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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur dreidimensionalen Bildgebung in der Mikroskopie unter Nutzung einer asymmetrischen Punktbildübertragungsfunktion (PSF; point spread function). Außerdem betrifft die Erfindung eine Anordnung und ein Mikroskop zur Durchführung des Verfahrens.
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Auf dem Gebiet der Mikroskopie, insbesondere bei der Bildgebung unter Verwendung markierter Strukturen und Moleküle (Objekte) einer biologischen Probe, ist eine hohe Bildauflösung bei einer zugleich geringen Belastung der Probe und der abzubildenden Objekte erwünscht. Eine Schonung der Probe ist besonders dann von Vorteil, wenn die Erfassung der Bilddaten (Bildaufnahme) über einen längeren Beleuchtungszeitraum und/oder mehrmalig erfolgt. Derartige Beleuchtungsregime werden beispielsweise angewendet, wenn Ortsveränderungen eines oder mehrerer Objekte über einen bestimmten Zeitraum festgestellt und erfasst werden sollen (engl.: tracking).
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Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass eine Beleuchtung einer Probe mit einem Lichtblatt im Wesentlichen nur die markierten Objekte in einer dünnen beleuchteten Ebene zum Aussenden einer Detektionsstrahlung anregt (siehe zum Beispiel
DE 10 2016 212 020 A1 ). Die Positionen der mittels der Beleuchtungsstrahlung angeregten Objekte innerhalb der beleuchteten Ebene können mittels eines ortsauflösenden (zweidimensionalen) Detektors (Kamera) ermittelt und somit der Ursprungsort der jeweiligen Detektionsstrahlung zweidimensional lokalisiert werden.
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Um neben einer zweidimensionalen (2D-) Lokalisierung zusätzlich eine Information zur Position des Ursprungsort in Richtung einer optischen Achse des Detektionsstrahlengangs (Zc-Richtung; 3D) zu erhalten, kann die Punktbildübertragungsfunktion derart modifiziert werden, dass aus einer Rotationslage und/oder einer Umrissform einer Abbildung einer Punktlichtquelle Rückschlüsse auf die Zc-Position der Punktlichtquelle gezogen werden können.
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Beispielsweise kann ein Lichtblatt gegenüber einer Fokuslage eines Detektionsobjektivs versetzt eingestrahlt und die Umrissform der Abbildung der Punktlichtquelle analysiert werden, um die Zc-Position der erfassten Punktlichtquelle zu ermitteln (
DE 10 2013 208 926 A1 ).
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Es ist auch möglich, dass die PSF mittels einer entsprechend gestalteten Maske zu einer Doppelhelix geformt wird (double-helix method), sodass eine Punktlichtquelle als zwei voneinander getrennte Lichtpunkte abgebildet wird. Die relative Rotationslage der Punkte zueinander erlaubt die Ermittlung der zugehörigen Zc-Position (
WO 2012/039636 A2 ;
Pavani et al., 2009: Three-dimensional, singlemolecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function; PNAS Vol. 106, Nr. 9: 2995 - 2999).
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Nachteilig an den Lösungen gemäß dem Stand der Technik sind die erforderlichen teuren Masken zur Erzeugung einer Doppelhelix-PSF beziehungsweise die sehr eingeschränkte Anwendbarkeit der Lösung nach der
DE 10 2013 208 926 A1 in optischen Anordnungen, bei denen insbesondere die optische Achse des Detektionsstrahlengangs schräg durch Trennschichten unterschiedlicher Brechkraft verläuft, wie dies beispielsweise bei inversen Mikroskopen der Fall ist.
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Eine alternative Lösung zur dreidimensionalen Lokalisierung punktförmiger Objekte in Zc-Richtung ist aus der
DE 10 2011 055 294 A1 bekannt. Dabei werden in einem Objektraum angeordnete punktförmige Objekte mittels einer Detektionsoptik in Form einer dreidimensionalen Fokuslichtverteilung abgebildet. Das dabei erfasste Licht wird in separate Lichtbündel unterschiedlicher Wellenlängen aufgeteilt, mit verschiedenen Detektoren erfasst und anhand der Lagen der Lichtflecken auf den jeweiligen Detektoren eine laterale x-y-Position des betreffenden Objekts ermittelt. Eine Position in Zc-Richtung wird unter Auswertung der jeweils vorliegenden Form des Lichtflecks und einer dieser zugeordneten Form der PSF ermittelt.
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Die Form eines erfassten Bildes eines punktförmigen Objektes wird auch in der
DE 10 2018 128 590 A1 ausgewertet, um Rückschlüsse auf eine axiale Position des Objekts ziehen zu können. Unter Verwendung einer optischen Manipulationsvorrichtung wird das Bild eines punktförmigen Objekts so beeinflusst, dass dieses mindestens zwei Bildlappen aufweist, deren relative Ausrichtung von einer Position des punktförmigen Objekts relativ zur Fokallage und/oder von der Wellenlänge einer von dem Objekt abgegebenen Fluoreszenzstrahlung abhängt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde ein Verfahren vorzuschlagen, mit dem die Nachteile des Standes der Technik reduziert und eine dreidimensionale Bildgebung mit einer hohen Auflösung ermöglicht ist. Es ist ebenfalls Aufgabe der Erfindung, eine geeignete Vorrichtung, insbesondere eine optische Anordnung und ein Mikroskop mit einer solchen Anordnung, vorzuschlagen, mittels denen das Verfahren ausgeführt werden kann.
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Die Aufgabe wird mit den Gegenständen der unabhängigen und nebengeordneten Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Bei der Ausführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur dreidimensionalen Bildgebung in der Mikroskopie werden in einem Detektionsstrahlengang mittels wenigstens eines Korrekturelements Aberrationen einer von einer Probe kommenden Detektionsstrahlung korrigiert. Die Probe ist dabei insbesondere mit Markierungsmolekülen (auch: Sonden, Marker) wie zum Beispiel Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorophore) versehen, so dass spezifisch Bilddaten beispielsweise bestimmter Strukturen und/oder Moleküle der Probe erfasst werden können. Die Detektionsstrahlung kann dabei eine ganz oder über bestimmte Wellenlängenbereiche reflektierte Beleuchtungsstrahlung sein. Die Detektionsstrahlung kann außerdem eine von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Fluoreszenzstrahlung sein, die durch Wirkung einer entsprechenden Beleuchtungsstrahlung angeregt wurde. Die mittels des Korrekturelements korrigierte Detektionsstrahlung wird ortsaufgelöst mit einem geeigneten ortsauflösenden zweidimensionalen Detektor erfasst. Eine Detektionsebene des Detektors ist dabei vorzugsweise im Wesentlichen orthogonal zur optischen Achse des Detektionsstrahlengangs ausgerichtet.
