JP2018045148A - ライトシート顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】背景光による影響を十分に抑制することができるライトシート顕微鏡装置を提供する。【解決手段】ライトシート顕微鏡１００は、標本Ｓを照明する照明光学系５０の光軸と垂直な方向から、標本からの光を検出するライトシート顕微鏡装置である。ライトシート顕微鏡は、可干渉性を有する照明光を出射するレーザ光源１と、照明光を集光し標本に照射する照明光学系と、レーザ光源と照明光学系の間に配置された照明光を変調する変調光学系１０１であって、照明光から、輪帯状に光強度分布を有する第１の光束と、第１の光束の内側に第１の光束の内径よりも小さな光束径を有する第２の光束と、を形成する変調光学系と、照明光学系により標本に形成される照明パターンを照明光学系の光軸方向に移動させる可変位相素子７と、照明パターンが形成された標本を撮像する撮像装置２４と、標本の画像を生成する画像処理を行なう画像処理装置２５と、を備える。【選択図】図２

Description

蛍光標本を照明するライトシート顕微鏡装置に関する。

蛍光標本（以降、蛍光標本を単に標本とも記載する）から画像を取得する手法として、ライトシート顕微鏡を用いた観察手法が知られている。ライトシート顕微鏡では、標本にシート状の励起光（以降、ライトシートとも記載する）を照射することで発生する蛍光を、ライトシートを照射する方向と垂直な方向から観察光学系を通して検出する。

従来のライトシート顕微鏡に関する技術としては、以下のようなものが挙げられる。

非特許文献１には、標本上にガウスビームを集光させ、ガウスビームを用いて標本を走査することで、擬似的にライトシートを形成する技術が記載されている。

特許文献１には、標本上にベッセルビームを形成し、ベッセルビームを用いて標本を一次元方向に走査することで、擬似的にライトシートを形成する技術が記載されている。ベッセルビームによって形成されるライトシートのシート厚は、ガウスビームによって形成されるライトシートよりも薄い。そのため、特許文献１の方法で形成されるライトシートによれば、ガウスビームを用いて形成されるライトシートよりも、観察光学系の光軸方向（以降、観察光軸方向とも記載する）の分解能を向上させた観察を行なうことができる。

Keller, P. J. & Stelzer, E. H. K., Curr. Opin. Neurobiol. 18, 624-632 (2009)

米国特許第8711211号明細書

一方で、ベッセルビームを標本に形成するとき、図１に示すように、ベッセルビームの中心光束Ａの周囲に、ベッセルビームのサイドローブによる背景光Ｂが一定間隔で形成され得る。尚、図１において示されるＸ軸が、照明光軸である。焦点深度内にこのような背景光Ｂが存在すると、背景光Ｂによる余分な蛍光を検出光として含んでしまい、ライトシートのシート厚が実質的に広がっていることと等しくなる。即ち、ベッセルビームを用いた観察手法では、背景光による影響から、本来のベッセルビームの中心光束によって形成される薄いシート厚による高い分解能での観察を行なうことが難しくなる。

以上から、観察光軸方向の分解能を向上させるために、背景光による影響を十分に抑制することができる技術が望まれている。

従って、本発明では、背景光による影響を十分に抑制することができるライトシート顕微鏡装置を提供することを目的とする。

本発明の一態様におけるライトシート顕微鏡装置は、標本を照明する照明光学系の光軸と垂直な方向から、前記標本からの光を検出するライトシート顕微鏡装置であって、可干渉性を有する照明光を出射する光源と、前記照明光を集光し、前記標本に照射する前記照明光学系と、前記光源と前記照明光学系の間に配置された、前記照明光を変調する変調光学系であって、前記照明光から、輪帯状に光強度分布を有する光束である第１の光束と、前記第１の光束の内側に前記第１の光束の内径よりも小さな光束径を有する第２の光束と、を形成する変調光学系と、前記照明光学系により前記標本に形成される照明パターンを前記照明光学系の光軸方向に移動させる変調光束移動手段と、前記照明パターンが形成された前記標本を撮像する撮像装置と、前記標本の画像に基づいて、前記標本の画像を生成する画像処理を行なう画像処理装置と、を備えることを特徴とする。
本発明の別の態様におけるライトシート顕微鏡装置は、標本を照明する照明光学系の光軸と垂直な方向から、前記標本からの光を検出するライトシート顕微鏡装置であって、可干渉性を有する照明光を出射する光源と、前記照明光を集光し、前記標本に照射する前記照明光学系と、前記光源と前記照明光学系の間に配置された、前記照明光を変調する変調光学系であって、前記照明光から、輪帯状に光強度分布を有する光束である第１の光束と、前記第１の光束の内側に前記第１の光束の内径よりも小さな光束径を有する第２の光束と、を形成する変調光学系と、前記照明パターンが形成された前記標本を撮像する撮像装置と、前記標本の画像に基づいて、前記標本の画像を生成する画像処理を行なう画像処理装置と、を備え、前記照明光学系は、第１の照明光学系と、第２の照明光学系と、を有し、前記第１の照明光学系は、前記第２の照明光学系に対して１８０度反対から照明することを特徴とする。

