JP2017520805A

JP2017520805A - メソ光学素子を用いた光シート顕微鏡法

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Publication number: JP2017520805A
Application number: JP2017517399A
Authority: JP
Inventors: ドット，ハンス−ウルリッヒ; サグハフィ，サイエデー
Original assignee: ドット，ハンス−ウルリッヒ
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2017-07-27
Also published as: US20170115475A1; WO2015189240A1; EP3155469A1; EP3155469B1; US10088657B2

Abstract

本発明は、少なくとも二つの一緒に接続されたメソ光学素子(101、103)の使用による、長いレイリー長の光シート及び細い光ビームを生成するための装置及び方法に関する。【選択図】図３

Description

本発明は、少なくとも二つの一緒に接続されたメソ光学素子の使用による、長いレイリー長の光シート及び細い光ビームを生成するための装置及び方法に関する。

長いレイリー長のラインビーム又は薄い光シートの生成は、光ビームの大きな長さにわたって横方向の強度プロファイルができるだけ平らな光ビームが有益な様々な技術的用途にとって望ましい。その一つはなかでも、大きな体積の標本を層状に三次元で分析できるいわゆる光シート顕微鏡法である。これに関しては、透明で蛍光を発する標本に、側面から薄い光シート(light sheet)によって光を通し、これにより「光学的断面」を生じさせる。この光学的断面は、特異的に光シートの平面内で、蛍光の光学的励起から発生する。この断面を、光シート平面に対して実質的に垂直に、カメラによって撮影する。この繰り返しが、標本の層状で三次元の再構築を可能にする。軸方向の解像度にとって決定的なのは光シートの厚さである。横方向の強度プロファイルが実質的にガウス分布を示す従来のガウス光学系の場合、光シートのプロファイルは、焦点から遠ざかるにつれて急速に拡がっていく。したがって既知の代替策は、ガウスビームの代わりに、適切な代替光学手段により、それ自体で既知のやり方で生成されるいわゆるベッセルビームを使用する。ベッセルビームは強力な中心の強度極大を有している。しかし、ベッセルビームは、同軸の「リング」の形態での望ましくない副極大を示す。これらの副極大は邪魔な背景を生成し、これが、使用する蛍光色素の励起挙動に応じて、分析可能な光学的層の有効厚さを不利に拡張する。

それと共に、STED原理(stimulated emission depletion)に基づいていわゆる「超解像の(ueberaufgeloest)」光学顕微鏡法が開発され、これは例えばDE102009008646で記載されている。STED顕微鏡法では、中心の励起焦点を有しており、且つ別の波長の円形の強度プロファイルを有するさらなる光ビーム、いわゆる脱励起光ビームにより同軸で取り囲まれている特別な励起光ビームを提供することにより、励起光の回折限界をくぐり抜ける。中心の励起ビームとこの励起ビームを円形に取り囲む脱励起ビームを組み合わせることにより、蛍光色素の励起挙動との関連で、標本中の蛍光発光が、励起光自体の回折限界より小さな局所的な領域へと縮小される。同軸のSTED照明を生成するための既知の光学構成での欠点は、ビームのレイリー長が短いことである。したがって既知の構成では、両方の同軸の光ビームの効果的な協働は、ビームの光軸における焦点内でしか可能でない。これらの同軸の光ビームのレイリー長を大きくすることが望ましい。特に、これによりSTED顕微鏡法と光シート顕微鏡法の組合せも可能にするべきである。

それと共に、あまり透明でない標本に光を通すための近赤外領域内の波長での二光子励起のための、レーザからのガウスビームを基礎とする光シート顕微鏡法の適用は、この場合の非常に短い焦点長さに基づき、ほとんど実施不可能である。

