JP6284372B2 - 走査型レーザ顕微鏡および超解像画像生成方法 - Google Patents

Description

本発明は、走査型レーザ顕微鏡に関するものである。

ヒトゲノムの解読以降、癌などの疾患機序や心臓・脳神経といった各臓器の発生／分化機序など、細胞単位の生物学的な挙動が分子レベルで解明されるようになっている。そして、顕微鏡を用いて細胞などの生体サンプルを観察する場合には、タンパクやＤＮＡ／ＲＮＡなど、生体分子１個レベルの挙動を観測することが求められている。このため、光学分解能を上回る超解像観察の重要性が増々高まっている。

従来、複数の検出素子からなるＣＣＤやＰＭＴアレイのような検出器を用いて回折限界を上回る解像度（超解像）の画像を取得する技術が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。非特許文献１に記載の技術は、２次元検出器アレイを対物レンズの焦点位置と共役な位置に配置し、スキャナにより標本上で走査させたレーザ光のスポットからの戻り光のスポットを複数の検出素子により細分化して検出するようになっている。そして、レーザ光の走査に従い異なる検出タイミングで異なる検出素子により検出される同一の標本位置からの戻り光の光強度信号どうしを合算した画素値をスキャナの走査位置に対応づけて配列することで、標本の超解像の画像を生成するようになっている。

"Ｉｍａｇｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ"Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０４，１９８１０１（２０１０）ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０３／ＰｈｙｓＲｅｖＬｅｔｔ．１０４．１９８１０１

しかしながら、非特許文献１に記載の技術により超解像効果を得るには、２次元検出器アレイに入射させる戻り光のスポットの位置と各検出素子の位置とを合致させる必要があり、戻り光のスポットの位置と各検出素子との位置関係がずれてしまうと、画像形成を正しく行うことができないという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、所期の超解像効果を有する画像を簡易かつ精度よく生成することができる走査型レーザ顕微鏡および超解像画像生成方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源から発せられたレーザ光を標本上で走査させる走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を前記標本に照射する一方、該標本からの戻り光を集光する対物レンズと、該対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配列されたＯＮ／ＯＦＦを個々に切り替え可能な複数の検出素子を有する検出部と、該検出部のＯＮ状態の各前記検出素子から出力される光強度信号を比較し、前記戻り光の強度が最も強くなる検出素子に前記戻り光のスポットの中心位置が配置されているものと判断して、前記検出部に入射する前記戻り光のスポットの中心位置を算出する算出部と、該算出部により算出された前記スポットの中心位置と前記検出部におけるＯＮ状態の選択範囲の中心の前記検出素子とが合致するように、ＯＮ状態に切り替える前記検出素子の選択範囲を調整する制御部とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、光源から発せられたレーザ光が走査部により走査されて対物レンズにより標本に照射され、標本におけるレーザ光のスポットから戻る戻り光が対物レンズにより集光されて検出部に入射し、複数の検出素子により戻り光のスポットが細分化されて検出される。したがって、レーザ光の走査に従い異なる検出タイミングで異なる検出素子により検出される同一の標本位置からの戻り光の光強度信号どうしを合算した画素値を走査部の走査位置に対応づけて配列することで、標本の超解像の画像を生成することができる。

そして、本態様によれば、算出部により戻り光のスポットの中心位置が算出されるので、戻り光のスポットの中心位置が検出部の中心位置に一致するように戻り光のスポットと検出部とを相対移動させれば、戻り光のスポットと検出部の各検出素子とを容易に位置合わせすることができる。これにより、仮に戻り光のスポットと各検出素子との位置関係がずれた場合であっても、戻り光のスポットの位置と各検出素子の位置とを容易に合致させて、所期の超解像効果を有する画像を簡易かつ精度よく生成することができる。

