JP2023109177A - 非対称ｐｓｆを用いた顕微鏡における三次元画像化のための方法、装置及び顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】顕微鏡における３次元画像化のための方法の提供。【解決手段】試料５からの検出放射の収差を、補正要素によって検出ビーム経路内で補正し、補正された検出放射を空間的に分解された形態で捕捉する。方法は、その時点で発生する収差を可能な限り低減する、補正要素の可能な限り最良の補正設定を決定し、さらに、可能な限り最良の補正設定に基づいて、発生する収差が検出放射線の非対称点拡がり関数ＰＳＦａｓｙｍｍにつながる設定である、欠陥のある補正設定を決定する、という事実によって特徴づけられる。欠陥のある補正設定に伴って発生する非対称点拡がり関数を決定し；決定された欠陥のある補正設定がもたらされ；試料５の画像データを二次元的に捕捉し；非対称点拡がり関数の非対称性のそれぞれの捕捉された出現に基づいて、検出ビーム経路の光軸Ａ２の方向のＺｃ位置が、各ケースで少なくとも選択された画像データに割り当てられる。【選択図】図５

Description

本発明は、非対称点拡がり関数又は点像分布関数（ＰＳＦ）を用いた顕微鏡における三次元画像化のための方法に関する。また、本発明は、この方法を実行するための装置及び顕微鏡に関する。

顕微鏡の分野では、特に生物学的試料のマークされた構造及び分子（対象）を使用して画像化する場合、高い画像解像度が、画像化されるべき試料及び対象に対する低レベルのストレスと同時に望まれる。試料に対するストレスを最小限に抑えることは、画像データの捕捉（画像記録）が長い照射時間及び／又は何度も行われる場合に特に有利である。このような照射領域は、例えば、特定の時間における１つ以上の対象の位置の変化を検出して捕捉（追跡）する場合に使用される。

従来技術から、光シートによる試料の照明は、検出放射を発放出するために照明された薄い平面内のマークされた対象のみを本質的に励起することが知られている（例えばＤＥ １０ ２０１６ ２１２ ０２０ Ａ１参照）。照明された平面内の照明放射によって励起された対象の位置は、空間分解（二次元）検出器（カメラ）によって決定することができ、このようにして、それぞれの検出放射の原点を二次元的に位置特定する（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）ことができる。

検出ビーム経路（Ｚｃ方向；３Ｄ）の光軸方向の原点の位置に関する二次元（２Ｄ）位置特定情報に加えて、点光源の画像化の回転位置及び／又は輪郭形状を用いて、点光源のＺｃ位置に関する推論を導き出すことができるように、点拡がり関数を変更することができる。

例えば、捕捉された点光源のＺｃ位置を決定するために、検出対物レンズの焦点位置及び解析された点光源の画像化の輪郭形状からオフセットして光シートを放射することができる（ＤＥ １０ ２０１３ ２０８ ９２６ Ａ １）。

また、対応して設計されたマスク（二重らせん法）によってＰＳＦを二重らせんにすることで、１つの点光源を２つの別々の光点として画像化することも可能である。相互に関連する点同士の相対回転位置により、関連する Ｚｃ 位置の決定を可能にする（ＷＯ ２０２１／０３９６３６ Ａ２； Ｐａｖａｎｉ 他２００９： Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ， ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｏｕｂｌｅ－ｈｅｌｉｘ ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ； ＰＮＡＳ １０６： ２９９５４ － ２９９９）。

先行技術による解決策の欠点は、二重らせんＰＳＦを生成するために必要な高価なマスクと、例えば倒立顕微鏡の場合のように、特に検出ビーム経路の光軸が異なる屈折力の分離層を斜めに通過する光学的装置において、ＤＥ １０ ２０１３ ２０８ ９２６ Ａ１による解決策を使用できる範囲が非常に限られていることである。

本発明は、先行技術の欠点を低減し、高解像度の三次元画像化を可能にする方法を提案することを目的としている。また、本発明の目的は、適切なデバイス、特に光学的装置及びそかかる装置を有し、それにより本方法を実行することができる顕微鏡を提案することである。

目的は、独立請求項及び代替的独立請求項の主題によって達成される。有利な発展形態は、従属クレームの主題である。

本発明による顕微鏡の三次元画像化のための方法を実施する場合、少なくとも１つの補正要素によって、試料からの検出放射の収差を検出ビーム経路で補正する。この場合、試料は特に、例えば蛍光色素（蛍光体）などのマーカー分子（すなわち、プローブ、マーカ）を備えおり、したがって、具体的には、例えば試料の特定の構造及び／又は分子の、画像データを捕捉することができる。この場合の検出放射は、特定の波長範囲にわたって全反射又は反射される照明放射であり得る。検出放射は、対応する照明放射の効果によって励起された蛍光体によって放出される蛍光放射であり得る。補正要素によって補正された検出放射は、適切な空間分解二次元検出器（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）によって空間分解された形態で捕捉される。検出器の検出面は、この場合望ましくは、検出ビーム経路の光軸に関して基本的に直交するように整列される。

本発明によれば、方法は、その時点で発生する収差を可能な限り低減する、補正要素の可能な限り最良の補正設定（ａ ｂｅｓｔ－ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｓｅｔｔｉｎｇ）を決定することによって、特徴づけられる。この場合、最良の補正設定とは、特に検出ビーム経路の技術的要素と寸法に関して、技術的及び光学的条件に応じて最適化された補正素子の設定である。最良の補正設定を決定するために、点拡がり関数、以下検出ＰＳＦとも称される、は、一連のテスト及び／又はシミュレーションによって決定され、特にその方法が実際に実行される前に、読み出し可能な方法で保存され得る。

