JP7180964B2 - 三次元イメージング装置および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、認可番号R21NS053684、R01NS076628、R01NS063226の国立衛生研究所(NINDS)、認可番号0954796の全米科学財団(キャリア)、および、アメリカ国防総省の総合的大学研究イニシアチブ(DoD)W911NF-12-1-0594による政府支援を受けてなされた。合衆国政府は本発明に対して権利を有する。
本開示は、図1(f)に示されたSCAPEの光学レイアウトの多数の代替案を含む。限定ではなく追加の光学配置の例は、図6~10に示すものと同じまたは類似のスキャン・デスキャン構成を実現する。特定の実施態様では、スキャンおよび光を戻すデスキャンの両方に1つのポリゴンスキャナを用いるのではなく、2つの物理的に分離しているスキャンミラーを用いることができる。ポリゴンミラーは、物理的に結合されて正確なスキャンおよびデスキャンを可能にする。その一方で、1秒に50~100体積という高体積速度でも、シートがスキャンされるべき速度が比較的遅ければ(それぞれ1秒につき50~100掃引)、2つの別々のミラーは容易に同期されることができる。2つ(またはそれ以上)の別々のミラーあるいは、以下に述べるような単一のミラーを用いた実施態様は、ポリゴンミラーの実施態様を上回る利点がある。第一に、ポリゴンがその回転軸に関して回転するにつれ、鏡平面が平行移動するとともに回転するので、ポリゴンの回転は、理想的なスキャンパターンで行われず、その結果、スキャン/デスキャンに誤差が生じる。第二に、ポリゴンの使用は、検出光を、対物レンズのバックアパーチャから出る光のたった半分までに制限してしまう。これは、検出光の開口数(NA)を制限することになるため、(図24および25に示されたモデルによって予測されるように)結果として生じた画像の解像度を下げ、その一方で、カメラに達する放射光の量も減少する(信号対雑音比が低下する)。開口数(NA)が大きい検出光を集光することにより、入射光シートと検出光の点拡がり関数との間の有効角は縮小するが、我々のモデルでは、イメージングの点拡がり関数へのこの変化の影響は、放射光すべてを集光することにより、NAが増大し、ポリゴンを用いるよりも解像度を全体的に向上させるというポジティブなものになると予測している。最後に、利用可能なポリゴンの物理的形状がファセットの物理的大きさを制限するので、検出のためにカメラに届く光の量はさらに減少する。ポリゴンの慣性によって高速の両側スキャンにスキューが生じる可能性がある。
SCAPEの1つの特徴としては、組織を深さに沿って光ビームまたはシートによって照明することにより、異なる深さのところからデータを収集できることである。これは、生成された画像が軸方向の広がりを有しているなら、レンズは軸方向の広がりを有する物体の画像を生成できるということである。極端な例では、画像は完全な軸平面画像であり得るが、実際には、励起平面と検出光との間の角度を大きくすることができるので、光シートの照明にはより傾斜した平面が適しており、より優れたセクショニングをもたらすことができる。しかしながら、これは、斜光シートから形成される画像は、斜めであることを意味する。カメラが斜画像面に位置合わせされているのではなく、入射する検出光に対して垂直に配置されている場合、光シートの軸方向の焦点面の上下からの光により、照明された平面のピントがぼけた画像が形成されることになる。画像全体を保持しつつ、画像回転光学部品を用いてこの斜画像面の向きを変更することにより、斜画像面は、垂直に配置されたカメラチップの正面に向けられる。この画像回転スキームにはいくつかの代替案があり、簡易化と光スループットの向上とを両立できる。これらの代替案は、SCAPEのスキャン/デスキャン光学経路の代替構造を含み、画像の回転は、本願明細書中に記載されるような異なるスキャン/デスキャンのアプローチとさまざまに組み合わせてよい。
より深い組織を撮像するためにSCAPEを用いることに関する潜在的な問題の1つに、浅い層から深い層に行くまでに検出光が減衰してしまうということがある。例えば、斜めから照明された平面の画像は、単一のカメラフレームで取得されるので、表面に一番近い部分は、非常に明るいが、深い組織の信号は、かなり暗くなってしまう。特定の実施態様では、表面は、明るい光によってさらにダメージを受け、および/または、カメラ信号は、長い積分時間、強い光力で飽和され、その一方で、深い組織からの信号は、許容範囲内の励起強度に対するノイズレベルを下回る。このダイナミックレンジを拡大すべく、デスキャン光学系とカメラとの間の中間画像面において、またはその近くで、空間的に変化するアッテネータを用いてもよい。