上記発明においては、前記算出部が、前記検出素子の出力を比較し、前記戻り光の強度が最も強くなる検出素子に前記戻り光のスポットの中心位置が配置されているものと判断する。
戻り光はスポットの中央付近ほど強度が強い傾向がある。したがって、強度が最も強い戻り光を検出した検出素子に戻り光のスポットが配置されているとみなすことで、戻り光のスポットの中心位置を容易に算出することができる。
本発明は、光源から発せられたレーザ光を走査部により走査させて対物レンズにより標本上に照射し、前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に２次元的に配列されたＯＮ／ＯＦＦを個々に切り替え可能な検出器アレイの複数の微小検出素子により前記標本からの戻り光を検出し、前記検出器アレイのＯＮ状態の各前記微小検出素子の出力を比較して、戻り光の強度が最も強くなる前記微小検出素子に戻り光のスポットの中心位置が配置されているものと決定し、前記検出器アレイのＯＮ状態に切り替える前記微小検出素子の選択範囲を調整して、前記スポットの中心位置と前記検出器アレイにおけるＯＮ状態の前記選択範囲の中心の前記微小検出素子とを一致させ、前記走査部による前記レーザ光の走査に従い、異なる検出タイミングで異なるＯＮ状態の前記微小検出素子により検出された同一の前記標本位置からの戻り光の光強度信号どうしを合算して前記標本の超解像画像を生成する超解像画像生成方法を提供する。
上記発明においては、前記検出器アレイが、奇数×奇数の前記検出素子を有することとしてもよい。
上記発明においては、前記対物レンズまたは前記レーザ光の波長を変更した場合に前記戻り光のスポットの中心位置を算出することとしてもよい。

上記発明においては、前記算出部により算出された前記スポットの中心位置と前記検出部の中心位置とが合致するように、前記検出部または前記検出素子の選択範囲を移動させる制御部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、戻り光のスポットと複数の検出素子との位置関係がずれた場合であっても、制御部により、戻り光のスポットと検出部の各検出素子とを自動的に位置合わせすることができる。

上記発明においては、前記算出部により算出された前記スポットの中心位置と前記検出部の中心位置とが合致するように、前記検出部における前記戻り光のスポットの入射位置を移動させる制御部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、戻り光のスポットと複数の検出素子との位置関係がずれた場合であっても、制御部により、戻り光のスポットと検出部の各検出素子とを自動的に位置合わせすることができる。

上記発明においては、前記検出部に入射する前記戻り光のスポットを角度に応じて移動可能な平行平面ガラスを備え、前記制御部が、前記平行平面ガラスの角度を変更することとしてもよい。
このように構成することで、制御部により平行平面ガラスの角度を変更するだけで、検出部に入射する戻り光のスポットを移動させて、戻り光のスポットの中心位置と検出部の中心位置とを容易に合致させることができる。

上記発明においては、前記検出部が、奇数×奇数の前記検出素子を有することとしてもよい。
このように構成することで、いずれか１つの検出素子を中心に各検出素子を２次元的に配置することにより、戻り光のスポットの中心を検出部の中央に配された１つの検出素子に一致させることができる。これにより、戻り光の輝度に相当するより高精度な光強度信号を得ることができる。

上記発明においては、前記算出部が、前記対物レンズまたはレーザ光の波長を変更した場合に前記戻り光のスポットの中心位置を算出することとしてもよい。
対物レンズやレーザ光の波長を変更すると、戻り光のスポットと各検出素子との位置関係がずれる場合があるが、このように構成することで、対物レンズやレーザ光の波長を変更した場合に算出部により戻り光のスポットの中心位置を自動的に算出して、制御部により戻り光のスポットの位置と検出部の各検出素子の位置とを合致させることができる。したがって、変更後の対物レンズやレーザ光の波長により、所期の超解像効果を有する画像を簡易かつ精度よく生成することができる。

