JP7003056B2 - 試料を結像する顕微鏡および方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料を結像する顕微鏡に関し、この顕微鏡は、試料上へ照明光を送出するための照明ユニットと、試料から生じた検出光を検出するための検出器と、照明ユニットから送出された照明光を試料へ焦点合わせし、かつ試料から生じた検出光を検出器上へ焦点合わせするための光学系と、照明光で試料をスキャンするためのスキャンユニットと、を含んでいる。さらに本発明は、顕微鏡を用いて試料を結像する方法に関する。

特に蛍光顕微鏡では近年、試料が面状または線状に拡げられた光分布によって照明される顕微方法が用いられている。これに対する例は、ＳＰＩＭ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＯＰＭ（Ｏｂｌｉｑｕｅ Ｐｌａｎｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）およびＳＣＡＰＥ（Ｓｗｅｐｔ Ｃｏｎｆｏｃａｌｌｙ－Ａｌｉｇｎｅｄ Ｐｌａｎａｒ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）の名称で知られている顕微方法である。例えばＳＰＩＭ顕微鏡では、照明光束が、例えばシリンダーレンズを用いて、１方向においてのみ焦点合わせされ、ひいては拡張される。これによって、試料は、試料内で、１つの試料面だけを照明するライトシートによって照明される。ＳＰＩＭ顕微鏡は、照明と検出のために、試料側に２つの別個の対物レンズを有している。これら対物レンズの光軸は相互に垂直に延在している。結像されるべき試料面は、検出対物レンズの光軸に対して垂直に位置している。この試料面の照明は、照明対物レンズが、検出対物レンズの光軸に対して垂直に、試料へ放射するライトシートによって行われる。

これに対して、ＳＣＡＰＥ方法では、唯一の、試料側の対物レンズが、照明のためにも、検出のためにも使用される。照明は、対物レンズの光軸に対して傾斜して位置するライトシートによって行われる。ライトシートがこのように傾斜しているために、ＳＣＡＰＥ顕微鏡は通常、対物レンズと共に作用する、相互に傾斜している部分光学系を備えた正立光学系（Ａｕｆｒｉｃｈｔｕｎｇｓｏｐｔｉｋ）を有している。これらの部分光学系は、中間結像を介して、傾斜しているライトシートによって照明された試料領域が、正しい姿勢で、検出器上へ結像されるように、作用する。

上述したＳＰＩＭ方法、ＯＰＭ方法およびＳＣＡＰＥ方法をより詳細に説明するために、例えば、刊行物である、Ｋｕｍａｒ，Ｓ．等著「Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ２Ｄ ａｎｄ ３Ｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ（Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ １９， １３８３９ （２０１１））」、Ｄｕｎｓｂｙ，Ｃ．著「Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ ｏｂｌｉｑｕｅ ｐｌａｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ １６， ２０３０６－２０３１６ （２００８））」およびＢｏｕｃｈａｒｄ，Ｍ．Ｂ．等著「Ｓｗｅｐｔ ｃｏｎｆｏｃａｌｌｙ－ａｌｉｇｎｅｄ ｐｌａｎａｒ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ （ＳＣＡＰＥ） ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｎａｔ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ９， １１３－１１９ （２０１５））」ならびに特許文献である、米国特許第８５８２２０３号明細書（US 8582203 B2）および米国特許第８６１９２３７号明細書（US 8619237 B2）を参照されたい。

正立光学系がなくてもよい、類似の顕微方法は、いわゆるＨＩＬＯ（Ｈｉｇｌｙ Ｉｎｃｌｉｎｅｄ Ａｎｄ Ｌａｍｉｎａｔｅｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｈｅｅｔ）方法である。これに関しては、Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｍ．、Ｉｍａｍｏｔｏ，Ｎ．およびＳａｋａｔａ－Ｓｏｇａｗａ，Ｋ．著「Ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｃｌｉｎｅｄ ｔｈｉｎ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｃｅｌｌｓ（Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ５， １５９－１６１ （２００８））」を参照されたい。

独国特許発明第１０２０１１０００８３５号明細書（DE 10 2011 000 835 B4）では、試料の傾斜照明のためのライトシートが、スキャンユニットによって生成される。このスキャンユニットは、照明対物レンズの後方の焦点面に対して共役関係にある面に存在している。検出されるべき蛍光は、対物レンズとスキャンユニットとの間で取り出される。

従来技術に関して、最後に、国際公開第２０１５／１０９３２３号（WO 2015/109323 A2）を参照されたい。これはとりわけ、検出されるべき蛍光の分離のためにダイクロックミラーが、光方向において、スキャンミラーの後ろに配置されており、これによって蛍光がスキャンミラーによって直接的にデスキャン（ｅｎｔｓｃａｎｎｔ）される顕微鏡構造を示している。このような構造は、実質的に、点走査方式共焦点顕微鏡の構造に相当する。しかしこれは、点走査方式共焦点顕微鏡の構造と、一方では、照明ビームが弱く焦点合わせされ、傾斜して、試料へ向けられているという点で異なっている。他方では、傾斜した、対物レンズの焦点面の方へ延在するラインフォーカスから集められた蛍光が、正立光学系によって起こされる。これによって、画像情報が、照明された線に沿って、ラインセンサによって得られる。スキャンミラーは、照明ビームによる試料のスキャンにも、検出された蛍光のデスキャンにも使用されるので、位置固定された検出器が使用可能である。

上述した、従来技術から既知の方法は、それぞれ、所定の時点での個々の試料平面の検出だけを予定している。したがって、拡げられた試料体積体を結像するのには比較的多くのコストがかかる。さらに、個々の試料面への照明光の集約によって、これらの方法の幾つかにおいては、蛍光色素分子の不所望な飽和が生じてしまい得る。