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Erfindungsgemäß gekennzeichnet ist das Verfahren dadurch, dass eine bestmögliche Korrektureinstellung des Korrekturelements ermittelt wird, bei der aktuell auftretende Aberrationen bestmöglich reduziert werden. Die bestmögliche Korrektureinstellung ist dabei eine entsprechend den technischen und optischen Gegebenheiten, insbesondere hinsichtlich der technischen Elemente und Dimensionierungen des Detektionsstrahlengangs, optimierte Einstellung des Korrekturelements. Um eine bestmögliche Korrektureinstellung zu ermitteln, kann insbesondere vor der eigentlichen Verfahrensdurchführung eine, nachfolgend auch als Detektions-PSF bezeichnete, Punktbildübertragungsfunktion per Versuchsreihe und/oder Simulation ermittelt und abrufbar gespeichert werden.
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Für die Erfindung wesentlich ist das Vorhandensein wenigstens eines Korrekturelements. Dieses ist üblicherweise im Detektionsstrahlengang angeordnet. Alternativ oder zusätzlich kann ein Korrekturelement in einem Beleuchtungsstrahlengang vorhanden sein. Wichtig ist, dass dessen Wirkung auf die Ausbildung der Detektions-PSF im Sinne der Erfindung gegeben ist. Nachfolgend wird vereinfachend weitgehend auf lediglich ein Korrekturelement Bezug genommen.
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Ausgehend von der bestmöglichen Korrektureinstellung wird eine fehlerbehaftete Korrektureinstellung ermittelt, bei der auftretende, insbesondere verbleibende, Aberrationen zu einer asymmetrischen Punktbildübertragungsfunktion der Detektionsstrahlung führen. Dabei soll die fehlerbehaftete Korrektureinstellung eine qualitativ ausreichende Erfassung von Bilddaten erlauben und zugleich Informationen zur Position der Punktlichtquelle in Richtung der optischen Achse bereitstellen. Die bei der fehlerbehafteten Korrektureinstellung auftretende asymmetrische Detektions-PSF wird empirisch oder mittels einer Simulation rechnerisch ermittelt und für eine weitere Prozessierung erfasster Bilddaten vorgehalten. Eine empirische und eine rechnerische Ermittlung können miteinander kombiniert werden.
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Ein Bewertung, wann eine geeignete fehlerbehaftete Korrektureinstellung erreicht ist, kann beispielsweise anhand der aus dem Stand der Technik bekannten Fisher-Information durchgeführt werden (siehe dazu auch oben: Pavani et al. 2009).
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Die bestmögliche Korrektureinstellung muss nicht zwingend tatsächlich eingestellt werden. Es reicht, wenn diese theoretisch bekannt ist. Dem gleichgestellt ist die offensichtliche Annäherung an eine bestmögliche Korrektureinstellung, wenn diese sequenziell im Rahmen einer Feedback-Regelung ermittelt wird. Eine offensichtliche Annäherung ist zum Beispiel gegeben, wenn die Aberrationen einer Bilderfassung unter einen zuvor festgelegten Grenzwert fallen.
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Die so ermittelte fehlerbehaftete Korrektureinstellung wird bewirkt, indem beispielsweise das Korrekturelement angesteuert und entsprechend eingestellt wird. Nach dem Bereitstellen der fehlerbehafteten Korrektureinstellung werden zweidimensional Bilddaten der Probe erfasst. Mindestens ausgewählten Bilddaten werden anhand der jeweiligen erfassten Ausprägung der Asymmetrie der Detektions-PSF jeweils eine Position, insbesondere in Form einer Koordinate, in Richtung der optischen Achse des Detektionsstrahlengangs (fortan auch: Zc-Position) zugeordnet und vorzugsweise gespeichert. Die erfassten Bilddaten erlauben eine dreidimensionale Darstellung der erfassten Bilddaten.
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Kern der Erfindung ist die Nutzung eines zur Korrektur auftretender Aberrationen vorgesehenen Korrekturelements, um mit dessen Hilfe eine asymmetrische Detektions-PSF zu erzeugen. Entgegen der dem Korrekturelement ursprünglich zugedachten Funktion einer möglichst vollständigen Korrektur vorhandener Aberrationen der Detektionsstrahlung, wird dieses gezielt in eine fehlerbehaftete Korrektureinstellung überführt. Der so herbeigeführte Nachteil einer nicht optimierten Korrektur erlaubt aber überraschenderweise, Informationen zu einer Zc-Position erfasster Bilddaten zu erlangen.
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Im Folgenden sollen einige im Rahmen dieser Beschreibung der Erfindung verwendete Begriffe näher erläutert werden.
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Der Detektionsstrahlengang bedingt aufgrund seiner Konstruktion sowie der Eigenschaften und aktuellen Einstellungen der in ihm angeordneten optischen Elemente ein spezifisches Verhalten der Detektionsstrahlung während ihrer Ausbreitung entlang des Detektionsstrahlengangs. Dieses modifizierte Ausbreitungsverhalten wird hier mit der Detektions-PSF ausgedrückt.
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Im weiteren Verlauf dieser Beschreibung wird auf eine Beleuchtung mittels eines Lichtblatts Bezug genommen (siehe unten). Wird ein solches Lichtblatt verwendet, bedingt auch dieses einen Beitrag zu der Detektions-PSF, der als Lichtblatt-PSF bezeichnet werden kann. Die Detektions-PSF wird hier vereinfachend als ein Ergebnis der optischen Eigenschaften beispielsweise der Beleuchtung und des Detektionsstrahlengangs verstanden. Beiträge zum Beispiel der Probe zur Detektions-PSF werden der Einfachheit halber unter der Lichtblatt-PSF zusammengefasst.
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Im idealisierten Fall weist eine PSF eine Form auf, die um eine Fokuslage des Detektionsstrahlengangs, insbesondere eines Detektionsobjektivs, in Richtung der optischen Achse (Zc-Richtung) symmetrisch ausgebildet ist (siehe dazu 1a und 1b).