本発明には、少なくとも１つの補正要素の存在が不可欠である。これは通常、検出ビーム経路に配置される。代替的に又は付加的に、照明ビーム経路に補正要素がある場合がある。検出ＰＳＦの形成に対するその効果が本発明によって提供されることが重要である。以下では簡略化のため、補正要素のみを参照することが多い。

可能な限り最良の補正設定に基づいて、欠陥のある補正設定（ａ ｆｌａｗｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｓｅｔｔｉｎｇ）が決定され、これは、発生する、特に残存する、収差が検出放射の非対称点拡がり関数につながる設定である。この場合、欠陥のある補正設定は、画像データの定性的に十分な捕捉（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃａｐｔｕｒｅ）を可能にすると同時に、光軸方向における点光源の位置に関する情報を提供する必要がある。欠陥のある補正設定で発生する非対称検出ＰＳＦは、シミュレーションによって経験的又は計算的に決定され、捕捉された画像データのさらなる処理のために提供される。経験的決定と計算的決定は、互いに組み合わせることができる。

適切な欠陥補正設定がいつ達成されるかの評価は、例えば、先行技術から知られているフィッシャー情報に基づいて行われる（この点に関して、前述のＰａｖａｎｉ他２００９も参照されたい）。

可能な限り最良の補正設定を実際に設定する必要はない。理論的にわかっていれば十分である。これに相当するのは、フィードバック制御の過程で逐次的に決定される場合、可能な限り最良の補正設定への自明な近似（ｔｈｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ）である。自明な近似は、例えば画像捕捉の収差が所定の限界値を下回る場合に得られる。

このようにして決定された欠陥補正設定は、例えば補正要素が駆動され又は作動され（ａｃｔｕａｔｅｄ）、相応に設定されることによってもたらされる。欠陥補正設定を提供した後、試料の画像データは二次元的に捕捉される。非対称検出ＰＳＦの非対称性のそれぞれの捕捉された出現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）に基づいて、検出ビーム経路の光軸の方向における位置（以下Ｚｃ位置とも称される）が、特に座標の形態で、各場合に（ｉｎ ｅａｃｈ ｃａｓｅ）少なくとも選択された画像データに割り当てられ、好ましくは保存される。捕捉された画像データは、捕捉された画像データの３次元表現を可能にする。

本発明の本質は、非対称検出ＰＳＦを生成するのに役立つように、発生する収差を補正するために提供される補正要素を使用することである。検出放射の既存の収差を可能な限り完全に補正する補正要素のために当初想定されていた機能に反して、欠陥のある補正設定に意図的に変換される。しかしながら、最適化されていない補正の結果として生じる欠点は、意外にも、捕捉された画像データのＺｃ位置に関する情報を達成することを可能にする。

本発明の説明の過程で使用される用語のいくつかは、以下により詳細に説明される。

その構造及びその中に配置された光学要素のその時点の特性及び設定のために、検出ビーム経路は、検出ビーム経路に沿った伝播中に検出放射の特定の挙動を引き起こす。この変更された伝播挙動は、ここでは検出ＰＳＦによって表される。

画像化されるべき試料の照明は、少なくとも１つの照明スポットが走査方式で試料の上を移動するか、線状照明によって行われ、後者は同様に走査方式で移動することができる。エリア照明が行われることもある。エリア照明の一実施形態は、例えば光シートであることができ、又は、広域照明の形でエリア照明が行われることができる。

この説明の残りの部分を通して、光シートによる照明を例として参照する（以下を参照）。かかる光シートが使用される場合、光シートＰＳＦと称される検出ＰＳＦへの貢献も生じる。検出ＰＳＦは、簡単化のために、例えば照明及び検出ビーム経路の光学的特性の結果として理解される。簡単化のために、例えば試料による検出ＰＳＦへの貢献は、光シートＰＳＦの下に含まれる。

理想的なケースでは、ＰＳＦ は、光軸の方向 （Ｚｃ 方向） において、検出ビーム経路、特に検出対物レンズの焦点位置に関して対称的に形成される形を有する（この点については、図１ａ及び１ｂ）。

本発明の範囲内では、非対称ＰＳＦは、その断面の特定の形態及び／又は各Ｚｃ位置におけるＺｃ方向の断面の特定のサイズを有する検出ＰＳＦを意味すると解される。したがって、断面の形態、アラインメント及び／又はサイズに基づいて、Ｚｃ位置を具体的に割り当てることができる。

光シートは、先行技術から知られているように、例えば円筒レンズ（静的光シート）によるビーム成形によって、又は、例えばスキャナ（動的光シート）によって光ビームを前後に急速に移動させることによって、生成することができる照明された平面を意味すると解されるべきである。

この場合の光シートの厚さは、その平面に対して横方向の光シートの拡がりと、平面に対して垂直な検出ビーム経路の方向を示す。

構造化された光シートは、複数の非回折限界ビーム、例えばベッセルビーム及び場合によってはｓｉｎｃ３ビームが１つの平面内で互いに隣り合って配置されることによって生成され得る。この場合、ビーム間の距離は、破壊的な干渉（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ）によるビームを含む平面の上下の不所望な照明効果が大幅に排除されるように選択される。必要に応じて、平面内で均一な光シートを生成するために、ビームを平面内で移動することもできる。また、必要に応じて、平面内で移動されないビームの間に照明されていない領域がある場合もある。