本発明の課題は、効率が良く、かつダメージの少ない体積体画像化を可能にする、試料を結像する顕微鏡および方法を提供することである。

本発明は、独立請求項に記載された構成要件によって、上述の課題を解決する。有利な発展形態は、従属請求項に記載されている。

本発明の顕微鏡は、照明光を試料へ送出するための照明ユニットと、試料から生じた検出光を検出するための検出器と、照明ユニットから送出された照明光を試料へ焦点合わせし、かつ試料から生じた検出光を検出器上へ焦点合わせするための光学系と、照明光によって試料をスキャンするためのスキャンユニットとを有している。照明ユニットは、照明光を、複数の別個の照明光束の形態で、次のようにスキャンユニット上へ送出するように構成されている。すなわち、照明光束が、試料のスキャン時に同時に、空間的に相互に別個にされている試料領域へ焦点合わせされるように、照明光をスキャンユニット上へ送出するように構成されている。検出器は、検出光を、別個の、空間的に相互に別個にされた、線状またはストリップ状の試料領域から生じた検出光束の形態で、同時に、かつ空間的に相互に別個に検出するように構成されている。

本発明は複数の、空間的に相互に別個にされた試料領域を同時に照明し、かつ空間的に相互に別個に検出することを可能にする。このために、検出器は、空間的に相互に別個にされた試料領域に割り当てられている、いわば別個の検出チャネルを有している。試料内での検出光束の分割は、次のように選択されている。すなわち、自身に割り当てられている検出チャネルからの検出光が、別の検出チャネルに対してクロストークすることが、確実に回避されるように選択されている。このようなクロストークは、個々の画像において、ノイズとなる信号バックグラウンドを高め、これによって、画像コントラストを低減させてしまう。試料から生じた検出光を検出器上へ焦点合わせする本発明の光学系が、照明される各試料領域に対して、点拡がり関数、略してＰＳＦの形態の検出体積体を規定するということに基づくと、試料内での所望の光束分割は、このＰＳＦを考慮して、適切に定められる。

本発明の顕微鏡は、従来のＳＰＩＭ顕微鏡の様式にしたがっても、従来のＳＣＡＰＥ顕微鏡またはＯＰＭ顕微鏡の様式にしたがっても動作させることができ、ここでの相違は、所定の時点で、唯一の、つながっている試料領域だけでなく、複数の、空間的に相互に別個にされている試料領域が照明される、ということである。特に、照明光束は、複数のライトシートを生成するためにも使用される。これらのライトシートは、試料を、種々の試料面において同時に照明する。例えば、ライトシートを、観察される試料面内に、スキャンユニットによってシーケンシャルに形成することが可能である。これにしたがって、観察される試料面において、検出器はライトシートを形成する、つながっている光分布の形態の、動かされる照明光束を「見る」。検出光の空間的に別個の検出は、この場合には、種々の試料面に関してのみ行われ、観察される１つの試料面内では行わない。

照明光の本発明に相応する分布は有利には、ダメージの少ない試料照明に利用され、これによって特に、蛍光色素分子の不所望な飽和が回避される。

有利には、照明ユニットとスキャンユニットと光学系とは、照明光束が試料内で、相互の平行オフセットを有するように、共に作用する。

このような平行オフセットは、光学系内に含まれている検出対物レンズの光軸に対して垂直に位置する第１の軸に沿った第１の平行オフセットおよび／または検出対物レンズの光軸に対して垂直に位置する第２の軸に沿った第２の平行オフセットを含み得る。ここで第１の軸と第２の軸とは、相互に垂直に配向されている。試料内で相互に平行にずらされている照明光束によって、検出器を、比較的容易な方法で、所望の、空間的に相互に別個にされた、検出光束の検出が可能であるように構成することができる。

有利な実施形態では、スキャンユニットは、試料を照明光束で、光学系内に含まれている検出対物レンズの光軸に対して垂直に位置する第１の軸に沿ってスキャンするように、かつ／または検出対物レンズの光軸に対して垂直に位置する第２の軸に沿ってスキャンするように構成されている。ここで第１の軸と第２の軸とは、相互に垂直に配向されている。このような実施形態では例えば、上述した様式での所定の試料面内の第１の軸に沿ったスキャン運動によってそれぞれ、ライトシートを形成することが可能であり、また第２の軸に沿ったスキャン運動によって、このように形成されたライトシートが引き続いて、試料内でシフトされる。これは、特に効率の良い体積体画像化を可能にする。

有利な実施形態では、スキャンユニットは、スキャンミラーを含んでいる。ここでこのスキャンミラーは第２の軸を中心に傾斜可能であり、これによって試料は、照明光束によって、第１の軸に沿ってスキャンされ、かつ／またはスキャンミラーは第１の軸を中心に傾斜可能であり、これによって試料は、照明光束によって、第２の軸に沿ってスキャンされる。スキャンミラーとして、例えば、ガルバノミラー（例えばカルダン式懸架装置を有する）または微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）ミラーが１Ｄまたは２Ｄのスキャナーとして使用される。個々のスキャンミラーの代わりに、択一的に、２つまたは２つよりも多くのミラーの組み合わせも使用される。しかし本発明は、このようなスキャンユニットに制限されない。例えば、音響光学偏向器（ＡＯＤ）の使用も考えられる。当然ながら、上述した複数の技術の組み合わせも実行可能である。

特に有利な実施形態では、光学系は、対物レンズを１つだけ含んでいる。この対物レンズは、照明ユニットから送出された照明光束を試料へ焦点合わせするための照明対物レンズと、試料から生じた検出光束を検出器上へ焦点合わせするための検出対物レンズと、を同時に形成する。このような実施形態では、本発明の顕微鏡は、ＳＣＡＰＥ顕微鏡またはＯＰＭ顕微鏡の様式で動作され得る。