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Unter einer asymmetrischen PSF wird im Rahmen dieser Erfindung eine Detektions-PSF verstanden, die in Zc-Richtung an jeder Zc-Position eine bestimmte Form ihres Querschnitts und/oder eine bestimmte Größe ihres Querschnitts aufweist. Anhand von Form, Ausrichtung und/oder Größe des Querschnitts kann daher konkret eine Zc-Position zugeordnet werden.
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Unter einem Lichtblatt ist eine beleuchtete Ebene zu verstehen, die beispielsweise durch Strahlformung mittels einer Zylinderlinse (statisches Lichtblatt) oder durch schnelles Hin- und Herbewegen eines Lichtstrahls, beispielsweise mittels eines Scanners (dynamisches Lichtblatt) erzeugt werden kann, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist.
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Die Dicke eines Lichtblatts gibt dabei die Ausdehnung des Lichtblatts quer zu dessen Ebene und in Richtung des senkrecht auf der Ebene stehenden Detektionsstrahlengangs an.
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Ein strukturiertes Lichtblatt kann erzeugt sein, indem eine Mehrzahl von nicht-beugungsbegrenzten Strahlen, zum Beispiel Besselstrahlen sowie ggf. sinc3-Strahlen, nebeneinander in einer Ebene angeordnet werden. Die Abstände der Strahlen werden dabei so gewählt, dass durch destruktive Interferenzen unerwünschte Beleuchtungswirkungen ober- und unterhalb der die Strahlen aufweisenden Ebene weitgehend aufgehoben sind. Optional können die Strahlen in der Ebene bewegt werden, um ein homogenes Lichtblatt in der Ebene zu erzeugen. Ebenfalls optional können in der Ebene zwischen den unbewegten Strahlen unbeleuchtete Bereiche vorliegen.
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In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Ausbildung der asymmetrischen Detektions-PSF mittels einer angepassten Gestaltung der Beleuchtungsstrahlung als Lichtblatt bewirkt. Dabei wird die Beleuchtungsstrahlung entlang einer optischen Achse eines Beleuchtungsstrahlengangs in einen Probenraum und auf die dort angeordnete Probe gerichtet. Um eine asymmetrische Detektions-PSF zu bewirken, wird entweder eine Lage des Lichtblatts asymmetrisch zur Fokusebene des Detektionsstrahlengangs eingestellt und/oder das Lichtblatt wird in seiner Ausprägung asymmetrisch und/oder orthogonal zur Richtung der optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs moduliert und als ein strukturiertes Lichtblatt ausgebildet.
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Wie bereits erwähnt, kann mit einem Lichtblatt ein dünner, flächiger Bereich der Probe beleuchtet und Bilddaten von diesem beleuchteten Bereich erfasst werden. Um einen größeren Volumenbereich der Probe abzutasten, können das Lichtblatt und die Probe relativ zueinander in unterschiedliche Positionierungen versetzt werden. Die Probe oder Bereiche der Probe werden also mit dem Lichtblatt abgetastet. Je relativer Positionierung von Lichtblatt und Probe wird beispielsweise jeweils mindestens ein Bild erfasst.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens überlappen die von dem Lichtblatt während eines Abtastvorgangs beleuchteten Bereiche der Probe je relativer Positionierung einander um einen Bruchteil der Dicke des Lichtblatts. Auf diese Weise werden nicht erfasste Bereiche zwischen den einzelnen Positionierungen vermieden.
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Die Erfindung ermöglicht nicht nur eine dreidimensionale Bildgebung, sondern lässt auch ein Nachverfolgen von Bewegungen einzelner Objekte in einem Volumen der Probe zu (particle tracking; single molecule tracking). Dazu werden über einen Beleuchtungszeitraum Ortsveränderungen wenigstens eines Objekts der Probe erfasst. Sollen Ortsveränderungen einer Mehrzahl von Objekten erfasst werden, erfolgt die Abtastung des Volumens vorteilhaft mit einem einmaligen Beleuchten an jeder Positionierung, insbesondere mittels einer zu einem Lichtblatt geformten Beleuchtungsstrahlung. Dabei kann die Abtastgeschwindigkeit, also insbesondere die Beleuchtungsbeziehungsweise Erfassungsdauer je Positionierung, an die jeweilige Probe und/oder die optischen Parameter angepasst werden. Beispielsweise kann die Erfassungsdauer so lang gewählt werden, dass eine gewünschte Anzahl von Lokalisierungen jedes zu verfolgenden Objekts erreicht wurden. Die einzelnen Positionierungen des Lichtblatts überlappen sich vorteilhaft um einen Anteil der Dicke des Lichtblatts, um eine kontinuierliche Bildwiedergabe des abgetasteten Volumens zu erreichen.
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Wenn wenige oder nur ein einzelnes Objekt erfasst und lokalisiert werden soll, kann die Positionierung des Lichtblatts in Anhängigkeit der erfassten Ortsveränderungen gesteuert und nachgeführt werden. Beispielsweis kann das Lichtblatt nachgeführt werden, wenn sich abzeichnet, dass das nachverfolgte Objekt das Lichtblatt verlassen wird. In jedem Fall ist aufgrund der asymmetrischen Detektions-PSF neben einer zweidimensionalen Lokalisierung auch die Erfassung zugehöriger Zc-Positionen möglich, sodass ohne ein zusätzliches optisches Element im Detektionsstrahlengang eine dreidimensionale Bildgebung erfolgen kann.
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Es ist auch möglich, dass das abzutastende Volumen mehrfach und mit jeweils kürzeren Beleuchtungsdauern überstrichen wird. Bei jeder einzelnen Erfassung wird dabei eine Anzahl der Objekte erfasst. Die Abtastung wird so oft wiederholt, bis eine genügende Anzahl von Objekten und/oder Ortserfassungen (Lokalisierungen) erfolgt ist. Diese Vorgehensweise ist für dynamische Vorgänge geeignet, beispielsweise für das Nachverfolgen mehrerer einzelner Objekte (single particle tracking).
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Eine laterale, zweidimensionale Positionsbestimmung des Objekts kann in bekannter Weise beispielsweise mittels Schwerpunktbestimmung, Anpassen einer Gauß-Maske, einer 2D-Gauß-Funktion oder einer experimentellen PSF erfolgen.