本発明によれば、背景光による影響を十分に抑制することができるライトシート顕微鏡装置を提供することができる。

標本にベッセルビームが形成された様子を示す照明光学系の光軸を含む断面図。 第１の実施形態のライトシート顕微鏡の構成を示す図。 変調光学系により形成される第１の光束と第２の光束の断面図。 標本Ｓに形成される照明パターンの照明光学系の光軸を含むＸＺ平面での断面図。 図４における照明パターンを拡大した図。 観察光学系の光軸方向に対する光の強度分布を示す図。 第１の実施形態のライトシート顕微鏡を用いて標本の観察を行なう手順を示したフローチャート。 観察光学系の光軸方向に対する点像分布関数を示した図。 保持具と、保持具を移動制御する移動制御機構を示した図。 第１の実施形態の１つ目の変形例における、変調光学系の構成を示す図。 第１の実施形態の２つ目の変形例における、変調光学系の構成を示す図。 第１の実施形態の３つ目の変形例における、変調光学系の構成を示す図。 第２の実施形態のライトシート顕微鏡が有する変調光学系の構成を示す図。 第３の実施形態のライトシート顕微鏡が有する変調光学系の構成を示す図。 第３の実施形態の変形例における、変調光学系の構成を示す図。 第４の実施形態のライトシート顕微鏡の構成の一部を示す図。 第４の実施形態の１つ目の変形例における、照明光学機構の構成を示す図。 第４の実施形態の２つ目の変形例における、照明光学機構の構成を示す図。 第４の実施形態の３つ目の変形例における、照明光学機構の構成を示す図。

以下、第１の実施形態におけるライトシート顕微鏡１００について、図面を用いて説明する。図２は、ライトシート顕微鏡１００の構成を示す。ライトシート顕微鏡１００は、標本Ｓを照明する後述する照明光学系５０の光軸と垂直な方向から、標本からの光を検出するようなライトシート顕微鏡である。

ライトシート顕微鏡１００は、レーザ光源１と、変調光学系１０１と、走査用のミラー１０と、照明光学系５０と、観察光学系５１と、撮像装置２４と、画像処理装置２５を備える。

変調光学系１０１は、レーザ光源１と照明光学系５０との間に配置された、照明光を変調する変調光学系である。変調光学系１０１は、構成として、レーザ光源１から射出される照明光を分割する第１の光路分割素子であるハーフミラー２と、分割された照明光のうち一方の光がたどる光路中に設置される第１の光学系２０１と、分割された照明光のうちもう一方の光がたどる光路中に設置されるミラー５と、第２の光学系３０１と、可変位相素子７と、ミラー８と、を備える。さらに、第１の光学系２０１で形成される第１の光束と、第２の光学系３０１で形成される第２の光束と、を１つの光路中に併合する光路結合素子であるハーフミラー９と、を備える。第１の光学系２０１は、アキシコンレンズ３と、レンズ群４とを含み、第２の光学系３０１は、レンズ群６を含む。

変調光学系１０１では、ハーフミラー２によって分割された照明光は、それぞれ第１の光学系２０１と、第２の光学系３０１と、へ入射する。第１の光学系２０１へ入射した光は、アキシコンレンズ３によって偏向され、アキシコンレンズ３とレンズ群４との間にベッセルビームを形成した後リング状の発散光束となってレンズ群４へ入射する。２つのレンズで構成されたレンズ群４は、レンズ群４の前側レンズへ入射したリング状の発散光束を円形状に集光した後、後側レンズで円筒状にコリメートして射出するように配置されたレンズ群である。即ち、アキシコンレンズ３、レンズ群４を通過した光は、コリメートされた輪帯光束となって後の光路へ進む。言い換えるならば、第１の光学系２０１を通過した光は、輪帯状に光強度分布を有する光束（第１の光束）となって後の光路へ進む。

ハーフミラー２によって分割されたレーザ光源１からの照明光のうち、第２の光学系３０１へ入射した光は、レンズ群６によってコリメートされた光束（第２の光束）となる。このとき、レンズ群６は、光路結合素子であるハーフミラー９によって第１の光束と第２の光束とが併合されるときに、第２の光束が、上記の輪帯光束である第１の光束の内側に第１の光束の内径よりも小さい光束径を有するように調整されている。第２の光学系３０１を通過した第２の光束は、可変位相素子７、ミラー８を介して後の光路へ進む。

可変位相素子７は、可変位相素子７を通過する光の位相を変化させる素子である。例えば、電圧により透過する光の位相を変化させる液晶素子や挿脱可能なガラス板であってもよい。可変位相素子７は、第１の光学系２０１を通過した第１の光束と、第２の光学系３０１を通過した第２の光束との間の位相差を変更するために設けられる手段であり、ここでは、第２の光学系３０１を通過した第２の光束の位相を変化させることで、第１の光束と、第２の光束との間の位相差を変更している。可変位相素子７は、例えば、レンズ群６の光軸に垂直な平面上で、入射した光の位相を変化させる素子である。また、可変位相素子７の代わりに、光の位相を変化させる手段として、位相の変更量が異なる複数の挿脱可能な位相板から構成されていてもよい。

尚、可変位相素子７は、上記の例では、第２の光束の位相を変化させるように配置される例を示したが、第１の光束と、第２の光束との間の位相差を変更するようにどちらか一方の光学系に配置されていれば良く、例えば、可変位相素子７が第１の光学系２０１の後ろ側に配置されるような構成であってもよい。また、可変位相素子７は、第１の光学系２０１、第２の光学系３０１の後側に限られず、前側に配置されるような構成であってもよい。即ち、可変位相素子７は、第１の光束または第２の光束の位相を変更するような手段である。また、可変位相素子７は、標本Ｓに形成される照明パターンを照明光学系５０の光軸方向に移動させる変調光束移動手段として機能するが、詳しくは後述する。

尚、レンズ群４、６は、それぞれ２枚のレンズから構成されるが、レンズ群４、６の構成はこれに限られない。上記説明した特徴を満たすならば、レンズ群４、６が２枚以上のレンズによって構成されていてもよい。