有利にはスキャンユニットは付加的に、検出器上へ焦点合わせされた検出光束をデスキャンするように構成されている。「デスキャン」とは、ここでは、試料から生じた検出光を唯一の試料側の対物レンズによって、検出器へ入射する前に、既に照明光に作用しているスキャンユニットに戻すことである。検出光をこのようにスキャンユニットに戻すことによって、スキャンユニットによって、照明光に伝わるスキャン運動が、検出光に関して、対向作用の主旨で、相殺される。この結果、特に有利には、検出光の検出のために、位置が固定された検出器が使用可能になる。

有利には、照明ユニットとスキャンユニットとは、照明光束同士が第２の軸を中心に傾斜されて、対物レンズの入射瞳に入射し、これによって、試料において、第１の軸に沿った第１の平行オフセットが生起されるように共に作用し、かつ／または、照明ユニットとスキャンユニットとは、照明光束同士が第２の軸を中心に相互に傾斜されて、対物レンズの入射瞳に入射し、これによって、試料において、第２の軸に沿った第２の平行オフセットが生起されるように共に作用する。したがって対物レンズ瞳における照明光束の傾斜は、対物レンズから出た照明光束を、対物レンズの光軸に対して横方向にシフトさせる。

有利な実施形態では、照明ユニットとスキャンユニットとは、照明光束がそれぞれ、対物レンズの入射瞳の中心を外れた部分領域だけを照明するように共に作用する。対物レンズ瞳のこのような中心を外れた照明は、対物レンズの光軸に対して相対的な、対物レンズから出た照明光束の傾斜を生じさせる。

有利には、検出光の伝搬方向においてスキャンユニットに後続配置されている正立光学系には、中間像を生成するための第１の部分光学系と、検出器上に中間像を正しい姿勢で結像するための、第１の部分光学系に対して傾斜されている第２の部分光学系とが設けられている。したがって正立光学系は、傾斜照明のもとで対物レンズによって結像される試料領域を起こすために用いられる。

別の有利な実施形態では、光学系は２つの別個の対物レンズを含んでおり、これらの対物レンズのうちの一方は、照明ユニットから送出された照明光束を試料へ焦点合わせするための照明対物レンズを構成し、これらの対物レンズのうちの他方は、試料から生じた検出光束を検出器上へ焦点合わせするための検出対物レンズを構成する。このような実施形態では、本発明の顕微鏡は、ＳＰＩＭ顕微鏡の様式で動作され得る。

有利にはこのような実施形態では、照明対物レンズの光軸と検出対物レンズの光軸とは、相互に垂直に位置している。照明対物レンズから、試料へ焦点合わせされる照明光束は、有利には、照明対物レンズの光軸に対して平行に延在し、ひいては検出対物レンズの光軸に対して垂直に延在する。

特に有利な構成では、照明光束によって照明される試料領域は、複数の、有利には相互に平行にずらされた試料面に位置する。種々の試料面から同時に画像データが得られることによって、体積体画像化の効率が特に良くなる。

有利には検出器は、それぞれ試料面のうちの１つに割り当てられている複数の部分検出器を含んでおり、ここで、各部分検出器は、この部分検出器に割り当てられている試料面から生じた検出光束を検出する。これらの部分検出器は、検出光束の空間的に別個の検出を可能にする別個の検出チャネルを形成する。

有利には、部分検出器は、検出器の前に配置されている検出光学系の被写体深度領域に配置されている。ＳＣＡＰＥ用途では、検出光学系は、例えば、正立光学系によって形成されている。このような実施形態では、検出器をワンピースの面状検出器の形態で形成することが可能である。この面状検出器は、部分検出器を形成する、複数の線状またはストリップ状検出器領域を有している。

択一的な実施形態では、検出器の前に配置されている、光路長に影響を与えるための少なくとも１つの要素が設けられており、これは試料面のずれを補償する。

上述した要素は例えばガラスブロックであり、これは照明光束のずれを、検出対物レンズの光軸に沿って補償し、これによって、照明される各試料面の鮮明な画像が得られる。このような実施形態においても、ワンピースの面状検出器の使用が可能である。

別の有利な構成では、検出器は、部分検出器を形成する複数のライン検出器を含んでいる。このような構成は、試料内の照明光束の軸方向のオフセットが考慮されているように、ライン検出器を検出対物レンズの光軸に沿って配置することを可能にする。

各個々の照明光束に対して、割り当てられたライン検出器上での鮮明な結像に対して寄与する、適した光学系を設けることも可能である。ここで、試料内での照明光束の軸方向のオフセットが、典型的に、僅か数マイクロメータの範囲にあり、したがって結像エラー、特に球面収差の修正が通常は不必要になるほど小さい、ということを指摘しておく。

択一的な実施形態では、照明光束によって照明される試料領域は、唯一の試料面にだけ位置していてもよい。このような場合には、試料は、１つの試料面においてのみ、照明光束によってスキャンされる。これによって、極めて迅速なシーケンスで、このような唯一の試料面の画像を作成することが可能である。このような試料面の個々の撮影の間の時間は、画像領域全体を複数回連続して結像するために個々のカメラが必要とするであろう時間よりも格段に短い可能性がある。むしろ、個々の撮影の間の時間は、個々の試料面の照明に必要な時間よりも格段に短い。このような構成では、例えば、極めて迅速に経過するプロセスを結像すべき画像シーケンスが撮影される。例えばＰＩＶ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｉｍａｇｅ Ｖｅｌｏｃｉｍｅｔｒｙ）顕微鏡から、技術的に極めてコストの高いダブルパルスシステムが既知であり、ここでは、２つの極めて強い光パルスを短時間の連続で送出する高価なレーザーが使用される。カメラはこれに相応して、２つの画像を撮影する。しかしカメラとレーザーによって形成されるこのシステムは、このようなダブルパルスの後にそれぞれ、長い休止を必要とし、その後、別の画像対が撮影可能になる。このような技術は、フロープロファイルの分析に対しては極めて価値が高いが、これは、フローバランス内になければならない。なぜなら、全体的なフロープロファイルは、多数の画像対からのみ得られるからである。上述した実施形態において、本発明の顕微鏡は、例えば、極めて迅速なプロセスを相応に観察するために、生物医学的研究において使用可能である。