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Um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, kann eine Anordnung zur Mikroskopie verwendet werden, die einen Detektionsstrahlengang umfasst. Der Detektionsstrahlengang weist ein Objektiv zum Erfassen einer Detektionsstrahlung und einen ortsauflösenden Detektor zur zweidimensionalen Erfassung von Bildpunkten der Detektionsstrahlung auf. Außerdem ist zwischen Objektiv und Detektor ein Korrekturelement zur Korrektur von Aberrationen der Detektionsstrahlung im Detektionsstrahlengang angeordnet. Weiterhin ist eine Steuervorrichtung (Steuerung) zur Ansteuerung und gesteuerten Einstellung des Korrekturelements vorhanden. Die Steuervorrichtung ist beispielsweise durch einen Rechner oder einen Mikrocontroller realisiert.
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Gekennzeichnet ist die Anordnung dadurch, dass die Steuervorrichtung konfiguriert und eingerichtet ist, um ausgehend von einer bestmöglichen, beziehungsweise von einer als bestmöglich ermittelten, Korrektureinstellung des Korrekturelements, bei der aktuell auftretende Aberrationen bestmöglich reduziert werden, eine fehlerbehaftete Korrektureinstellung zu bewirken, um eine asymmetrische Punktbildübertragungsfunktion der Detektionsstrahlung zu erzeugen. Die Steuervorrichtung weist daher eine Speicherstruktur (z. B. RAM) auf, in der die Abläufe des erfindungsgemäßen Verfahrens kodiert sind. Weiterhin ist eine Befehlsstruktur (z. B. CPU) vorhanden, die aufgrund der erfassten Eingangssignale, insbesondere der erfassten Bilddaten, Steuerbefehle generiert, deren Ausführung, beispielsweise durch Stellantriebe des Korrekturelements, zu einer asymmetrischen Detektions-PSF führen.
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In einer vorteilhaften Ausführung der erfindungsgemäßen Anordnung ist das Korrekturelement durch mindestens ein Paar Alvarezplatten gebildet. Die einzelnen Alvarezplatten sind mittels geeigneter Stellantriebe relativ zueinander einstellbar.
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Die genannte Anordnung kann insbesondere in einem Mikroskop vorhanden sein. Dabei kann das Mikroskop ein aufrechtes Mikroskop sein. Die Erfindung ist aber besonders vorteilhaft in einem Mikroskop in einer inversen Ausführung umgesetzt. Das inverse Mikroskop umfasst dabei eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv zur Beleuchtung einer auf einem Probenträger in einem Probenbereich einer Probenebene befindlichen Probe mittels einer Beleuchtungsstrahlung über einen Beleuchtungsstrahlengang. Dabei schließt die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs mit der Normalen der Probenebene, hinsichtlich welcher der Probenträger ausgerichtet ist, einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel ein.
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In dem Beleuchtungsstrahlengang sind Mittel zur Strahlformung und zur Erzeugung eines Lichtblatts der Beleuchtungsstrahlung vorhanden. Die Strahlformungsmittel können eine Zylinderlinse, ein Scanner und/oder ein räumlicher Lichtmodulator (spatial light modulator; SLM) sein. Der SLM dient vor allem der Erzeugung und Bereitstellung eines strukturierten Lichtblatts.
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In dem Detektionsstrahlengang ist eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv vorhanden, dessen optische Achse mit der Normalen der Probenebene einen von Null verschiedenen Detektionswinkel einschließt.
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Zusätzlich zu dem mindestens einem Korrekturelement im Detektionsstrahlengang kann die Anordnung beziehungsweise das Mikroskop ein weiteres optisches Element aufweisen, das zur Vorkorrektur von Aberrationen, die aufgrund des Durchtritts von Detektionsstrahlung und/oder von Beleuchtungsstrahlung durch Medien unterschiedlicher Brechkraft entstehen, ausgebildet ist. Das Korrekturelement dient zur Korrektur von verbliebenen Aberrationen.
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Als optisches Element für eine solche Vorkorrektur kann beispielsweise ein Freiformelement verwendet sein, durch dessen Wirkung eine mittlere Deckglasdicke, beispielsweise die Dicke eines transparenten Bodens des Probenträgers, beispielsweise einer Petrischale oder einer Mikrotiterplatte, ausgeglichen wird (siehe zum Beispiel
DE 10 2013 112 600 A1 ). Das optische Element zur Vorkorrektur kann dabei in Form einer Meniskuslinse ausgebildet sein, die sowohl in dem Beleuchtungsstrahlengang als auch in dem Detektionsstrahlengang angeordnet ist. Eine Meniskuslinse weist zwei Seitenflächen auf, die in dieselbe Richtung gekrümmt sind.
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Eine Vorkorrektur eines auftretenden vertikalen Astigmatismus kann auch durch Wirkung einer Zylinderlinse korrigiert werden, während ein Sprung des Brechungsindex beispielsweise mittels einer konzentrischen Linse oder mit einem Prisma reduziert sein kann, wobei Letzteres mit einem Immersionsmedium gefüllt ist.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Dabei zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung eines inversen Mikroskops und eine symmetrische Punktbildübertragungsfunktion bei einer Beleuchtung mit einem Lichtblatt einer ersten Dicke gemäß dem Stand der Technik;
- 2 eine schematische Darstellung eines inversen Mikroskops und eine symmetrische Punktbildübertragungsfunktion bei einer Beleuchtung mit einem Lichtblatt einer zweiten Dicke gemäß dem Stand der Technik;
- 3 eine schematische Darstellung einer Ausführung eines erfindungsgemäßen Mikroskops in Form eines inversen Lichtblattmikroskops;
- 4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen inversen Mikroskops und einer erfindungsgemäßen Verfahrensausgestaltung mit einer Erzeugung einer asymmetrischen Punktbildübertragungsfunktion bei einer Beleuchtung mit einem Lichtblatt;
- 5 ein Beispiel für eine Auswahl von Zernike-Koeffizienten der infolge des schrägen Durchgangs von Strahlung durch einen Probenhalter verursachten Aberrationen;
- 6 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Verfahrensausgestaltung mit einer wiederholten Abtastung einer Probe und der dreidimensionalen Nachverfolgung zweier Objekte der Probe;
- 7 eine schematische Darstellung einer Koordinatentransformation mi einer Anzahl zueinander versetzter Lichtblattpositionierungen erfasster Objekte; und
- 8 ein Ablaufschema einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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In den folgenden Abbildungen zum Stand der Technik sowie zu Ausführungsmöglichkeiten der Erfindung sind gleiche technische Elemente mit gleichen Bezugszeichen benannt.