例えば、特定の実施態様では、アッテネータ(例えば部分的に反射するかまたは吸収するガラスまたはフィルム)のストリップを配置して表面組織からカメラに達する光の強度を低下させ、その一方で、より深い層からの光のすべてがカメラに届くようにすることにより、入射光の照明をより明るくするか、または、カメラの積分時間/利得を飽和させずに高め得る。特定の実施態様では、段階的なアッテネータを同様の目的で使用してよい。このようなアッテネータは、物理的に移動できる(あるいは、LCD型の調整可能なフィルタまたはSLMなどの反射表面を用いて変更できる)ことにより、サンプルに固有の方法で減衰量を調整できる。組織の特定の深さにおける組織の相対位置がカメラ面の特定の行にマップされ、その物理的関係は、スキャンの間変化しないので、この構成は有効である(ただし、表面が平らでないもの、スキャンの間にそれ自体が動くものは除く)。摺動するアッテネータの位置、または、空間的に変化するアッテネータからの相対的な減衰パターンに関する情報を用いて、この減衰のために収集されるデータを校正してよく、その結果、絶対強度の画像を取り出すことができる。
SCAPEイメージングのための配置を提供すべく、特定の実施態様では、入射する励起ビーム光を、対物レンズのバックアパーチャの中心を外した、サンプル内の光シートの角度を決定する位置に入射するよう位置決めしてよい。いくつかの対物レンズは、バックアパーチャの大きさが異なる。対物レンズを変えたい場合、例えば、対物レンズの異なる特性(倍率など)が互いに代替可能に用いられる対物レンズ用ターレット(または同様なもの)を要する場合、光路を変更する必要がある。特定の実施態様では、これは、スキャンレンズとチューブレンズとの組合せの倍率を変えることで達成し得る。それには、対物レンズのバックアパーチャにおけるビーム位置を変更するとともに、凹レンズと凸レンズとの組合せを移動させるズームレンズタイプの配置を取り入れる(図15を参照)。特定の実施態様では、これは、エンジンまたは手動での移動、あるいは、電動レンズを用いて行われてよい。この調整は、特殊な設計のレンズ、または、システムで用いられるようにそれぞれの対物レンズに取り付けられた複合レンズを導入することによってなされ得る。検出側のレンズにも同様な調整がなされることにより、検出側の光学部品の構成や、デスキャンおよび画像回転の方法によって、異なるレベルの解像度を提供することができる。特定の実施態様では、検出レンズをさらに平行移動させることにより、カメラにおける画像の最適な焦点の調整が可能になる。SCAPEの高速体積イメージングでは、対物レンズを“Z”軸方向に平行移動させる必要がないため、便利なタレット式の対物レンズが実現できる。
SCAPEは、臨床用途にも実施できる。共焦点内視鏡による検査は、無傷の組織を顕微鏡解像度でイメージングでき、生検およびその場での診断を容易にするため人気のある技術だが、ほとんどの場合、非常に制約のある環境で対物レンズと組織表面との間の距離を物理的に調整する必要があるため、時間がかかる上に三次元データを得るのが難しい。光学的セクショニングの能力があるシステムでも、口腔粘膜および肌などのアクセスしやすい組織でさえ、三次元スキャンを用いたイメージングは困難である。これに対し、SCAPEは、ほとんどビデオ速度のイメージングを可能とし、イメージングの間の動きアーチファクトへの耐性もより高いことから、現在の臨床顕微鏡検査技術を高めるとができる。また、リアルタイムで連続した領域を詳細に検査できる「サーチライト」タイプのイメージングによって、組織のより大きい面積をサンプリングすることができる。さらに、SCAPEは、組織とイメージングレンズとの間の距離を物理的に調整する必要をなくすべく、平行移動なしの対物レンズ構成を導入し得る。例えば、特定の実施態様では、一定の厚さのスペーサによって組織を必要なオフセットで保持し、画像は、スペーサと接触している組織の深さの断面の可視化を提供する。
ミラースキャナおよび対物レンズを使用せずにSCAPEイメージングの配置を設計するために広範な技術およびアプローチが用いられ得る。特定の実施態様では、図19(a)~(c)に示されるように、単一の反射面が前後に回転してよい。特定の実施態様では、適切に位置合わせされた入力ビームおよび検出平面が相互に位置合わせされ、ミラーの前後移動に合わせ、互いに位置合わせされる。このタイプの設計の特定の実施態様では、スキャナとサンプルとの間にはレンズを配置しない。しかしながら、特定の実施態様では、この測定配置をサンプルにリレーするために中間レンズを追加してもよい。特定の実施態様では、この簡単な構成は、SCAPEの構成が大型でも、また、例えば、MEMSによるマイクロ内視鏡などのように小型でもいずれも有益である。