照明ユニットは、別個の照明光束を送出する光源を１つだけ有していてよい。しかし同様に、各照明光束に対して、固有の光源を設けることが可能である。これによって、個々の照明光束間のコヒーレンスが回避される。

有利には照明ユニットは、異なる波長で照明光束を送出するように構成されている。これらの異なる波長は、相応に別個にされて、唯一の幅の広い光源から生じても、または種々の光源から生じてもよい。このような構成では例えば、その蛍光が単純なフィルタによってスペクトル的に分離可能である種々の蛍光色素分子を照明光束が励起するように、強く、照明光束の波長を相互にずらすことが可能である。このような場合には、これらの照明光束が、必ずしも、スキャン方向に沿って（照明光束の伝搬方向に対して垂直な試料面において）ずらされている、または種々の試料面において延在する必要はない。

有利な構成では、検出器はＴＤＩ（Ｔｉｍｅ Ｄｅｌａｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）ラインカメラを含んでいる。このようなＴＤＩラインカメラは、隣接して位置している複数のセンサラインから成り、動かされる対象物の時間遅延された多重照明を可能にする。各照明周期の終わりに、これまで生成された電荷が、ライン毎に、それぞれ次に高いラインへ移動される。後続の照明周期の間、さらなる電荷がこれに加わる。これは足し合わされ、ラインからラインへ転送され、最終的に、センサラインの数に相当する数の照明の後に、信号として送出される。このコンテキストでは、このようなＴＤＩラインカメラは、シングルラインセンサの使用に頼ることなく、検出光束のライン状の検出を実行するために使用される。例えば、検出光束は通常、シングルラインセンサの個々のピクセルラインよりも幅が広いので、これらのピクセルラインは、検出光束によって明確に照らされる。シングルラインセンサとは異なり、ＴＤＩラインカメラによって、検出信号の不鮮明化が生じることなく、検出光束の全体的な幅を捕捉することが可能である。特に、このために、徐々にスキャンされる必要はない。むしろ、ＴＤＩラインカメラによって、継続的なスキャンが可能である。

有利には、スキャンユニットと光学系とで、テレセントリック系を形成する。

本発明の別の態様では、顕微鏡を用いて試料を結像する方法が提示される。このような方法は特に、ＳＰＩＭ方法、ＯＰＭ方法またはＳＣＡＰＥ方法の様式にしたがって適用されるべきである。２光子励起のためのパルス状のレーザーと組み合わせることも可能である。

本発明を以降で、実施例に基づいて、図面を参照してより詳細に説明する。

比較例としての従来のＳＣＡＰＥ顕微鏡 別の目線からの、図１に示された従来のＳＣＡＰＥ顕微鏡 第１の実施例である、ＳＣＡＰＥ顕微鏡の様式で動作する、本発明の顕微鏡 別の目線からの、本発明の顕微鏡の第１の実施例 第１の実施例において、照明光束によって照明された試料領域が検出器上へ、どのように結像されるのかを視覚化するための概略図 別の目線からの、図５に相応する概略図 本発明の顕微鏡の第２の実施例において、照明光束によって照明された試料領域が検出器上へ、どのように結像されるのかを視覚化するための概略図 別の目線からの、図７に相応する概略図 本発明の顕微鏡の第３の実施例において、照明光束によって照明された試料領域が検出器上へ、どのように結像されるのかを視覚化するための概略図 別の目線からの、図９に相応する概略図 光束の別の幾何学形状的な図を伴う、図９に相応する概略図 光束の別の幾何学形状的な図を伴う、図１０に相応する概略図 ＳＣＡＰＥ顕微鏡の様式で動作する本発明の顕微鏡を実現するための、例示的な機能コンポーネントを伴うブロック図 ＳＰＩＭ顕微鏡の様式で動作する本発明の顕微鏡を実現するための、例示的な機能コンポーネントを伴うブロック図

図１および図２に基づいて、従来のＳＣＡＰＥ顕微鏡１０の構造を説明する。以降では、本発明の実施例の説明のために、これを参照する。図１および図２ならびに全ての別の図ではそれぞれ、軸ｘ、ｙおよびｚを伴う直交座標系が引き合いに出される。

図１および図２に示されているように、ＳＣＡＰＥ顕微鏡１０は、照明光束１６を送出する光源１４を備える照明ユニット１２を含んでいる。照明光束１６は、ミラー１８上に入射する。ミラー１８は照明光束１６を、２Ｄスキャンミラー２０の方向に反射する。例示的にガルバノミラーまたはＭＥＭＳミラーとして構成されているスキャンミラー２０は、ｘ軸を中心にしても（図１において、図平面に対して垂直）、ｙ軸を中心にしても（図２において、図平面に対して垂直）、図示されていない駆動部によって傾斜可能である。スキャンミラー２０で反射された照明光束１６は、光学系２２に達する。光学系２２は、スキャンレンズ２４、チューブレンズ２６および対物レンズ２８から構成されている。スキャンミラー２０は、対物レンズ２８の後方の焦点面に対して共役関係にある面に位置している。スキャンミラー２０と光学系２２とで、テレセントリック系を形成する。

図１に示されているように、照明光束１６がｙ軸に沿ってオフセットされて、対物レンズ２８に入射するように、照明光束１６がスキャンミラー２０に入射する。照明光束１６はしたがって、対物レンズ２８の入射瞳の中心を外れた部分領域だけを照明する。したがって照明光束は、試料３０内で、対物レンズ２８の光軸に対して傾斜して伝播する。したがって照明光束１６は、試料３０を、図１で参照符号Ａが付けられている線状領域またはストリップ領域に沿って照明し、ここで蛍光ビームを放射するように試料３０を励起する。図を見易くするために、試料３０は図１にしか示されていない。

