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Die Erfindung bezieht sich auf ein 3D-Lokalisierungsmikroskopiesystem und ein 3D-Lokalisieru ngsm ikroskopieverfah ren.
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Die 3D-Lokalisierungsmikroskopie (wie z.B. PALM oder STORM) dient dazu, dreidimensionale Strukturinformation von organischen oder anorganischen Strukturen, wie z.B. Molekülen, in einem abzubildenden Bereich zu ermitteln, um die Relativlagen der Strukturen festzustellen. Die entsprechende Lokalisierungsinformation wird zum Erzeugen eines 3D-Gesamtbildes oder einer 3D-Gesamtwiedergabe verwendet, üblicherweise mit einer lateralen Auflösung von unter 30 Nanometer.
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Der abzubildende Bereich ist mit vielen Fluoreszenzmarkern belegt, die jeweils zur Fluoreszenz angeregt und deren Ort jeweils bestimmt wird. Durch ein geeignetes Beleuchtungsschema emittieren zu einem gegebenen Zeitpunkt nur einige Marker Fluoreszenzstrahlung und werden in einem Einzelbild detektiert. Für solche fluoreszierenden Marker wird die Ortsangabe ermittelt, und die Ortsinformationen aus mehreren solcher Bilder mit verschiedenen, statistisch zusammengesetzten Teilmengen von Marken werden zum 3D-Gesamtbild oder der 3D-Gesamtwiedergabe zusammengesetzt. Es gibt verschiedene Verfahren, um die Ortsinformation nicht nur hinsichtlich der x- und der y-Achse, sondern auch hinsichtlich der z-Achse aus den 2D-Bildern zu extrahieren.
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Die Auflösung eines Mikroskops ist durch das optische Beugungslimit des Mikroskops beschränkt. Beugung führt dazu, dass ein einzelner Punktemitter einer Größe, die kleiner ist als das Beugungslimit des Mikroskops, auf einen größeren Fleck abgebildet wird. Durch Algorithmen, wie z.B. Fitting oder Schwerpunktsbestimmung, und unter Kenntnis der Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) des Mikroskops kann man das Zentrum des Flecks hinsichtlich der x- und y-Koordinate mit einer Genauigkeit jenseits der Beugungsgrenze ermitteln.
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Gegenwärtige 3D-Lokalisierungstechniken werden im wesentlichen in zwei Kategorien unterteilt: Die Aufnahme mehrerer, gleichzeitiger Abbildungen des Moleküls, wie beispielsweise bei Doppelebenen- oder iPALM-Ansätzen, und Verfahren, welche die Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) beeinflussen, so dass die 3D-Lageinformation in einer von der Defokussierung abhängigen Form des lateralen PSF-Profils kodiert ist, beispielsweise Astigmatismus oder Doppel-Helix-Strukturen verwendende Verfahren. Beim Doppel-Helix-Verfahren hat das abbildende System eine PSF, die so ausgebildet ist, dass ein einzelner Punktemitter zwei getrennte Bildflecken erzeugt, wobei der Winkel einer Verbindungslinie zwischen den beiden Flecken vom Abstand zwischen Emitter und Objektiv abhängt. Eine Variation der Lage des Emitters längs der z-Achse des Objektivs bewirkt, dass die zwei Bildflecken gegeneinander auf charakteristische Weise rotieren, d.h. es verändert sich der Winkel der Verbindungslinie. Hat man kalibriert, kann aus der Drehlage die z-Lage eines Emitters im einzelnen 2D-Bild ermittelt werden, ohne dass man die Probe oder das Objektiv bewegen muss. Solche Systeme sind aus der
US 7,705,970 B1 ,
WO 2010/080030 A1 und
US 2009/0219549 A1 bekannt.
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Die
US 2008/0137059 A1 sowie die Veröffentlichungen
Pavani et al.: „Three-dimensional, signal-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function", Proc. Nat. Acad. Sc., Vol. 106, Nr. 9, März 2009, S. 2995-2999 und
Pavani et al.: „Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system", Opt. Express, Vol. 16, Nr. 26, Dezember 2008, S. 22048, beschäftigen sich mit der hochauflösenden Mikroskopie, wobei eine Punktbildverwaschungsfunktion nach einem sogenannten Doppelhelix-Prinzip zur Wirkung kommt. Die
DE 10 2008 049 886 A1 und
US 2009/0059360 A1 befassen sich mit der Lokalisierungsmikroskopie, bei dem eine spektrale Information in Form eines Versatzes zweier Bildpunkte ausgewertet wird. Aus
WO 2009/085218 A1 ist ein Lokalisierungsmikroskopieverfahren bekannt, bei dem eine Tiefeninformation in Form einer Größe, Position, Breite und Elliptizität eines einzelnen Bildpunktes ermittelt wird.
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Die Erfindung ist in den unabhängigen Ansprüchen definiert.
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Einigen Ausführungsformen der Erfindung liegt das Ziel zugrunde, ein verbessertes oder zumindest weiteres Verfahren zur 3D-Lokalisierungsmikroskopie anzugeben.
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Anderen Ausführungsformen der Erfindung liegt das Ziel zugrunde, bei der 3D-Lokalisierungsmikroskopie eine weitere Dimension einzuführen, so dass eine zusätzliche Eigenschaft der Lichtemitter kodiert werden kann (nachfolgend als 4D-Lokalisierungsmikroskopieverfahren bezeichnet).
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Allgemein gesehen weist ein Gesichtspunkt der Erfindung ein Verfahren zur 3D-Lokalisierungsmikroskopie (nachfolgend als erfindungsgemäßes 3D-Verfahren bezeichnet) auf, das umfasst: Erzeugen einer Phasendifferenz zwischen Licht zu oder von einem Teil des Objektivs und Licht zu oder von einem anderen Teil des Objektivs, um ein Punktemitterbild zu erzeugen, das zwei Bildlappen hat, so dass bei einer eine negative Defokussierung bewirkenden Relativlage von Emitter und Objektiv, die zwei Bildlappen zueinander im wesentlichen entlang einer Achse in einem ersten Sinn gegenläufig versetzt sind und dass bei einer eine negative Defokussierung bewirkenden Relativlage von Emitter und Objektiv die zwei Bildlappen zueinander im wesentlichen entlang der Achse in einem zweiten Sinn gegenläufig versetzt sind, und um eine z-Position der Emitter aus Relativlagen der Bildlappen zu erzeugen. In der Regel umfasst das Verfahren das sequentielle Einschalten einer oder mehrerer Emitter in der Probe und das Bestimmen der Lokalisierung des einen oder der mehreren Emitter(s) und das nachfolgende Zusammensetzen der Lokalisierungsdaten aus den mehreren Bildern zu einem 3D-Bild oder einer 3D-Wiedergabe. In anderen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Bestimmen und Zusammensetzen der Lokalisierungsdaten aus einem einzelnen Bild zu einem 3D-Bild oder einer 3D-Wiedergabe.