特定の実施態様では、SCAPE内の対物レンズは、三次元イメージング中は固定されているので、追加で同時に光学的動作を行う際も、あるいは、撮像中に組織を撮像する際も同じレンズを使用することができる(また、サンプルの選択に制約があるものの、他のレンズを用いてサンプルで集束させることも可能である)。従来、2光子および共焦点レーザスキャン顕微鏡法が用いられているが、三次元画像を形成するには、物体を軸方向に上下にスキャンする必要がある。これだとサンプルを物理的に損傷させるだけでなく、同じ対物レンズを介して固定のスポットを同時に照明することは不可能に近い。それに対し、特定の実施態様では、SCAPEのイメージングは、追加のフォトマニピュレーションおよび/またはイメージング技術と共に実行することができる。
2光子励起を用いてSCAPEを実施することにより、浸入深さ、コントラスト、および、解像度を向上させることができる。(2光子励起に用いられる)近赤外光は、例えば、散乱した生体組織などの材料のより深いところまで達する。このことは、SCAPEで用いられる入射光シートは、より深いところまで進むにつれより狭くなり、その一方で、より深いところまで行く途中でエネルギーを損失することを意味する。しかしながら、2光子顕微鏡法が必要とするレーザ出力は高く、我々の標準的なSCAPEの配置では、2光子顕微鏡法で通常用いている標準的なレーザによって要求を満たすのは困難である。例えば、ほとんどの2光子顕微鏡は、単一の焦点(約1ミクロンの立方)をスキャンするが、散乱したサンプルをより深いところで撮像するために、チタンサファイヤレーザから得られる限りの出力を用いるものもある(レーザでは約1.5W、サンプルではそれ以下)。この同じ出力が500×500ミクロンの光シート状に広がると、各点で同じ瞬間照明強度を得るには、500×500ミクロンにわたりこの出力が必要である。さらに、2光子励起は、入射電力の二乗(P2)の関数としての放射信号を生成するので、初期ビームが4つに分割されると、同じドウェル時間にこれらのビームの1つからは1/16の信号しか得られないことになる。4つの点のすべてが同時に撮像されると、4倍の長い積分時間が与えられ、よって、同じ期間内に4点すべてを次々に訪れる必要がある顕微鏡の4倍の信号になるが、図21および22に示されるように、検出信号は、1/4になってしまう。
各事例における所定の体積速度に対する積分時間は以下のとおりである。
tpix≒1/(Vr×xpix×ypix×zpix)
tline≒1/(Vr×xpix×ypix)
tsheet≒1/(Vr×xpix)
ここでは、x/y/zpixは、x/y/zにおけるボクセルの数を表す。2光子励起のスケールはパワーの二乗として示されるので、各事例の発光強度×積分時間の積は、Pi 2×tとなる。(FOVへの除算は二乗されないので)単一点のスキャンモデルが最も高い値Pi,pix 2tpixとなり、50VPSでの400×400×200の体積(x-y-z)では、単一点のスキャンが1,600MHzのピクセルレートを必要とし、これは実現不可能である(80MHzのパルスの2光子顕微鏡法に一般的に用いられるチタンサファイヤレーザの場合)。光のラインは、光シートより高い発光強度×積分時間Pi 2tを示し、カメラのフレームレートがどちらの場合もVr/xpixになるという点でより優れている(この例では、幾分高い20,000fps)。
SCAPEデータに多くの様々な分析および画像補正方法が適用されることにより、画像の解像度、コントラスト、および、空間線形性が向上し得る。特定の実施態様では、中間レンズおよび対物レンズを含むイメージング配置をモデル化してスキャン中に検出されるカメラのピクセルを物体平面におけるデカルト空間にマッピングしてよい。このモデルを用いることにより、結果として生じるデータの完全なデコンボリューションのための予測される空間変化点拡がり関数を生成してよい。特定の実施態様では、(ラミナー光トモグラフィー(LOT)および拡散光トモグラフィーにおいて見られるように)光伝播の放射輸送タイプのモデルにより励起光および放射光のいずれの散乱効果も補正するので、補正画像を「再現」することができる。
4.1.導入部
トランスジェニック技術により、ニューロンの活動などの動的な生体内プロセスの蛍光リポータは、日々進化している[1、2]。その結果、生体内イベントを撮影する高速の三次元体積測定光学顕微鏡法の必要性が高まっている。なお、本開示で導入するSCAPE顕微鏡法は、既存の顕微鏡技術とは本質的に異なる、体積測定のイメージング速度を実質的に向上させる光シートイメージング技術である。SCAPEは、標準的な落射蛍光顕微鏡の配置における光学的にセクショニングされた三次元データを収集し、対物レンズ(もしあれば)またはサンプルの平行移動を必要とせずに、無傷の齧歯類の脳、および、例えば、キイロショウジョウバエの幼虫などを含む自由に動く生物体を含む多様なサンプルの三次元動態を毎秒20体積を上回る速度で取得することができる。