本発明による方法の１つの構成において、非対称検出ＰＳＦの形成は、光シートとしての照明放射の適合設計によってもたらされる。この場合、照明放射は、照明ビーム経路の光軸に沿って試料空間に方向付けられ、そこに配置された試料に方向付けられる。非対称検出ＰＳＦを実現するために、光シートの位置が検出ビーム光路の焦点平面に対して非対称に設定されているか、及び／又は、光シートは、照明ビーム経路の光軸の方向に対して非対称及び／又は直角にその発現において変調され、構造化された光シートとして形成される。

既に述べたように、光シートによって試料の薄い範囲領域を照明することができ、この照明された領域の画像データを捕捉することができる。試料のより大きな体積領域を走査するために、光シートと試料を互いに関して異なる配置（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇｓ）に移動させることができる。したがって、試料又は試料の領域は光シートで走査される。例えば、光シートと試料の相対的な配置に応じて、各場合に少なくとも１つの画像が捕捉される。

本方法の有利な構成において、相対的な配置に応じて、走査動作中に、光シートによって照明される試料の領域が光シートの厚さの一部又は何分の１か（ａ ｆｒａｃｔｉｏｎ）が、互いに重なり合う。このようにして、個々の配置の間で捕捉されない領域が回避される。

本発明は、３次元画像化を可能にするだけでなく、試料の体積（粒子追跡；単一分子の追跡）内の個々の対象の動きの追跡を可能にする。この目的のために、照明期間にわたって試料のうちの少なくとも１つの対象の位置の変化（ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ）が捕捉される。複数の対象の位置の変化を捕捉する場合、体積の走査は、特に光シート内に形成された照明放射によって、各配置で１回照明することによって有利に行われる。この場合、走査速度、特に各配置の照明又は捕捉時間は、それぞれの試料及び／又は光学パラメータに適合させることができる。例えば、捕捉時間は、追跡対象の各オブジェクトの所望の数の位置特定（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ）が達成されるような長さになるように選択できる。走査された体積の連続的な画像再生（ｉｍａｇｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を実現するために、光シートの個々の配置は、光シートの厚さの一部（ａ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）によって有利にオーバーラップする。

少数の対象又は単一の対象のみを捕捉して位置特定する場合、光シートの配置は、捕捉された位置の変化に応じて制御及び修正され得る。例えば、追跡対象が光シートから離れることがわかった場合、光シートは補正され得る。いずれにしても、非対称検出ＰＳＦのため、２次元位置特定とともに、関連するＺｃ 位置の捕捉も可能であり、検出ビーム経路への追加の光学要素なしで ３ 次元画像化を行うことができる。

また、走査する体積を何度も通過させ、そのたびにより短い照射期間で通過させることも可能である。これにより、個々の捕捉で多数の対象が捕捉される。十分な数の対象及び／又は対象の捕捉（位置特定）が行われるまで、走査は十分な頻度で繰り返される。この手順は、複数の個々の対象の追跡（単一の粒子追跡）など、動的なプロセスに適している。

対象の横方向の２次元の位置決定は、既知の方法で、例えば、ガウスマスク、２Ｄガウス関数、又は実験的なＰＳＦを適用し、重心決定によって行うことができる。

本発明による方法を実行するために、検出ビーム経路を含む顕微鏡用の装置を使用することができる。検出ビーム経路には、検出放射を捕捉する対物レンズ及び、検出放射の像点を２次元的に捕捉するための空間分解検出器がある。また、検出ビーム経路内の対物レンズと検出器との間には、検出放射の収差を補正するための補正要素が配置されている。さらに、補正要素の駆動及び制御設定のための制御デバイス（コントローラ）がある。制御デバイスは、例えばコンピュータ又はマイクロコントローラによって実現される。

この装置は、検出放射の非対称点拡がり関数を生成するために、その時点で発生する収差を可能な限り低減した補正素子の、可能な限り最良と決定された補正設定又は最良と判断された補正設定に基づいて、制御デバイスが欠陥のある補正設定をもたらすように構成及び設定されている、という事実によって特徴づけられる。したがって、制御デバイスは、発明による方法のシーケンスがコード化されたメモリ構造（例えばＲＡＭ）を有する。さらに、コマンド構造（例えばＣＰＵ）があり、これは、捕捉された入力信号、特にキャプチャされた画像データに基づいて制御コマンドを生成し、これを例えば補正要素のアクチュエータによって実行すると、非対称検出ＰＳＦにつながる。

本発明による装置の有利な実施形態では、補正要素は、少なくとも１対のアルバレスプレートによって形成される。個々のアルバレスプレートは、適切なアクチュエータによって互いに関連して設定されることができる。

駆動可能なデジタルマイクロミラーアレイ及び／又は空間光変調器（ＳＬＭ）を補正要素として使用することもできる。

記載されている装置は、特に顕微鏡で使用することができる。この場合、顕微鏡は正立型の顕微鏡であり得る。しかしながら、本発明は、倒立型の実施形態の顕微鏡において特に有利に実施される。この場合の倒立型の顕微鏡は、照明ビーム経路上の照明放射によって、試料平面の試料領域内の試料キャリア上に位置する試料を照明するための照明対物レンズを有する照明光学ユニットを含む。ここで、照明対物レンズの光軸は、試料キャリアが整列している試料平面の法線とともに、ゼロとは異なる照明角度を形成する。