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Allgemein gesehen weist die Erfindung unter einem weiteren Gesichtspunkt ein 3D-Lokalisierungsmikroskopiesystem (nachfolgend als erfindungsgemäßen 3D-System bezeichnet) auf, das so ausgebildet ist, dass es eine Phasendifferenz zwischen Licht zu oder von einem Teil des Objektivs und Licht zu oder von einem anderen Teil des Objektivs bewirkt, um ein Punktemitterbild zu erzeugen, das zwei Bildlappen aufweist, so dass bei einer eine negative Defokussierung bewirkten Relativlage von Emitter und Objektiv die zwei Bildlappen zueinander im wesentlichen entlang einer Achse in einem ersten Sinn gegenläufig versetzt sind und bei einer eine negative Defokussierung bewirkenden Relativlage von Emitter und Objektiv die zwei Bildlappen zueinander im wesentlichen entlang der Achse in einem zweiten Sinn gegenläufig versetzt sind.
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Allgemein gesehen weist die Erfindung unter einem weiteren Gesichtspunkt ein Verfahren zur Lokalisierungsmikroskopie oder zum Verfolgen eines einzelnen Emitters (nachfolgend als erfindungsgemäßes 4D-Verfahren bezeichnet) auf, das umfasst: Erzeugen einer Phasendifferenz zwischen Licht zu oder von einem Teil des Objektivs und Licht zu oder von einem anderen Teil des Objektivs, um ein Punktemitterbild zu erzeugen, das zwei Lappen aufweist, deren Versatz von der Relativposition von Emitter und Objektiv des Abbildungssystems abhängt, und eine weitere Eigenschaft des Bildes oder des Lichtes zu oder von dem Objektiv hängt von einer anderen ortsunabhängigen Eigenschaft des Emitters ab, und um eine z-Position des Emitters aus Relativlagen der Bildlappen zu erzeugen, und Ermitteln der anderen lokalisierungsunabhängigen Eigenschaft.
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Das 4D-Verfahren kann das Erzeugen einer Phasendifferenz zwischen Licht zu oder von einem Teil des Objektivs und Licht zu oder von einem anderen Teil des Objektivs umfassen, um ein Punktemitterbild zu erzeugen, das zwei Bildlappen aufweist, wobei bei einer eine negative Defokussierung erzeugenden Relativlage von Emitter und Objektiv die zwei Bildlappen zueinander im wesentlichen entlang einer Achse in einem ersten Sinn gegenläufig versetzt sind und bei einer eine negative Defokussierung erzeugenden Relativlage von Emitter und Objektiv die zwei Bildlappen zueinander im wesentlichen längs der Achse in einem zweiten Sinn gegenläufig versetzt sind.
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Allgemein gesehen weist die Erfindung unter einem weiteren Gesichtspunkt ein System zur Lokalisierungsmikroskopie oder zum Verfolgen eines einzelnen Emitters (nachfolgend als erfindungsgemäßes 4D-System bezeichnet) auf, das so ausgebildet ist, dass es eine Phasendifferenz zwischen Licht zu oder von einem Teil des Objektivs und Licht zu oder von einem anderen Teil des Objektivs erzeugt, um ein Punktemitterbild zu erzeugen, das zwei Lappen aufweist, wobei ein Versatz zwischen den Lappen von einer Relativlage von Emitter und Objektiv des Abbildungssystems abhängt, und eine weitere Eigenschaft des Bildes oder des Lichtes zu oder von dem Objektiv von einer anderen lokalisierungsunabhängigen Eigenschaft des Emitters abhängt.
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Das 4D-System kann so ausgebildet sein, dass es eine Phasendifferenz zwischen Licht zu oder von einem Teil des Objektivs und Licht zu oder von einem anderen Teil des Objektivs bewirkt, um ein Punktemitterbild zu erzeugen, das zwei Bildlappen aufweist, wobei bei einer eine negativen Defokussierung erzeugenden Relativlage von Emitter und Objektiv die zwei Bildlappen zueinander im wesentlichen entlang einer Achse in einem ersten Sinn gegenläufig versetzt sind und bei einer eine positive Defokussierung erzeugenden Relativlage von Emitter und Objektiv die zwei Bildlappen zueinander im wesentlichen entlang der Achse in einem zweiten Sinn gegenläufig versetzt sind.
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Die weitere Eigenschaft kann ein Versatz zwischen den Bildlappen sein, wie beispielsweise ein Versatz der Bildlappen entlang einer Achse, die in einem Winkel, beispielsweise im Wesentlichen orthogonal, zur Achse des Versatzes der Bildlappen, die hinsichtlich der Position der Emitter wirksam ist. Die weitere Eigenschaft kann alternativ eine Eigenschaft wie spektrale Zusammensetzung, Lebenszeit oder Polarisation des Lichtes des Emitters sein.
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Die lokalisationsunabhängige Eigenschaft des Emitters kann spektrale Zusammensetzung, Lebensdauer und/oder Polarisation des Lichts des Emitters sein.
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Sowohl beim 3D- als auch beim 4D-Verfahren und -System sind bei einer fokusgerechten Lage der Emitter zum Objektiv die zwei Bildlappen im Wesentlichen nicht zueinander entlang der Achse versetzt. Es können bei einer fokusgerechten Lage der Emitter zum Objektiv die zwei Bildlappen zueinander im Wesentlichen orthogonal zur genannten Achse versetzt sein.
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Sowohl beim 3D- als auch beim 4D-Verfahren und -System kann die Phasenmodifikationseinrichtung im Abbildungssystem auf einer Seite eine Phasenrampe, z.B. eine lineare Phasenrampe, oder mehrere Phasenrampen umfassen, die die Phase auf der einen Seite nicht beeinflussen oder die auf der anderen Seite eine Phasenmodifikationsauswirkung haben, die in Vorzeichen oder Betrag anders ist. Die Phasenmodifikationseinrichtung kann im Abbildungssystem so aufgebaut sein, dass sie eine linear variierende Phasendifferenz zwischen den zwei Hälften der Pupillenebene erzeugen. Sie kann in Form einer einzelnen Phasenrampe, die eine Hälfte der Pupillenebene überdeckt, realisiert sein, oder als zwei Phasenrampen oder unterschiedliche Phasengradienten, die beide Hälften abdecken, wobei eine linear variierende Phasendifferenz zwischen den beiden Hälften vorliegt. Sie kann zwei Phasenrampen mit gleichem, aber entgegengesetztem Gradienten aufweisen, da das beim Einsetzen keinen Bildversatz erzeugt. Die Phasenrampen müssen nicht zusammenhängend sein und können auch aus mehreren linearen Segmenten in einem Sägezahnmuster zusammengesetzt sein, wobei jedes Segment einen Phasenwinkel von 2 Pi abdeckt. Die zwei Hälften in der Pupillenebene können auch eine zusätzliche konstante (d.h. nicht lateral variierenden) Phasendifferenz haben, da dadurch die Wechselwirkung des Lichts der beiden Hälften entweder kohärent oder inkohärent sein kann. In einigen Ausführungsformen ist die Phasenmodifikationseinrichtung so ausgebildet, dass das Bild eines einzelnen Punktemitters zwei Bildlappen aufweist, die ausreichend eng beieinander liegen, um ein einzelnes (längliches) Bild zu erzeugen (zumindest bei Fokussierung), wobei die Form oder der Versatz der Lappen mit dem Abstand des Emitters zum Objektiv (positive oder negative Defokussierung) variiert. In anderen Ausführungsformen umfasst das Bild des einzelnen Punktemitters zwei getrennte Bildlappen (zumindest nahe des Fokus), deren Versatz mit dem Abstand des Emitters zum Objektiv variiert.