本発明によれば、所期の超解像効果を有する画像を簡易かつ精度よく生成することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 図１のアレイ型検出器を示す概略図である。 図１のアレイ型検出器と電動ステージを示す概略図である。 蛍光のスポットの位置と微小検出素子の位置とがずれた状態を示す図である。 蛍光のスポットの位置と微小検出素子の位置とを合致させた状態を示す図である。 本発明の第２実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡のビーム偏向板を示す図である。 本発明の第３実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の共焦点ピンホールを示す図である。 本発明の第３実施形態の変形例に係る走査型レーザ顕微鏡の絞りを示す図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００は、図１に示すように、レーザ光を発生するレーザユニット１０と、レーザユニット１０から発せられたレーザ光を導光するシングルモードファイバ１１と、シングルモードファイバ１１により導光されたレーザ光を平行光に整形するコリメートレンズ１３と、平行光に整形されたレーザ光を反射可能な３つの励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃと、励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃのいずれかにより反射されたレーザ光を偏向するガルバノスキャナ（走査部）１７と、偏向されたレーザ光をリレーする瞳投影レンズ１９と、リレーされたレーザ光を反射する反射ミラー２１と、反射ミラー２１により反射されたレーザ光を集光して像を結像させる結像レンズ２３と、結像レンズ２３により集光されたレーザ光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ２５とを備えている。

また、走査型レーザ顕微鏡１００には、対物レンズ２５により集光されてレーザ光の光を戻り、ガルバノスキャナ１７によりデスキャンされて光路上の励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃを透過した蛍光を集光する共焦点レンズ２７と、共焦点レンズ２７により集光された蛍光を検出するアレイ型検出器（検出部）２９と、アレイ型検出器２９により取得された光強度信号を演算処理する超解像演算部（算出部）３１と、音響光学素子９、ガルバノスキャナ１７およびアレイ型検出器２９を制御する制御部３３とが備えられている。

レーザユニット１０は、蛍光色素で染色した標本Ｓに対してその励起波長の各レーザ光を出力することができるようになっている。このレーザユニット１０は、例えば、励起波長４８８ｎｍのレーザ光を発振するＡｒレーザ装置（光源）１Ａと、励起波長５４３ｎｍのレーザを発振するＨｅＮｅ−Ｇレーザ装置（光源）１Ｂと、励起波長６３３ｎｍのレーザ光を発振するＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置（光源）１Ｃとを備えている。

また、レーザユニット１０には、Ａｒレーザ装置１Ａから発せられたレーザ光を反射する反射ミラー３と、波長４８８ｎｍと波長５４３ｎｍの２つの波長のレーザ光を合成するダイクロイックミラー５と、波長４８８ｎｍと波長５４３ｎｍと波長６３３ｎｍの３つの波長のレーザ光を合成するダイクロイックミラー７と、各波長４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎｍのうち任意の波長のレーザ光を選択する音響光学素子（ＡＯＴＦ）９とが備えられている。

３つの励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃは、コリメートレンズ１３を透過したレーザ光の光路上に選択的に挿脱可能に配置されている。これら励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃは、それぞれコリメートレンズ１３からのレーザ光を反射する一方、標本Ｓからの蛍光を透過する特性を有している。

具体的には、励起ダイクロイックミラー１５Ａは、各励起波長４８８ｎｍ，５４３ｎｍ，６３３ｎｍのレーザ光を反射し、これらのレーザ光により励起された標本Ｓからの蛍光を透過させるようになっている。励起ダイクロイックミラー１５Ｂは、励起波長４８８ｎｍのレーザ光を反射し、励起波長４８８ｎｍよりも長い波長の光を透過させるようになっている。励起ダイクロイックミラー１５Ｃは、励起波長５４３ｎｍのレーザ光を反射し、励起波長５４３ｎｍよりも長い波長の光を透過させるようになっている。

これらの励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃは、観察する標本Ｓの種類により使い分けられる。例えば、励起波長６３３ｎｍのレーザ光のみを用いて蛍光観察するときや複数の励起波長を用いて多重蛍光観察するときは、励起ダイクロイックミラー１５Ａを使用する。また、励起波長４８８ｎｍのレーザ光のみを用いて蛍光観察するときは、励起ダイクロイックミラー１５Ｂを使用する。また、励起波長５４３ｎｍのレーザ光のみを用いて蛍光観察するときは、励起ダイクロイックミラー１５Ｃを使用する。これにより、蛍光の取り込み効率を向上することができる。