蛍光ビームによって得られ、図１および図２において、参照番号３２が付けられている検出光束は同様に、対物レンズ２８に達する。したがって対物レンズ２８は、照明対物レンズとしても、検出対物レンズとしても機能する。検出光束３２は、チューブレンズ２６およびスキャンレンズ２４を通過した後、スキャンミラー２０に入射する。スキャンミラー２０は、検出光束３２を次のように反射する。すなわち、検出光束が、ミラー１８を通過し、正立光学系３４に達するように反射する。正立光学系３４は、第２の対物レンズ３６と、第３の対物レンズ３８と、ライン検出器４２が後置されているチューブレンズ４０と、を含んでいる。スキャンミラー２０へ戻すことによって、検出光束３２は、共焦点顕微鏡の場合のようにデスキャンされる。このようにして、照明された試料領域Ａは、中間結像の経路において、正立光学系３４において、位置固定されたストリップＡ’へ結像される。ストリップＡ’は、図１および図２において参照番号４４が付けられている、光学系２２の焦点面に対して光学的に共役関係にある面４３に対して傾斜されている。

図１に示されているように、正立光学系３４は、対物レンズ３６の形態の第１の部分光学系ならびにこれに対して傾斜されている第２の部分光学系を含んでいる。この第２の部分光学系は、対物レンズ３８とチューブレンズ４０とから形成されている。これらの相互に傾斜された２つの部分光学系３６もしくは３８、４０によって、ストリップＡ’は、正しい姿勢で、ライン検出器４２上へ結像される。スキャンミラー２０のデスキャンする作用によって、さらに、照明された試料領域Ａが位置固定された中間画像Ａ’を介して、位置が固定されて、ライン検出器４２上へ結像されることが保証される。

図２における検出ビーム路の図は著しく簡略化されている、ということを指摘しておく。実際には、スキャンミラー２０と対物レンズ３６との間に位置する、検出ビーム路の部分は、図２の図平面に対して垂直に延在しており、またライン検出器４２の方向においてこれに続く、検出ビーム路の部分は、図２の図平面から傾斜して延在している。

図３および図４には、図１および図２に示されたＳＣＡＰＥ顕微鏡１０の、本発明に相応する発展形態である顕微鏡５０が示されている。本発明の顕微鏡５０は、従来のＳＣＡＰＥ顕微鏡１０に対して、次のことに関して変更されている。すなわち、所定の時点で、試料が唯一の照明光束だけによってスキャンされるのではなく、複数の、空間的に相互に別個にされた照明光束によってスキャンされるということに関して変更されている。従来のＳＣＡＰＥ顕微鏡１０の機能コンポーネントと一致している、顕微鏡５０の機能コンポーネントには、図１および図２において使用された参照番号が付けられており、以降で再度説明されない。

図３および図４に示された実施例では、光源１４は、３つの照明光束５２、５４および５６を送出する。見やすくするために、照明光束５２、５４および５６は、図３および図４において、その主要ビームの形態でのみ、示されている。

照明光束５２、５４、５６は、レンズ４６を通過して、ミラー１８によって反射され、ミラー１８から、スキャンミラー２０上へ結束される。図３に示されているように、照明光束５２、５４、５６が、スキャンレンズ２４およびチューブレンズ２６を通過した後、ｙ軸に沿って相互に傾斜して、対物レンズ２８の入射瞳に達するように、照明光束５２、５４、５６は相互に傾斜して、スキャンミラー２０上へ入射する。ｙ軸に沿ったこの傾斜によって、照明光束５２、５４、５６は、試料内で、ｘ軸に沿った第１の平行オフセットを有する（図５および図６を参照）。さらに、照明光束は、図４に示されているように、スキャンミラー２０で次のように反射される。すなわち、照明光束が、スキャンレンズ２４およびチューブレンズ２６を通過した後に、ｘ軸に沿って相互に傾斜して、対物レンズ２８の入射瞳に入射するように反射される。

このような傾斜によって、照明光束５２、５４、５６は試料内で、ｙ軸に沿った第２の平行オフセットを有する（図５および図６を参照）。

スキャンミラー２０がｘ軸を中心に傾斜されることによって、試料は照明光束５２、５４、５６によって、ｙ軸に沿ってスキャンされる。これに相応して、スキャンミラー２０がｙ軸を中心に傾斜される場合に、試料は、照明光束５２、５４、５６によって、ｘ軸に沿ってスキャンされる。

照明光束５２は、試料内で、ストリップ状の試料領域Ｂを照明する。これに相応して、照明光束５４はストリップ状の試料領域Ｃを照明し、照明光束５６はストリップ状の試料領域Ｄを照明する。照明された試料領域Ｂ、ＣおよびＤから生じる蛍光ビームは、別個の検出光束５８、６０もしくは６２の形態で、対物レンズ２８、チューブレンズ２６およびスキャンレンズ２４を通過した後、スキャンミラー２０に戻る。スキャンミラー２０は、検出光束５８、６０および６２を正立光学系３４へ反射する。ここで、照明光束５２、５４および５６によって照明された試料領域の中間像が生成される。これらは、光学系２２の焦点面４４に対して共役関係にある面４３に対して傾斜されている。図３に示された簡略化された図では、この中間像に参照符号Ｂ’、Ｃ’もしくはＤ’が付けられている。