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Beim 4D-Verfahren können zusätzliche optische Elemente vorgesehen sein, die einen oder beide Lappen der PSF so variieren, dass eine zweite, lokalisierungsunabhängige Eigenschaft des Emitters kodiert wird, wie oben erwähnt. Das optische System ist so ausgebildet, dass der Lappenversatz in einer orthogonalen Richtung von der anderen, lokalisierungsunabhängigen Eigenschaften des Emitters abhängt. Das optische System kann alternativ so ausgebildet sein, dass die relative Helligkeit der beiden Lappen von der anderen Eigenschaft des Emitters abhängt.
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Bei einigen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen 4D-Verfahrens und Systems der Erfindung kann die Steilheit des Phasengradienten ein Punktemitterbild erzeugen, das zwei Lappen aufweist, deren Versatz in einer Richtung mit der Relativlage zwischen Emitter und Objektiv des Abbildungssystems verknüpft ist, und in der anderen, dazu orthogonalen Richtung von der anderen kodierten Eigenschaft des Emitters, wie z.B. spektrale Zusammensetzung, Fluoreszenzlebensdauer oder Polarisation abhängt.
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In dieser Beschreibung umfasst der Begriff „Fluoreszenz“ auch Phosphoreszenz, Lumineszenz oder ähnliche Arten der Lichtemission eines Markers.
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Der Begriff „umfassen“ oder „aufweisen“ im Sinne dieser Beschreibung soll bedeuten „zumindest teilweise daraus bestehen“. Bei der Auslegung einer Aussage dieser Beschreibung, die den Begriff „aufweisen“ enthält, können auch andere, als die mit dem Begriff gemeinten Merkmale vorhanden sein. Entsprechende Begriffe wie „aufweist“ und „aufweisend“ sind gleichermaßen auszulegen.
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Die 3D-Lokalisierungsmikroskopie weist das Aufbauen eines Bildes aus der Lokalisierung mehrerer Moleküle oder Emitter auf, wobei die Lokalisierung eines bestimmten Markers üblicherweise für eine lateral ruhende Probe erhalten wird. Die Teilchen- oder Molekül-Verfolgungs-Mikroskopie bringt es mit sich, dass ein Marker oder mehrere Marker zur Fluoreszenz gebracht und hinsichtlich seiner Bewegung/ihrer Bewegungen über eine Zeit verfolgt werden.
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Die Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen erläutert, in denen:
- 1 schematisch ein Mikroskop zeigt, das erfindungsgemäß eine Phasenrampe zwischen dem Objektiv und der Kamera oder Abbildungsebene hat,
- 2a und 2b die Phasenverteilung in der Pupille eines Mikroskopsystems und das entsprechende Phasenprofile zeigen, die/das sich aus einer anderen Phasenrampenausbildung ergibt; 2d und 2e eine andere mögliche Phasenverteilung in der Pupille des Mikroskopsystems zeigen und 2c die Veränderung des Profils eines Emitterbildes beim Defokussieren veranschaulicht,
- 3a schematisch zwei Lappen eines fokussierten Emitterbildes zeigt, und 3b und 3c den Versatz der beiden Bildlappen bei negativer bzw. positiver Defokussierung zeigen,
- 4 schematisch ein Mikroskopsystem zeigt, das eine reflektive Oberfläche als Phasenrampe aufweist,
- 5a und 5b schematisch eine Realisierung einer dispersiven Phasenmaske zeigen, die Materialien starker und schwacher Dispersion aufweist,
- 6 schematisch eine Realisierung einer dispersiven Phasenmaske mittels diffraktivem Gitter zeigt,
- 7 ein Flussdiagramm eines erfindungsgemäßen Bildanalysealgorithmus zeigt,
- 8 ein Flussdiagramm eines „Entprellungs“-Algorithmus einer Ausführungsform der Erfindung zeigt,
- 9 ein Flussdiagramm eines „Fit“-Algorithmus einer Ausführungsform der Erfindung zeigt,
- 10a eine Phasenrampe und deren Wirkung auf die PSF eines Mikroskopsystems zeigt,
- 10c ein Histogramm von z-Lagen zeigt, 10b eine in z-Richtung projizierte Rekonstruktion gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt, und 10d eine Niveauflächenwiedergabe eines Bereiches des rekonstruierten Bildes entsprechend einem in
- 10b gepunkteten Bereich zeigt, wobei diese Figuren in der nachfolgenden Beschreibung experimenteller Ergebnisse abgehandelt sind,
- 11 eine tatsächliche Defokussierung und die durch Anpassen einer Phasenrampen-PSF an eine Bildreihe dreier dunkelrot fluoreszierender Beads von 200 Nanometer Durchmesser erhaltenen Ergebnisse zeigt, die in der nachfolgenden Beschreibung experimenteller Ergebnisse abgehandelt werden,
- 12a und 12b einen experimentellen Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer astigmatischen Detektion veranschaulichen,
- 13 den Vergleich von erfindungsgemäßem Verfahren, astigmatischer Detektion und Doppel-Ebenendetektion veranschaulicht und
- 14 den Einsatz eines Filters zum Einführen einer wellenlängenabhängigen Veränderung in der Relativhöhe der PSF-Lappen veranschaulicht.
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1 zeigt ein Fluoreszenzmikroskop, das eine Lichtquelle, wie z.B. eine Xenonbogenlampe, eine Quecksilberdampflampe oder eine Laseranregung 7, ein Anregungsfilter 8, einen dichroitischen Spiegel 6 oder dichroitischen Strahlteiler, und ein (nicht dargestelltes) Anregungsfilter umfasst. Die Filter und dichroitischen Elemente sind passend zu den spektralen Anregungs- und Emissionseigenschaften von Fluorophoren gewählt, mit deren die Probe markiert ist. Das Mikroskop trägt das Objekt 1, und nach der Anregung läuft das Licht der Fluorophore durch ein Objektiv 2 zu einer Bildebene, die teilweise hier auch als Pupillenebene bezeichnet ist, z.B. zu einer Kamera 3 (oder einer anderen Abbildungseinrichtung) durch eine Tubuslinse 4, die das Licht in die Bildebene 3 fokussiert. Das Fluoreszenzmikroskop kann jede bekannte bzw. geeignete Bauweise haben.
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Das Mikroskop weist eine Phasenmodifikationseinrichtung auf, die in dieser Ausführungsform eine refraktive Phasenrampe 5 zwischen dem Objektiv und der Bildebene 3 ist und in dieser Ausführungsform insbesondere in einem Unendlichstrahlengang des Strahlenganges gezeigt ist. Das bewirkt eine Phasendifferenz zwischen dem Licht verschiedener Emitter, deren Licht durch verschiedene Teile des Objektivs läuft, wodurch für jeden Punktemitter in der Bildebene ein Bild entsteht, das zwei miteinander verbundene oder zueinander versetzte Lappen aufweist, wobei der Grad des Versatzes vom Abstand des Emitters vom Objektiv abhängt, wie nachfolgend noch erläutert werden wird. In der hier beschriebenen Ausführungsform befindet sich das Phasenrampenelement 5 im optischen Strahlengang an der Stelle der rückseitigen Apertur des Objektivs. Die Phasenrampe ist an der rückseitigen Apertur oder nahe dieser, so dass sie im Unendlichstrahlengang des Objektivs ist (in dem aus dem Objektivfokus stammende Strahlung im Wesentlichen parallel verläuft). In einem Mikroskop ohne Unendlichstrahlengang kann die Phasenrampe näherungsweise in der rückseitigen Fokus-/Fourier-Ebene sein. In der hier beschriebenen Ausführungsform ist die Phasenrampeneinrichtung refraktiv, kann jedoch in anderen Ausführungsformen reflektiv oder dispersiv sein, wie später noch erläutert werden wird.