ガルバノスキャナ１７は、互いに直交する揺動軸回りに揺動可能な一対のＸガルバノミラー(走査部材）１７ＡおよびＹガルバノミラー（走査部材）１７Ｂを備えている。Ｘガルバノミラー１７Ａはレーザ光を水平方向に走査し、Ｙガルバノミラー１７Ｂはレーザ光を垂直方向に走査するようになっている。

これらＸＹガルバノミラー１７Ａ，１７Ｂは、励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃによるレーザ光の反射光路上に配置されており、励起波長４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎｍの各レーザ光を標本Ｓ上で２次元的に（Ｘ方向およびＹ方向）に走査することができるようになっている。
共焦点レンズ２７は、励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃからの蛍光を集光して結像し、アレイ型検出器２９に蛍光のコンフォーカルスポット（スポット）を投影するようになっている。

アレイ型検出器２９としては、例えば、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）イメージセンサやＣＣＤイメージセンサを用いることができる。このアレイ型検出器２９は、図２に示すように、例えば２次元的に配列された７×７個の奇数の微小検出素子（検出素子）３０を有している。

これら微小検出素子３０は、対物レンズ２５の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されている。また、各微小検出素子３０は、入射した蛍光のコンフォーカルスポットを細分化して検出し、検出した蛍光を光電変換して標本Ｓの画像情報としての光強度信号を出力するようになっている。

このアレイ型検出器２９は、図３に示すような電動ステージ３５により支持されており、電動ステージ３５によりＸ方向およびＹ方向に位置をずらすことができるようになっている。電動ステージ３５は、例えば、図示しないモータまたはピエゾ素子により駆動するようになっている。

超解像演算部３１は、アレイ型検出器２９の各微小検出素子３０から出力される光強度信号に基づいて、アレイ型検出器２９に入射する蛍光のコンフォーカルスポットの強度分布を計測し、強度分布のピーク位置、すなわちコンフォーカルスポットの中心位置を算出するようになっている。例えば、超解像演算部３１は、各微小検出素子３０の光強度信号を比較し、蛍光の強度が最も強くなる微小検出素子３０に蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置が配置されていると判断するようになっている。

制御部３３は、レーザユニット１０からＡｒレーザ装置１Ａ、ＨｅＮｅ−Ｇレーザ装置１ＢまたはＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置１Ｃを作動させ、音響光学素子９によりその波長のレーザ光を選択的に射出させるようになっている。また、制御部３３は、ＸＹガルバノミラー１７Ａ，１７Ｂを走査駆動し、ＸＹガルバノミラー１７Ａ，１７Ｂの行きの揺動動作中にレーザ光を走査させるようになっている。

また、制御部３３は、微小検出素子３０のＯＮ／ＯＦＦを個々に切り替えて、ＯＮする範囲を選択するようになっている。また、制御部３３は、電動ステージ３５をＸＹ駆動することにより、蛍光のコンフォーカルスポットの位置に対してアレイ型検出器２９の位置をＸ方向およびＹ方向にずらすようになっている。そして、制御部３３は、超解像演算部３１により算出された蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置に従って、蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置とアレイ型検出器２９の中心位置とが合致するようにアレイ型検出器２９のＸ方向およびＹ方向の位置を調整するようになっている。

さらに、制御部３３は、ガルバノスキャナ１７によるレーザ光の走査に従い、異なる検出タイミングで異なる微小検出素子３０により検出される同一の標本位置からの蛍光の光強度信号どうしを合算するようになっている。そして、制御部３３は、合算した画素値をガルバノスキャナ１７の走査位置に対応づけて配列することにより標本Ｓの画像を生成するようになっている。

このように構成された走査型レーザ顕微鏡１００の作用について説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００により標本Ｓを観察するには、まず、アレイ型検出器２９に入射する蛍光のコンフォーカルスポットとアレイ型検出器２９の各微小検出素子３０との位置関係を調整する。この場合、標本Ｓに蛍光標識を付与し、制御部３３により音響光学素子９およびアレイ型検出器２９を作動させる。

