JP2008241791A - 光ピンセット装置 - Google Patents

Abstract

【課題】レンズを移動させることなく、ミラーの操作のみによって標本を３次元的に操作・観察できる光ピンセット装置を提供する。
【解決手段】レーザー光源２、レーザー光源から出射されたレーザー光を反射する第１の偏向手段４、第１の偏向手段によって反射されたレーザー光を反射する第２の偏向手段６、第２の偏向手段によって反射されたレーザー光を標本上に集束して光ピンセット効果を生じさせる対物レンズ１０とを備え、第１の偏向手段及び第２の偏向手段はその反射角β、γがそれぞれ変更可能に取付けられている。
【選択図】図２

Description

本発明は、レーザー光の集光照射による光放射圧を利用して、非接触的に標本（例えばデオキシリボ核酸や高分子）を操作する光ピンセット装置に関する。

近年、レーザー光の集光照射による光放射圧を利用して水中の微細物を捕捉する、いわゆる光ピンセットが用いられている。この光ピンセットは、レーザー光を水等の媒質を通して微細物に照射した場合に、媒質と微細物の屈折率の違いからレーザー光が屈折し、それに伴う光運動量変化に対する反作用によって微細物を焦点にトラップするものである。そして、微細物を捕捉した状態で、微細物を含む試料ステージ側を相対移動させることにより、微細物を移動・搬送することができる。このような光ピンセットを用いて微細物を操作・採取する技術が種々開発されている（例えば、特許文献１、２参照）。

一方、光ピンセットを用いてプラズマディスプレイの背面基板の蛍光体色素を移動させて定着させる技術が提案されている（特許文献３参照）。この技術によれば、レーザ発光器からのレーザの照射方向を、ミラーの角度を回動させることによって変化させ、レーザを壁面に均等に照射させて色素を定着させることが記載されている。

又、光ピンセット装置を使用中に、試料ステージへ入射するレーザー光のＸＹ（平面方向）スキャンを行うため、レーザー光路の１箇所にミラー（偏向手段）を配置した技術がある。このミラーとしては、ガルバノミラー、ピエゾスキャナやＡＯＤ（音響光学回折偏向機）が用いられる。例えばガルバノミラーの場合、ミラー１枚あたり１軸（ＸかＹのどちらか１次元方向）しかスキャンできないので、ＸとＹにそれぞれスキャンするミラー２枚１組で2次元的なＸＹスキャンを行うようになっている。

特開２００１−７１３００号公報 特開２００１−２１１８７５号公報 特開２００２−１００２８６号公報

上記したように、従来の光ピンセット装置の場合、標本を載置したＸＹステージをレーザー光に対して平面上で相対移動させることにより、標本を２次元的に操作・観察するようになっている。しかしながら、標本を３次元的に操作・観察しようとすると、対物レンズ等を微小に移動させる必要があり、操作が複雑となる。そのため、従来は、高価な共焦点顕微鏡を用いて擬似的に３次元像を観察できたに過ぎなかった。

仮にレーザー光路上に１個（レーザー光路の１箇所に２枚１組のミラーを設置した場合も含む、又、レーザー光路の１箇所にＸ方向へスキャンするミラーを置き、この位置と異なる位置（先の共役焦点に当たる位置）にＹ方向へスキャンするミラーを置いた場合も含む）のミラーを用いてレーザー光の照射方向を変えても、３次元的な操作を充分に行うことは難しい。このことを図４を用いて説明する。
図４において、レーザー光源２から出射したレーザー光がミラー２００で方向を約９０度曲げられ、対物レンズ１０へ入射するものとする。対物レンズ１０の上方には試料ステージ１２が配置され、試料ステージ１２上には標本１００が載置されている。レーザー光は対物レンズ１０から試料ステージ１２上へ入射光Ｓ１として入射し、光ピンセット効果により標本１００を捕捉する。
いま、ミラー２００を反時計回りに角度αだけ傾けた場合、レーザー光源２から出射したレーザー光は反時計回りに角度θだけ傾いて対物レンズ１０に入射し、試料ステージ１２上へ入射光Ｓ２として入射する。このようにして、入射光Ｓ２による光ピンセット効果により、標本１００を角度θ傾けることができる。しかしながら、この場合、試料ステージ１２への入射光Ｓ２の入射位置がＳ１より距離ｄだけ左にずれるという不具合が生じる。このため、標本１００が観察視野から外れたり、標本１００の捕捉に失敗し、３次元的に操作・観察がし難いという欠点があった。
つまり、従来の光ピンセット装置の場合、ミラー（偏向装置）を用いてレーザー光の入射角度を変えようとすると、入射位置も変化してしまうという不具合がある。