この技術的課題の解決策を、本発明、新規の光学システムが提供し、この光学システムは、複数のメソ光学素子、とりわけパウエルレンズ又はアキシコンレンズ(Axicon)を使用すること、及びとりわけ位相変位素子、特に非球面レンズと関連させることに基づいている。本発明は、ビーム経路内で、少なくとも二つのパウエルレンズか又は少なくとも二つのアキシコンを有するレンズ群と、とりわけ、その間にある位相変位素子、好ましくは非球面レンズとを使用することにより、周知のように一つのメソ光学素子だけを使用する際に生じるビーム拡張性の副極大の発生が阻止されるという知見を利用する。本発明によれば、この副極大は、二つのメソ光学素子を用いることで、邪魔な副極大が位相変位により相殺的に重なり合い、したがって消し合い得ることによって消える。中心ビームは建設的に重なり合い、これにより最終的には、長いレイリー長を有するビームが、長く延びた薄い光シート又は細い中心ビームの形態で生じる。

したがって本発明は、メソ光学素子の使用下で生成可能な光シート又は光ビームと関連しており、これは、邪魔な副極大が干渉によって消えて主極大だけが維持され続けるように、メソ光学素子によって生成された非ガウスビームが重なり合うことを特徴とする。好ましいのは、なかでもメソ光学素子として二つのパウエルレンズを使用して、光シートを静的に生成することである。その代わりに好ましいのは、なかでもメソ光学素子として二つのアキシコンを使用し、且つ生じるビームをスキャンするためのスキャンミラーを任意で使用して、光シートを(動的に)生成することである。

代替的な一変形形態では、メソ光学素子として回折素子を用いる。回折素子は、いわゆる「空間光変調器」であることが好ましい。

本発明は、本発明により生成された二つの光シートを重ねることで生じる光シートにも関しており、これに関しては、この両方の光シートの一方の光シートが、より長い波長を有しており、且つ波長がより短いもう一方の光シートを包囲している。この両方の光シートの波長は、蛍光を発する標本中でSTED顕微鏡法の枠内で極薄の光シートとして有効になる励起波長及び脱励起波長であるように選択されるのが好ましい。

そのうえ、散乱性の又は大きな標本を検査するために、蛍光の二光子励起の目的で、二光子レーザ(フェムト秒レーザ)の赤外放射線を光シートの生成に用いることができる。発せられた光の散乱作用を減少させるために、共焦点ライン検出を使用することが好ましい。その代わりに又はそれに加えて、発せられた光の散乱作用を減少させるために、構造化された照明が使用される。

本発明の対象は、ビーム方向において、光軸に沿った配置で、第1のメソ光学素子と、続いて非球面レンズと、続いて第2のメソ光学素子とを内包している少なくとも一つの第1のレンズ群を含んでいる、光シート又はラインビームの生成に適した光学構成である。これに関しては、本発明によれば、邪魔な極大が干渉によって消えて主極大だけが維持され続けるように、メソ光学素子によって生成された非ガウスビームが重なり合うよう、レンズ群の素子が配置されている。とりわけメソ光学素子の位置及び頂角を、中心の光ビームの領域内では建設的干渉が生じ、これに対して副極大は相殺的干渉によって消えるように選択する。ビームは、最初に第1のメソ光学素子に当たり、それにより非回折限界ビームが生じる。このビームが非球面レンズを通り抜け、非球面レンズは、ビームの振幅及び位相の正確に計算された変位を生成する。その後、ビームが第2のメソ光学素子を通り抜け、それにより副極大(とりわけリング構造)が相殺的干渉によって消え、且つ第1及び第2のメソ光学素子としてアキシコンを使用する場合は中心の、とりわけ中空のビームが生じ、又は第1及び第2のメソ光学素子としてパウエルレンズを使用する場合は静的な光シートが生じる。