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Bei einigen Ausführungsformen kann ein zusätzliches spektrales Filterelement 9 vor oder nach der Phasenrampe 5 eingesetzt werden, so dass die relative Helligkeit der beiden Lappen von einer lokalisierungsunabhängigen Eigenschaft des Emitters abhängt. In einer weiteren Ausführungsform kann man die Phasenrampeneinrichtung zusätzlich dünnfilmbeschichten oder anderweitig behandeln, so dass die relative Helligkeit der zwei Lappen von einer solchen lokalisierungsunabhängigen Eigenschaft des Emitters abhängt.
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Beim Ausführen der erfindungsgemäßen 3D- oder 4D-Lokalisationsmikrosopie werden in der Probe eine oder mehrere Emitter photo-aktiviert oder photo-geschaltet und zur Fluoreszenz gebracht. Sie emittieren Photonen einer bestimmten Wellenlänge. Die Beleuchtung regt statistisch nur einige Marker an und nach dem (permanenten oder reversiblen) Bleichen jedes Fluorophors wird der Ort einer oder mehrerer der Fluorophore ermittelt. Die x- und y-Koordinate jedes Emitters kann aus einer Messung des Zentrums des Markerbildes entweder direkt mittels einer zentrumsangebenden Formel oder in einem computerisierten Bildverarbeitungssystem durch Anpassen eines PSF-Modells an das Markerbild erhalten werden. In einer Ausführungsform kann ein 3D-Modell an das Bild angepasst werden, um die x-, y- und z-Koordinaten des Emitters gleichzeitig zu ermitteln. Auch wird erfindungsgemäß die z-Erstreckung aus dem Grad der Bildlängung oder des Versatzes der zwei Bildlappen bestimmt, die/der mit dem Abstand zwischen Emitter und Objektiv verknüpft ist. Bei einer vorherigen Kalibrierung bildet man einen oder mehrere Emitter (z.B. Fluoreszenz-Beads) aus der Objektebene ab. Das Objektiv wird durch Positionen bewegt, die einen bekannten Abstand von der Objektebene / dem Emitter / den Emittern haben, wodurch sich die Bildform ändert, und ein Zusammenhang zwischen Bildform und Fokusabstand wird erhalten. Tabellenwerte können gewonnen werden, die die relative z-Koordinate und die Bildform in Verbindung setzen. Dadurch kann man im Betrieb aus dem Grad der Bildlängung oder des Versatzes zwischen den Lappen eines Emitterbildes die relative z-Lage dieses Emitters und die z-Koordinate des Emitters ermitteln. Im Betrieb werden die obengenannten Schritte wiederholt, um eine Gruppe aus mehreren Bildern oder Bilddaten und Emitterortsangaben aufzunehmen, aus welchen man ein 3D-Gesamtbild oder eine 3D-Gesamtwiedergabe erzeugen kann. Alternativ können die Lokalisierungsinformation und ein 3D-Bild aus einem einzigen erhalten Bild bestimmt werden. Ein erfindungsgemäßes Mikroskopsystem kann ein Computerbildverarbeitungssystem aufweisen, das einen Relationsalgorithmus oder eine Tabelle, welche die relative z-Lage und die Bildform miteinander in Beziehung setzen, oder ein Modell der obengenannten Art verwendet, und so ausgebildet ist, dass es die relative z-Lage eines Emitters aus der Emitterbildform bestimmt. In einer Ausführungsform kann beispielsweise ein Computerbildverarbeitungssystem so ausgebildet werden, dass es ein Bild aus einer Bild-Datenbanktabelle oder aus einem mathematischen oder numerischen Modell der defokussierungsabhängigen Bilder bestmöglich an die Bildform anpasst. Beim Einsatz zur erfindungsgemäßen 3D-Teilchen- oder Molekül-Verfolgung können Emitterkoordinaten (x, y, z) und in einigen Ausführungsformen auch eine oder mehrere Emittereigenschaften wie spektrale Zusammensetzung, Lebenszeit oder Polarisation des Lichts des Emitters aus einer direkten Parametrisierung des Bildes (beispielsweise Bildzentrum, Winkel oder Abstand zwischen Lappen oder ähnliche Maße) angegeben werden.
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2a zeigt eine Pupillenebene ohne Phasenmodifikation auf einer Seite einer Vertikalen durch die Pupille und einer linearen Phasenrampe auf der anderen Seite. 2b zeigt eine ähnliche Pupille mit mehreren Phasenrampen auf einer Seite. 2d zeigt eine Pupillenebene mit gleicher und gegensinniger Phasenmodifikation auf beiden Seiten in der Pupillenebene. 2e zeigt eine Pupillenebene mit einem konstanten Betrag der Phasenmodifikation auf einer Seite der Vertikalen durch die Pupillenebene und einer linearen Phasenmodifikation auf der anderen Seite. 2c zeigt, wie unterschiedliche Beabstandung zwischen Emitter und Mikroskopobjektiv die Relativlage der zwei Lappen des Emitterbildes im erfindungsgemäßen System beeinflusst. Ist der Abstand zwischen Objektiv und Emitter so, dass das Bildsystem fokussiert ist, gibt es entlang einer zwischen den beiden Lappen durchlaufenden Achse, wie beispielsweise der Achse N-P, keinen oder einen minimalen Versatz der beiden Lappen, wie das mittlere Bild der 2c zeigt. Liegt der Emitter hingegen näher zum Objektiv oder weiter vom Objektiv weg, tritt eine positive oder negative Defokussierung auf und dementsprechend ändert sich der Versatz der beiden Lappen entlang der Achse. In der dargestellten Ausführungsform wächst er in den vier rechten und linken Bildern der 2c entsprechend dem Abstand des Emitters vom Objektiv. 3 veranschaulicht dies in einem schematischen Beispiel weiter. 3a zeigt die zwei fokussierten Lappen eines fokussierten Bildes, die nur entlang einer Achse, die in der Figur mit LS bezeichnet ist, getrennt sind. Der Grad der Trennung hängt von der Steilheit der Phasenrampe ab und bleibt bei positiver oder negativer Defokussierung gleich. Die 3b und 3c zeigen, dass bei einem negativen bzw. positiven Fokus die beiden Bildlappen sich entlang einer orthogonalen Achse OS versetzen, wobei der Grad des Versatzes in 3 exemplarisch mit FDS eingezeichnet ist. Die Bildlappen sind entlang dieser Achse in einem Sinn gegeneinander versetzt, der davon abhängt, ob die Defokussierung positiv oder negativ ist. Bei einem Emitterabstand vom Objektiv, der eine negative Defokussierung zur Folge hat, ist ein Bildlappen entlang der Achse gegenüber der fokussierten Lage in einer Richtung und der andere Bildlappen entlang der Achse in der anderen Richtung versetzt. Bei einem Emitterabstand vom Objektiv, der eine positive Defokussierung verursacht, sind die Bildlappen entlang der Achse gegenüber der fokussierten Lage in entgegengesetztem Sinn bezogen auf die negative Defokussierung gegeneinander versetzt. Die „Bewegung“ der Bildlappen entlang der Achse ist mit variierendem Fokus näherungsweise oder im Wesentlichen linear.