ここに示されたすべてのデータは、オリンパスの対物レンズXLUMPLFLN(20倍/0.95Wまたは1.0W;アップライト落射蛍光顕微鏡配置)、および、CWレーザ(30mWまたは50mW、サンプル入射時0.5~5mW、波長488nm)を用いて収集された。ここに示すすべてのデータは、SCAPEの「未処理の」座標系(特に説明がない限り、横方向(y’)×スキャン角度(‘x)×斜めの深さ(z’)、図1(b)を参照のこと)。視野は、実験後のシステムの校正によって決定した(以下の第4.5章を参照のこと)。
図2は、マウスの脳の生体内SCAPEイメージングを示す。図2(c)は、SCAPEの体積レンダリングを示し、図2(d)は、頭部を固定されて覚醒して動いているマウスをx’-y’断面の異なる深さで撮像した画像である。マウスの血管内をテキサスレッドデキストランでラベリングして赤くしており、ヒゲのバレル皮質のV層のピラミッド状ニューロンにおいてGCaMP6fを発現している。画像は、定位置の2色画像スプリッタを用いて波長488nmの励起で取得された。(x’-y’-z’空間における100×500×80のボクセルに対応する)350×800×105ミクロンの体積の2色画像が毎秒10体積で撮像された。図2(e)は、血管を蛍光共役デキストランで染色したマウスを撮像した2光子顕微鏡法と高解像度SCAPEとの比較を示す。140ミクロンの深さでは、単一の毛細管(5~10ミクロンの大きさ)が解像でき、下行の血管が2光子顕微鏡法より高いコントラストを示している。図28は、より大きい血管をほぼ300ミクロンの深さまで解像できることを示している。動物の準備、位置合わせ、イメージング、および、パラメータについては、第4.4章および4.5章を参照されたい。
スライドガラスの上でリン酸緩衝生理食塩水中を自由に動いている1齢~3齢の間の年齢と大きさが異なるキイロショウジョウバエを撮像した。いくつかの事例では、横方向への動きを制限するためにアガロースチャンネルを用いた。図4は、1齢のミオシン重鎖(mhc)-Gal4,UAS-CD8:GFP導入の幼虫のSCAPE画像を示す。体壁、心管、および、内臓の平滑筋を含むすべての筋肉において緑色の蛍光タンパク質(GFP)の発現が見られる[23、24](図31は、同様の幼虫の2光子画像を示す)。動物を自由に動かせつつ、(x’-y’-z’空間における120×800×80のボクセルに対応する)430×1330×134ミクロンの視野を毎秒20体積で撮像した。図4(b)は、全身のSCAPE体積レンダリングを示し、図4(c)は、心管の拍動を撮像した際の、2か所の異なる深さにおける3つの連続したSCAPEx’-y’画像面を示す。図4(e)のキモグラフは、単一の横方向スキャン位置から取られた2つの深度の平面の平均を示す。周辺の筋肉の収縮を示すせん動波と、毎秒2~3拍の心管のリズミカルな拍動とが撮影されている。
SCAPEは、無傷の生きて自由に動く多様な種類のサンプルの三次元構造および機能を撮像することができる、新規で超高速な体積測定顕微鏡法のアプローチの1つである。SCAPEのサンプルは、平行移動させる必要がないので、多目的な光シートの配置に大変有益であり、従来のレーザスキャン顕微鏡技術に比べて体積測定におけるイメージング速度が1桁向上する。スピニングディスク共焦点などの広視野技術と比べて、SCAPEは、物理的なz方向スキャンを必要とせず、選択的な平面照明の利点を活用するので、生体内イメージングでの光損傷を抑制することができる。我々のシミュレーションおよびファントム測定は、従来の共焦点光シート顕微鏡法に比べ、SCAPEは、解像度および浸入深さについてのわずかなトレードオフで、多くの利点を有することを実証している。
イメージングシステム
我々の現在のSCAPEシステムのプロトタイプは図1(f)に示されている。システムの主な構成要素を以下に示す。
1)オリンパスの対物レンズXLUMPLFLN(20倍/0.95W;アップライト落射蛍光顕微鏡配置)。
2)CWレーザ(30mWまたは50mW、サンプル入射時0.5~5mW、波長488nm)(85-BCD-030-115、メレスグリオ社製)。
3)ガルバノメータのモータ(6240HA、ケンブリッジテクノロジー社製)にカスタム装着したシステムのスキャン素子である軽量の12面ポリゴンスキャンミラー(DT-12-138-043、リンカーンレーザー社製)。
4)Andor ZylaのsCMOSカメラ(Zyla-5.5-CL10)。
5)2色イメージングのための光度計用DV-2画像スプリッタ。
システムの他のすべての部品は、標準的な光学および光学機械構成要素である。我々のプロトタイプの完全な構成、および、光路については、校正手順と共に以下の第4.5章で説明する。