照明ビーム経路内には、ビーム成形し、照明放射の光シートを生成するための手段がある。ビーム成形手段は、円筒レンズ、スキャナ及び／又は空間光変調器（ＳＬＭ）であることができる。ＳＬＭは、特に構造化された光シートの製造及び提供に役立つ。

検出ビーム経路には、検出対物レンズを有する検出光学ユニットがあり、その光軸は、試料平面の法線とともにゼロとは異なる検出角度を形成する。

検出ビーム経路内の少なくとも１つの補正要素に加えて、装置又は顕微鏡は、異なる屈折力の媒体を通過する検出放射及び／又は照明放射によって引き起こされる収差の事前補正のために設計された、さらなる光学素子を有することができる。補正要素は、持続する収差の補正に役立つ。

例えば、ペトリ皿やマイクロタイタープレートなどの試料キャリアの、透明なベースの厚さなどの、平均的なカバースリップの厚さを補償するような方法で作用するフリーフォーム要素を、かかる事前補正のための光学要素として使用することができる（例えばＤＥ １０ ２０１３ １１２ ６００ Ａ １を参照）。この場合、事前補正のための光学要素は、検出ビーム経路及び検出ビーム経路の両方に配置されたメニスカスレンズの形態を取ることができる。メニスカスレンズは、同じ方向に湾曲した２つの側面を有する。

発生する垂直非点収差の事前補正は、円筒レンズの効果によっても補正することができるが、屈折率のジャンプは、例えば、同心レンズ又はプリズムによって減少させることができ、後者は液浸媒体で満たされる。

本発明は、例示的な実施形態及び図示に基づいて、以下により詳細に説明される。
図１は、先行技術による第１厚さの光シートによる照明の場合の倒立顕微鏡と対称点拡がり関数を模式的に示す図である。 図２は、先行技術による第２厚さの光シートによる照明の場合の倒立顕微鏡と対称点拡がり関数を模式的に示す図である。 図３は、倒立光シート顕微鏡の形態で本発明による顕微鏡の第１実施形態を模式的に示す図である。 図４は、倒立光シート顕微鏡の形態で本発明による顕微鏡の第２実施形態を模式的に示す図である。 図５は、本発明による倒立顕微鏡の例示的な実施形態の概略図と、光シートによる照明の場合に非対称な点拡がり関数を生成する本発明による方法の構成を模式的に示す図である。 図６は、放射が試料ホルダを斜めに通過するために生じる収差のゼルニケ係数の選択例を示す図である。 図７は、試料の繰り返し走査と、試料の２つの対象の３次元追跡による、本発明による方法を模式的に示す図である。 図８は、捕捉された対象の相互にオフセットされた複数の光シートの配置による座標変換を模式的に示す図である。 図９は、本発明による方法の構成のフロー図を示す図である。

以下の先行技術の図及び本発明の可能な実施形態の図において、同じ技術的要素は同じ参照符号で示されている。

例示的な実施形態が光シート６の形態の照明に基づいて説明されていることは、単なる例である。線状照明や、少なくとも１つのスポット又は少なくとも１つのラインの形態で走査するように移動する照明も可能である。

図１は倒立顕微鏡１を模式的に示したものであり、光シート６に形成された照明放射ＢＳが、照明対物レンズ２によって照明ビーム経路の第１光軸Ａ １に沿って、試料５が配置されている試料空間に放射される。試料５は、試料キャリア７の上に配置されており、試料キャリア７は、試料平面４に対して位置合わせされ、試料キャリア７のベースを介して照明放射が試料空間に方向付けられる。試料キャリア７は、試料５が配置されている媒体８で満たされている。

照明ビーム経路の光軸Ａ１は、試料平面４の法線Ｎとともに、ゼロとは異なる角度α１、例えば６０°を形成する。検出ビーム経路の第２光軸Ａ２は、光シート６上に直角に方向付けられ、また、試料平面４の法線Ｎとともにゼロとは異なる角度α２、この場合は３０°を形成する。試料５内の光シート６の影響による検出放射ＤＳを検出対物レンズ３で集光し、検出ビーム経路に沿って通過させる。

詳細の拡大図は、対称点拡がり関数ＰＳＦｓｙｍｍを示しており、これは検出ビーム経路（Ｚｃ軸の方向；Ｚｃ方向）の光軸Ａ２の方向に延在し、光シート６の厚さＤ１の大部分に及んでいる。

図２は、図１と比較して厚さＤ２が小さい光シート６の対称点拡がり関数ＰＳＦｓｙｍｍを拡大した図である。対称点拡がり関数ＰＳＦｓｙｍｍは、図１との関係で対称点拡がり関数ＰＳＦｓｙｍｍよりもＺｃ方向に短く（比較のために点線で示されている）、光シート６の厚さＤ２全体に広がっている。

例示と簡略化のためだけに、対称点拡がり関数ＰＳＦｓｙｍｍの断面は、第１光軸Ａ １から等距離にある２つの平面で示されている。断面は互いに同じであり、その形やサイズに基づいて、Ｚｃ軸の方向におけるそれぞれの実際の位置を推論することはできない。図１に従って、より厚い光シート６の第１光軸Ａ １から等距離の断面についても同様である。

以下の図４から図９の方法側の構成について本発明を説明する前に、本発明に従った方法を行うのに適した顕微鏡１、特に倒立型の光シート顕微鏡６（図３）を図３及び図４に示し、より詳細に説明する。