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4 zeigt eine alternative Verwirklichung der Erfindung unter Verwendung einer reflektiven Phasenmodifikationseinrichtung. In 4 tragen Elemente, die denen der 1 entsprechen, dieselben Bezugszeichen. Die reflektive Oberfläche 6 wird in oder nahe einer konjugierten Objektivebene angeordnet und ist so geformt, dass eine Hälfte der rückseitigen Fokalebene bezogen auf die andere einen linearen Phasengradienten erfährt. In einer anderen Ausführungsform kann die Phasenrampe aus mehreren ebenen Spiegeln bestehen, die so angeordnet sind, dass sie gegeneinander geneigt sind, so dass eine Hälfte der rückseitigen Fokalebene gegenüber der anderen einen linearen Phasengradienten erfährt. In einer anderen Ausführungsform kann die Phasenrampe aus einem verformbaren Spiegel bestehen, der so eingestellt wird, dass eine Hälfte der rückseitigen Fokalebene gegenüber der anderen einen linearen Phasengradient erfährt. Der verformbare Spiegel (oder eine ähnliche Phasensteuereinrichtung) kann zur Korrektur von Aberrationen (des optischen Systems und/oder der Probe) eine Überlagerung an Phasenmustern und einen Phasengradienten zwischen den zwei Hälften der rückseitigen Fokalebene verwenden. Ein Vorteil des Systems mit reflektiver Phasenrampe liegt darin, dass der Grundversatz der Lappen einfach eingestellt oder justiert werden kann, indem man den Reflexionswinkel der Spiegelflächen verändert. Eine solche Einstellung kann auf verschiedene Weisen erreicht werden - entweder manuell mittels einstellbarer Spiegelhalterungen oder elektronisch mittels piezo-angetriebener Halterungen, DMDs oder ähnlicher Einrichtungen. Diese Möglichkeit, den Grundversatz der Lappen einzustellen oder zu justieren, kann hilfreich sein, um einen Kompromiss zwischen hinreichend großem Versatz der Lappen und damit einer störungsfreien axialen Unterscheidung, und der Trennung unterschiedlicher Emitterbilder, die gleichzeitig erscheinen (eine Erhöhung des Versatzes der Lappen erhöht den „Fußabdruck“ eines einzelnen Molekülsignals und damit den zwischen einzelnen Emittern zu deren zuverlässigen Trennung nötigen Abstand), zu optimieren. Der Einsatz eines verformbaren Spiegels macht es möglich, durch adaptive Optiken die Phasenrampe hinsichtlich der Korrektur von Bildaberrationen zu korrigieren.
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5a zeigt eine alternative Ausführungsform mit einer dispersiven Phasenmodifikationseinrichtung, insbesondere einer Phasenmaske, welche zwei dispersive Phasenrampen aufweist, die zwischen dem Objektiv 2 und der Tubuslinse 4 angeordnet ist, wobei die eine eine stark dispersive Phasenmaske 9 und die andere eine schwach dispersive Phasenmaske 10 ist, wodurch die Wirkung eines übermäßigen, durch die stark dispersive Phasenmaske 9 eingeführten Gradienten reduziert wird, wie 5c zeigt. Da die Phasenrampen aus dispersivem Material sind, hängt die Steilheit des erzeugten Phasengradienten von der Wellenlänge des durch die Phasenrampe geleiteten Lichts ab. Dies hat eine wellenlängenabhängige Änderung des Grundversatzes der Lappen zur Folge. Da der Grundversatz der Lappen orthogonal zur Änderung der Lappenposition ist, die durch die Defokussierung entsteht, kann man für das Punktemitterbild die spektrale Komponente unabhängig von der örtlichen Komponente ermitteln und damit die Farbe des abgebildeten Objektes und die Relativlage des Emitters auf der z-Achse feststellen. In einigen Ausführungsformen kann das Licht mit relativ schmalen Ablenkungswinkeln durch diese dispersiven Phasenmasken laufen, andere Ausführungsformen des dispersiven Elementes können größere Ablenkwinkel erzeugen (z.B. bei der Verwendung von Prismen). Das Prinzip zwischen der relativen z-Lage des Emitters und einer weiteren Emittereigenschaft, wie spektraler Zusammensetzung, Polarisation oder Lebensdauer, durch orthogonale Änderung des Versatzes der Lappen zu unterscheiden, kann auf jede Eigenschaft angewendet werden, für die die Steilheit des Phasengradienten in charakteristischer Art von dieser Emittereigenschaft abhängig gemacht werden kann.
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6 zeigt eine alternative Ausführungsform, die eine Phasenmodifikationseinrichtung aufweist, welche die Reflektion an einer dispersiven Oberfläche einsetzt, z.B. ein Beugungsgitter 11. Ein etwaiger überschießender Phasengradient, der beispielsweise zum Bereitstellen einer ausreichenden Wellenlängenabhängigkeit nötig sein kann, kann mittels einer zusätzlichen, ebenen Spiegelfläche 11 zurückgefahren werden. Man kann einen einfacheren Aufbau erreichen, indem ein Beugungsgitter und ein ebener Spiegel in die beiden Hälften der rückseitigen Fokusebene des Objektivs gestellt werden.
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7 ist ein Flussdiagramm eines Bildanalysealgorithmus einer Ausführungsführungsform der erfindungsgemäßen 3D- oder 4D-Lokalisationsmikroskopie. Nachdem ein Rohbild erhalten wurde, werden zuvor gemessene Kameraeigenschaften dazu verwendet, den Offset im Rohbild zu entfernen, und eine Bildkalibrierung wird hinsichtlich der Photo-Elektronen ausgeführt. Anschließend wird am kalibrierten Bild ein Verfahren zum Entfernen von Untergrundstrahlung ausgeführt, indem ein Untergrundbild vom kalibrierten Bild abgezogen wird. Das Untergrundbild kann näherungsweise durch Bilden des Durchschnittes aus N Bildern bestimmt werden, welche dem aktuell kalibrierten Bild in der schon kalibrierten Bildfolge vorangingen. Durch Berechnen der Wurzel aus der Anzahl von Photoelektronen jedes Pixels im kalibrierten Bild wird zusätzlich nach dem Kalibriervorgang eine Signal/Rausch-Angabe gewonnen. Eine Entfaltung hinsichtlich der gemessenen PSF des verwendeten Abbildungssystems ist erforderlich für das untergrundkorrigierte Bild und die SNR-Angabe des kalibrierten Bildes, um Beugungseffekte einzelner Punktemitter zu entfernen. Der Entfaltungsprozess entfernt mehr-lappige PSF-Aberrationen durch ein Wiener-Filter, PSF-Korrelation und/oder eine Maximum-Likelihood-(ML)-Entfaltung. Die entfaltete SNR-Angabe wird dann mit einem Schwellwertfaktor multipliziert, dessen Einsatz die Detektion weniger störungsanfällig macht und eine benutzergesteuerte Schwellwertänderung bei verschiedenen Bildaufnahmebedingungen unnötig macht. Der SNRbasierte Schwellwert wird dann verwendet, um das Bild zu filtern, wobei nur über dem Schwellwert liegende Werte im Bild ausgewählt werden. Anschließend wird eine binäre Maskierung und Markierung des Bildes durchgeführt, um im Bild zusammenhängende Bereiche zu identifizieren und deren Intensität am Zentrum jedes zusammenhängenden Bereichs zu berechnen, wodurch man eine Liste mit Anfangspositionen erhält. Diese Liste von Anfangspositionen kann jedoch auch verbleibende Falschdetektionen enthalten, die aus der lappigen Struktur der PSF herrühren. Die Falschdetektionen müssen entfernt werden, und man muss eine bereinigte Liste von Anfangspositionen durch ein „Entprellungs“-Verfahren erzeugen, das in 8 veranschaulicht ist. Die bereinigte Liste von Anfangspositionen wird dann einem „Fitting“-Verfahren gemäß 9 unterworfen, indem jede Anfangsposition der Liste mittels eines aus der gemessenen PSF des verwendeten Mikroskops abgeleiteten Interpolationsmodells interpoliert wird. Die Liste der gefitteten Positionen kann dann zum Erzeugen eines 3D-Bildes verwendet und einem Benutzer angezeigt werden.