例えば、制御部３３により、レーザユニット１０の音響光学素子９に対してＡｒレーザ装置１Ａを選択する指令を出力し、Ａｒレーザ装置１Ａから出力される励起波長４８８ｎｍのレーザ光を音響光学素子９により選択してレーザユニット１０から射出させる。

レーザユニット１０から射出された励起波長４８８ｎｍのレーザ光は、シングルモードファイバ１１により伝送されてコリメートレンズ１３に導光され、コリメートレンズ１３により平行光に整形されて励起ダイクロイックミラー１５により反射される。励起ダイクロイックミラー１５により反射されたレーザ光は、ガルバノスキャナ１７を介して瞳投影レンズ１９を透過し、反射ミラー２１で反射されて結像レンズ２３、対物レンズ２５を介して標本Ｓ上に光スポットとして結像される。

レーザ光の光スポットが結像することにより蛍光標識が励起されて例えば中心波長５２０ｎｍの蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズ２５により集光されてレーザ光の光路を戻る。そして、蛍光は、結像レンズ２３、反射ミラー２１、瞳投影レンズ１９、ガルバノスキャナ１７Ａ，１７Ｂを介して励起ダイクロイックミラー１５Ａを透過し、共焦点レンズ２７より集光されてアレイ型検出器２９に入射する。

アレイ型検出器２９においては、共焦点レンズ２７により投影された蛍光のコンフォーカルスポットが複数の微小検出素子３０により細分化されて検出され、微小検出素子３０ごとに検出した蛍光が光電変換されて画像情報としての光強度信号が出力される。

各微小検出素子３０から出力された光強度信号は、制御部３３を介して超解像演算部３１に送られ、超解像演算部３１により互いに比較される。そして、超解像演算部３１により、蛍光の強度が最も強くなる微小検出素子３０が検出され、その微小検出素子３０の位置により蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置が算出される。

次いで、例えば、図４に示すように、超解像演算部３１により算出された蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置がアレイ型検出器２９の中央に配された微小検出素子３０からずれている場合は、制御部３３により、蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置とアレイ型検出器２９の中央の微小検出素子３０の位置とが合致するように電動ステージ３５がＸＹ駆動される。

電動ステージ３５の駆動により、図５に示すように、アレイ型検出器２９のＸ方向およびＹ方向の位置が調整されて蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置がアレイ型検出器２９の中央の微小検出素子３０に移動する。これにより、蛍光のコンフォーカルスポットとアレイ型検出器２９の各微小検出素子３０とが位置合わせされる。

蛍光のコンフォーカルスポットとアレイ型検出器２９の各微小検出素子３０との位置合わせが終了したら、レーザ光を走査させて標本Ｓの画像を生成する。この場合、制御部３３によりガルバノスキャナ１７を作動させ、レーザユニット１０から発せられたレーザ光をガルバノスキャナ１７により偏向して標本Ｓ上で２次元的に走査させる。

ガルバノスキャナ１７の作動により、標本Ｓ上に結像される光スポットは、Ｘガルバノミラー１７Ａによって水平方向に走査され、次にＹガルバノミラー１７Ｂによって垂直方向に１画素分走査され、再びＸガルバノミラー１７Ａによって水平方向に走査されることが繰り返される。

次いで、レーザ光が走査されることにより標本Ｓにおいて発生してアレイ型検出器２９に入射する蛍光のコンフォーカルスポットを複数の微小検出素子３０により細分化して検出する。これにより、レーザ光の走査に従い、異なる検出タイミングで異なる微小検出素子３０によって同一の標本位置からの蛍光が検出される。