第１の光学系２０１を通過した第１の光束と、第２の光学系３０１を通過した第２の光束は、光路結合素子であるハーフミラー９によって１つの光路中に併合される。このとき、併合後の第１の光束と第２の光束の断面を示した図が図３である。このように、ハーフミラー９を通過後には、輪帯状に光強度分布を有する光束である第１の光束Ｃの内側に、第１の光束Ｃの内径よりも小さな光束径を有する第２の光束Ｄが存在するような状態となる。

ミラー１０は、角度を変更可能なミラーであり、標本Ｓに照射される照明光の位置を変更する。具体的には、ミラー１０は、図２のＺ軸を中心軸として回転することで、照明光学系５０へ入射する照明光の角度を変更し、標本Ｓの照射位置を図２のＹ軸方向に変更する。

照明光学系５０は、レンズ群１１と、照明レンズ１２を含む。レンズ群１１は、第１の光束、及び、第２の光束を照明レンズ１２の入射瞳位置に投影する。照明レンズ１２の入射瞳位置とミラー１０の光軸上の位置は、光学的に共役となるよう配置される。照明レンズ１２は、図２のＸ軸方向から照明光である第１の光束と第２の光束とを集光し、標本Ｓに照射する。

このとき、照明光は、標本Ｓに集光して照射されることで、第１の光束と、第２の光束とが干渉を起こし、図４に示されるような照明パターンを標本ＳにおいてＸ軸方向に形成する。図４は、標本Ｓに形成される照明パターンを、図２のＸ軸とＺ軸とからなるＸＺ平面での照明光学系の光軸を含む断面図である。図５は、図４のＸ軸方向の中心付近のパターンを拡大した断面図である。

図５に示すように、Ｘ軸方向に形成される照明パターンは一つではない。照明パターンは、輪帯光束である第１の光束が集光することで、ベッセルビームでの中心光束が形成される領域である領域iに形成される照明パターンと、ベッセルビームのサイドローブが形成される領域である領域ii、iii、・・・、に形成される照明パターンとにわけられる。領域iに形成される照明パターンは、ベッセルビームの中心光束を形成する第１の光束と、第２の光束とが干渉することによって形成され、Ｘ軸方向に明暗を繰り返すような光束となる。一方、領域ii、iiiに形成される照明パターンは、ベッセルビームのサイドローブを形成する第１の光束と、第２の光束とが干渉して生じるものであり、Ｘ軸方向に明暗を繰り返す光束となる。ここで、標本Ｓに照射されるサイドローブを、中心光束に近い位置に形成される順に、１次のサイドローブ、２次のサイドローブ、・・・、ｎ次のサイドローブと記載する。即ち、領域iiに形成される照明パターンは、１次のサイドローブと、第２の光束とが干渉することによって形成されたものであり、領域iiiに形成される照明パターンは、２次のサイドローブと、第２の光束とが干渉することによって形成されたものである。

尚、このようにベッセルビームを形成する場合に集光位置から外れてしまうｎ次のサイドローブが生じることは、既知の事象である。

図５に示す、第１の光束と第２の光束とによって形成される複数の照明パターンは、何れも光が強め合うことで形成される光強度の強い部分（明線）と、光が弱め合うことで形成される光強度の弱い部分（暗線）とがＸ軸方向に交互に存在するような照明パターンである。図５では、領域iに形成される照明パターンのうちＸ軸方向の領域ごとに明線となる範囲を含む領域を領域ａ、暗線となる範囲を含む領域を領域ｂとしている。尚、領域ａ、ｂは、Ｚ軸方向の範囲を含むものとする。

特に、上記照明パターンの特徴として、Ｚ軸方向に隣り合う照明パターンの明線と暗線の領域は、交互に形成される。例えば、ベッセルビームの中心光束を形成する第１の光束と、第２の光束とによる照明パターン（領域iの照明パターン）の明線を含む領域ａには、１次のサイドローブと第２の光束とが干渉する照明パターン（領域iiの照明パターン）の暗線が含まれる。即ち、領域iの照明パターンの明線を含む領域ａでは、１次のサイドローブに由来する領域iiの光強度が低くなっている。言い換えるならば、領域iの明線を含む領域ａからの光を検出することで標本Ｓを撮像した場合、１次のサイドローブによる不要な光が検出されることを抑制することができる。

図６は、標本Ｓに照明光を照射した際の、観察光学系５１の光軸方向（図２におけるＺ軸方向）に対する光の強度分布を示した図である。線Ｅは、輪帯状の光強度分布を有する光束を集光させることで、従来における一般的なベッセルビームを標本Ｓ上に形成した際の光強度分布を示し、線Ｆは、本発明のライトシート顕微鏡１００における輪帯状の光強度分布を有する第１の光束と、第２の光束を含む照明光を集光し、標本Ｓに照射した際の、明線領域（図５の領域iの照明パターンの明線を含む領域ａに相等する領域）での光強度分布を示す。一般的なベッセルビームを形成した場合、横軸の０．２５から０．５（−０．２５から−０．５）にかけて光強度分布のピークを有し、即ち１次のサイドローブが照射されることで不要光が検出されてしまう。一方で、本発明の第１の光束と、第２の光束を含む照明光を集光して標本Ｓに照射した場合には、横軸の０．２５から０．５（−０．２５から−０．５）に生じ得る１次のサイドローブ由来の光強度分布のピークが十分に抑制されていることがわかる。即ち、領域iの照明パターンの明線を含む領域ａにおいては、１次のサイドローブによる影響を十分に抑制することができる。