図2(a)~(d)および図3に示したマウスは、皮質のV層におけるピラミッド状ニューロンにクレリコンビナーゼを発現しているトランジェニックマウス(Rbp4:Cre,GENSAT)であり、Cre誘発性の遺伝的に符号化できるカルシウム指示薬であるGCaMPを担持するアデノ随伴ウィルスの皮質注射を受けている(AAV2:hSyn:FLEX:GCaMP5gまたは6fPENNベクトルコア)。生後6~8週間のオスのマウスにウィルスの皮質注射をした(およそ25g)。機能的に識別される領域をウィルス注射のターゲットとすべく、1回のヒゲ刺激の間に、固有の光学信号でイメージングすることにより、まず各マウスのバレル皮質をマッピングした。注射の後に、マウスは、頭部を慢性的に固定するためにヘッドプレートを埋め込まれた。術後回復してから、2週間で動物を頭部固定に慣れさせ、その後、イソフルラン麻酔をして2mmの頭蓋窓を埋め込み、一晩かけて回復させた。数日後、動物は、行動に関するタスクについての訓練を受けた。図3に示すマウスは、30~60秒の行動セッションの間に、ヒゲ刺激による検出タスクを実行しながら2光子顕微鏡によるイメージングを受けた。
1齢~3齢の生きた幼虫を標準的な条件下で飼育し、標準的な落射蛍光顕微鏡(オリンパスBX51)で目視検査することにより選択した。その後各幼虫をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄して表面のゴミを取り除き、スライドガラスの上のPBS滴に配置した。アップライト型SCAPE対物レンズがサンプルを損傷させずにカバースリップの上部の水滴に浸され得るよう、約1mmの厚みのスペーサを用いてサンプルを覆うガラスのカバースリップを緩く支持した。いくつかの事例では、幼虫は、イメージング中に動きを制限されるよう、アガロースチャンネル内に配置された。いくつかの事例では、イメージング中にサンプルを手動で平行移動させることにより、視野内に収まるようにした(例えば図4)。図5(a)~(b)に示す大きい3齢の幼虫を、その端部は自由に動かせるが、視野からはみ出るような前進運動はできないよう、その腹側表面の中心でシアノアクリレートの小滴を用いてカバーガラスに固定した。さらなる幼虫(図示せず)は、逆の構成のSCAPEによって撮像された。図5(c)は、幼虫を10分間100%エタノールに浸して安楽死させた後、死後に撮像したものを示す。
本願に示される比較的単純な視覚化および分析は、MATLAB(登録商標)およびAmira(登録商標)を用いて実行された。生データとしての平面画像を示し、特に記載のない限り、平滑化、補間、および、レジストレーションはしていない。三次元体積レンダリングは、特注のカラーマップを使用したAmira(登録商標)5.2.1(ヴィサージュイメージング社)のボルレン(Volren)モジュールを用いて生成した。すべてのデータが“SCAPE”(x’-y’-z’)画像空間(図1(b)参照)に示されている。図2(e)および図28に示されるSCAPEデータでは、それぞれの深度での平面を一定の線形係数だけずらすことにより、斜光シートのスキュー効果を補正した。2光子データをx-y平面においてデジタル的に回転させ、SCAPE画像の視野の向きと一致させる。マウスの脳における樹状突起の発火、および、キイロショウジョウバエのニューロンの追跡についてのさらなる詳細および時空間分析に関しては、第4.5章を参照されたい。
SCAPEのプロトタイプ設計および光路
図1(f)に示すように、SCAPEは、ガルバノメータのモータ(6240HA、ケンブリッジテクノロジー社製)にカスタム装着した12面ポリゴンスキャンミラー(DT-12-138-043、リンカーンレーザー社製)を用いて実施することができる。本実施形態では、SCAPEは、ファセットを1回掃引する毎に1つの体積全体を取得するので、ポリゴンは回転せずに、比較的小さい角度範囲を双方向にスキャンする。よって、十分なミラー表面領域を維持しつつ、大きいファセットのデューティサイクルの制限を克服し得る。イメージング速度が高い場合、ポリゴンの動きは連続すると見なされるが、ガルバノメータを用いてこの動きを制御することにより、カメラの動きとカメラによる撮影とを正確に同期できる。ガルバノメータは、カメラのフレームキャプチャ信号によって駆動されるクロックを有するDAQアナログ出力ボードによって駆動される。
MATLAB(登録商標)で記述されている簡単なグラフィカルユーザインターフェース(GUI)を用いてスキャンパターンを生成し、カメラストリーミングおよびガルバノメータ位置信号をトリガしてモニタし、レーザシャッタおよび動物のシミュレーションを制御した(使用先)。