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8 veranschaulicht das Entprellungs-Verfahren, das in der Liste der Anfangspositionen enthaltene Falschdetektionen verwirft. Zuerst werden die Informationen über alle Anfangspositionen in der Liste und deren innerhalb eines gewissen, bevorzugt etwas größer als die PSF-Größe bemessenen Bereichs benachbarte Punkte entnommen. Das entfaltete Bild der vorherigen Schritte, das kalibriert ist und in dem der Untergrund entfernt ist, wird verwendet, um für jeden Anfangspunkt und für dessen Nachbarpunkte die Intensitätsangabe zu entnehmen. Ist die Intensität einer Anfangsposition größer als die der Nachbarn, kann man darauf schließen, dass die Anfangsposition keine Fehldetektion ist. Ist die Intensität einer Anfangsposition geringer als die deren Nachbarn, kann die Anfangsposition eine Falschdetektion sein und wird aus der Liste ausgeschlossen. Dann wird die nächste Anfangsposition in der Liste mit demselben Verfahren verarbeitet, bis alle Anfangspositionen der Liste geprüft und eine bereinigte Liste von falschdetektionsfreien Anfangspositionen erhalten wurde.
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9 zeigt den Fitting-Prozess, in dem ein Interpolationsmodell, welches aus der gemessenen PSF des Mikroskops abgeleitet wurde, an jeder Anfangsposition an die Bilddaten angepasst wird. Das Interpolationsmodell kann als lineare Interpolation, kubische Spline-Interpolation und/oder Fourier-Domain-Verschiebung realisiert sein. Für jede zu fittende Anfangsposition werden ROI- und SNR-ROI-Angaben aus dem untergrundkorrigierten Bild bzw. der SNR-Angabe des kalibrierten Bildes entnommen. Die SNR-ROI wird auch verwendet, um die Startparameter des Fittingverfahrens abzuschätzen. Im PRI-Fall kann das Winkelmoment der ROI verwendet werden, um einen Startwert für die z-Koordinate zu erhalten. An jeder Anfangsposition wird das Fitting-Verfahren dann mittels des Interpolationsmodells, der ROI-Daten (data), SNR-ROI (wait) und den Startparametern ausgeführt. Das Fitting-Verfahren kann mittels eines Levenberg-Marquardt-Schätzers realisiert werden, um die gewichtete Least-Square-Aufgabe zur Lokalisierung einer gefitteten Position zu lösen. An jeder Anfangsposition wird das Fitting-Verfahren durchgeführt, bis eine Liste von optimal-angepassten Lokalisierungsangaben ermittelt wurde.
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Experimente
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Die folgende Beschreibung experimenteller Arbeiten veranschaulicht die Erfindung zusätzlich:
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Beispiel
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Material und Methode
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Zellisolierung und Markierung: Ventrikuläre Myocyten wurden enzymatisch bei einer adulten Ratte isoliert und in 2% Paraformaldehyd 10 Minuten lang fixiert. Dann wurden sie hinsichtlich ß-Tubulin gemäß einem Standardimmunofluoreszenzprotokoll unter Verwendung primärer Antikörper aus Mäusen (T4026, Sigma-Aldrich, NZ) und einer sekundären Alexa 680 Markierung (A21058, Molekular Probes/Invitrogen, NZ) markiert. Die markierten Zellen wurden in einem „Schaltpuffer“ bestehend aus 0,5 mg/ml Glukoseoxidase, 40 µg/ml Katalase, 10 w/v-% Glukose und 50 mM ß-Mercaptoethylenamin in einer 80:20 Mischung von Glycerin und PBS (sämtlich von Sigma-Aldrich, NZ) gelagert.
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Abbildung: Die Abbildung wurde mit einem modifizierten Nikon TE2000 Mikroskop mit einem 60 x 1,47 NA TIRF Objektiv und einer Andor IXon DV887DCS-BV EMCCD Kamera zur Fluoreszenzdetektion durchgeführt. Mittels einer 671 nm Laserquelle wurde eine stark verkippte Beleuchtung durchgeführt, was eine Fokusintensität von etwa 109 W/m2 realisierte. Für jede Rekonstruktion wurden mit einer Integrationszeit von jeweils 10 ms pro Einzelbild 20.000 Einzelbilder aufgenommen. Die Fokussierung wurde durch einen Piezofokussierer (Physik Instrumente P-725, Deutschland) durchgeführt und z-Stapel mit einer 200 nm großen z-Schnittgröße wurden aufgenommen. Jeder z-Stapel umfasst 7 axiale Positionen über einen Bereich von 1,4 µm. Um sicherzustellen, dass Probenbleichen das in unterschiedlichen Ebenen zu beobachtende Signal nicht beeinflusst, wurde eine z-Abtaststrategie verwendet, bei der der Fokus schnell (verglichen mit der Bleichfrequenz, mit 100 Einzelbildern pro z-Niveau) vorwärts und rückwärts bewegt wurde und die Ebenen, die einer jeweiligen axialen Lage entsprachen, nach dem Abschluss der Bildaufnahme zusammengefügt wurden. Der Winkel, der zum Erreichen eines PSF-Lappenversatzes von s in der Probe nötig ist, wurde aus strahlenoptischen Betrachtungen als s M / (fT(n-1)) abgeschätzt, wobei M die Objektivvergrößerung, fT die konstruktionsgemäße Tubuslänge (200 mm für Nikon CFI 60 Objektive) und n der Brechungsindex des Glasprobenträgers (1,51) ist. Ein kleiner jedoch gut erkennbarer Spotversatz von -400 nm kann somit mit einem 60-fach vergrößernden Objektiv bei einem Winkel von -50 arcsec zwischen den Probenträgeroberflächen erreicht werden. Durch Ausnutzen der Tatsache, dass die zwei Deckflächen eines Mikroskopieglasträgers sehr flach, aber nicht perfekt parallel sind, wurde eine Phasenmaske erzeugt. Für einen kleinen, aber gut auflösbaren Lappenversatz von -400 nm genügt bei einem 60-fach vergrößernden Objektiv ein Winkel von -50 arcsec, was innerhalb der Parallelitätstoleranzen üblicher Objektträger liegt, die 2 bis 3 arcmin ist. Bei einer Überprüfung einer Schachtel mit Objektträgern fanden sich mehrere Objektträger, die einen geeigneten Phasengradienten erzeugten, wenn sie unterhalb des Filterwechslers eingesetzt wurden, und dort die halbe rückseitige Apertur des Objektivs abdeckten, so dass sie wirksam die halbe Pupillenebene überdeckten. Dadurch wurde eine Bifurkation in der PSF erzeugt. Die Wirkung trat auch auf, wenn die Phasenrampe nicht exakt in der Pupillenebene sondern an anderer Stelle innerhalb des Unendlichstrahlengangs nach einem aktuellen, unendlich-korrigierten Objektiv (das Licht aus einer Punktquelle in der Probe im wesentlichen parallelisiert) lag. Dadurch konnte darauf verzichtet werden, die Pupillenebene zwischenabzubilden, und die Phasenrampe konnte an einer gut zugänglichen Stelle nach dem Filterwechsler in einem unbelegten DIC-Analysatorschlitz angeordnet werden.