したがって本発明の好ましい対象は、レンズ群内の第1及び第2のメソ光学素子がそれぞれパウエルレンズであり、それにより静的な光シートを生成可能な光学構成である。本発明の代替的な好ましい対象は、レンズ群内の第1及び第2のメソ光学素子がそれぞれアキシコンであり、それにより光ビームを生成可能な光学構成である。この光ビームは、とりわけ、規定の円形でリング状の強度プロファイルを有するいわゆる「中空ビーム」である。この形態では、この光ビームは、後でより詳しく説明するようにSTED顕微鏡法の枠内で励起光ビームとして及びとりわけ脱励起光ビームとして用い得ることが有利である。前述の光学構成のために非常に細い中空ビームも生成できるように、この光学構成は、STEDと組み合わせることで超解像に適していることが理想である。STEDでは、蛍光を発する標本で、中心励起焦点を別の波長の脱励起リングによって取り囲み、それにより焦点がいわば絞られ、且つ回折限界より小さくされ得ることにより、光学顕微鏡法での回折限界を突破する。これは確かにDE102009008646で記載されているようにラインの場合も可能である。この場合にはいわば中心の励起ラインが脱励起チューブによって取り囲まれている。ただし、ガウスビームが相応に短いレイリー長で、励起及び脱励起のために使用されている。

ここで説明している本発明による非古典的ビームは、STED光シート顕微鏡法のためにとりわけ良く適している。したがって本発明によれば、波長の異なる相互に組み込まれた二つのビームを同時に生成することも行われる。内側の極細ビームは、励起波長のレーザによって生成することができる。このビームに重なる中空の第2のビームは、脱励起波長のレーザによって生成することができる。両方のビームは、本発明による構成に基づき大きなレイリー長を有するので、したがって極細の長い同軸のビームを生成することができる。このビームのアクティブスキャンにより、極薄の光シートが獲得される。

その代わりに又はそれに加えて本発明は、この光学構成において、レンズ群内の第1及び第2のメソ光学素子としてパウエルレンズを使用することにより、静的な光シートを中空の光シートの形態で生成する。この場合は、単一ビームの場合のように、より長い波長の中空の光シートと、より短い波長の同軸で中心の静的な光シートとを重ねることにより、STEDの枠内で使用可能な組み合わされた光シートを生成することができる。これまでは、(一重の)光シートの厚さが光シート顕微鏡法の解像制限要因だったので、これは大きな改善である。

ここで述べるように、本発明の好ましい一形態では、レンズ群の後に少なくとも一つの集光レンズが接続されており、この集光レンズは、レンズ群から出た光ビームをラインビームへと合焦する機能を有している。とりわけ、本発明による光学構成において第1及び第2のメソ光学素子としてアキシコンを使用することにより、中心の中空ビームが生成される場合、この中空ビームをとりわけ平凸レンズに当てることができ、平凸レンズはビームを極細ラインへと合焦する。この形態の好ましい一変形形態では、追加的にスキャンミラーが設けられている。スキャンミラーが垂直軸の周りで移動することによりラインが変位することで、非常に長いレイリー長を有する極薄の光シートが生じる。その際、スキャンミラーが相応に径方向並びにX及びY方向に移動することにより、ラインの線形変位を達成できることが好ましい。その代わりに好ましいのは、ビーム方向においてスキャンミラーの前に設けられた集光レンズを、ビーム方向においてスキャンミラーの後に配置するか、又はスキャンミラーの後にもう一つの集光レンズを配置することである。

したがって本発明の好ましい対象はさらに、本発明によるレンズ群の後に、アクティブビーム偏向及び光シートの動的生成に適したスキャンミラーが接続されている光学構成である。したがって本発明の対象はさらに、細い光ビームを生成するための方法が実施され、且つこの光ビームを、移動しているスキャンミラーによって偏向させ、これにより、合焦された光ビームが、スキャンミラーの移動の際に一平面をなぞり、したがって光シートが形成される、光シートを生成するための方法である。