顕微鏡５０は、３つのラインセンサ６６、６８、７０から形成されている検出器７１を有しており、この検出器７１は、光束５８、６０もしくは６２を検出する。ここで、中間像Ｂ’は、正しい姿勢でラインセンサ６６上へ結像され、中間像Ｃ’は、正しい姿勢でラインセンサ６８上へ結像され、中間像Ｄ’は、正しい姿勢でラインセンサ７０上へ結像される。図３および図４に示されているように、ラインセンサ６６、６８および７０は、試料内の照明された試料領域Ｂ、ＣおよびＤ、およびこれに相応して中間像Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’が有しているオフセットに相応して、相互にオフセットされている。

図５および図６には再び、照明光束５２、５４、５６によって照明されたストリップ状の試料領域Ｂ、ＣもしくはＤが、検出光束５８、６０もしくは６２の形態で、ラインセンサ６６、６８もしくは７０上へ、どのように結像されるのかが視覚化されている。ここで図５は図３に対応し、図６は図４に対応する。正立光学系３４が暗示されているだけの図５および図６は、特に、ラインセンサ６６、６８および７０が軸方向に、すなわちｚ軸もしくは対物レンズ２８の光軸Ｏに沿っても、横方向に、すなわちｘ軸に沿っても、相互にオフセットされて配置されていることを示している。図５および図６にはさらに、スキャン方向が暗示されており、このスキャン方向において、照明光束５２、５４、５６が、スキャンミラー２０の傾斜によって動かされる。スキャンミラー２０がｘ軸を中心に傾斜されると、照明光束５２、５４および５６が、ｙ軸に沿って動かされる。これとは異なり、スキャンミラー２０が、ｙ軸を中心に傾斜されると、照明光束５２、５４および５６が、ｘ軸に沿って動かされる。

図７および図８には、顕微鏡５０の変更された実施形態が、第２の実施例として示されている。この実施例では、ラインセンサ６６および６８の前にガラスブロック７２もしくは７４が配置されている。ガラスブロック７２、７４は、対物レンズ２８の光軸Ｏに沿った照明光束のオフセットを補償するために用いられる。ラインセンサ６６、６８、７０はこのようにして、１つの面に配置され得る。特に、３つのラインセンサ６６、６８、７０の代わりに、ラインセンサに相応する、別個のセンサ領域を備えるワンピースの面状センサを設けることも可能である。

図９および図１０は、本発明の顕微鏡が、ＳＰＩＭ顕微鏡の様式で動作する第３の実施例を示している。これに相応して、第３の実施例では、試料側に、２つの別個の対物レンズが設けられており、これらの対物レンズのうちの１つの対物レンズ８０が、検出対物レンズとして機能し、対物レンズ８２（図９を参照）が、照明対物レンズとして機能する。２つの対物レンズ８０および８２は、自身の光軸でもって、相互に垂直に配置されている。

図１１および図１２には、各光束の幾何学形状的な図を伴う第３の実施例が示されている。

図１３は、ブロック図を用いて、再び、ＳＣＡＰＥ顕微鏡の様式の本発明の顕微鏡を実現するための例を示している。ここで、図１３に示された図では、個々の機能コンポーネントの間の矢印は、顕微鏡内の照明光もしくは検出光の経路を示している。

図１３にしたがった実現形態は、例示的な機能コンポーネントとして、ビーム拡張器を有し得る、光源であるレーザー９０と、格子、音響光学ビームスプリッター（ＡＯＢＳ）、空間光変調器（ＳＬＭ）またはデジタルマイクロミラー装置の形態のビームスプリッター９２と、１つまたは複数のガルバノミラーまたはＭＥＭＳミラーの形態の２Ｄスキャナー９４と、スキャンレンズ９６と、チューブレンズ９８ならびに、照明にも検出にも用いられる対物レンズ１００と、を含んでいる。２Ｄスキャナー９４、スキャンレンズ９６、チューブレンズ９８および対物レンズ１００は、テレセントリック系を形成する。検出光路の、２Ｄスキャナー９４に続く部分では、顕微鏡はさらに、例えば２つの、相互に傾斜されている対物レンズを有する正立光学系１０２ならびに複数のラインセンサもしくはストリップセンサ１０４または、択一的な実施形態では、面状センサの前に配置されている１つまたは複数のガラスブロックを含んでいる。

図１４は、最後に、ＳＰＩＭ顕微鏡として本発明の顕微鏡を実現する機能コンポーネントを有するブロック図を示している。同様に、機能コンポーネント間の矢印は、照明光もしくは検出光の光路を暗示している。図１４から見て取れるように、ＳＰＩＭ実現形態は、ＳＣＡＰＥ実現形態と、２Ｄスキャナー９４の代わりに１Ｄスキャナー９４’（例えば音響光学偏向器（ＡＯＤ）、ガルバノミラーまたはＭＥＭＳミラー）を使用していること、ならびに試料側の唯一の対物レンズ１００の代わりに、照明対物レンズもしくは検出対物レンズとして試料側の２つの別個の対物レンズ１００’、１００’’を使用していることしか相違していない。

上述した実施形態は単に例示的なものであると理解されたい。例えば本発明の教示の実現形態に対して多数の変更が可能である。例えば、図３および図４に示された実施形態では、ミラー１８は、照明光を入力するために用いられる。しかしミラー１８の代わりに、伝播において照明光を入力し、反射において検出光を検出器に導く（またはその逆である）ダイクロックミラー要素が設けられていてもよい。

上述した実施形態は、ＳＣＡＰＥ顕微鏡またはＳＰＩＭ顕微鏡の様式の本発明の顕微鏡の実現形態に関する。しかし既に先述したように、本発明は、これらの実現形態に制限されない。例えばＯＰＭ顕微鏡としての実現形態も可能である。特に、図３および図４に示されたＳＣＡＰＥ実施形態に関連して、そこで予定されている２Ｄスキャンミラー２０の傾斜の代わりに、対物レンズ３６を、ＯＰＭ用途（これに関しては、冒頭に挙げた、Ｋｕｍａｒ等著の刊行物を参照されたい）の主旨で動かすことも可能であり、これによって、照明光束と、結像されるべき面の同期したシフトを生じさせることができる。このような場合には、対物レンズ３６を介したビーム入力結合が必要である。すなわち本発明のスキャンユニットは、ＳＣＡＰＥ用途においては、２Ｄスキャンミラーを有しているが、ＯＰＭ用途（図３および図４に関連して）においては、ｙ軸に沿った照明のオフセットのために、対物レンズ３６を光軸に沿ってシフトさせるアクチュエーターと、ｘ軸に沿った照明のオフセットのためのスキャナー（または択一的にシリンダーレンズ）と、を含んでいる。