次いで、制御部３３により、レーザ光の走査に従って異なる検出タイミングで異なる微小検出素子３０によって検出された同一の標本位置からの蛍光の光強度信号どうしが合算され、その画素値がガルバノスキャナ１７の走査位置に対応づけて配列される。この結果、仮想的に共焦点ピンホールを絞った状態になり解像度を向上した画像を生成することができる。これにより、ユーザは、標本Ｓの超解像の画像に基づいて標本Ｓを精度よく観察することができる。

以上説明したように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００によれば、アレイ型検出器２９に入射する蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置がアレイ型検出器２９の中心位置に一致するようにアレイ型検出器２９のＸＹ方向の位置を調整することで、蛍光のコンフォーカルスポットとアレイ型検出器２９の各微小検出素子３０とを容易に位置合わせすることができる。これにより、仮に蛍光のコンフォーカルスポットと各微小検出素子３０との位置関係がずれた場合であっても、蛍光のコンフォーカルスポットの位置と各微小検出素子３０の位置とを容易に合致させて、所期の超解像効果を有する画像を簡易かつ精度よく生成することができる。

また、アレイ型検出器２９が奇数の複数の微小検出素子３０を有することで、いずれか１つの微小検出素子３０を中心に各微小検出素子３０を２次元的に配置し、蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置をアレイ型検出器２９の中央に配された１つの微小検出素子３０の位置に一致させることができる。これにより、蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置が複数の微小検出素子３０の位置に跨る場合と比較して、高精度な光強度信号を得ることができる。

本実施形態においては、例えば、励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃや対物レンズ２５等の光学素子、あるいはレーザユニット１０から発生させるレーザ光の波長等を変更すると、超解像演算部３１が蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置を算出し、制御部３３により蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置に基づいてアレイ型検出器２９のＸＹ方向の位置を調整することが望ましい。

励起ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃや対物レンズ２５あるいはレーザ光の波長を変更すると、蛍光のコンフォーカルスポットと各微小検出素子３０との位置関係がずれる場合があるが、このようにすることで、対物レンズ２５等やレーザ光の波長を変更した場合に超解像演算部３１により蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置を自動的に算出して、制御部３３により蛍光のコンフォーカルスポットの位置と各微小検出素子３０の位置とを合致させることができる。したがって、変更後の対物レンズ２５等やレーザ光の波長により、所期の超解像効果を有する画像を簡易かつ精度よく生成することができる。

本実施形態においては、アレイ型検出器２９のＸ方向およびＹ方向の位置を調整することとしたが、これに代えて、例えば、制御部３３により、ＯＮする微小検出素子３０の選択範囲を調整することとしてもよい。この場合、超解像演算部３１により算出された蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置が選択範囲の中央の微小検出素子３０の位置に合致するように、制御部３３によりＯＮする微小検出素子３０の選択範囲を調整することとすればよい。

また、本実施形態においては、超解像演算部３１が、蛍光の強度が最も強くなる微小検出素子３０に蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置が配置されていると判断することとしたが、例えば、超解像演算部３１が、蛍光のコンフォーカルスポットにおける強度分布の加重平均を算出し、該当する微小検出素子３０に蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置が配置されていると判断することとしてもよい。

また、超解像演算部３１が蛍光のコンフォーカルスポットの強度分布をあらかじめ記憶しておき、各微小検出素子３０の強度分布と照合して蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置を算出することとしてもよい。このようにすることで、蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置を微小検出素子単位よりも細かく推定して、蛍光のコンフォーカルスポットとアレイ型検出器２９の各微小検出素子３０とをより高精度に位置合わせすることができる。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡２００は、図６に示すように、ガラス板からなるビーム偏向板（平行平面ガラス）３７を備え、ビーム偏向板３７の制御により、蛍光のコンフォーカルスポットとアレイ型検出器２９とを相対移動させる点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

ビーム偏向板３７は、互いに板厚方向に平行に間隔を空けて配された均一な一定の厚さを有する一対のガラス板により構成されており、共焦点レンズ２７とアレイ型検出器２９との間の光路上に配置されている。