さらに、上記照明パターンは、前述した可変位相素子７（変調光束移動手段）により、照明光学系５０の光軸方向に移動させることができる。より詳しくは、可変位相素子７を通過する光束の位相量を変化させ、第１の光束と、第２の光束との間の位相差を変更することで、照明パターンの明線の位置と暗線の位置とが照明光学系５０の光軸方向に変更される。

ここで、可変位相素子７は、可変位相素子７によって照明パターンが移動されることで、図５に示す領域iの照明パターンが形成されるＸ軸上の全ての領域が、領域iの照明パターンの明線部分により照射されるように構成される。例えば、領域iの照明パターンの明線の領域と暗線の領域とが反転するように、可変位相素子７の位相変化量が調整される。また、領域iの照明パターンが形成されるＸ軸上の全ての領域が、領域iの照明パターンの明線部分により照射されていればよく、例えば、領域iの照明パターンの明線の領域と暗線の領域とが反転するような２パターンの位相変化量だけでなく、より少量ずつ位相を変更するように、可変位相素子７の位相変化量が調整されてもよい。例えば、可変位相素子７が液晶素子であれば電圧を徐々に変更することにより実施される。

観察光学系５１は、標本Ｓからの光を検出する検出用レンズ２２と、結像レンズ２３と、を含む。観察光学系５１は、撮像装置２４へ標本Ｓからの光を導光する。

結像レンズ２３の結像位置には、標本Ｓからの光を検出し、標本Ｓを撮像する撮像装置２４が配置される。撮像装置２４は、上記照明パターンが形成された標本Ｓを撮像する。

画像処理装置２５は、撮像装置２４で生成された画像に対し、画像処理を行う。画像処理装置２５は、図５に示すベッセルビームの中心光束を形成する第１の光束と、第２の光束とによる照明パターン（領域iの照明パターン）の暗線を含む領域ｂを除いた画像を生成する画像処理を行なう。また、画像処理装置２５は、領域iの照明パターンの暗線を含む領域ｂを除いた画像を含む複数の画像を貼り合わせる画像処理を行なう。具体的には、可変位相素子７（変調光束移動手段）により、照明パターンを照明光学系５０の光軸方向に移動させ、照明パターンがＸ軸方向（照明光学系５０の光軸方向）に異なった位置で撮像された複数の画像において、照明パターンの領域ｂを除去する画像処理をそれぞれ行ない、生成された領域ｂを除いた複数の画像を貼りあわせる画像処理を行なう。画像処理装置２５が行なう画像処理について、詳しくは後述する。画像処理装置２５は、例えば、コンピュータである。

以上の構成を有する本発明のライトシート顕微鏡１００によれば、輪帯状に光強度分布を有する第１の光束と、第２の光束とを含む照明光を集光し、標本Ｓに照射することで形成される上記のような照明パターンを利用することで、観察光学系５１の焦点深度内に含まれてしまう１次のサイドローブによる背景光の影響を抑制し、標本Ｓの観察を行なうことができる。

以下、ライトシート顕微鏡１００を用いた標本Ｓの観察の手順の一例を、図７を用いて説明する。図７は、ライトシート顕微鏡１００を用いて標本Ｓの観察を行なう手順の一例を示したフローチャートである。

図７のステップＳ１では、レーザ光源１を点灯し、照明光学系５０によって標本Ｓを照明し、照明パターンを形成する。

ステップＳ２では、ミラー１０の角度を変更していくことにより、照明光により標本Ｓを図２のＹ軸方向に走査する。尚、ステップＳ１からＳ２にかけて、撮像装置２４は、撮像を続けており、ＸＺ平面において図４、５で示したような照明パターンが形成され、その照明パターンをＹ軸方向にスキャンしつつ積算した標本Ｓの１枚の画像を撮像する。尚、この状態でＸＺ平面において形成された照明パターンの位置を第１の位置とする。また、撮像された画像は、中心光束を形成する第１の光束と第２の光束とが干渉することで形成される明暗を繰り返す照明パターン（領域iの照明パターン）を主に反映した画像となる。

ステップＳ３では、画像処理装置２５は、照明パターンが第１の位置に形成されているときにステップＳ２で撮像装置２４が撮像した画像（第１の画像）から、ベッセルビームの中心光束を形成する第１の光束と、第２の光束とによる照明パターン（図５の領域iの照明パターン）の暗線を含む領域ｂを除いた画像を作成する。

ステップＳ４では、画像処理装置２５は、可変位相素子７（変調光束移動手段）が変更し得る全ての位置で照明パターンを形成し、標本Ｓを撮像したかどうかを判定する。例えば、可変位相素子７を明線、暗線が反転した二種類の照明パターンのぞれぞれで標本Ｓを撮像したかどうかを判定する。即ち、上記第１の位置での照明パターンと、第１の位置での照明パターンと明線と暗線の領域が反転した第２の位置での照明パターンとで標本Ｓを撮像したかどうかを判定する。ステップＳ４の判定がＮｏの場合、ステップＳ６に移行する。

ステップＳ６では、例えば、可変位相素子７が挿脱可能なガラス板等であれば、可変位相素子７（変調光束移動手段）を挿入する（または外す）ことで照明パターンを変更させて、再度ステップＳ１へ戻る。その後、ステップＳ４でＹｅｓと判定されるまでステップＳ６からステップＳ４を繰り返す。

尚、可変位相素子７が、複数の位相変化パターンを含むように調整される場合は、第１の位置と、第１の位置に対して少しずつ位置が異なる、第２の位置、第３の位置、・・・、を含む全ての位置で照明パターンが形成された状態で標本Ｓを撮像するまで、ステップＳ６からステップＳ４を繰り返す。