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Die 1 zeigt schematisch ein inverses Mikroskop 1, bei dem mittels eines Beleuchtungsobjektivs 2 entlang einer ersten optischen Achse A1 eines Beleuchtungsstrahlengangs eine zu einem Lichtblatt 6 geformte Beleuchtungsstrahlung BS in einen Probenraum eingestrahlt wird, in dem eine Probe 5 angeordnet ist. Die Probe 5 ist auf einem Probenträger 7 aufgelegt, der relativ zu einer Probenebene 4 ausgerichtet ist und durch dessen Boden die Beleuchtungsstrahlung in den Probenraum gerichtet wird. Der Probenträger 7 ist mit einem Medium 8 gefüllt, in dem sich die Probe 5 befindet.
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Die optische Achse A1 des Beleuchtungsstrahlengangs schließt mit einer Normalen N der Probenebene 4 einen von Null verschiedenen Winkel α1 von beispielsweise 60° ein. Eine zweite optische Achse A2 eines Detektionsstrahlengangs ist in einem rechten Winkel auf das Lichtblatt 6 gerichtet und schließt mit der Normalen N der Probenebene 4 ebenfalls einen von Null verschiedenen Winkel α2 ein, der in diesem Falle 30° beträgt. Eine durch Wirkung des Lichtblatts 6 in der Probe 5 verursachte Detektionsstrahlung DS wird mittels eines Detektionsobjektivs 3 gesammelt und entlang des Detektionsstrahlengangs geführt.
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In der gezeigten Detailvergrößerung ist eine symmetrische Punktbildübertragungsfunktion PSFsymm dargestellt, die sich in Richtung der optischen Achse A2 des Detektionsstrahlengangs (Richtung der Zc-Achse; Zc-Richtung) und über einen großen Anteil der Dicke D1 des Lichtblatts 6 in der erstreckt.
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Die 2 zeigt in der Detailvergrößerung eine symmetrische Punktbildübertragungsfunktion PSFsymm eines Lichtblatts 6, das einer gegenüber der 1 geringere Dicke D2 aufweist. Die symmetrische Punktbildübertragungsfunktion PSFsymm ist in Zc-Richtung ebenfalls kürzer als die symmetrische Punktbildübertragungsfunktion PSFsymm zu 1 (zum Vergleich mit einer Punktlinie umrissen gezeigt) und erstreckt sich über die gesamte Dicke D2 des Lichtblatts 6.
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Lediglich beispielhaft und vereinfacht sind die Querschnitte der symmetrischen Punktbildübertragungsfunktion PSFsymm in zwei gleich weit von der ersten optischen Achse A1 entfernten Ebenen gezeigt. Die Querschnitte sind zueinander gleich und lassen anhand ihrer Form und/oder Größe keinen Rückschluss auf ihre jeweilige tatsächliche Position in Richtung der zc-Achse zu. Entsprechendes gilt für gleich weit von der ersten optischen Achse A1 entfernte Querschnitte eines dickeren Lichtblatts 6 gemäß 1.
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Bevor in den nachfolgenden Abbildungen 4 bis 8 die Erfindung in Hinblick auf ihrer verfahrensseitige Ausgestaltung erläutert werden soll, wird in 3 ein für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignetes Mikroskop 1, insbesondere ein Lichtblattmikroskop 6 in einer inversen Form, dargestellt und näher erläutert.
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Das Ausführungsbeispiel des zur Lichtblattmikroskopie ausgebildeten inversen Mikroskops1 weist eine Steuerung 13 auf, die zur Ausführung des Verfahrens konfiguriert ist. Das Lichtblattmikroskop 1 ist mit Korrekturelementen 2KE, 3KE und einem optischen Element 10 zur Vorkorrektur auftretender Aberrationen in Form einer Meniskuslinse dargestellt. Die Winkel α1 und α2 zwischen einer senkrecht auf der Bezugsebene 4 stehenden Normalen B und der ersten optischen Achse A1 beziehungsweise der zweiten optischen Achse A2 betragen im Ausführungsbeispiel je 45°. Als adaptive Korrekturelemente 2KE, 3KE sind jeweils zwei Alvarezplatten vorhanden, die mittels Stellantrieben 12.1, beispielsweise in Form eines Alvarez-Manipulators, in dem Strahlengang der Beleuchtungsstrahlung BS und in dem Strahlengang der Detektionsstrahlung DS angeordnet sind. In alternativen Ausführungsformen sind lediglich im Detektionsstrahlengang ein adaptives Korrekturelement 3KE und ein zugehöriger Stellantrieb 12.1 vorhanden.
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Die Korrekturelemente 2KE, 3KE dienen der Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des schrägen Durchgangs der Beleuchtungsstrahlung BS beziehungsweise der Detektionsstrahlung durch den Boden der Probenhalterung 7 auftreten können. Das optische Element 10 in Form der Meniskuslinse unterstützt den Übergang der Beleuchtungsstrahlung BS von Luft in ein Immersionsmedium 18 und in das Medium 8 sowie den Übergang der Detektionsstrahlung DS von dem Medium 8 in das Immersionsmedium 18 und in die Luft.
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Die Probenhalterung 7 ist auf einem Probentisch 11 gehalten. Der Probentisch 11 selbst ist in einer durch die X-Achse X und die Y-Achse Y aufgespannten X-Y-Ebene mittels Stellantrieben 11.1 gesteuert verstellbar.
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Das Beleuchtungsobjektiv 2 und das Detektionsobjektiv 3 sind optional mittels je eines Objektivantriebs (nicht gezeigt), der als ein Piezoantrieb ausgebildet sein kann, entlang der ersten optischen Achse A1 beziehungsweise entlang der zweiten optischen Achse A2 gesteuert verstellbar.
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Die Beleuchtungsstrahlung BS wird durch ein Lasermodul 15 bereitgestellt und mittels einer Strahlformung 16 geformt. Die Strahlformung 16 ist beispielsweise eine Optik, mittels der die bereitgestellte Beleuchtungsstrahlung BS geformt, beispielsweise kollimiert, wird. Diese kann beispielsweise ein räumlicher Lichtmodulator (SLM, spatial light modulator) sein. Mittels der Strahlformung 16 ist die Beleuchtungsstrahlung BS zu einem Lichtblatt 6 in einem Probenraum geformt, in dem sich die Probe 5 befindet.
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Der Strahlformung 16 nachgeordnet ist ein Scanner 17 vorhanden, mittels dem die geformte Beleuchtungsstrahlung BS gesteuert in zwei Richtungen ablenkbar ist (X-Y-Scanner).