SCAPEと比較するための2光子顕微鏡データは、我々の自作の2光子顕微鏡システム[44]を用いて収集された。このシステムは、MaiTai HPレーザ、および、スペクトル的に分解された検出器である浜松光電子増倍管R3896を用いる。図2(e)および28に示された2光子データは、505~560nmの発光フィルタ、800nmの励起を有するFITC-dx、および、オリンパスの対物レンズXLUMPLFLN(20倍/0.95W)によって収集された。図に示された2光子画像は、3ミクロンの深度において、750ミクロンの視野に対応する400×400のx-y平面ピクセルにより取得された。
それぞれのイメージング実験の後に、以下の方法を用いて、我々の現在のSCAPEシステムの校正係数を測定した。これらの校正によって、SCAPE空間がデカルト空間へと形式的に変換されることはないが、各軸に沿った現実の(ミクロンの)寸法に結果を残している。
蛍光テープ内にコーティングされた平面に斜光シートが集束された。1インチの1/1000の増分のマイクロマニピュレータステージを用いて深さ寸法(z)に沿ってサンプルを平行移動させ、カメラチップに沿った画像のずれ(深さ方向における)をピクセル内で計算した。この校正係数を用いて、z’方向におけるピクセル空間をサンプルz内の現実の深さに変換した。
システムを用いて、標準的な顕微鏡テストサンプル(本例では、蛍光染色したスズランの茎の切片)を撮像した。1インチの1/1000の増分のマイクロマニピュレータステージを用いて、横方向寸法(y)に沿ってサンプルを平行移動させた。(y方向における)カメラチップに沿った画像のずれをピクセル内で計算した。この校正係数を用いて横方向のピクセルをy方向における実際の距離に変換した。
単一の体積内の連続したフレームの間にも角度間隔があると仮定した場合、標準的な顕微鏡テストサンプル(本例では、蛍光染色したスズランの茎の切片)の2組の測定値からスキャン軸変換係数を計算した。まず、ポリゴンスキャナ(0.01体積/秒)の最大角度範囲でサンプルの高解像度体積スキャンを得た。次に、中心位置に固定した照明平面によって、マイクロマニピュレータステージを用いて同じサンプルをx方向に物理的に平行移動させることにより、1インチの1/1000の増分での画像を得た。スキャン範囲で2つのデータセットを比較し、ポリゴンの1度の角度スキャンと等しいミクロン単位の物理的な平行移動を決定した(係数Kとして定義;単位μm/度)。所定のデータセットでは、変換係数は、以下の式によって表される。この校正係数を用いて、角度ステップをx方向における実際の距離に変換した。
図3(c)に示されている色分けされた樹状突起は、まず、ニューロンのイベントの四次元データセットを検索することにより得られた。ピークの前の10~20のフレームに関する各イベントのピークのマップを用いて、発火している樹状突起の位置を識別し、これらのピクセルから、同じニューロンにおける他のイベントの表現としての経時変化を抽出した。所定のニューロンの各発火のマップが比較されてソートされることにより、識別されたイベントが同じニューロンと一致することが確かめられた。これらの一致したニューロンをすべてのイベントで平均化することにより、所定の時間的に相関する樹状突起の三次元マップが生成された。平均化された体積のそれぞれは、Amira(登録商標)のボルレン関数を用いてレンダリングされ、独自のカラーマップで表された。各マップにおけるピークピクセルの位置から抽出された経時変化を(生のフィルタリングされていないデータとして)プロットしたものを図3(d)に示している。
図5(e)に示されたニューロンの追跡は、MATLAB(TM)で実行され、幼虫の内臓の混合発光信号からのGFPニューロンサブセットの澄んだ緑色の信号を、まずスペクトル分離することによってなされた[44]。時系列の開始時におけるニューロンの位置は、深さ(z’)の最大強度投影から手作業で選ばれた。その後、まず、(y’およびz’を見出す)深さの最大強度投影から、連続するフレームを分析して開始点の選択された半径内のピーク強度の点を識別し、このピーク強度の位置を、y’およびz’によって定義される列内のx’の関数として見出した。次のフレームに移動する前に「開始」位置をアップデートした。
プロセスは、誤差のないよう管理されているが、ほぼリアルタイムで進行した。
4.6.1.スキャン/デスキャン配置
我々の現在のベンチトップシステムは、安易に入手可能な構成要素によって組み立てられており、軸外透過に対しては最適化されていない。よって、原理を実証してはいるものの、我々の測定値は、SCAPEの能力の理論限界を捉えていない。これらの限界値を完全に理解すべく、我々は、SCAPEシステムのいくつかの計算モデルを開発した。第1に、SCAPEのオプタリクス(OpTalix)(登録商標)モデルであり、これは、SCAPEのデスキャンの配置によって、システムを移動中の照明平面が固定カメラにマッピングされる方法を実証するのに用いられる。1つのモデルは、オリンパスの対物レンズXLUMPLFLN(20倍/0.95W)を含む現在の我々のシステムのレンズに基づき生成され、他のモデルは、薄レンズ近似を用いて生成され、30nmの焦点距離を有する直径1インチのレンズがシステムの対物レンズとして含まれている。シミュレーションは、所定のポリゴン回転角度に対する物体空間における光シートの位置を識別し、照明された平面をデスキャンされた中間斜画像面にマッピングする(図1(a)参照)。