ステップＳ４でＹｅｓと判定された場合、ステップＳ５へ移行する。ステップＳ５では、画像処理装置２５は、ステップＳ３で生成された全ての画像を貼り合わせる。例えば、明線、暗線が反転した二種類の照明パターンで撮像を行なった場合には、照明パターンが第１の位置に形成されたときの標本Ｓの第１の画像から暗線を含む領域ｂを除去した画像と、照明パターンが第２の位置に形成されたときの標本Ｓの第２の画像から暗線を含む領域ｂを除去した画像と、を貼り合わせた、第３の画像を生成する。

尚、明線、暗線が反転した二種類の照明パターンを形成するような位相変化量だけでなく、例えばより少量ずつ複数の位相変化を与えるように可変位相素子７が調整される場合には、ステップＳ３で、第１の画像と第２の画像を含む複数の標本Ｓの画像のそれぞれにおいて暗線を含む領域ｂを除去した画像を生成し、ステップＳ５で、それらの画像を貼り合わせることで、第３の画像を生成してもよい。即ち、画像処理装置２５は、第１の画像と、第２の画像と、を含む複数の標本Ｓの画像に基づいて、標本Ｓの第３の画像を生成する画像処理を行なう。

以上によって、ライトシート顕微鏡１００を用いて標本Ｓの観察を行なう図７のフローチャートで示される処理を終了する。

図７のフローチャートで示される処理によって生成された第３の画像は、領域iの照明パターンの明線部分によって照射された画像をつなぎ合わせたものである。つまり、第３の画像は、１次のサイドローブによる不要な光が検出されることが抑制された、明線を含む領域ａから発生した蛍光の画像をつなぎ合わせたものでもある。

従って、ライトシート顕微鏡１００によれば、観察光学系５１の焦点深度内に含まれてしまう１次のサイドローブによる背景光の影響を抑制すると共に、本来のベッセルビームによって形成される薄いシート厚による高い分解能での観察を行なうことができる。

また、ライトシート顕微鏡１００に用いられる光源は、レーザ光源１を用いるとしたが、可干渉性を有する照明光を出射するような光源であればよく、レーザ光源に限られない。例えば、きわめて狭い帯域を有するＬＥＤ光源や、単一波長を発振する電磁場源を用いてもよい。

また、ライトシート顕微鏡１００では、照明光学系５０の開口数をNA_i、観察光学系５１の開口数をNA_dとしたとき、標本Ｓに照射される光束の半値幅（λ/2NA_i）と、観察光学系５１の焦点深度（λ/2 NA_d ²）との関係が、λ/2 NA_i＞λ/2 NA_d ²を満たすような関係を満たしていてもよい。即ち、NA_i ＜ NA_d ²を満たすようにNA_i、NA_dが調整されていてもよい。ここで、λは、レーザ光源１が射出する照明光の波長である。このように、照明光の半値幅を焦点深度よりも大きくすることで、焦点深度内に１次のサイドローブが含まれなくなり、１次のサイドローブによる背景光の影響をより抑制することができる。

また、図８は、標本Ｓに照明光を照射した際の、観察光学系の光軸方向（図２におけるＺ軸方向）に対する点像分布関数を示した図である。ここで、線Ｉは、輪帯状の光強度分布を有する光束を集光させることで、従来における一般的なベッセルビームを標本Ｓ上に形成した際の点像分布関数を示し、線Ｊは、本発明のライトシート顕微鏡１００における、光強度が略同じである、輪帯状の光強度分布を有する第１の光束と、第２の光束を含む照明光を集光し、標本Ｓに照射した際の、明線領域での点像分布関数を示す。さらに、線Ｋは、第２の光束の強度を第１の光束に対して０．４倍に抑えた場合の点像分布関数である。

即ち、第１の光束と第２の光束の光強度分布の強度比率を変更することによってサイドローブを抑制する効果を調整することができる。図８に示した例では、第１の光束と第２の光束との光強度を略同じとした線Ｊの状態において、最も１次のサイドローブを抑制する効果が得られる。このような特徴を利用し、本発明のライトシート顕微鏡１００において、第１の光学系２０１または第２の光学系３０１のいずれかまたは両方に、可変減光フィルタを設置することで、第１の光束と第２の光束の強度比を調整し、サイドローブによる影響を抑制する最適な条件を調整することができる。

また、レーザ光源１として超短パルス光を発振する超短パルスレーザ光源を用いて、標本Ｓに照明光を照射し、多光子吸収を誘起させるような構成としてもよい。超短パルスレーザは、Ｘ軸上の照明パターンの強度の高い中心部において多光子励起を引き起こすことから、サイドローブにおいて蛍光が生じず、サイドローブによる余計な光を検出してしまうことを防ぐことができる。

また、ライトシート顕微鏡１００は、さらに図９に示すように、標本Ｓを固定する保持具２６と、保持具２６を図９のＸＺ平面で移動させることで、照明光学系５０に対する標本Ｓの位置を移動するような移動制御機構２７と、を備えていてもよい。移動制御機構２７は、例えば、ピエゾアクチュエータやステッピングモータである。移動制御機構２７を備えることにより、ＸＺ平面のより広い標本Ｓの領域で撮像を行なうことができる。例えば、標本ＳがＸ軸方向に長く、図７のフローチャートを実行したときに撮像できなかったＸＺ平面上の領域があったとしても、移動制御機構２７により照明光学系５０に対する標本Ｓの位置をＸ軸方向に変更し、撮像できなかったＸ軸方向の領域へ移動することでその領域を撮像することができる。