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Nach dem Scanner 17 ist das Beleuchtungsobjektiv 2 auf der ersten optischen Achse A1 angeordnet. Die von dem Scanner 17 abgelenkte Beleuchtungsstrahlung BS gelangt zu dem Beleuchtungsobjektiv 2 und wird durch dieses weiter geformt und/oder fokussiert. Das Lichtblatt 6 wird durch eine entsprechende Ablenkung der Beleuchtungsstrahlung BS mittels des Scanners 17 in dem Probenbereich erzeugt.
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Die von der Probe 5 und aus dem Probenbereich kommende Detektionsstrahlung DS ist entlang der zweiten optischen Achse A2 auf einen Detektor 19 gerichtet und durch diesen in einer Detektionsebene DE erfassbar.
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Zur Ansteuerung des Probentischs 11, der Stellantriebe 11.1, der Objektivantriebe 14, der Korrekturelemente 2KE, 3KE beziehungsweise deren Stellantriebe 12, des Lasermoduls 15, der Strahlformung 16, des Scanners 17 und/oder des Detektors 19 ist eine Steuereinheit 13 vorhanden, die mit den anzusteuernden Elementen in einer zur Datenübertragung geeigneten Verbindung steht (nur angedeutet gezeigt).
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In weiteren Ausführungen ist die Steuereinheit 13 zusätzlich zur Erfassung, Speicherung und/oder zur Auswertung von Messwerten konfiguriert. Mittels der Steuereinheit 13 können weitere Elemente sowie Einheiten des Mikroskops 1 ansteuerbar sein und/oder Messwerte von diesen erhalten und ausgewertet werden.
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Aberrationen, die bei einem schiefen Durchgang der Beleuchtungsstrahlung BS durch die Probenhalterung 7 auftreten, sind von deren Dicke abhängig. Aus diesem Grund sind beispielsweise die Korrekturelemente 2KE, 3KE verschiebbar in den Beleuchtungsobjektiv 2 und/oder dem Detektionsobjektiv 3 gelagert, um durch eine Verschiebung der Korrekturelemente 12 zueinander eine Aberrationskorrektur auf die Dicke abzustimmen.
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Es werden im Folgenden zur Beschreibung zwei Koordinatensysteme mit zueinander orthogonalen Achsen genutzt. Das erste Koordinatensystem ist das Koordinatensystem der gesamten Anordnung mit einer X-Achse X, einer Y-Achse Y und einer Z-Achse Z. Idealerweise ist die Probenhalterung 7, insbesondere deren Boden, parallel zu einer durch die X-Achse X und die Y-Achse Y aufgespannte X-Y-Ebene ausgerichtet. Das zweite Koordinatensystem ist das Koordinatensystem des Detektors 19 mit der X-Achse Xc, einer y-Achse Yc und einer z-Achse Zc. Eine Abbildung beispielsweise eines Bildes aus der Bildebene BE auf dem Detektor 19 besitzt die Koordinaten Xc und Yc. Die X-Achse Xc ist in beiden Koordinatensystemen orthogonal zur Zeichenebene der Figuren gerichtet. Die beiden anderen Achsen Y und Yc beziehungsweise Z und Zc, können durch eine Rotation um die X-Achse X ineinander überführt werden.
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Aberrationen, die bei einem schiefen Durchgang der Beleuchtungsstrahlung BS durch die Probenhalterung 7 auftreten, sind von deren Dicke abhängig. Aus diesem Grund sind die Alvarezplatten des Korrekturelements 2KE, 3KE relativ zueinander verschiebbar in dem Detektionsstrahlengang gelagert. Mittels einer Verschiebung der Alvarezplatten zueinander kann eine Aberrationskorrektur vorgenommen werden.
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Die Steuervorrichtung 13 ist erfindungsgemäß so konfiguriert, dass ausgehend von einer als bestmöglich ermittelten Korrektureinstellung des Korrekturelements 2KE, 3KE eine fehlerbehaftete Korrektureinstellung bewirkt wird, um eine asymmetrische Punktbildübertragungsfunktion der Detektionsstrahlung zu erzeugen. Die ermittelte bestmögliche Korrektureinstellung kann dabei vorab ermittelt worden und in einem Speicher, beispielsweise als eine Untereinheit der Steuervorrichtung 13, abrufbar vorgehalten sein. Die Steuervorrichtung 13 ruft die für eine aktuelle Konstellation des Mikroskops 1, beispielsweise für eine bestimmte Probenart, eine Wellenlänge der Beleuchtungsstrahlung, des verwendeten Immersionsmediums, die Art des Lichtblatts 6 sowie dessen Dicke D und/oder der anzuwendenden Fokuslänge des Detektionsobjektivs 3 als bestmöglich ermittelte Korrektureinstellung ab. Mit dieser wären die Aberrationen weitestgehend korrigiert und im Ergebnis eine symmetrische Punktbildübertragungsfunktion PSFsymm der Detektion bewirkt. Eine solche symmetrische Punktbildübertragungsfunktion PSFsymm erlaubt zwar eine zweidimensionale Erfassung der Bilddaten sowie deren Lokalisation, aber sie lässt keine Ermittlung von Positionen in Zc-Richtung zu.
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Ausgehend von dieser bestmöglichen Korrektureinstellung werden die Alvarezplatten zueinander so in einer Richtung und um einen Betrag so verschoben, dass eine asymmetrische Punktbildübertragungsfunktion PSFasymm der Detektion bewirkt ist.
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In der 4 sind die Wirkungen dieser erfindungsgemäßen Ausformung der Punktbildübertragungsfunktion PSFasymm veranschaulicht. Zur Erläuterung sind je zwei Querschnitte von gleich weit von der optischen Achse A1 entfernten Ebenen gezeigt. Obwohl sowohl die äußeren beiden Ebenen als auch die beiden inneren Ebenen jeweils gleich weit von der optischen Achse A1 entfernt sind, können deren jeweilige Querschnitte anhand ihrer individuellen Größen, Ausrichtung und/oder Formen eindeutig unterschieden werden. So weist der in der Detailvergrößerung oben gezeigte Querschnitt eine achteckige Form mit eingezogenen Ecken auf, während der an unterster Position gezeigte Querschnitt ein an den Ecken abgerundetes Viereck ist. Die mittleren beiden Querschnitte sind zwar beides Ovale, allerdings unterscheiden sich beiden durch ihrer jeweiligen Abmessungen als auch in ihrer Lage (Ausrichtung) der jeweiligen Hauptachse voneinander.