１０ 従来のＳＣＡＰＥ顕微鏡
１２ 照明ユニット
１４ 光源
１６ 照明光束
１８ ミラー
２０ スキャンミラー
２２ 光学系
２４ スキャンレンズ
２６ チューブレンズ
２８ 対物レンズ
３０ 試料
３２ 検出光束
３４ 正立光学系
３６ 対物レンズ
３８ 対物レンズ
４０ チューブレンズ
４２ ラインセンサ
４３ 面
４４ 焦点面
４６ レンズ
５０ 顕微鏡
５２、５４、５６ 照明光束
５８、６０、６２ 検出光束
６６、６８、７０ ラインセンサ
７１ 検出器
７２、７４ ガラスブロック
８０ 検出対物レンズ
８２ 照明対物レンズ
９０ レーザー
９２ ビームスプリッター
９４ ２Ｄスキャナー
９６ スキャンレンズ
９８ チューブレンズ
１００ 対物レンズ
１００’、１００’’ 対物レンズ
１０４ ストリップセンサ
１０６ ガラスブロック

Claims (21)

1. 試料（３０）を結像する顕微鏡（５０）であって、前記顕微鏡（５０）は、
   前記試料（３０）上へ照明光を送出するための照明ユニット（１２）と、
   前記試料（３０）から生じた検出光を検出するための検出器（７１）と、
   前記照明ユニット（１２）から送出された前記照明光を前記試料（３０）へ焦点合わせし、かつ前記試料（３０）から生じた前記検出光を前記検出器（７１）上へ焦点合わせするための光学系（２２）と、
   前記照明光で前記試料（３０）をスキャンするためのスキャンユニット（２０）と、
   を含んでいる顕微鏡（５０）において、
   前記照明ユニット（１２）は、複数の別個の照明光束（５２，５４，５６）が、前記試料（３０）のスキャン時に同時に、空間的に相互に別個にされている、ストリップ状の試料領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）へ焦点合わせされるように、前記照明光を前記複数の別個の照明光束（５２，５４，５６）の形態で、前記スキャンユニット（２０）上へ送出するように構成されており、
   前記検出器（７１）は、前記検出光を、別個の、空間的に相互に別個にされた、前記ストリップ状の試料領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）から生じた検出光束（５８，６０，６２）の形態で、同時にかつ空間的に相互に別個に検出するように構成されており、
   前記照明光束（５２，５４，５６）によって照明される前記試料領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、複数の相互に平行にずらされた試料面に位置し、
   前記検出器（７１）は、それぞれ前記試料面のうちの１つに割り当てられている複数の部分検出器（６６，６８，７０）を含んでおり、各部分検出器（６６，６８，７０）は、前記部分検出器（６６，６８，７０）に割り当てられている前記試料面から生じた検出光束（５８，６０，６２）を検出し、
   前記光学系（２２）は、対物レンズ（２８）を１つだけ含んでおり、前記対物レンズ（２８）は、前記照明ユニット（１２）から送出された照明光束（５２，５４，５６）を前記試料（３０）へ焦点合わせするための照明対物レンズと、前記試料（３０）から生じた前記検出光束（５８，６０，６２）を前記検出器（７１）上へ焦点合わせするための検出対物レンズと、を同時に形成する、
   ことを特徴とする顕微鏡（５０）。
2. 前記照明ユニット（１２）と前記スキャンユニット（２０）と前記光学系（２２）とは、前記照明光束（５２，５４，５６）が前記試料（３０）内で、相互の平行オフセットを有するように、共に作用する、
   請求項１記載の顕微鏡（５０）。
3. 前記平行オフセットは、前記光学系（２２）内に含まれている検出対物レンズ（２８）の光軸に対して垂直に位置する第１の軸（ｘ）に沿った第１の平行オフセットおよび／または前記検出対物レンズ（２８）の光軸（Ｏ）に対して垂直に位置する第２の軸（ｙ）に沿った第２の平行オフセットを含んでおり、前記第１の軸（ｘ）と前記第２の軸（ｙ）とは、相互に垂直に配向されている、
   請求項２記載の顕微鏡（５０）。
4. 前記スキャンユニット（２０）は、前記試料（３０）を前記照明光束（５２，５４，５６）で、前記光学系（２２）内に含まれている検出対物レンズ（２８）の光軸（Ｏ）に対して垂直に位置する第１の軸（ｘ）に沿ってスキャンするように、かつ／または、前記検出対物レンズ（２８）の光軸（Ｏ）に対して垂直に位置する第２の軸（ｙ）に沿ってスキャンするように構成されており、前記第１の軸（ｘ）と前記第２の軸（ｙ）とは、相互に垂直に配向されている、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
5. 前記スキャンユニットは、スキャンミラー（２０）を含んでおり、前記スキャンミラー（２０）は、前記第２の軸（ｙ）を中心に傾斜可能であり、これによって前記試料（３０）は、前記照明光束（５２，５４，５６）によって、前記第１の軸（ｘ）に沿ってスキャンされ、かつ／または、前記スキャンミラー（２０）は、前記第１の軸（ｘ）を中心に傾斜可能であり、これによって前記試料（３０）は、前記照明光束（５２，５４，５６）によって、前記第２の軸（ｙ）に沿ってスキャンされる、
   請求項４記載の顕微鏡（５０）。
6. 前記スキャンユニット（２０）は、付加的に、前記検出器（７１）上へ焦点合わせされた前記検出光束（５８，６０，６２）をデスキャンするように構成されている、
   請求項１から５までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
7. 前記照明ユニット（１２）と前記スキャンユニット（２０）とは、前記照明光束（５２，５４，５６）同士が前記第２の軸（ｙ）を中心に傾斜されて、前記対物レンズ（２８）の入射瞳に入射し、これによって、前記試料（３０）において、前記第１の軸（ｘ）に沿った第１の平行オフセットが生起されるように共に作用し、かつ／または、前記照明ユニット（１２）と前記スキャンユニット（２０）とは、前記照明光束（５２，５４，５６）同士が前記第２の軸（ｙ）を中心に傾斜されて、前記対物レンズ（２８）の入射瞳に入射し、これによって、前記試料（３０）において、前記第２の軸（ｙ）に沿った第２の平行オフセットが生起されるように共に作用する、
   請求項３から５までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