従って、本発明の目的は、レンズを移動させることなく、偏向装置の操作のみによってレーザー光の入射位置を変えずに入射角度を変えることにより、標本を３次元的に操作・観察できる光ピンセット装置を提供することにある。

すなわち本発明の光ピンセット装置は、レーザー光源と、前記レーザー光源から出射されたレーザー光を偏向する第１の偏向手段と、前記第１の偏向手段によって偏向されたレーザー光を偏向する第２の偏向手段と、前記第２の偏向手段によって偏向されたレーザー光を標本上に集束して光ピンセット効果を生じさせる集光手段とを備え、前記第１の偏向手段及び前記第２の偏向手段はその偏向角がそれぞれ変更可能に取付けられている。
このようにすると、前記第１の偏向手段によって偏向されたレーザー光の入射位置がずれたとしても、そのずれを補償するように第２の偏向手段の偏向角を調整することにより、標本へのレーザー光の入射位置を変えることなく、レーザー光の入射角度のみを変えることができる。
なお、レーザー光が集光手段（対物レンズ）を通過すると、レーザー光の入射角度のずれが入射位置のずれに変換され、入射位置のずれが入射角度のずれに変換されるが、上記した作用は実質的に変わらない。

前記第１の偏向手段及び前記第２の偏向手段における偏向位置は、前記集光手段の焦点に対する共役焦点及び共役後側焦点のいずれかであることが好ましい。

前記第１の偏向手段及び前記第２の偏向手段の偏向角を別個に制御する制御手段をさらに備えたことが好ましい。

本発明によれば、レンズを移動させることなく、偏向装置の操作のみによってレーザー光の入射位置を変えずに入射角度を変えることにより、標本を３次元的に操作・観察できる。

以下、本発明の光ピンセット装置の実施形態について説明する。図１は、本発明の実施形態に係る光ピンセット装置の構成を示すブロック図である。図１において、試料セル５０内に操作対象となる標本（例えば、棒状の桿菌）が懸濁している。試料セル５０は試料ステージ１２上に保持されている。試料ステージ１２は、図示しないＸＹ移動ステージに装着され、ＸＹ移動ステージが装置本体の光学系の基準座標に対して縦横に移動する。これにより、試料ステージ１２上の試料セル５０がレーザー光の光軸に対して相対移動可能になっている。ＸＹ移動ステージ４は、それぞれ縦、横に変位可能なＸ移動ステージ、Ｙ移動ステージから構成される。Ｘ移動ステージ、Ｙ移動ステージは、ステッピングモータ等の駆動装置によってそれぞれ縦、横に駆動される。

試料ステージ１２の開口の下方には油浸対物レンズ（集光手段）１０が光軸を垂直にして配置され、油浸対物レンズ１０の下方にはダイクロイックミラー（ハーフミラー）８が斜め（４５度）に配設されている。ダイクロイックミラー８の下方には、ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ１４が配設されている。カメラ１４は、油浸対物レンズ１０と同軸の光軸上に位置し、ダイクロイックミラー８及び油浸対物レンズ１０を通して試料セル５０内を撮像する。
試料ステージ１２の開口の上方には、試料セル５０内の観察用光源であるハロゲンランプ（図示せず）が設置され、このランプから垂直下方向にハロゲン光Ｈが照射され、油浸対物レンズ１０、ダイクロイックミラー８を通ってＣＣＤカメラ１４に受光されるようになっている。