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Es ist möglich, jeder Kombination von Größe und Form genau eine Position in Richtung der Zc-Achse (Zc-Position) zuzuordnen. Neben einer Lokalisierung eines Bildpunkts in einer zweidimensionalen Bildebene BE (siehe 3) kann daher einem mit mindestens einem Bildpunkt erfassten Objekt auch eine Positionsinformation hinsichtlich seiner relativen Lage in Richtung der Zc-Achse zugeordnet und optional gespeichert werden.
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Die Auswirkungen eines schrägen Durchgangs der Beleuchtungsstrahlung BS und/oder der Detektionsstrahlung DS durch den Boden der Probenhalterung 7 sind beispielhaft in 5 anhand von Zernike-Koeffizienten illustriert. So weist eine Wellenfront bei Abbildung durch ein Deckglas (Probenhalterung 7) unter einem Winkel von 32° zur Normalen N die ausschnittsweise gezeigten Zernike-Koeffizienten auf. Sehr große Beiträge zur auftretenden Aberration stammen von vertikalem Astigmatismus (Z5) und vertikalem Koma (Z8). Weitere Beiträge beruhen beispielsweise auf dem sogenannten Dreiblatt (Z11) und auch Aberrationen höherer Ordnung (z. B. sekundäres Koma Z15) tragen zur gesamten Aberration bei.
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Um dem Erfindungsgedanken folgend eine asymmetrische Punktbildübertragungsfunktion PSFasymm zu erzeugen, kann beispielsweise in einer einzustellenden fehlerbehafteten Korrektureinstellung ein hoher Beitrag des Astigmatismus (Z5) bewirkt werden.
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In der 6 ist schematisch eine erfindungsgemäße Verfahrensausgestaltung mit einem wiederholten Abtasten einer Probe 5 und der dreidimensionalen Nachverfolgung zweier Objekte 9.1 und 9.2 der Probe 5 dargestellt. In den beispielhaft gezeigten einzelnen Positionierungen des Lichtblatts 6 sind gegebenenfalls jeweils die Orte gezeigt, an denen sich eines der nachzuverfolgenden Objekte 9.1 beziehungsweise 9.2 im Bereich des Lichtblatts 6 befindet. Nach einer Anzahl von Abtastungen des Volumens der Probe 5 kann aus den gesammelten Bilddaten und der Information zur Zc-Position eine Bewegungsbahn jedes der Objekte 9.1, 9.2 erstellt werden.
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Die bereits angesprochene Transformation von Koordinaten ist in 7 beispielhaft gezeigt. In der 7 sind mehrere Positionierungen eines Lichtblattes 6 mit einer Dicke D gezeigt. Diese Positionierungen können durch entsprechendes Verschieben des Probentisches 11 und/oder durch eine Veränderung der Lichtblattpositionierung eingestellt werden. Dabei kann es vorteilhaft sein, einen Überlapp-Bereich ΔD zwischen benachbarten Positionierungen des Lichtblatts 6 vorzusehen. Der zu einer Dicke D korrespondierende Koordinatenbereich der Y-Achse ist mit dY bezeichnet und der zum Überlapp-Bereich ΔD korrespondierende Koordinatenbereich mit ΔY.
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Innerhalb einer Positionierung werden die Moleküle im Koordinatensystem des Detektors 19 mit den Achsen Xc, Yc und Zc lokalisiert. Die jeweilige Positionierung des Lichtblatts 6 ist bekannt (beispielhaft mit einer unterbrochenen Linie veranschaulicht). Relativ zu dem Lichtblatt 6 können die Objektkoordinaten mittels bekannter Lokalisierungsalgorithmen und unter Auswertung der die Zc-Position kodierenden asymmetrischen Punktbildübertragungsfunktion PSFasymm ermittelt werden. Die Gesamtheit der gefundenen Molekülkoordinaten der Probe 5 kann nach Abschluss der Messung zweckmäßigerweise in das Koordinatensystem der Anordnung mit den Achsen X, Y und Z transformiert werden (siehe auch 6).
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Soll die Positionierung des Lichtblatts 6 verändert werden, wird mittels der Steuerung 13 ein entsprechender Befehl erzeugt und an den Stellantrieb 11.1 des Probentischs 11 und/oder an den Scanner 17 übermittelt und ausgeführt (8). Die aktuellen Positionsdaten des Lichtblatts 6 relativ zum Probentisch 11 - und damit zur darauf befindlichen Probe 5 - werden erfasst und den an der betreffenden Positionierung erfassten Bilddaten zugeordnet. Die Positionsdaten und die Bilddaten werden anschließend weiterverarbeitet, um die jeweiligen Ursprungsorte der erfassten Bilddaten, insbesondere von Ursprungsorten erfasster Detektionsstrahlung, zu ermitteln. Als Grundlage dieser Lokalisierung dienen Punktbildübertragungsfunktionen, die zuvor experimentell und/oder theoretisch ermittelt wurden. Für eine zweidimensionale Lokalisierung kann sowohl eine symmetrische als auch eine asymmetrische Punktbildübertragungsfunktion verwendet werden.
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Für eine dreidimensionale Lokalisierung wird erfindungsgemäß eine asymmetrische Punktbildübertragungsfunktion verwendet, die zuvor unter Kenntnis einer bestmöglichen Korrektureinstellung insbesondere der vorhandenen Korrekturelemente erzeugt wurde. Die ermittelten Koordinaten von Bildpunkten beziehungsweise deren Ursprungsorten werden anschließen optional in ein für den Benutzer intuitiv verständliches und/oder in ein für nachfolgende Verarbeitungsschritte geeignetes Koordinatensystem überführt und ein Bild der Probe 5 erstellt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend in Hinblick auf die 3 bis 8 zusammenfassend erläutert. Als Grundlage für das erfindungsgemäße Verfahren wird eine bestmögliche Korrektureinstellung insbesondere des Korrekturelements 3KE ermittelt. Dies kann bereits vor der eigentlichen Bilderfassung erfolgen, indem beispielsweise empirisch und/oder unter Verwendung von Simulationsmodellen eine bestmögliche Korrektureinstellung ermittelt und wiederholt abrufbar gespeichert wird. Dabei können als Parameter die optischen Eigenschaften der Detektionsstrahlengangs, der Probe 5, des Lichtblatts 6, gegebenenfalls eines optischen Elements zur Vorkorrektur 10, eines Immersionsmediums 18, eines Probenträgers 7, einer Wellenlänge der Beleuchtungsstrahlung BS, Eigenschaften verwendeter Marker der Probe 5 und/oder die Beleuchtungs- und Detektionswinkel alpha1 beziehungsweise alpha 2 berücksichtigt werden.