以下、第１の実施形態のライトシート顕微鏡１００の変形例について説明する。

図１０は、ライトシート顕微鏡１００の変調光学系１０１ａに関する１つ目の変形例について説明する図である。ライトシート顕微鏡１００の変調光学系１０１ａは、第１の光学系２０１の代わりに、図１０に示すような第１の光学系２０２を備える。第１の光学系２０２は、アキシコンレンズ３とアキシコンレンズ４ａとを含み、アキシコンレンズ４ａは、アキシコンレンズ３と正反対の方向を向くように配置される。アキシコンレンズ４ａは、アキシコンレンズ３を通過して一度集光した後の発散光束をコリメートし、第１の光束を形成する。

アキシコンレンズ３とアキシコンレンズ４ａとの距離を変更することで、輪帯光束の大きさを照明光学系５０に使用する照明用レンズの瞳径に合わせて調整することができる。

以上のような第１の光学系２０２を備えることで、第１の光束の大きさを調整することができるため、照明光学系５０に用いるレンズを交換する場合にも対応することができる。

図１１は、ライトシート顕微鏡１００の変調光学系１０１ｂに関する２つ目の変形例について説明する図である。ライトシート顕微鏡１００の変調光学系１０１ｂは、第１の光学系２０１の代わりに、図１１に示すような遮光素子３ａを含む第１の光学系２０３を備える。遮光素子３ａは、リングスリットが設けられた素子であり、入射する光束の中心部分が遮光されることで、第１の光束が形成される。

以上のような第１の光学系２０３を備えることで、装置を安価な構成とすることができる。また、第１の光学系２０３の位置調整は、第１の光学系２０１に比べて容易に行なうことができる。

図１２は、ライトシート顕微鏡１００の変調光学系１０１ｃに関する３つ目の変形例について説明する図である。ライトシート顕微鏡１００の変調光学系１０１ｃは、第２の光学系３０１の代わりに、図１２に示すような遮光素子６ａを含む第２の光学系３０２を備える。遮光素子６ａは、光束の中心部分のみを通過し、周辺部を遮光するような開口が設けられた素子であり、例えば、絞りやピンホールである。遮光素子６ａを通過することで、第２の光束が形成される。

以上のような第２の光学系３０２を備えることで、装置を安価な構成とすることができる。また、第２の光学系３０２の位置調整は、第２の光学系３０１に比べて容易に行なうことができる。

さらに、図示はしないが、ライトシート顕微鏡１００の可変位相素子７を備えず、代わりに照明光学系５０を照明光学系５０の光軸方向に移動させるような焦点移動機構を備える構成としてもよい。照明光学系５０を移動させることで、照明光学系５０の焦点位置を変更し、標本Ｓに形成される照明パターンを照明光学系５０の光軸方向に移動させることができる。即ち、そのような照明光学系５０の焦点移動機構は、可変位相素子７の代わりに変調光束移動手段として機能する。

以下、第２の実施形態におけるライトシート顕微鏡２００について説明する。図１３は、ライトシート顕微鏡２００が有する変調光学系１０２の構成を示す図である。尚、ライトシート顕微鏡２００は、変調光学系１０１の代わりに、変調光学系１０２を備える点以外は、ライトシート顕微鏡１００と同様の構成である。

変調光学系１０２は可変位相素子７と、ミラー８の代わりに、ミラー８ａ〜８ｃと、ミラー８ｂとミラー８ｃを図１３の矢印の方向に移動させる駆動手段７ａを備える。駆動手段７ａは、例えば、ピエゾアクチュエータやステッピングモータを取り付けた移動ステージであり、駆動手段７ａにミラー８ｂ、８ｃが固定される。

駆動手段７ａによって、ミラー８ｂとミラー８ｃを矢印の方向に移動させることによって、第２の光学系３０１を通過した第２の光束がたどる光路長が変化する。従って、駆動手段７ａによれば、第１の光束と、第２の光束との間の光路長差を変更することで、位相差を生じさせることができる。即ち、駆動手段７ａは、可変位相素子７と同様に変調光束移動手段として機能する。

従って、本実施形態におけるライトシート顕微鏡２００によれば、位相を変化させる光学素子等を備えずに、観察光学系５１の焦点深度内に含まれてしまう１次のサイドローブによる背景光の影響を抑制することができる。

また、駆動手段７ａを含む構成は、第２の光学系３０１の後の光路に限らず、例えば、第１の光学系２０１の光路の後に備えられていてもよい。また、第２の光学系３０１の光路の前、若しくは、第１の光学系２０１の光路の前に備えられていてもよい。駆動手段７ａを含む構成は、第１の光束と、第２の光束との間に位相差を生じさせるように配置されていればよい。

また、ライトシート顕微鏡２００は、ハーフミラー９と第２の光学系３０１との間、若しくは、ハーフミラー２と第２の光学系３０１との間に、光路長の異なる複数の光路を設け、電動シャッタ等により複数の光路のいずれかを選択的に通過させるような構成としてもよい。複数の光路は、第２の光束に対しそれぞれ異なる位相量の変化を与える。

以下、第３の実施形態におけるライトシート顕微鏡３００について説明する。図１４は、ライトシート顕微鏡３００が有する変調光学系１０３の構成を示す図である。尚、ライトシート顕微鏡３００は、変調光学系１０１の代わりに、変調光学系１０３を備える点以外は、ライトシート顕微鏡１００と同様の構成である。

変調光学系１０３は、リングスリットである第１の開口と、第１の開口の内側に形成された第２の開口を有する遮光素子１３により構成される。遮光素子１３では、第１の開口と第２の開口以外の領域で遮光され、第１の開口を通過した光束は、第１の光束を形成し、第２の開口を通過した光束は、第２の光束を形成する。