光シート顕微鏡用に設計された倒立顕微鏡１の例示的な実施形態は、方法を実行するように構成されたコントローラ１３を有する。光シート顕微鏡１は、メニスカスレンズの形態で発生する収差を事前補正するための補正要素２ＫＥ、３ＫＥ及び光学素子１０とともに示されている。基準平面４に垂直な法線Ｂと第１光軸Ａ１及び第２光軸Ａ２との角度α１及びα２は、それぞれ本実施例では４５°である。適応補正要素２ＫＥ、３ＫＥとしては、それぞれ２枚のアルバレスプレートがあり、これをアクチュエータ１２．１によって、例えばアルバレスマニピュレータの形態で、照明放射ＢＳのビーム経路内と検出放射ＤＳのビーム経路内に配置されている。代替的実施形態では、検出ビーム経路内には、適応補正要素３ＫＥ及び関連するアクチュエータ１２．１のみが存在する。

補正要素２ＫＥ、３ＫＥは、照明放射ＢＳ又は検出放射が試料ホルダ７のベースを斜めに通過することによって発生する収差を補正する役割を果たす。メニスカスレンズの形態の光学要素１０は、空気から浸漬媒体１８及び媒体８への照明放射ＢＳの移行を支援するとともに、媒体８から浸漬媒体１８及び空気への検出放射ＤＳの移行を支援する。

試料ホルダ７は、試料ステージ１１上に保持される。試料ステージ１１自体は、アクチュエータ１１．１によって、Ｘ軸Ｘ及びＹ軸ＹにまたがるＸＹ平面において、制御されて調節可能である。

照明対物レンズ２及び検出対物レンズ３は、それぞれ第１光軸Ａ１に沿って及び第２光軸Ａ２に沿って、ピエゾドライブとして形成され得る対物レンズドライブ（図示せず）によってそれぞれ制御された方法で任意に調整可能である。

照明放射ＢＳは、レーザーモジュール１５によって供給され、ビーム成形部１６によって成形される。ビーム成形部１６は、例えば光学ユニットであり、それによって、提供された照明放射ＢＳが成形され、例えばコリメートされる。これは、例えば、空間光変調器（ＳＬＭ）であり得る。照明放射ＢＳは、ビーム成形部１６により、試料５が位置する試料空間で光シート６内に形成されている。

ビーム成形部１６の下流にはスキャナ１７があり、これにより、成形された照明放射ＢＳは、制御された方法で二方向に偏向可能である（Ｘ－Ｙスキャナ）。

スキャナ１７の下流には、照明対物レンズ２が第１光軸Ａ１上に配列される。スキャナ１７によって偏向する照明放射ＢＳは、照明対物レンズ２に達し、照明対物レンズ２によって成形され及び／又は集束される。光シート６は、スキャナ１７によって照明放射ＢＳが適切に偏向されることによって試料領域に生成される。

試料５及び試料領域からの検出放射ＤＳは、第２光軸Ａ２に沿って検出器１９に方向付けられ、検出平面ＤＥで検出器１９によって捕捉される。

試料ステージ１１、アクチュエータ１１．１、対物レンズドライブ１４、補正要素２ＫＥ、３ＫＥ又はそれらのアクチュエータ１２、レーザーモジュール１５、ビーム成形部１６、スキャナ１７及び／又は検出器１９を駆動するために、制御ユニット１３があり、駆動すべき要素とのデータ伝送に適した接続である（例示的にのみ示されている）。

さらなる実施態様において、制御ユニット１３は、付加的に、測定値を捕捉し、保存し及び／又は評価するように構成されている。顕微鏡１のさらなる要素及びユニットは、制御ユニット１３によって駆動可能であることができ、及び／又は、それによって、測定値は取得され評価されることができる。

照明放射ＢＳが試料ホルダ７を斜めに通過する際に発生する収差は、その厚さに依存する。このために、複数の補正要素１２を互いに関して移動することによって収差補正を厚さｄに適合するために、補正素子２ＫＥ、３ＫＥは、例えば照明対物レンズ２及び／又は検出対物レンズ３内に変位可能に搭載される。

説明の目的のために、以下では、互いに直交する軸を有する２つの座標系が用いられる。第１座標系は、Ｘ軸Ｘ、Ｙ軸Ｙ及びＺ軸Ｚを有する装置全体の座標系である。理想的には試料ホルダ７は、実際にはその土台は、Ｘ軸Ｘ及びＹ軸ＹにまたがるＸＹ平面と平行に配列される。第２座標系は、Ｘ軸Ｘｃ、Ｙ軸Ｙｃ及びＺ軸Ｚｃを有する検出器１９の座標系である。例えば、検出器１９上の画像平面ＢＥからの画像の画像化は、座標ＸｃとＹｃを有する。Ｘ軸Ｘｃは、両方の座標系の図形の描画平面に対して直交する方向を向いている。２つの他の軸ＹとＹｃ及びＺとＺｃは、それぞれ、Ｘ軸Ｘ周りの回転によって互いに重ね合わされ得る。

照明放射ＢＳが試料ホルダ７を斜めに通過する際に発生する収差は、その厚さに依存する。このため、補正要素２ＫＥ、３ＫＥのアルバレスプレートは、検出ビーム経路内で互いに変位可能に搭載されている。アルバレスプレート同士の変位により、収差補正を行うことができる。