光ピンセット用のレーザー光はダイクロイックミラー８の側方から導入され、ダイクロイックミラー８によって油浸対物レンズ１０に入射するようになっている。このレーザー光学系は以下のように構成されている。
まず、光ピンセット用の光源であるＹＡＧレーザー（レーザー光源）２が横向きに設置されている。ＹＡＧレーザー２から側方に出射したレーザー光はビームエキスパンダー１６によって平行光束に広げられ、レンズＬ４によって集光された後、斜め（４５度）に配設されたθφ-Ｍミラー（第１の偏向手段）４に入射する。θφ-Ｍミラー４は、アンプ４０ａ及びファンクションジェネレータ４０ｂによって制御されるステッピングモータに接続され、ミラーの反射角（偏向角）を４５度±１０度の間で変更可能である。

θφ-Ｍミラー４によってレーザー光は垂直下方に向けられた後、レンズＬ３によって平行光束に広げられ、斜め（４５度）に配設されたＸＹ−ガルバノミラー（第２の偏向手段）６に入射する。ＸＹ−ガルバノミラー６は、アンプ６０ａ及びファンクションジェネレータ６０ｂによって制御されるステッピングモータに接続され、ミラーの反射角を４５度±１０度の間で変更可能である。
ＸＹ−ガルバノミラー６によってレーザー光は側方に向けられた後、レンズＬ２で集光され、次にレンズＬ１によって光束を広げられ、ダイクロイックミラー８の側方に導入され、上記したように油浸対物レンズ１０に入射する。レーザー光は油浸対物レンズ１０を通って試料ステージ１２の開口から試料セル５０内に入射し、試料セル５０内の標本にレーザー光が集光され、標本はレーザー光の光圧力によって非接触で光ピンセット効果により捕捉される。なお、ダイクロイックミラー８は、レーザー光（波長１０６４ｎｍの光）を反射するものを使用することができる。

なお、詳しくは後述するが、試料ステージ１２上のレーザー光の焦点Ｆとし、後側焦点（バックフォーカス）ＢＦとしたとき、θφ-Ｍミラー４で反射される位置をＦの共役焦点Ｆ^＊に合わせ、ＸＹ−ガルバノミラー６で反射される位置をＢＦの共役焦点ＢＦ^＊に合わせることが好ましい。又、レンズＬ２で集光される位置をＦの共役焦点Ｆ^＊に合わせることが好ましい。
又、θφ-Ｍミラー４、ＸＹ−ガルバノミラー６の反射角は、ファンクションジェネレータ４０ｂ、６０ｂに接続された制御部７０によって調整することができる。制御部７０はキーボード等の入力部及びモニター等の表示部を有し、例えばパーソナルコンピュータからなる。

次に本発明の光ピンセット装置により２個のミラーを用いてレーザー光の照射方向を変え、３次元的な操作を行う原理について、図２を用いて説明する。
図２において、レーザー光源２から出射したレーザー光がミラー４で方向を約９０度曲げられ、次に、ミラー６で方向を約９０度曲げられ、図示しない対物レンズ１０を経由して試料ステージ１２上へ入射することは既に述べた通りである。なお、説明を簡単にするため、図２においては、ダイクロイックミラー８による光学経路を省略している。
まず、ミラー４、ミラー６の反射角をそれぞれ４５度とした場合、レーザー光は試料ステージ１２へ垂直へ入射し、入射光Ｐ１となる。
いま、ミラー４を反時計回りに角度βだけ傾け、ミラー６を傾けない場合（つまりミラー６が無い場合と同様）、レーザー光源２から出射したレーザー光は反時計回りに角度φだけ傾き、試料ステージ１２上へ入射光Ｐ２として入射するのは、図４で説明した通りであｗる。この場合、入射光Ｐ２の入射位置がＰ１より距離ｄ１だけずれるという不具合が生じる。このミラー６の機能のみを持つ光学技術はすでに存在し、試料ステージ１２上での入射位置Ｍを移動させる役割を持っていることは既に述べた通りである。