従って、ライトシート顕微鏡３００によっても、観察光学系５１の焦点深度内に含まれてしまう１次のサイドローブによる背景光の影響を抑制することができる。特に、本構成では、変調光学系１０３の構成が縮小され、装置全体を小型化することができる。また、ライトシート顕微鏡１００の構成に比べて安価な構成とすることができる。

また、遮光素子１３は、照明光学系５０に含まれるレンズの瞳位置に取り付けられてもよい。

また、ライトシート顕微鏡３００は、遮光素子１３の代わりに、ホログラム素子や、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を設けるような構成としてもよい。ホログラム素子や、ＤＭＤによっても第１の光束と第２の光束とを一度に形成することができる。

また、遮光素子１３の代わりに空間光位相変調器（ＳＬＭ、ＬＣＯＳ等）を設けるような構成としてもよい。空間光位相変調器を設けた場合には、第１の光束と第２の光束とを一度に形成することができると共に、第１の光束と第２の光束との間の位相差を制御することもできる。そのため、空間光位相変調器を設けた場合は、空間光位相変調器が変調光束移動手段としても機能することから、可変位相素子７を構成として含まなくてもよい。

また、ライトシート顕微鏡３００は、遮光素子１３の代わりに図１５に示すようなレンズ１３ａとレンズ１３ａの光路の後側に、周辺部を通過した光束をコリメートするようなレンズ群４を設けるような構成としてもよい。レンズ１３ａは、円錐形状のレンズの先端部を切り取った形状を有する変形のアキシコンレンズである。レンズ１３ａは、より詳しくは、図１５のように、光が進むに従って光軸に近づくよう傾斜する角度を持つ円錐形状の周辺部、すなわち光軸方向に負の傾斜角を有する周辺部と、光軸に垂直な平面であって、標本Ｓ側の平面である中心部とを含むレンズである。レンズ１３ａに入射した光束は、周辺部を通過する光束と、中心部を通過する光束とにわかれる。周辺部を通過した光束は、一度ベッセルビームを形成した後に輪帯状の光強度分布を有する発散光束となる。ここで、レンズ１３ａの光路の後側に、周辺部を通過した光束をコリメートするようなレンズ群４により周辺部を通過した光束を第１の光束とすることができる。また、中心部を通過した光束は、レンズ１３ａの光路の後側のレンズ群により第１の光束の内径よりも小さい径を有するような第２の光束となる。従って、レンズ１３ａによっても、第１の光束と第２の光束とを一度に形成することができる。

以下、第４の実施形態におけるライトシート顕微鏡４００について説明する。図１６は、ライトシート顕微鏡４００の部分的な構成を示す図である。尚、ライトシート顕微鏡４００は、照明光学系５０の代わりに照明光学機構５２を備える点、可変位相素子７の代わりに観察時に固定の位相素子１６を備える点以外は、ライトシート顕微鏡１００と同様の構成である。位相素子１６は、例えば、組立時に適正に厚みが選択されたガラス板であっても良い。また、図１６では、観察光学系５１以降の構成を省略している。

照明光学機構５２は、変調光学系１０１からの照明光を分割する光路分割素子１４と、光路分割素子１４によって分割された一方の光路上に、電動シャッタ１５と、位相素子１６と、ミラー１０ａと、第１の照明光学系５０ａとを備え、さらに光路分割素子１４によって分割されたもう一方の光路上に、ミラー１７と、電動シャッタ１８と、ミラー１０ｂと第２の照明光学系５０ｂと、を備える。

電動シャッタ１５、１８は、電気制御によりシャッタが開閉し、光束を選択的に通過させ、また遮光する。

位相素子１６は、入射する光束である第１の光束と第２の光束のいずれか一方に作用し、その光束の位相量を変更するような変調光束移動手段である。例えば、位相素子１６は、第１の光束の内径よりも小さく第２の光束の径よりも大きい位相素子であり、第１の光束に作用せず、第２の光束に作用するような位相素子である。

また、位相素子１６は、観察時において選択可能に構成されている。即ち、利用者が、照明光学系５０ａと照明光学系５０ｂが標本Ｓに形成する領域iの照明パターンの明線と暗線の位置が反転するような位相素子１６を適切に選択することで、第１の実施形態と同様に、領域iの照明パターンが形成されるＸ軸上の全ての領域が、領域iの照明パターンの明線部分により照射されるようにすることができる。また、位相素子１６は、光路分割素子１４によって分割されたもう一方の光路（図１６の下の光路）に配置されてもよい。即ち、位相素子１６は、第１の照明光学系５０ａを通過する光、または、第２の照明光学系５０ｂを通過する光の位相を変更する。このように位相素子１６が、装置の組立時に適正なものに選択可能に構成されていることにより、装置の組立性を良くすることが出来き、観察時は一つの位相に固定するので繰り返し精度を高くすることが出来る。

なお、ライトシート顕微鏡４００は、位相素子１６を含まない構成とすることもできる。例えば、照明レンズ１２ａ又は照明レンズ１２ｂの位置を装置の組立時に調整して標本Ｓに形成される領域iの照明パターンの明線と暗線の位置が反転するようにしても良い。即ち、ライトシート顕微鏡４００は、ライトシート顕微鏡１００における照明光学系５０の代わりに照明光学機構５２を備えた構成とすることで、照明レンズ１２ａ又は照明レンズ１２ｂの位置を適宜調整して、第１の実施形態と同様に、領域iの照明パターンが形成されるＸ軸上の全ての領域が、領域iの照明パターンの明線部分により照射されるようにすることができる。