制御装置１３は、本発明によれば、検出放射の非対称な点拡がり関数を生成するために、補正素子２ＫＥ、３ＫＥの最良と決定された補正設定に基づいて、欠陥のある補正設定をもたらすように構成されている。決定された可能な限り最良の補正設定は、この場合、事前に決定され、例えば制御装置１３のサブユニットとしてメモリ内に検索可能な方法で提供されることができる。制御装置１３は、例えば、特定の種類の試料、照明放射の波長、使用される液浸媒体、光シート６の種類とその厚さＤ、及び／又は検出対物レンズ３に使用される焦点距離について、顕微鏡１のその時点でのセットアップに最適であると決定された補正設定を読み出す。これにより収差を最大限に補正し、結果として検出の対称点拡がり関数ＰＳＦｓｙｍｍをもたらす。かかる対称点拡がり関数ＰＳＦｓｙｍｍは、画像データの２次元捕捉とその位置特定を可能にするが、Ｚｃ方向の位置を決定することはできない。

この可能な限り最良の補正設定に基づいて、検出の非対称点拡がり関数ＰＳＦａｓｙｍｍがもたらされる（ｂｒｏｕｇｈｔ ａｂｏｕｔ）ような方向及び量だけ、アルバレスプレートが互いに対して変位される。

光シートによる照明の代替として、照明放射ＢＳは、少なくとも１つのスポット又は少なくとも１つのラインに形成されることができる。特に、図４に簡略化された形態で示されているように、エリア照明及び検出（広視野顕微鏡）も行うことができる。照明スポット、照明ライン、又はエリア照明（広視野照明）としての照明の表示は、簡単のために参照符号６．２で指定されている。他の実施形態では、顕微鏡１は正立型顕微鏡１であり得る。光学要素１０は、事前補正のために任意に存在する。

図５に、本発明による点拡がり関数ＰＳＦａｓｙｍｍのこの形成の効果を図示する。説明のために、いずれの場合も光軸Ａ１から等距離にある平面の２つの断面を示す。２つの外側の平面と２つの内側の平面は、いずれも光軸Ａ１から等距離にあるが、それぞれの断面は、個々のサイズ、位置合わせ、及び／又は形状に基づいて明確に異なる場合がある。例えば、詳細の拡大図で示される断面図は、頂部では角がへこんだ八角形であるが、一番下の断面図は角が丸くなった正方形である。真ん中の２つの断面図はいずれも楕円形であるが、それぞれの寸法とそれぞれの主軸の位置（配置）が異なっている。

サイズと形状の組み合わせごとに、Ｚｃ軸方向に正確に１つの位置（Ｚｃ位置）を割り当てることができる。２次元画像平面ＢＥ（図３参照）での画像点の位置特定とは別に、したがって、Ｚｃ軸方向の相対位置に関する位置情報を、少なくとも１つの画像点によって捕捉され、任意に格納された対象に割り当てることもできる。

照明放射ＢＳ及び／又は検出放射ＤＳが試料ホルダ７のベースを斜めに通過したときの効果を、ゼルニケ係数に基づいて図６に例として示す。例えば、法線Ｎに対して３２°の角度でカバーグラス（試料ホルダ７）を通して撮像したときの波面は、抽出形式で示されるゼルニケ係数を有する。発生する収差に対する非常に大きな寄与は、垂直非点収差（Ｚ５）と垂直コマ収差（Ｚ８）に由来する。さらなる寄与は、例えばいわゆるトレフォイル（Ｚ１１）に基づいており、高次の収差（例えば二次コマ収差Ｚ１５）も全体的な収差に寄与する。

本発明の着想に従って非対称点拡がり関数ＰＳＦａｓｙｍｍを生成するために、例えば設定されるべき欠陥のある補正設定において、非点収差（Ｚ５）の大きな寄与がもたらされ得る。

試料５を繰り返し走査し、試料５の２つの対象９．１及び９．２を三次元追跡する本発明による方法の構成を図７に模式的に示す。例として示した光シート６の個々の配置において、適切であれば、追跡されるべき対象９．１又は９．２のうちの１つが光シート６の領域内に配置されている位置がそれぞれ示される。試料５の体積を何度も走査した後、収集した画像データとＺｃ位置の情報から、各対象９．１、９．２の移動経路を作成することができる。

既に述べた座標の変換を例として図８に示す。図８に厚さＤの光シート６のいくつかの配置を示す。これらの配置は、試料ステージ１１の対応する変位及び／又は光シートの位置を変化させるすることによって設定できる。ここでは、光シート６の隣り合う配置の間に重複領域ΔＤを提供することが有利であり得る。厚さＤに対応するＹ軸の座標領域をｄＹ、重複領域ΔＤに対応する座標領域をΔＹで表す。

配置の内で、分子は軸Ｘｃ、Ｙｃ、Ｚｃを有する検出器１９の座標系で位置特定される。光シート６のそれぞれの配置は既知である（例として中断線（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｌｉｎｅ）で示す）。対象座標は、既知の位置特定アルゴリズムとＺｃ位置をコーディングした非対称点拡がり関数ＰＳＦａｓｙｍｍの評価とによって、光シート６に関連して決定することができる。試料５の見い出された分子座標の全体は、測定の完了後、軸Ｘ、Ｙ及びＺを有する装置の座標系（ｔｈｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に好都合に変換することができる（図７も参照）。