このビーム偏向板３７は、例えば、図示しないモータにより、Ｘ軸回りおよびＹ軸回りに角度を変更することができるようになっている。また、ビーム偏向板３７は、蛍光の入射角度を変えることにより、透過させる蛍光を入射角度に応じて平行移動させることができるようになっている。

制御部３３は、ビーム偏向板３７をＸ軸回りおよびＹ軸回りに角度を変更して蛍光の入射角度を変えることにより、アレイ型検出器２９に入射させる蛍光のコンフォーカルスポットの位置をＸ方向およびＹ方向にずらすようになっている。そして、制御部３３は、超解像演算部３１により算出された蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置に従って、蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置とアレイ型検出器２９の中心位置とが合致するようにビーム偏向板３７のＸ軸回りおよびＹ軸回りの角度を調整するようになっている。

このような構成によれば、アレイ型検出器２９に入射する蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置がアレイ型検出器２９の中央に配された微小検出素子３０からずれている場合は、制御部３３により、超解像演算部３１によって算出された蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置とアレイ型検出器２９の中央の微小検出素子３０の位置とが合致するようにビーム偏向板３７のモータが駆動される。

これにより、ビーム偏向板３７のＸ軸回りおよびＹ軸回りの角度が調整されて蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置がアレイ型検出器２９の中央の微小検出素子３０に移動し、蛍光のコンフォーカルスポットとアレイ型検出器２９の各微小検出素子３０とが位置合わせされる。

したがって、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡２００によれば、制御部３３によりビーム偏向板３７の角度を変更するだけで、アレイ型検出器２９に入射する蛍光のコンフォーカルスポットを移動させて、蛍光のコンフォーカルスポットの中心位置とアレイ型検出器２９の中心位置とを容易に合致させることができる。

本実施形態においては、ビーム偏向板３７を収差補正しておくことが望ましい。このようにすることで、ビーム偏向板３７の非球面収差によって蛍光の形状が僅かに変化する場合であっても、その影響を回避することができる。

〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡３００は、図７に示すように、共焦点レンズ２７によって集光された蛍光の光束を制限する共焦点ピンホール３９と、共焦点ピンホール３９を通過した蛍光を集光して結像し、アレイ型検出器２９に蛍光のコンフォーカルスポットを再投影する再投影レンズ４１とを備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

共焦点ピンホール３９は、標本Ｓの観察面と共役な位置に配置されている。また、共焦点ピンホール３９は、共焦点レンズ２７により焦点位置に投影される蛍光のコンフォーカルスポットよりも若干大きい開口を有しており、標本Ｓにおけるレーザ光の焦点面外からの迷光のような光は遮断することができるようになっている。

このように構成された走査型レーザ顕微鏡３００によれば、共焦点レンズ２７より集光された蛍光は、共焦点ピンホール３９を通過した後、再投影レンズ４１により集光されてアレイ型検出器２９に入射する。これにより、標本Ｓにおけるレーザ光の焦点面外からの光を遮断して、アレイ型検出器２９に再投影された標本Ｓにおけるレーザ光の焦点面から発生した蛍光のみを各微小検出素子３０により検出して標本Ｓの画像を生成することができる。
本実施形態においては、第２実施形態と同様に、ビーム偏向板３７を用いて、蛍光のコンフォーカルスポットとアレイ型検出器２９とを相対移動させることとしてもよい。

また、本実施形態においては、図示しないターレット等により、開口径が異なる複数の共焦点ピンホール３９を蛍光の光路上に選択的に配置することができるようにしてもよい。このようにすることで、対物レンズ２５やレーザ光の波長の切り替えに合わせて光路に配置する共焦点ピンホール３９を変更し、結像条件を最適化することができる。

また、本実施形態は共焦点ピンホール３９を採用することとしたが、これに代えて、例えば、図８に示すように、共焦点レンズ２７により焦点位置に投影される蛍光のコンフォーカルスポットよりも若干大きい開口を有し、標本Ｓにおけるレーザ光の焦点面外からの迷光のような光は遮断する絞り４３を採用することとしてもよい。