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Zur astigmatischen Abbildung wurden zwei astigmatische Optometrieuntersuchungslinsen mit 1 dpt. (f = 1m) in den Strahlengang innerhalb des Teleskops, das zum Anpassen der Kamerapixel an die Mikroskopvergrößerung verwendet wurde, eingesetzt und mit ihren Achsen ausgerichtet, um eine kombinierte Fokallänge von 500 mm zu erreichen.
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In beiden Fällen wurde eine empirische PSF durch Ausrichten und Mitteln der Bilder mehrerer dunkelrot fluoreszierender Beads mit 200 nm Durchmesser (F-8807, Invitrogen, NZ) ermittelt. Die Bead-Größe störte den Fitting-Vorgang ersichtlich nicht.
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Datenanalyse: Die Positionen der einzelnen Moleküle wurden mittels eines Fit der interpolierten, gemessenen PSF-Bilddaten gemäß gewichteten kleinsten Quadraten nach Levenberg-Marquardt gewonnen. Drei unterschiedliche Interpolationstechniken wurden untersucht, nämlich Fourier-Domain-Verschiebung, kubische Spline-Interpolation und einfache lineare Interpolation. Zwischen den Ergebnissen der Fourier-Domain-Verschiebung der kubischen Spline-Interpolation zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Die lineare Interpolation war klar die schnellste. Die im Fitting-Algorithmus verwendeten Gewichte entsprechen dem berechneten Rauschen (unter Berücksichtigung von Poisson-, Elektronenvervielfachung- und Ausleserauschprozessen) jedes Pixels. Dadurch konnten Angaben des Fit-Fehlers aus einer Analyse der Kovarianzmatrix bei der Konvergenz erhalten werden.
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Bildrekonstruktion: Durch Rendern jedes Lokalisierungsergebnisses als Gauß'sch mit einer der gefitteten z-Koordinaten entsprechenden Farbe und einer der mittleren lateralen Lokalisationsgenauigkeit gleichenden Standardabweichung wurden die in 10b gezeigten tiefenkodierten Projektionsbilder erhalten. Die erhaltenen Bilder wurden dann unter Verwendung des Bildbearbeitungsprogramms GIMP hinsichtlich der Intensität geringfügig gesättigt, um die Sichtbarkeit schwacher Strukturen zu verbessern. Durch Rendern jedes Ergebnisses mit einer 3D-Gauß-Funktion deren laterale und axiale Standardabweichung dem für das Ergebnis abgeschätzten Lokalisationsfehler in lateraler und axialer Richtung entsprechen, wurden 3D-Volumendaten erzeugt. Da die mit der eingeschränkten Phasenplatte erzeugten Weitfeldbilder schlecht sind und Geist-Artefakte zeigen, wurden Volumendaten bei standard-beugungsbegrenzter Auflösung aus den Lokalisationsergebnissen dadurch rekonstruiert, dass jedes Ergebnis mit einer lateralen und axialen Standardabweichung gerendert wurde, die einer typischen Weitfeld-PSF bei der gleichen Anregungswellenlänge entsprechen. Mittels OpenDX (www.opendx.org) wurde ein Niveauflächenrendering der Volumendaten durchgeführt.
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10a zeigt die Phasenrampe und ihre Wirkung auf die PSF. Während der vorangehenden Kalibrierung wurde die PSF durch Abbilden von Fluoreszenz-Beads von 200 nm Größe aufgenommen. Bemerkenswerterweise treten fokusabhängige Bewegungen der zwei Lappen bei verschiedenen Defokussierungswerten auch im 3D-gerenderten PSF-Bild auf. 10c zeigt ein Histogramm der z-Koordinaten, die an den mit Alexa 680 markierten und auf einem Glasträger immobilisierten Antikörpern erhalten wurden. Die maximale Breite bei halber maximaler Verteilung dieser Punkte ergibt eine obere Grenze von -82 nm für die axiale Auflösung. 10b zeigt eine mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugte, z-projizierte Rekonstruktion von ß-Tubulin bei Herz-Myozyten einer Ratte. Die Tiefe ist entsprechend der auf Tafel D gezeigten Tabelle farbkodiert. Der Maßstab beträgt 1 µm. 10d zeigt eine Niveauflächenwiedergabe eines Bereiches des rekonstruierten Bildes, der dem gepunkteten Bereich der 10b entspricht. Zu Vergleichszwecken ist eine Rekonstruktion bei üblicher, beugungsbegrenzter Auflösung eingezeichnet. Deutlich sieht man für das erfindungsgemäße Verfahren die merklich verbesserte Auflösung in allen drei Dimensionen.
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11 zeigt die tatsächliche Defokussierung und die Ergebnisse, welche durch Anpassen der Phasenrampen-PSF an eine Bildfolge von drei, dunkelrot fluoreszierenden Beads mit 200 nm Durchmesser erhalten wurde. Eine Restabweichung wurde anhand der Positionsdaten der Beads nach Filterung durch ein zehn Einzelbilder erfassendes Rechteckfilter korrigiert. Die gemessene Breite (Standardabweichung) der z-Lokalisierungen waren ~9 nm für jedes Bead ohne Defokussierung, was gut mit dem auf Basis der Fit-Reste geschätzten mittleren Lokalisierungsfehler übereinstimmt.
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In 12a und 12b sind die geschätzten Lokalisierungsfehler und die Anzahl der gefitteten Ergebnisse als Funktion der Defokussierung bei der Abbildung von ß-Tubulin von Herz-Myozyten aufgetragen, um das erfindungsgemäße Verfahren mit der astigmatischen Detektion zu vergleichen. Es wurden nur diejenigen Ergebnisse ausgewählt, die in ein schmales (10 %) Intensitätsfenster um den entsprechenden mittleren Intensitätswert fielen. Dadurch wurden erschwerende Umstände der Intensitätsabhängigkeit der Detektion vermieden. Gegenüber der astigmatischen Detektion bleiben bei der Phasenrampenabbildung sowohl die Anzahl der lokalisierbaren Ergebnisse als auch die entsprechenden Lokalisierungsfehler über einen größeren axialen Bereich innerhalb vertretbarer Grenzen.