光シート６の配置を変更する場合は、コントローラ１３によって対応するコマンドが生成され、試料ステージ１１のアクチュエータ１１．１及び／又はスキャナ１７に送信され、実行される（図９）。試料ステージ１１、ひいてはその上にある試料５に対する光シート６のその時点での位置データが捕捉され、関連する配置において捕捉された画像データに割り当てられる。位置データ及び画像データは、捕捉された画像データのそれぞれの起源、特に捕捉された検出放射の起源を決定するために、その後さらに処理される。事前に実験的及び／又は理論的に決定された点拡がり関数は、この位置特定の基礎として機能する。対称点拡がり関数と非対称点拡がり関数の両方を２次元位置特定に使用することができる。

本発明によれば、３次元位置特定には、可能な限り最良の補正設定、特に存在する補正要素の知識で事前に生成された非対称点拡がり関数を使用する。決定された画像点の座標又はその原点は、その後、ユーザーが直感的に理解できる及び／又は後続の処理ステップに適した座標系に任意で転送され、試料５の画像が作成される。

本発明による方法は、図３から図８に関して以下により詳細に説明される。本発明による方法の基礎として、可能な限り最良の補正設定、特に補正要素３ ＫＥが決定される。これは、例えば、可能な限り最良の補正設定が経験的に決定されることによって及び／又はシミュレーションモデルを使用して繰り返し読出し可能な方法で保存されることによって、実際の画像捕捉の前にすでに行われている可能性がある。この場合、検出ビーム経路の光学特性、試料５、光シート６、場合によっては事前補正用の光学要素１０、液浸媒体１８、試料キャリア７、照明放射ＢＳの波長、使用される試料５のマーカーの特性、及び／又は照明角度及び検出角度α１及びα２は、パラメータとして考慮され得る。

また、可能な限り最良の補正設定は、画像化されるべき試料５が、画像捕捉を意図した照明放射ＢＳ、特にこれを意図した光シート６で照明され、それによって検出放射ＤＳが捕捉されることによって決定される。検出器１９と補正要素２ＫＥ、３ＫＥのアクチュエータ１２．１との間のフィードバック制御を使用して、可能な限り最良の補正設定を順次決定し、任意で保存することができる。この場合、コントローラ１３は、その時点で捕捉された画像データの評価と、アクチュエータ１２．１を駆動させるための対応する制御コマンドの生成のために設計及び構成された解析ユニット（例えばＣＰＵやＦＰＧＡ）を含むことができる。

したがって、この方法の性能は、決定された最良の可能な補正設定を読み出すか又は即座に決定するステップを含む。これに基づいて、欠陥のある補正設定が決定され、画像捕捉が十分な品質であるが、捕捉された点光源の原点のＺｃ位置に関する情報も、非対称検出ＰＳＦから抽出できる設定が決定される。

欠陥補正設定によってもたらされる非対称検出ＰＳＦも、例えば経験的に、計算的に、又は組み合わせた手順によって決定される。決定された非対称検出ＰＳＦは保存される。

かかる欠陥のある補正設定の許容誤差は事前に決定されることができる。本方法のさらなる構成では、例えば技術的に実現可能な設定可能性の関数とそれによって生じる収差の変化に基づいて、瞬間的な決定の過程で許容誤差が確立されることができる。

決定された欠陥補正設定は、制御デバイス１３によって対応する制御コマンドを生成し、それを補正要素２ＫＥ、３ＫＥのアクチュエータ１２．１に渡し、駆動動作に変換することによって設定される。

光シート６を用いて画像捕捉を行うために、試料５と光シート６を相対的に配置して画像捕捉を行う。試料５の体積を走査する場合には、試料５と光シート６との相対的な配置を対応して変化させる。これは、試料ステージ１１及び／又は光シート６の制御された動きによって行うことができる。各配置について、関連する位置データが既知であり、関連する配置で捕捉された画像データに割り当てられ、保存される。

位置データと共に提供されるこれらの画像データは、その後又は直接リアルタイムで分析され、適切な場合は処理される。この場合、非対称検出ＰＳＦのそれぞれの捕捉された出現に基づいて、捕捉された画像データにＺｃ位置を割り当てるために、決定された非対称検出ＰＳＦが使用される。

さらに、捕捉された画像データ、特に検出器１９の検出平面Ｘｃ－Ｙｃ内のそれぞれの点光源の画像は、位置特定され、即ち、それぞれのケースで座標ＸｃとＹｃのペアに割り当てられ、任意で格納される。

その後、座標ＸｃとＹｃとのペアを座標Ｘ－Ｙに変換して、視聴者に試料平面４に対する試料５の位置合わせに対応する画像を提供できるようにすることができる。捕捉したＺｃ座標をＺ座標に変換する場合も同様である。処理の一部として、準備された画像データを、例えばモニタやディスプレイ上でグラフィック表現に変換することができる。

光シート６の配置で捕捉された画像データは、処理後にそれぞれの空間座標と任意でそれぞれの強度値で利用できるため、２次元と３次元の両方の画像化を行うことができる。Ｚｃ位置の知識の結果として、他の断面も計算して視覚化することができる。