次に、我々は、2つの異なるモデルを利用するためのSCAPEの回折限界解像度について考察した。1つは、光シートによるイメージングの点拡がり関数を計算するためのエンゲルブレットおよびステルザーの方法に従う三次元フーリエ光学分析[46]に基づくものであり、図1(e)に示す点拡がり関数を生成するのに用いた。このモデルは、オリンパスの対物レンズXLUMPLFLN(20倍/0.95W、作動距離(WD)2mm、フロントアパーチャの半径2.3mm)の配置に基づくものであり、瞳孔平面に軸外アパーチャを有することにより、収差のある励起光シート(488nm)、および、図24(a)で定義されるような我々の「半開口」ポリゴン配置pe=a/2に対応する検出点(530nm)を生成することができる。このモデルでは、実際に点拡がり関数(PSF)をさらに小さくし得る、SCAPEの検出側における画像回転光学部品の付加的な影響は考慮していないことに留意されたい。図24(b)は、このシステムの拡がり関数(PSF)がどのように生成されるかを示す。図24(c)は、半開口(pe=a/2)および全開口(pe=a)の検出に対する、点拡がり関数を通じてのx方向およびz方向の断面を示す。
第4.6章のシミュレーションでは、SCAPEの分解能の本質的な限界を定義する一方で、ある範囲のファントム測定を実行して我々のSCAPEシステムの現在のプロトタイプのイメージング性能を実証した。本願明細書に示す生体内イメージングの例のほとんどでは、イメージング速度を最大にするには、(カメラの行数に対応するので、測定される最大深度にも対応する)撮像深度の数が選ばれる。これは、カメラでビニングする行数は、カメラの読み出し速度に直接影響するからである(第4.8章を参照のこと)。以下のファントム測定は、非散乱対散乱サンプルにおける我々の現在のシステムのプロタイプの視野を実証するだけでなく、我々の現在の分解能が我々の予測する「最高条件の」モデルにどれだけ近いかを決定する。
ガラスのカバーストリップ、および、アガロース(寒天)ファントム(脂質を含むもの)を用いることにより、我々の覚醒マウスの実験における頭蓋窓の配置および屈折率に関して、適正な近似を得ることができる。
図27は、我々の現在のシステムの視野を実証するために取得したSCAPEの測定値を示す。図27(a)は、ナノ散乱アガロースにおける4ミクロンの蛍光ビーズで収集されたデータを示す。それぞれの寸法に対して最大強度投影の画像を示している。データは、挿入画に定義されているような完全なデカルト空間ではないSCAPEのx’,y’,z’空間に示されている。すべての寸法は、第4.5章で説明した校正測定を介してミクロンに変換された。600ミクロンに対応するスキャン(x’)範囲が用いられ、均一に満たされた。横(y’)寸法の視野は、カメラセンサの幅に対応するが、照明光シートの横幅と、検出光学部品による戻り光のアパーチャリングとによって検出信号が制限される。したがって、この構成で使用可能な視野は、約1mmである。深さ(z’)軸がカメラの多数の行によって取得されることにより、可能な浸入深さが明確に示される。
イメージングの深さは、検出ビーム経路における光のアパーチャリングだけでなく、励起光および放射光の減衰および散乱によっても制限される。この構成では、約550ミクロンの有効範囲が明確に示される。
SCAPEの浸入深さおよび分解能に対する生体内の脳の光学特性の影響をさらに実証するために、我々は、生きたマウスに蛍光共役デキストランを静脈注射した後、SCAPEおよび2光子顕微鏡を用いて比較のためのイメージングを行った。静脈内をラベリングすることにより、皮質の、均一濃度の染料で満たされている直径5~10ミクロンオーダーの深いところにある毛管までの構造が得られる(上記のイメージングされた蛍光ビーズに対しても同じターゲットを提供する)。動物の準備に関しては第4.4章、イメージングのパラメータおよび位置合わせに関しては第4.5章を参照されたい。
図29は、我々のシステムの分解能のより詳細な分析を示す。非散乱の200nmのビーズファントムで得られたデータ(図29-1)と、μs’が約1mm-1の散乱ビーズファントムで得られたデータ(図29-2)とを分析した。システムの点拡がり関数は、(シミュレーションで我々が予測したように)空間的に異なるので、平均化するのではなく、図に示すように各ファントムにおける異なる深さでのビーズの範囲で、生の、単一のビーズの点拡がり関数を示している。
