfläche (138, 140) hat, die eine weitere teilre- flektierende Grenzfläche definiert,
wobei die beiden Grenzflächen in unterschiedlichen Abständen von dem Objek- tiv (120) angeordnet sind,
ein Optiksystem (107) mit einem dem Deck- oder Tragglas (118) zugewandten Objektiv (120),
eine Beleuchtungseinrichtung (102), die ausgebildet ist, ein Lichtblatt (134) zu erzeugen,
einen Sensor (150), und
einen Prozessor (110), wobei
die beiden Grenzflächen dadurch gebildet sind, dass zwei optische Medien (117, 119) in den Probenraum (116) anbringbar sind, die an die beiden Oberflä- chen des Deck- oder Tragglases (116) grenzen,
wobei das Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) eine Messvorrichtung zum Erfassen einer Messgröße bildet, die ausgebildet ist, das Lichtblatt (134) durch das Optiksystem (107) unter schrägem Einfall auf das Deck- oder Tragglas (118) zu lenken, ein Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) zu erzeugen, indem das Lichtblatt (134) zum Teil an der Grenzfläche reflektiert wird, ein weiteres Refle- xionslichtbündel (142, 142a, 142b) zu erzeugen, indem das Lichtblatt (134) zum Teil an der weiteren Grenzfläche reflektiert wird und die beiden Reflexionslicht- bündel (142, 142a, 142b) durch das Optiksystem (107) zu empfangen und auf den Sensor (150) zu lenken,
der Sensor (150) ausgebildet ist, die Intensitäten und/oder die Einfallsorte der beiden Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) zu erfassen, der Prozessor ausgebildet ist, auf Grundlage der erfassten Intensitäten und/o- der der Einfallsorte der beiden Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) die Messgröße zu ermitteln, und
der Prozessor (110) ausgebildet ist, auf Grundlage der erfassten Intensitäten der beiden Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) den Brechungsindex eines der beiden optischen Medien (117, 119) als Messgröße zu bestimmen.
2. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach Anspruch 1, wobei der Prozessor ausgebildet ist, auf Grundlage des erfassten Einfallsorts eines der beiden Refle- xionslichtbündel (142, 142a, 142b) den Abstand des Deck- oder Tragglases (116) von dem Objektiv (120) längs dessen optischer Achse (02) als die Mess- größe zu ermitteln.
3. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach Anspruch 1 oder 2, wobei die beiden Oberflächen des Deck- oder Tragglases (116) planparallel zueinander ausgebildet sind.
4. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, wobei der Prozessor (110) ausgebildet ist, auf Grundlage der erfassten Einfallsorte der beiden Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) die Dicke des Deck- oder Tragglases (116) als Messgröße zu bestimmen.
5. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) einem der vorhergehenden Ansprü- che, wobei das eine optische Medium (119) ein Einbettmedium für eine Probe ist, das an eine der beiden Oberflächen des Deck- oder Tragglases (116) grenzt.
6. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) einem der vorhergehenden Ansprü- che, wobei das andere optische Medium (119) ein Immersionsmedium ist, das an die andere Oberfläche des Deck- oder Tragglases (116) und das Objektiv (120) grenzt.
7. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, wobei die Messvorrichtung ausgebildet ist, durch das Lichtblatt (134) an der Grenzfläche ein Messmuster zu erzeugen,
das Messmuster durch das Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) auf den Sensor (150) abzubilden,
der Sensor (150) ausgebildet ist, das Messmuster in Form einer räumlichen In- tensitätsverteilung (V) zu erfassen, und
der Prozessor (110) ausgebildet ist, aus der räumlichen Intensitätsverteilung (V) die Intensität des Reflexionslichtbündels (142, 142a, 142b) zu bestimmen.
8. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, wobei der Sensor (150) ein Flächendetektor oder ein Zeilendetektor ist.
9. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, umfassend eine Detektionseinrichtung (106) mit einem weiteren Sen- sor (202) zum Erfassen von Detektionslicht, das von der Probe ausgeht, und eine Strahlteilereinheit (204), die ausgebildet ist, dass Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) auf den Sensor (150) und das Detektionslicht auf den weite- ren Sensor (202) zu lenken.
10. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, wobei der Prozessor (110) einen Speicher (154) umfasst, in dem Para- meter zur Ermittlung der Messgröße speicherbar sind.
11. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, umfassend ein dem Sensor (150) vorschaltbares Filter (148), das für das Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) undurchlässig ist.
12. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, umfassend ein Abtastelement (132), das ausgebildet ist, das Lichtblatt (134) längs einer Abtastachse zu bewegen.
13. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, wobei die Messvorrichtung ausgebildet ist, das Lichtblatt (134) durch das Objektiv (120) unter schrägem Einfall auf das Deck- oder Tragglas (118) zu lenken, und/oder das Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) durch das Objek- tiv (120) zu empfangen und auf den Sensor (150) zu lenken.
14. Lichtblattmikroskop (100, 200, 300, 400) nach einem der vorhergehenden An- sprüche, umfassend eine Transportoptik (104), die ausgebildet ist, das von der Beleuchtungseinrichtung (102) in einem Zwischenbildraum erzeugte Lichtblatt (134) in die Probe abzubilden.
15. Verfahren zum Erfassen einer Messgröße mittels eines Lichtblattmikroskops (100, 200, 300, 400), bei dem
in einem Probenraum (116) des Lichtblattmikroskops (100, 200, 300, 400) ein Deck- oder Tragglas (118) angeordnet wird, das eine Oberfläche (138, 140) hat, die eine teilreflektierende Grenzfläche definiert, und das eine weitere Oberflä- che (138, 140) hat, die eine weitere teilreflektierende Grenzfläche definiert, wobei die beiden Grenzflächen in unterschiedlichen Abständen von dem Objek- tiv (120) angeordnet sind,
ein Lichtblatt (134) unter schrägem Einfall auf das Deck- oder Tragglas (118) ge- lenkt wird,
ein Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) erzeugt wird, indem das Lichtblatt (134) zum Teil an der Grenzfläche reflektiert wird,
ein weiteres Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) erzeugt wird, indem das Lichtblatt (134) zum Teil an der weiteren Grenzfläche reflektiert wird, wobei die beiden Grenzflächen dadurch gebildet sind, dass zwei optische Me- dien (117, 119) in den Probenraum (116) eingebracht werden, die an die beiden Oberflächen des Deck- oder Tragglases (116) grenzen,
die beiden Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) empfangen und auf einen Sensor (150) gelenkt werden,
die Intensitäten und/oder die Einfallsorte der beiden Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) erfasst werden, und
auf Grundlage der erfassten Intensitäten und/oder der Einfallsorte der Reflexi- onslichtbündel (142, 142a, 142b) die Messgröße ermittelt wird,
auf Grundlage der erfassten Intensitäten der beiden Reflexionslichtbündel (142, 142a, 142b) der Brechungsindex eines der beiden optischen Medien (117, 119) als Messgröße bestimmt wird.
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