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Beispiel 2
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13 zeigt einen theoretischen Vergleich der axialen Lokalisationsgenauigkeit des Verfahrens (PRI) mit zwei bekannten 3D-Lokalisierungsverfahren, nämlich astigmatischer Detektion und Doppelebenendetektion. Für den Genauigkeitsvergleich wurden die Punktbildverwaschungsfunktionen der drei Verfahren simuliert und mit ihnen die untere Grenze gemäß Cramer-Rao berechnet. Dies beruht auf der in der Form der Punktbildverwaschungsfunktion enthaltenen Information und gibt den kleinstmöglichen Lokalisierungsfehler (den man mit einem perfekten Analysealgorithmus erhielte) unter gegebenen Rauschbedingungen wieder. Für Rauschberechnungen wurde angenommen, dass das Rauschen einer Poisson-Statistik genügt und dass für jedes fluoreszierende Molekül insgesamt 2000 Photonen aufgesammelt wurden. Man sieht, dass das erfindungsgemäße Verfahren hinsichtlich axialer und gesamter 3D-Genauigkeit anderen Verfahren überlegen ist, und dass die laterale Genauigkeit über einen größeren axialen Bereich besteht.
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Beispiel 3
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14 zeigt, dass eine Wellenlängenabhängigkeit der Relativamplitude der beiden Lappen mittels eines optischen Filters erzeugt werden kann. Im experimentellen Abbildungssystem, das ansonsten im Wesentlichen dem des Beispiels 1 entspricht, wurde eine Phasenrampe in eine Hälfte der Pupillenebene und ein Tiefpassinterferenzfilter in die andere eingesetzt. Mit dieser Konfiguration wurden drei verschiedenfarbige Fluoreszenz-Beads abgebildet. Die 14a-c zeigen fokussierte Schnitte durch die Punktbildverwaschungsfunktion für jede der Bead-Arten. In 14d ist ein Linienprofil durch das Zentrum jeder PSF aufgetragen. Es zeigt, dass die unterschiedlichen Bead-Arten anhand der relativen Lappenhöhen klar unterscheidbar sind.
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Die Erfindung wurde vorstehend anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben. Dem Fachmann ersichtliche Abwandlungen und Modifikationen seien davon im Rahmen der nachfolgenden Ansprüche umfasst.
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Bezugszeichenliste
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2
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| Phase profile |
Phasenprofil |
| Distance |
Abstand |
| Negative defocus |
Negative Defokussierung |
| Positive defocus |
Positive Defokussierung |
| In focus |
Fokussiert |
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5
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| Total Phase |
Gesamte Phase |
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7
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| Raw image |
Rohbild |
| Subtract Camera A to D offset |
Versatz für Kamera A bis D abziehen |
| Measured Camera Properties |
Gemessene Kameraeigenschaften |
| Offset Corrected Image |
Offset korrigiertes Bild |
| Calibrate image in terms of photoelectrons |
Kalibrierung des Bildes hinsichtlich Photoelektronenanzahl |
| Calibrated image |
Kalibriertes Bild |
| Background estimate |
Untergrundangabe |
| SNR Estimate |
SNR-Angabe |
| Background Corrected Image |
untergrundkorrigiertes Bild |
| Deconvolved SNR Estimate |
Entfaltete SNR-Angabe |
| Deconvolved Image |
Entfaltetes Bild |
| Threshold Factor |
Schwellwertfaktor |
| Binary Mask |
Binärmaske |
| Labelled Image |
Markiertes Bild |
| List of Starting Positions |
Liste der Anfangspositionen |
| Deconvolved Image |
Entfaltetes Bild |
| „Debounce“ to remove residual false detections resulting from the lobed nature of PSF |
„Entprellung“ zum Entfernen verbleibender Fehldetektionen aufgrund der lappigen Struktur der PSF |
| Clean List of Starting Positions |
Bereinigte Liste der Anfangspositionen |
| List of Fitted Positions |
Liste der gefitteten Positionen |
| Visualisation |
Darstellung |
| Legend |
Legende |
| Input Data |
Eingabedaten |
| Internal Step |
Verfahrensschritt |
| Intermediate Result |
Zwischenergebnis |
| Result |
Ergebnis |
| Reused Result |
Mehrfach verwendetes Ergebnis |
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8
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| Debouncing |
Entprellen |
| List of Starting Positions |
Liste der Anfangspositionen |
| Choose a position from list |
Auswahl einer Position aus der Liste |
| Loop over all positions |
Wiederholung des Durchlaufs für alle Positionen |
| Neighbour Information |
Informationen über Nachbarn |
| Starting Position |
Anfangsposition |
| Find all points within a distance slightly larger than the PSF size |
Auffinden aller Punkte innerhalb eines Abstandes, der etwas größer als PSF-Größe ist |
| Neighbours |
Nachbarn |
| Deconvolved Image |
Entfaltetes Bild |
| Neighbour Intensities |
Intensitäten benachbarter Punkte |
| Point Intensity |
Intensität des Punktes |
| Is point intensity greater than that of its neighbours? |
Ist die Intensität eines Punktes größer als die seiner Nachbarn? |
| No |
Nein |
| Yes |
Ja |
| Discard Point |
Verwerfe den Punkt |
| Clean list of Starting Positions |
Bereinigte Liste der Anfangspositionen |
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9
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| Fitting |
Fitting |
| Clean List of Starting Positions |
Bereinigte Liste der Anfangspositionen |
| Starting Position |
Anfangsposition |
| Loop over all positions |
Wiederholung des Durchlaufs für alle Positionen |
| Interpolating Model |
Interpolierendes Modell |
| SNR Estimate |
SNR-Angabe |
| Background Corrected Image |
Hintergrundkorrigiertes Bild |
| Extract ROI around position |
Den ortumgebenden Zielbereich festlegen |
| Data ROI |
ROI-Daten |
| Estimate starting parameters for fit |
Schätzen der Startparameter für das Fitten |
| Starting Parameters |
Startparameter |
| Data |
Daten |
| Weights |
Gewichte |
| Model |
Modell |
| Perform optimisation |
Optimierung durchführen |
| Fitted Position |
Gefittete Position |
| List of Fitted Positions |
Liste der gefitteten Positionen |
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10
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| Pupil phase |
Phase in der Pupille |
| Focal spots |
Fokusspots |
| Defocus |
Defokussierung |
| Focus |
Fokus |
| Frequency |
Frequenz |
| z position [nm] |
z-Position [nm] |
| Conventional |
Stand der Technik |
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11
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| Defocus (nm) |
Defokussierung (nm) |
| Time (frames) |
Zeit (Einzelbilder) |
| Focus |
Fokus |
| Bead |
Bead |
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12
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| Fit Error [nm] |
Fittingfehler [nm] |
| Defocus [nm] |
Defokussierung [nm] |
| Astigmatism |
Astigmatismus |
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13
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| Error Bound [nm] |
Fehlergrenze [nm] |
| Defocus [nm] |
Defokussierung [nm] |
| Widefield |
Weitfeld |
| Astigmatism |
Astigmatismus |
| Biplane |
Doppelebenenverfahren |
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14
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| Green |
Grün |
| Red |
Rot |
| Phase ramp |
Phasenrampe |
| Intensity |
Intensität |