好ましい形態では、横方向の強度プロファイルが平らにされた光ビーム、いわゆる「フラットトップ」ビーム(FTB)を生成するために特異的に形成された光源が、ビーム方向において本発明によるレンズ群の前に接続されている。このために光源は、相対して設置された二つの非球面レンズを内包することが好ましい。とりわけスキャニングによって生成される光シートを用いる実施形態では、まず最初に、初めはガウス型のレーザビームから、対応する光学素子、例えば二つの非球面レンズにより、均して平らにされたガウス型のレーザビーム(FGB)を生成する。

本発明の対象はさらに、光ビームが本発明による光学構成に通され、その際、中心ビームが建設的に重なり合い、副極大が相殺的干渉によって消えるように、光ビームの横方向の広がりに沿った位相変位が発生するよう、本発明によるレンズ群の素子を光ビームの光軸に沿った位置で位置決めし、場合によっては本発明による群内のメソ光学素子の頂角を適合させ、これにより光ビーム又は光シートが生じる、薄い光シート又は細いラインビームを生成するための方法である。この光ビーム又は光シートは並外れて大きなレイリー長を有している。この方法の一変形形態では、生成された細い光ビームから、アクティブスキャンにより光シートを生成することが追加的に行われ、これに関しては、前述の生成された細い光ビームを、移動しているスキャンミラーによって偏向させ、これにより、合焦された光ビームが、スキャンミラーの移動の際に一平面をなぞり、こうして光シートが形成される。これは、特異的に本発明によるレンズ群の第1及び第2のメソ光学素子としてパウエルレンズを使用することにより直接的にいわゆる「静的な」光シートを生成する上述の実施形態に対する一つの代替策である。

本発明の対象はさらに、波長の異なる二つの重なった光シートを形成し、この一方のより長い波長の光シートが、中空であり、且つもう一方のより短い波長の光シートを包囲する方法である。蛍光を発する物体中でSTED(stimulated emission depletion)により極薄の光シートが有効になるように、励起波長及び脱励起波長を選択することが好ましい。

本発明による光学構成によって生成されたラインビームが非常に細いことが有利であり、これは、光エネルギー(とりわけレーザエネルギー)全体が直径約1μmの非常に小さな断面に集中することを意味している。このように小さな励起断面は、標本中での蛍光の二光子励起のためのフェムト秒レーザの使用を可能にすることが有利である。このようなレーザの使用は、光シート顕微鏡法のために有利である。なぜならこのレーザは近赤外領域内の光を放出し、この光は、完全に透明ではない標本中で、可視光より散乱が少ない。二光子レーザの使用可能性自体は知られている。しかしガウスビームの場合、焦点から次第に遠ざかるにつれて励起断面が非常に強く拡がっていくので、使用可能な励起ラインはたったの400μm長であった。本発明による解決策では、焦点に対して遠ざかるにつれて励起断面が増すことはほとんどなく、したがって二光子励起によっても、長くて非常に細い励起ラインを維持することができる。ラインビームのここで述べたスキャンにより、大きくて薄いいわゆる二光子光シートを得ることができる。これは、なかでも散乱性の又は大きな透明な標本を使用する際に有利である。このシステムは、発せられた可視光の散乱効果を減少させるために、さらに共焦点ライン検出と結びつけ得ることが好ましい。本発明の意味において「共焦点ライン検出」とは、機械式又は電子式のスリット絞りにより、散乱した光を検出器での検出前にシーケンシャルに遮蔽するということである。スリット絞りは、励起ラインに対して光学的に共役に配置されている。スリット絞りの代わりに、構造化された照明も散乱光抑制のために使用することができる。したがって本発明はさらに、散乱した光を検出前にシーケンシャルに遮蔽できるようにするため、とりわけ機械制御式又は電子制御式で、励起ラインに対して光学的に共役に配置されているスリット絞りを追加的に有する本発明に基づく光学構成である。したがって本発明の対象はさらに、発せられた光の散乱作用を減少させるために、共焦点ライン検出及び/又は構造化された照明を使用する方法である。