8. 前記照明ユニット（１２）と前記スキャンユニット（２０）とは、前記照明光束（５２，５４，５６）がそれぞれ、前記対物レンズ（２８）の入射瞳の中心を外れた部分領域だけを照明するように共に作用する、
   請求項１から７までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
9. 前記顕微鏡（５０）は、前記検出光の伝搬方向において前記スキャンユニット（２０）に後続配置されている正立光学系（３４）を有しており、前記正立光学系（３４）は、中間像を生成するための第１の部分光学系（３６）と、前記検出器（７１）上に前記中間像を正しい姿勢で結像するための、前記第１の部分光学系に対して傾斜されている第２の部分光学系（３８，４０）と、を備えている、
   請求項１から８までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
10. 前記部分検出器は、前記検出器の前に配置されている検出光学系の被写体深度領域に配置されている、
    請求項１から９までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
11. 前記顕微鏡（５０）は、前記検出器（７１）の前に配置されている、光路長に影響を与えるための少なくとも１つの要素（７２，７４）を有しており、前記要素（７２，７４）は、前記試料面のずれを補償する、
    請求項１から１０までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
12. 前記検出器（７１）は、部分検出器を形成する複数の検出器部分を備えた面状検出器である、
    請求項１から１１までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
13. 前記検出器（７１）は、部分検出器を形成する複数のライン検出器（６６，６８，７０）を含んでいる、
    請求項１から１２までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
14. 前記ライン検出器（６６，６８，７０）は、前記検出器の前に配置されている検出光学系の光軸に沿って、相互にずれを伴って配置されており、前記ずれは、属する前記試料面のずれに相当する、
    請求項１３記載の顕微鏡（５０）。
15. 前記照明光束（５２，５４，５６）によって照明される前記試料領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、唯一の試料面に位置している、
    請求項１から１４までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
16. 前記照明ユニット（１２）は、別個の前記照明光束（５２，５４，５６）を送出する光源（１４）を１つだけ有している、
    請求項１から１５までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
17. 前記照明ユニット（１２）は、それぞれ前記照明光束（５２，５４，５６）のうちの１つを送出する複数の光源を有している、
    請求項１から１６までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
18. 前記照明ユニット（１２）は、異なる波長で前記照明光束（５２，５４，５６）を送出するように構成されている、
    請求項１から１７までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
19. 前記検出器は、ＴＤＩラインカメラを含んでいる、
    請求項１から１８までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
20. 前記スキャンユニット（２０）と前記光学系（２２）とで、テレセントリック系を形成する、
    請求項１から１９までのいずれか１項記載の顕微鏡（５０）。
21. 顕微鏡を用いて試料（３０）を結像する方法であって、
    照明ユニット（１２）によって、前記試料（３０）上へ照明光が送出され、
    検出器（７１）によって、前記試料（３０）から生じた検出光が検出され、
    光学系（２２）によって、前記照明ユニット（１２）から送出された前記照明光が前記試料（３０）へ焦点合わせされ、かつ前記試料（３０）から生じた前記検出光が前記検出器（７１）上へ焦点合わせされ、
    スキャンユニット（２０）によって、前記試料（３０）が前記照明光でスキャンされ、かつ前記検出器（７１）上へ焦点合わせされた前記検出光がデスキャンされる方法において、
    前記照明光は、複数の別個の照明光束の形態で、前記複数の別個の照明光束（５２，５４，５６）が、前記試料（３０）のスキャン時に同時に、空間的に相互に別個にされている、ストリップ状の試料領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）へ焦点合わせされるように、前記スキャンユニット（２０）上へ送出され、
    前記検出光は前記検出器（７１）によって、別個の、空間的に相互に別個にされた、前記ストリップ状の試料領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）から生じた検出光束（５８，６０，６２）の形態で、同時にかつ空間的に相互に別個に検出され、
    前記照明光束（５２，５４，５６）によって照明される前記試料領域（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、複数の相互に平行にずらされた試料面に位置し、
    前記検出器（７１）は、それぞれ前記試料面のうちの１つに割り当てられている複数の部分検出器（６６，６８，７０）を含んでおり、各部分検出器（６６，６８，７０）は、前記部分検出器（６６，６８，７０）に割り当てられている前記試料面から生じた検出光束（５８，６０，６２）を検出し、
    前記光学系（２２）は、対物レンズ（２８）を１つだけ含んでおり、前記対物レンズ（２８）は、前記照明ユニット（１２）から送出された照明光束（５２，５４，５６）を前記試料（３０）へ焦点合わせするための照明対物レンズと、前記試料（３０）から生じた前記検出光束（５８，６０，６２）を前記検出器（７１）上へ焦点合わせするための検出対物レンズと、を同時に形成する、
    ことを特徴とする方法。

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