各点拡がり関数による断面を半値全幅(FWHM)と共に右側に示す。これまでのように、我々の校正手順に基づいて寸法をミクロンに変換するが、データは、x’-y’-z’空間に固有のサンプル解像度で示されている。
本実施例で用いられているSCAPEにおいて移動する構成要素は、低速スキャンミラーだけなので、システムのイメージング速度は、主にカメラのフレームレート(および、最終的には信号対雑音比)によって制限される。所定の撮像における1秒あたりの体積速度(VPS)は、体積における所望のx’方向の角度ステップの数によって除されるカメラのフレームレートである。
本願明細書に示されたデータに用いられる様々なパラメータを以下に示す。
重要なのは、本願明細書で実証された速度を上回るカメラが市販されているということである。例えば、NAC Memrecam HX-3は、75,000fpsで384×288のフレームをサンプリングすることができ、適切な信号対雑音比を仮定すると、横サンプリングのステップが200である視野において毎秒375体積を撮像可能である。
記載された多数の文献は、そのすべての内容が参照により本願明細書に組み込まれる。
Claims (11)
- (a)光源から受けた光の向きを変えて前記光をサンプル体積内の異なる深さのところを含む斜めの照明された領域に送るよう配置され、前記サンプル体積内の前記異なる深さのところを含む斜めの照明された領域から光を受け、前記光を、前記サンプル体積内の前記異なる深さのところから第1の方向に沿った異なる位置からの光の個別の測定を検出することが可能な光検出器に同時に送る光再配向器と、
(b)前記サンプル体積内に向けられた光を、前記サンプル体積内における前記異なる深さのところから受けた前記光と分離するよう配置されたビームスプリッタと、
を備え、
前記光再配向器は、前記サンプル体積のスキャンの間に、前記サンプル体積の照明された領域の静止画像を前記光検出器に送るように調整され、前記光再配向器は、単一の平面のスキャンミラーを含み、前記スキャンミラーは、固定の斜画像面が形成されるようにスキャンおよびデスキャンのいずれも実施可能である、イメージング装置。 - 前記単一の平面のスキャンミラーは、
光源から受けた光の向きを変えて前記光をサンプル体積に送るよう配置され、
前記単一の平面のスキャンミラーは、
前記サンプル体積内の異なる深さのところから光を受け、前記光を、第1の方向に沿った異なる位置からの光の個別の測定を検出することが可能な光検出器に送るよう配置された、請求項1に記載のイメージング装置。 - 前記光再配向器は、前記スキャンの間に、照明された前記サンプル体積の前記静止画像を前記光検出器に送るよう制御されることが可能である、請求項1に記載のイメージング装置。
- 光源をさらに含み、
前記光源は、パルス光源であるか、及び/又は照明されたラインまたは照明された平面を提供する平行光源を含む、請求項1に記載のイメージング装置。 - 前記光検出器は、一次元画像または二次元画像を測定する検出器アセンブリを含む、請求項1に記載のイメージング装置。
- 前記光源から受けた光の向きを変えることにより、前記サンプル体積内の平面を照明する素子をさらに備える、請求項5に記載のイメージング装置。
- 前記サンプル体積内の異なる深さのところから光を受け、前記静止画像の向きを補正する素子をさらに備える、請求項1に記載のイメージング装置。
- 前記サンプル体積内の異なる深さのところから受けた光をフィルタリングするよう配置された素子、及び/又は、前記サンプル体積の異なる深さのところから受けた光のビーム幅を変えるアパーチャをさらに備える、請求項1に記載のイメージング装置。
- フォトマニピュレーションツールまたはイメージングツールを含む追加の光学ツールをさらに備える、請求項1に記載のイメージング装置。
- 前記フォトマニピュレーションツールは、細胞のオプトジェネティクス励起、抑制、または、修飾ツール、光ピンセットツール、光凝固ツール、光退色ツール、光誘起の細胞死または障害ツール、微小粒子またはナノ粒子からの光放出のための光キャビテーションツール、および、フォトアンケージングツールからなるグループから選択される、及び/又は
前記イメージングツールは、光コヒーレンストモグラフィーツール、広視野イメージングツール、スペックルフローグラフィーツール、レーザドップラーツール、レーザスキャン共焦点顕微鏡法ツール、および、2光子顕微鏡法ツールからなるグループから選ばれる、請求項9に記載のイメージング装置。 - 請求項1乃至10のいずれか一項に記載のイメージング装置を動作する方法。
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