いま、ミラー４を固定してミラー６を反時計回りに角度γだけ傾けた場合、入射位置Ｍは新たな移動先入射位置（図２においてＭより上側）に移ると共に角度εだけ傾き、レーザー光は試料ステージ１２上へ入射光Ｐ３として入射する。そこで、ミラー６を反時計回りに角度γだけ傾けると共に、ミラー４を時計回りに角度βだけ傾けた場合、ミラー６による入射位置の変更に伴うアオリ効果をミラー４が打ち消すことによって試料ステージ１２上への入射光Ｐ３の入射位置を入射光Ｐ１の入射位置Ｍに一致させることができる。
このように、２つのミラーを用いることにより、レーザー光の入射位置を変えることなく、レーザー光の入射角のみを変えることができ、光ピンセットによる３次元的な操作や観察が容易かつ精度よく行える。

なお、レーザー光が集光手段（対物レンズ）を通過すると、レーザー光の入射角度のずれが入射位置のずれに変換され、入射位置のずれが入射角度のずれに変換されるが、上記した作用は実質的に変わらない。
又、偏向手段としては、ガルバノミラー等の各種ミラー（反射手段）、ピエゾスキャナやＡＯＤ（音響光学回折偏向機）を用いることができるがこれらに限られない。第１及び第２の偏向手段は、それぞれＸＹ（平面）方向へ2次元的に偏向角を調整できることが望ましい。

図３は、本発明の光ピンセット装置により３次元的な操作を行う一態様を示す。例えば、標本として棒状の桿菌１００（長さ約３０μｍ、直径１μｍ未満）を光ピンセットにより捕捉して３次元的な操作・観察を行う場合、まず、レーザー光を試料ステージ１２上に垂直な入射光Ｐ１として入射すると、桿菌１００は長手方向を試料ステージ１２に垂直にして捕捉される。次に、ミラー６、ミラー４の反射角を調整すると試料ステージ１２上の入射位置Ｍを変えずに入射光Ｐ３の入射角度をＰ１から角度εだけ傾ける事ができる、すると桿菌１００は入射位置Ｍを支点にして先端が首振りするようになる。同様に、入射光Ｐ４の入射角度をＰ１から角度-εだけ傾けると、桿菌１００は入射位置Ｍを支点にして先端が反対方向に首振りする。このようにして、レーザー光の入射位置Ｍを変えずに入射角度のみを変化させることによって、標本は入射位置Ｍを支点とする首振り運動をするようになり、標本の３次元的な操作が行える。
なお、図３に示すミラーの操作は、ＸＹ（平面）方向のうち一方の方向を示すので、図３の紙面と垂直な方向についても同様に操作する必要がある。そのため、例えば、ミラー４、６として例えばガルバノミラーを用いる場合、ミラー４、６のそれぞれがＸとＹにそれぞれスキャンするミラー２枚１組を要する。

光ピンセットによれば、マイクロスケール（数μｍ〜１００μｍ）の標本を捕捉できるので、上記のようにしてマイクロスケールの３次元的な操作が実現できる。しかも、ミラーの反射角を調整することは、レンズの位置や角度を調整することに比べて容易であるので、光ピンセット装置も簡便、低コストになる。
特に、標本が生物の場合等、標本の形状は必ずしも理想的な球でない場合が多く、標本のうち光によってトラップされる部分は標本の中心と必ずしも一致せず、光ピンセットの入射角度に沿って捕捉される。そのため、レーザー光の入射角度のみを調整する事で、細胞を対象の領域に据えたままで（入射位置を変えずに）、細胞の向きを調整する事が可能になる。

一方、従来の方法で細胞の向きを変えるには、細胞を対象の領域から移動させるか（入射位置を変えるか）、代替の方法が必要となる。逆に、従来の方法では、レーザー光による捕捉領域の移動に伴い、細胞の向きが変化する可能性があるという不都合があったが、本発明によればそれを解消する事が可能になる。

なお、各ミラー４，６の反射角の調整は、標本を観察しながら操作者が行ってもよいが、例えば以下のような方法により、制御部７０が自動的に反射角の調整を行うこともできる。
すなわち、例えば図２において、予め、ミラー４の反射角βを変化させた時、試料ステージ１２上へのレーザー光の入射角度εがどの程度変化するかについて、いくつかのβに対して測定しておき、βとεの関係式をコンピュータプログラムに格納しておく。次に、いくつかのβに対し、入射位置Ｍを変えないため、ミラー６の反射角γをどの程度変化させればよいか、いくつかのβに対して測定しておき、βとγの関係式をコンピュータプログラムに格納しておく。