１ 光シート顕微鏡
２ 照明対物レンズ
２ＫＥ 照明補正要素
３ 検出対物レンズ
３ＫＥ 検出補正要素
４ 試料平面、参照平面
５ 試料
６ 光シート
６．２ 照明スポット、広視野照明
７ 試料ホルダ
８ 媒体
９．１ 対象物
９．２ 対象物
１０ メニスカスレンズ；光学要素（事前補正）
１１ 試料ステージ
１１．１ （試料ステージ１１の）アクチュエータ
１２ （補正要素２ＫＥ、３ＫＥの）アクチュエータ、アルバレスマニピュレータ
１３ コントロールユニット；コントローラ
１４ 対物レンズドライブ
１５ レーザーモジュール、光源
１６ ビーム成形部
１７ Ｘ－Ｙスキャナ
１８ 浸漬媒体
１９ 検出器
Ａ１ 第１光軸（照明対物レンズ２の光軸）
Ａ２ 第２光軸（検出対物レンズ３の光軸）
α１ 角度／照明角度
α２ 角度／検出角度
Ｄ１、Ｄ２、Ｄｎ 光シート６の厚さ
Ｎ 法線
ＰＳＦｓｙｍｍ 対称ＰＳＦ
ＰＳＦａｓｙｍｍ 非対称ＰＳＦ

Claims (12)

1. 顕微鏡における三次元画像化のための方法であって、
   － 試料からの検出放射の収差を、補正要素によって検出ビーム経路内で補正し、
   － 補正された前記検出放射を空間的に分解された形態で捕捉し、
   － その時点で発生する収差を可能な限り低減する、補正要素の可能な限り最良の補正設定を決定し、
   － 前記可能な限り最良の補正設定に基づいて欠陥のある補正設定を決定し、発生する収差が前記検出放射の非対称点拡がり関数につながる設定であり；
   － 前記欠陥のある補正設定に伴って発生する前記非対称点拡がり関数を決定し；
   － 決定された前記欠陥のある補正設定がもたらされ；
   － 前記試料の画像データを二次元的に捕捉し；
   － 前記非対称点拡がり関数の非対称性のそれぞれの捕捉された出現に基づいて、前記検出ビーム経路の光軸の方向の位置が、それぞれ少なくとも選択された画像データに割り当てられる、
   方法。
2. 前記非対称点拡がり関数の形成は、照明放射が試料空間内及びそこに配置された前記試料上への照明ビーム経路の光軸に沿って方向付けられることにより、光シートとしての前記照明放射の適合された設計によってもたらされ、
   前記光シートの位置は、前記検出ビーム経路の焦点平面に対して非対称であり、及び／又は
   前記光シートは、前記照明ビーム経路の光軸の方向に関して直角にその出現において変調されている、
   請求項１記載の方法。
3. 前記試料の体積を光シートによって走査し、
   前記試料を互いに関して異なる配置に移動させ、
   相対的な前記配置に応じて、それぞれ少なくとも１つの画像を捕捉し、
   相対的な前記配置に応じて、前記光シートによって照明される試料の領域が前記光シートの厚さの部分が、互いに重なり合っている、
   請求項１又は２記載の方法。
4. 照明期間にわたって前記試料のうちの少なくとも１つの対象の位置の変化が捕捉され、
   前記体積の走査は、
   ｉ） 複数の対象の位置の変化が捕捉される場合、各位置で１回照明することにより；又は
   ｉｉ） 単一の対象が捕捉され位置特定される場合、捕捉される位置の変化に応じて光シートの配置が制御及び補正される、
   請求項３記載の方法。
5. 検出光路を有する顕微鏡法のための装置であって、
   － 検出放射を捕捉するための検出対物レンズと；
   － 前記検出放射の像点を二次元捕捉するための空間分解検出器と；
   － 前記検出対物レンズと前記空間分解検出器との間の、前記検出放射の収差を補正するための補正要素と；
   － 前記補正要素の駆動及び制御設定のための制御デバイスと；を備え、
   － 前記制御デバイスは、前記検出放射の非対称点拡がり関数を生成するために、その時点で発生する収差を可能な限り低減する前記補正要素の可能な限り最良の補正設定に基づいて、欠陥のある補正設定をもたらすように構成されている、
   装置。
6. 前記補正要素が一対のアルバレスプレートによって形成されいる、
   請求項５記載の装置。
7. 請求項５又は６記載の装置を有する顕微鏡。
8. 正立型の請求項７記載の顕微鏡。
9. 広視野照明ビーム経路にわたる照明放射によって、試料平面の試料領域内の試料キャリア上に位置する試料を照明するための照明対物レンズを有する照明光学ユニットを備えている、
   請求項７又は８記載の顕微鏡。
10. 倒立型の顕微鏡であって、
    － 照明ビーム経路にわたる照明放射によって、試料平面の試料領域内の試料キャリア上に位置する試料を照明するための照明対物レンズを有する照明光学ユニットであって、前記照明対物レンズの光軸は、前記試料キャリアがゼロと異なる照明角度に位置合わせされる試料平面の法線とともに形成する平面内にあり、前記照明は前記平面内で行われる、照明光学ユニットを備え、
    － 前記照明ビーム経路内には、前記照明放射の光シートを生産するためのビーム形成手段があり；
    － 検出ビーム経路には、検出対物レンズを有する検出光学ユニットがあり、前記検出対物レンズの光軸は、前記試料平面の法線とともに、ゼロと異なる検出角度を形成する、
    請求項７記載の顕微鏡。
11. 前記試料キャリアと前記対物レンズとの間に、
    異なる屈折力の媒体を通過する、前記試料の検出放射及び／又は照明放射によって引き起こされる収差を事前補正するために設計された光学要素があり、
    前記補正要素は、残存する収差を補正するために設計されている、
    請求項７乃至１０いずれか１項記載の顕微鏡。
12. 前記事前補正のための前記光学要素は、メニスカスレンズの形態を取り、前記照明ビーム経路及び検出ビーム経路の両方に配置されている、
    請求項１１記載の顕微鏡。
    

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