本発明の対象はさらに、特に、大きな及び/又は散乱性の標本の顕微鏡検査のため、フェムト秒レーザの赤外放射線を標本中での蛍光の二光子励起のために使用する方法である。

本発明の対象はさらに、本発明による構成を用いて標本中での蛍光の二光子励起を生成する、大きな及び/又は散乱性の標本の顕微鏡検査のための方法である。

最後に本発明の対象はさらに、長いレイリー長の薄い光シート又は細い光ビームを生成するための、ここで開示されている本発明による光学構成の使用である。

ビーム軌道を示す図であり、横方向のガウスプロファイルを有するレーザビーム(ガウスビーム)のアキシコンレンズの通過を示す図である。ビーム軌道を示す図であり、横方向の平らにされたガウスプロファイルを有するレーザビーム(FGB)のアキシコンレンズの通過を示す図である。アキシコンレンズのアパーチャ(A)及び焦点からの多少の距離(B)並びに焦点(focus)自体での、光ビームの強度分布を概略的に示す図であり、ガウスレーザビーム(図1A)の強度分布を示す図である。アキシコンレンズのアパーチャ(A)及び焦点からの多少の距離(B)並びに焦点(focus)自体での、光ビームの強度分布を概略的に示す図であり、平らにされたガウスレーザビーム(図1B)の対応する強度分布を示す図である。アクティブスキャニングによって生成される光シートに関連する本発明の特異的な実施形態の、縮尺に従っていない概略図である。

以下の例示的実施形態により、本発明をより詳しく説明する。

図1は、ビーム軌道を示しており、これに関しては光ビームがメソ光学素子を通過する際の横方向の強度プロファイルが、ライン密度に基づいて概略的に描かれており、横方向の強度プロファイルが地点A、焦点、及び地点Bで捕捉されている。図1Aは、横方向のガウスプロファイルを有するレーザビーム(ガウスビーム)のアキシコンレンズの通過を示している。図1Bは、横方向の平らにされたガウスプロファイルを有するレーザビーム(FGB)のアキシコンレンズの通過を示している。

図2は、図1A及び図1Bに基づく、アキシコンレンズのアパーチャ(A)及び焦点からの多少の距離(B)並びに焦点(focus)自体での、光ビームの強度分布を概略的に示している。図2Aは、ガウスレーザビーム(図1A)の強度分布を示している。図2Bは、平らにされたガウスレーザビーム(図1B)の対応する強度分布を示している。

図3は、アクティブスキャニングによって生成される光シートに関連する本発明の特異的な実施形態の、縮尺に従っていない概略図を示している。レーザビーム110は、最初に第1のメソ光学素子101、特にアキシコンに当たり、それにより非回折限界ビーム111が生じる。このビームは、ビームの振幅及び位相の正確に計算された変位を生成する位相素子としての非球面レンズ102を通り抜ける。その後、こうして位相補正されたビーム112が、第2のメソ光学素子103、とりわけアキシコンを通り抜け、それにより副極大(リング構造)が相殺的干渉によって消え、且つ中心の、とりわけ中空のビーム113が生じる。示した特異的な実施形態では、このビーム113はその後、平凸レンズ104及びスキャンミラー105に当たる。レンズ104は、ビームを極細ライン114へと合焦する。その後、スキャンミラー105が図平面に垂直な軸の周りを移動すると、ラインが変位することで、非常に大きなレイリー長を有する極薄の光シートが生じる。その際、追加的にミラー105が相応に径方向並びにX及びY方向に移動することによりライン114の線形変位が達成され得るか、又はミラー105の前に描かれたレンズ104が、ミラーの後に配置されるか若しくはミラー105の後にもう一つのレンズ106が配置される。図解のため、合焦されたビーム114の様々な平面内での横方向のビームプロファイルを例示的に示している。(1):ミラーからの間隔45mm、(2):ミラーからの間隔60mm、(3):ミラーからの間隔65mm、(4):ミラーからの間隔70mm、(5):ミラーからの間隔130mm。