そして、例えば操作者が所望の入射角εを入力すると、制御部７０は上記したコンピュータプログラムの各関係式からβ、γを計算し、各ミラー４，６の反射角を調整する。一方、ＣＣＤカメラ１４によって、光軸上の光量を測定しておき、測定値を制御部７０に出力する。制御部７０は、光量が低下した場合は、反射角を元に戻すようなフィードバック処理を行い、光量が低下しないβ、γの角度を最終的に得るようにする。つまり、光軸上の光量が低下することは、試料ステージ１２上へ入射したレーザー光の入射位置が位置Ｍからずれたことを意味するので、フィードバック制御により、レーザー光の入射位置が位置Ｍに一致するようにβ、γの角度を微調整することができるようになる。

より具体的に説明すると、ミラー４の角度変化と、試料上での入射角度の変化はほぼ比例」し、その比例係数は試料とミラー４の間のレーザー光路上のレンズ群によって定まる固有の値である。比例係数は、所定の光学計算ソフトや光学理論を用いて計算することができる。
又、入射位置Ｍが変わると、上記比例係数が若干変化することがある。この場合の変化の度合は光軸の中心から周辺に向かうにつれて変化する関数であり、対物レンズに固有の値であると考えられる。
一方、ミラー６を動かして入射位置Ｍを変化させる際の、試料上での入射角度の変化は、中心から周辺に向かうにつれて変化する関数であり、レーザー光の径の大きさと分布、試料とミラー４の間の光路上のレンズ群によって定まる固有の関数である。この関数も、所定の光学計算ソフトや光学理論を用いて計算することができる。
上記した比例係数や関数を求めるには、使用に供する光ピンセット装置で想定される条件（レンズの配置等）について予め計算し、その数値や関数を記憶しておき、個々の使用時にミラーの角度を入力値としてコンピュータプログラムで処理すれば、最適な角度を算出することができる。

一方、対物レンズの形態等の影響により、上記以外の理由で、上記した比例係数や関数が変化したり誤差が生じることがあるが、その場合は、実測値により補正値を求めればよい。例えば、上記した比例係数や関数を補正するような修正関数をコンピュータプログラムに組み込み、ＣＣＤカメラ等からレーザー光の試料上の強度をフィードバックしたものを入力値として、補正値を算出すればよい。

本発明の実施形態に係る光ピンセット装置の構成を示すブロック図である。 レーザー光の照射方向を変え、３次元的な操作を行う原理を示す図である。 本発明の光ピンセット装置により３次元的な操作を行う一態様を示す図である。 １個のミラーを用いてレーザー光の照射方向を変えて、３次元的な操作を行う従来方法を示す図である。

符号の説明

２ レーザー光源
４ θφ-Ｍミラー（第１の偏向手段）
６ ＸＹ−ガルバノミラー（第２の偏向手段）
１０ 対物レンズ
１２ 試料ステージ１２
Ｍ （レーザー光の）入射位置
ε （レーザー光の）入射角度
β、γ （ミラーの）反射角

Claims (3)

1. レーザー光源と、前記レーザー光源から出射されたレーザー光を偏向する第１の偏向手段と、前記第１の偏向手段によって偏向されたレーザー光を偏向する第２の偏向手段と、前記第２の偏向手段によって偏向されたレーザー光を標本上に集束して光ピンセット効果を生じさせる集光手段とを備え、
   前記第１の偏向手段及び前記第２の偏向手段はその偏向角がそれぞれ変更可能に取付けられている光ピンセット装置。
2. 前記第１の偏向手段及び前記第２の偏向手段における偏向位置は、それぞれ前記集光手段の焦点に対する共役焦点及び共役後側焦点のいずれかである請求項１記載の光ピンセット装置。
3. 前記集光手段へのレーザー光の入射位置を変えずに該レーザー光の入射角度のみを変えるよう、前記第１の偏向手段及び前記第２の偏向手段の偏向角を別個に制御する制御手段をさらに備えた請求項１又は２記載の光ピンセット装置。

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