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Eine bestmögliche Korrektureinstellung kann auch ermittelt werden, indem die abzubildende Probe 5 mit der zur Bilderfassung vorgesehenen Beleuchtungsstrahlung BS, insbesondere mit dem dazu vorgesehenen Lichtblatt 6, beleuchtet und die dabei bewirkte Detektionsstrahlung DS erfasst wird. Unter Anwendung einer Feedback-Regelung zwischen dem Detektor 19 und den Stellantrieben 12.1 des Korrekturelements 2KE, 3KE kann die bestmögliche Korrektureinstellung sequenziell ermittelt und optional gespeichert werden. Dabei kann die Steuerung 13 eine Analyseeinheit (z.B. eine CPU, ein FPGA) umfassen, die zur Auswertung aktuell erfasster Bilddaten und dem Generieren entsprechender Steuerbefehle zur Ansteuerung der Stellanriebe 12.1 ausgelegt und konfiguriert ist.
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Die Verfahrensausführung weist daher den Schritt des Abrufens oder des instantanen Ermittelns einer ermittelten bestmöglichen Korrektureinstellung auf. Ausgehend von dieser wird eine fehlerbehaftete Korrektureinstellung ermittelt, bei der eine hinreichende Qualität der Bilderfassung gegeben ist, aber zudem eine Information zu Zc-Position eines Ursprungsortes einer erfassten Punktlichtquelle aus der dann asymmetrischen Detektions-PSF extrahiert werden kann.
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Ebenfalls ermittelt wird die mit der fehlerbehafteten Korrektureinstellung bewirkte asymmetrische Detektions-PSF, indem diese beispielsweise empirisch, rechnerisch oder mit einer kombinierten Vorgehensweise ermittelt wird. Die ermittelte asymmetrische Detektions-PSF wird gespeichert.
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Die zulässigen Fehler einer solchen fehlerbehafteten Korrektureinstellung können vorab festgelegt werden. In weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens kann ein zulässiger Fehler im Zuge eines instantanen Ermittelns beispielsweise anhand einer Funktion der technisch umsetzbaren Einstellmöglichkeiten und einer damit bewirkten Veränderung der auftretenden Aberrationen festgelegt werden.
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Die ermittelte fehlerbehaftete Korrektureinstellung wird eingestellt, indem entsprechende Steuerbefehle mittels der Steuervorrichtung 13 generiert und an die Stellantriebe 12.1 des Korrekturelements 2KE, 3KE geleitet werden, wo diese in eine Stellbewegung umgesetzt werden.
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Um die Bilderfassung unter Verwendung eines Lichtblatts 6 durchzuführen, werden die Probe 5 und das Lichtblatt 6 relativ zueinander positioniert und die Bilderfassung durchgeführt. Soll ein Volumen der Probe 5 abgetastet werden, wird die Positionierung von Probe 5 und Lichtblatt 6 relativ zueinander entsprechend verändert. Dies kann durch eine gesteuerte Bewegung des Probentisches 11 und/oder des Lichtblatts 6 erfolgen. Zu jeder Positionierung sind die zugehörigen Positionsdaten bekannt und werden dem mit der betreffenden Positionierung erfassten Bilddaten zugeordnet und gespeichert.
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Diese mit den Positionsdaten versehenen Bilddaten können anschließend oder direkt in Echtzeit analysiert und gegebenenfalls prozessiert werden. Dabei wird die ermittelte asymmetrische Detektions-PSF verwendet, um den erfassten Bilddaten aufgrund der jeweils erfassten Ausprägung der asymmetrischen Detektions-PSF eine Zc-Position zuzuordnen.
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Außerdem werden die erfassten Bilddaten, insbesondere die Abbildungen jeweiliger Punktlichtquellen, innerhalb der Detektionsebene Xc-Yc des Detektors 19 lokalisiert, also jeweils einem Koordinatenpaar Xc und Yc zugeordnet und optional gespeichert.
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Die Koordinatenpaare Xc und Yc können anschließend in Koordinaten X-Y transformiert werden, um dem Betrachter ein Bild anbieten zu können, dass der Ausrichtung der Probe 5 relativ zur Probenebene 4 entspricht. Entsprechendes gilt für eine Transformation erfasster Zc-Koordinaten in Z-Koordinaten. Teil der Prozessierung kann auch die Umsetzung der aufbereiteten Bilddaten in eine bildliche Darstellung, beispielsweise auf einem Monitor oder Display sein.
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Die an einer Positionierung des Lichtblatts 6 erfassten Bilddaten liegen nach der Prozessierung mit den jeweiligen räumlichen Koordinaten und optional mit den jeweiligen Intensitätswerten vor, sodass die Bildgebung sowohl zweidimensional als auch dreidimensional erfolgen kann. Infolge der Kenntnis des Zc-Positionen können auch andere Schnittebenen berechnet und visualisiert werden.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Lichtblattmikroskop
- 2
- Beleuchtungsobjektiv
- 2KE
- Beleuchtungskorrekturelement
- 3
- Detektionsobjektiv
- 3KE
- Detektionskorrekturelement
- 4
- Probenebene, Bezugsebene
- 5
- Probe
- 6
- Lichtblatt
- 7
- Probenhalterung
- 8
- Medium
- 9.1
- Objekt
- 9.2
- Objekt
- 10
- Meniskuslinse; optisches Element (Vorkorrektur)
- 11
- Probentisch
- 11.1
- Stellantrieb (des Probentisches 11)
- 12
- Stellantrieb (der Korrekturelemente 2KE, 3KE), Alvarez-Manipulator
- 13
- Steuereinheit; Steuerung
- 14
- Objektivantrieb
- 15
- Lasermodul, Lichtquelle
- 16
- Strahlformung
- 17
- X-Y-Scanner
- 18
- Immersionsmedium
- 19
- Detektor
- A1
- erste optische Achse (optische Achse des Beleuchtungsobjektivs 2)
- A2
- zweite optische Achse (optische Achse des Detektionsobjektivs 3)
- α1
- Winkel / Beleuchtungswinkel
- α2
- Winkel / Detektionswinkel
- D1, D2, Dn
- Dicke des Lichtblatts 6
- N
- Normale
- PSFsymm
- symmetrische PSF
- PSFasymm
- asymmetrische PSF