Claims

ビーム方向において、光軸に沿った配置で、
第1のメソ光学素子(101)と、
第2のメソ光学素子(103)と
を内包する第1のレンズ群(100)を含む、光シート又は光ビームの生成に適した光学構成であって、
邪魔な副極大が干渉によって消えて主極大だけが維持され続けるように、前記素子から生成された非ガウスビームが重なり合うように、第1及び第2のメソ光学素子(101、103)が配置されている、光学構成。
静的な光シートの生成に適した光学構成であって、第1及び第2のメソ光学素子(101、103)がそれぞれパウエルレンズである、請求項1に記載の光学構成。
光ビームの生成に適した光学構成であって、第1及び第2のメソ光学素子(101、103)がそれぞれアキシコンである、請求項1に記載の光学構成。
前記群(100)内で、第1及び第2のメソ光学素子(101、103)の間に位相変位素子(102)が配置されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の光学構成。
前記位相変位素子(102)が非球面レンズを内包しているか又は非球面レンズから成っている、請求項4に記載の光学構成。
前記群(100)の後に、前記光ビームをラインビームへと合焦するための少なくとも一つの集光レンズ(104、106)が配置されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の光学構成。
前記群(100)の後に、光シートを生成するためのアクティブビーム偏向に適したスキャンミラー(105)が接続されている、請求項6に記載の光学構成。
前記群(100)の前に、強度プロファイルが平らにされた光ビームを生成するために特異的に形成された光源が接続されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の光学構成。
波長の異なる二つの重なった光シートが形成可能であり、一方のより長い波長の光シートが、中空であり、且つもう一方のより短い波長の光シートを包囲している、請求項2に記載の光学構成。
前記メソ光学素子が回折素子である、請求項1から9のいずれか一項に記載の光学構成。
請求項1から10のいずれか一項に記載の光学構成に光ビームが通され、且つ中心ビームが建設的に重なり合い、副極大が相殺的干渉によって消えるように、前記光ビームの横方向の広がりに沿った位相変位が発生するように、前記群(100)の前記素子が前記光ビームの光軸に沿った位置で位置決めされ、場合によっては前記メソ光学素子の頂角が適合され、これにより光ビーム又は光シートが生じる、光シート又はラインビームを生成するための方法。
メソ光学素子としてパウエルレンズが使用される、静的な光シートを生成するための請求項11に記載の方法。
メソ光学素子としてアキシコンが使用される、細い光ビームを生成するための請求項11に記載の方法。
細い光ビームを生成するための請求項13に記載の方法が実施され、且つ前記光ビームが、移動しているスキャンミラーによって偏向され、これにより、合焦された光ビームが、前記スキャンミラーの前記移動の際に一平面をなぞり、したがって光シートが形成される、光シートを生成するための方法。
波長の異なる二つの重なった光シートが形成され、一方のより長い波長の光シートが、中空であり、且つもう一方のより短い波長の光シートを包囲する、請求項11から14のいずれか一項に記載の方法。
蛍光を発する物体中でSTED(stimulated emission depletion)により極薄の光シートが有効になるように、励起波長及び脱励起波長が選択される、請求項15に記載の方法。
フェムト秒レーザの赤外放射線が標本中での蛍光の二光子励起のために使用される、請求項11から14のいずれか一項に記載の方法。
発せられた光の散乱作用を減少させるために、共焦点ライン検出が使用される、請求項11、13から17のいずれか一項に記載の方法。
発せられた光の散乱作用を減少させるために、構造化された照明が使用される、請求項11、13から17のいずれか一項に記載の方法。
請求項17に記載の方法が標本中での蛍光の二光子励起のために実施される、大きな及び/又は散乱性の標本の顕微鏡検査のための方法。
長いレイリー長の薄い光シート又は細い光ビームを生成するための、請求項1から10のいずれか一項に記載の光学構成の使用。