この場合、絞り４３は、アレイ型検出器２９の直前の光路上に配置することとすればよい。このようにすることで、絞り４３により、共焦点ピンホール３９を用いた場合と同様の効果を奏することができる。本実施形態は、絞り４３とアレイ型検出器２９のサイズに差がある場合に有効である。

本変形例においては、絞り４３は、開口径が調節可能であることが好ましい。このようにすることで、対物レンズ２５やレーザ光の波長の切り替えに合わせて絞り４３の開口径を変更し、結像条件を最適化することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、上記各実施形態においては、検出部として、ＣＭＯＳイメージセンサやＣＣＤイメージセンサのようなアレイ型検出器２９を例示して説明したが、これに代えて、例えば、浜松ホトニクス（株）製のＨ８７１１（４×４の検出素子）やＨ７５４６（８×８の検出素子）のような複数の検出素子を有するマルチアノードＰＭＴ（光電子増倍管）を採用することとしてもよい。検出部が３×３個以上の検出素子を有する場合は、蛍光を検出させる検出素子が円形に近い配置となるようにＯＮする検出素子を選択することが望ましい。

１Ａ Ａｒレーザ装置（光源）
１Ｂ ＨｅＮｅ−Ｇレーザ装置（光源）
１Ｃ ＨｅＮｅ−Ｒレーザ装置（光源）
１７ ガルバノスキャナ（走査部）
２５ 対物レンズ
２９ アレイ型検出器（検出部）
３０ 微小検出素子（検出素子）
３１ 超解像演算部（算出部）
３３ 制御部
３７ ビーム偏向板（平行平面ガラス）
１００，２００，３００ 走査型レーザ顕微鏡
Ｓ 標本

Claims (6)

1. 光源から発せられたレーザ光を標本上で走査させる走査部と、
   該走査部により走査されたレーザ光を前記標本に照射する一方、該標本からの戻り光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配列されたＯＮ／ＯＦＦを個々に切り替え可能な複数の検出素子を有する検出部と、
   該検出部のＯＮ状態の各前記検出素子から出力される光強度信号を比較し、前記戻り光の強度が最も強くなる検出素子に前記戻り光のスポットの中心位置が配置されているものと判断して、前記検出部に入射する前記戻り光のスポットの中心位置を算出する算出部と、
   該算出部により算出された前記スポットの中心位置と前記検出部におけるＯＮ状態の選択範囲の中心の前記検出素子とが合致するように、ＯＮ状態に切り替える前記検出素子の選択範囲を調整する制御部とを備える走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記検出部が、奇数×奇数の前記検出素子を有する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記算出部が、前記対物レンズまたはレーザ光の波長を変更した場合に前記戻り光のスポットの中心位置を算出する請求項１または請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 光源から発せられたレーザ光を走査部により走査させて対物レンズにより標本上に照射し、
   前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に２次元的に配列されたＯＮ／ＯＦＦを個々に切り替え可能な検出器アレイの複数の微小検出素子により前記標本からの戻り光を検出し、
   前記検出器アレイのＯＮ状態の各前記微小検出素子の出力を比較して、戻り光の強度が最も強くなる前記微小検出素子に戻り光のスポットの中心位置が配置されているものと決定し、
   前記検出器アレイのＯＮ状態に切り替える前記微小検出素子の選択範囲を調整して、前記スポットの中心位置と前記検出器アレイにおけるＯＮ状態の前記選択範囲の中心の前記微小検出素子とを一致させ、
   前記走査部による前記レーザ光の走査に従い、異なる検出タイミングで異なるＯＮ状態の前記微小検出素子により検出された同一の前記標本位置からの戻り光の光強度信号どうしを合算して前記標本の超解像画像を生成する超解像画像生成方法。
5. 前記検出器アレイが、奇数×奇数の前記検出素子を有する請求項４に記載の超解像画像生成方法。
6. 前記対物レンズまたは前記レーザ光の波長を変更した場合に前記戻り光のスポットの中心位置を算出する請求項４または請求項５に記載の超解像画像生成方法。

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