ミラー１０ａ、１０ｂはミラー１０と同様に、角度を変更可能なミラーであり、標本Ｓに照射される照明光の位置を変更する。

第１の照明光学系５０ａは、照明光学系５０と同様の構成であり、レンズ群１１ａと、照明レンズ１２ａを含む。また、第２の照明光学系５０ｂについても、照明光学系５０と同様の構成であり、レンズ群１１ｂと、照明レンズ１２ｂを含む。また、第１の照明光学系５０ａと、第２の照明光学系５０ｂは、図１６のようにそれぞれＸ軸方向であって１８０度反対側から、標本Ｓを照明する。

このような構成では、第１の照明光学系５０ａと第２の照明光学系５０ｂとによって標本Ｓに形成される領域iの照明パターンは、それぞれ明線と暗線の位置が反転した照明パターンとなる。即ち、ライトシート顕微鏡４００は、照明光学機構５２によって二種類の照明パターン（明線と暗線の位置が反転した照明パターン）を選択的に形成することができ、領域iの照明パターンが形成されるＸ軸上の全ての領域を領域iの照明パターンの明線部分により照射することができる。

従って、ライトシート顕微鏡４００によっても、観察光学系５１の焦点深度内に含まれてしまう１次のサイドローブによる背景光の影響を抑制することができる。特に、本構成では、ライトシート顕微鏡４００内の位相素子１６は固定されており、位相素子１６がライトシート顕微鏡１００の光学素子（可変位相素子７）のように電気的（若しくは物理的な）制御を受けることなく、標本Ｓの観察を行なうことができる。従って、ライトシート顕微鏡１００に比べて、標本Ｓに照射される照明光の位置の再現性を向上させることができる。

また、電動シャッタ１５、１８として、電気的に光の遮光量を制御する液晶素子や、ＤＭＤを用いてもよい。

以下、第４の実施形態のライトシート顕微鏡４００の変形例について説明する。

図１７は、ライトシート顕微鏡４００の照明光学機構５２ａに関する１つ目の変形例について説明する図である。ライトシート顕微鏡４００の照明光学機構５２ａは、電動シャッタ１５、１８を備えず、挿脱可能な反射ミラー１４ａを備える構成としてもよい。即ち、反射ミラー１４ａを挿脱することで、第１の照明光学系５０ａと第２の照明光学系５０ｂとにより選択的に標本Ｓを照明することができる。

図１８は、ライトシート顕微鏡４００の照明光学機構５２ｂに関する２つ目の変形例について説明する図である。ライトシート顕微鏡４００の照明光学機構５２ｂは、電動シャッタ１５、１８を備えず、角度変更制御が可能な反射ミラー１４ｂを備える構成としてもよい。反射ミラー１４ｂは、例えば、ガルバノスキャナやＭＥＭＳミラーであり、反射ミラー１４ｂの向きを変更することで、第１の照明光学系５０ａと第２の照明光学系５０ｂとにより選択的に標本Ｓを照明することができる。

以上のように、図１７、図１８で説明した変形例によれば、電動シャッタ１５、１８を構成から外すことにより、装置全体を小型化することができる。

図１９は、ライトシート顕微鏡４００の照明光学機構５２ｃに関する３つ目の変形例について説明する図である。本変形例では、光路分割素子１４で分割された光束は、再び、図１９の光路結合素子２０によって一つの光路に併合される。そのため、照明光学機構５２ｃは、二つの照明光学系である第１の照明光学系５０ａと第２の照明光学系５０ｂを備えず、１つの照明光学系５０（第１の実施形態のライトシート顕微鏡１００が備えるものと同等）によって標本Ｓを照明する。

本変形例では、照明光学機構５２ｃは、光路分割素子１４で分割された一方の光路上に電動シャッタ１５と、位相素子１６と、を備え、もう一方の光路上にミラー１７と、電動シャッタ１８と、ミラー１９と、を備える。

従って、本変形例によれば、照明光学系を二つ備えないため、装置全体を小型化することができる。また、本変形例では、光路を二つに分割しているが、三つ以上に分割した構成とすれば、領域iの照明パターンの明線の領域と暗線の領域とが反転するような２パターンの位相変化量だけでなく、各光路毎に、より少量ずつ位相を変更するような照明パターンを形成することができる。

また、図１７、図１８、図１９で説明した変形例を組み合わせた構成も考えられる。例えば、図１９で説明した３つ目の変形例において、光路分割素子１４の代わりに、反射ミラー１４ａまたは反射ミラー１４ｂを備えた構成としてもよい。

尚、上述した実施形態は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。上述したライトシート顕微鏡は、特許請求の範囲に記載した本発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

１００、２００、３００、４００ ライトシート顕微鏡
１０１、１０１ａ、１０１ｂ、１０１ｃ、１０２、１０３ 変調光学系
２０１、２０２、２０３ 第１の光学系
３０１、３０２ 第２の光学系
５０、５０ａ、５０ｂ 照明光学系
５１ 観察光学系
５２ 照明光学機構
１ レーザ光源
２、９、１４、２０ ハーフミラー
３、４ａ アキシコンレンズ
４、６、１１、１１ａ、１１ｂ レンズ群
５、８、８ａ、８ｂ、８ｃ、１０、１０ａ、１０ｂ、１７、１９ ミラー
７ 可変位相素子
１２、１２ａ、１２ｂ 照明レンズ
１３ 遮光素子
１３ａ 変形のアキシコンレンズ
１５、１８ 電動シャッタ
１６ 位相素子
２２ 検出用レンズ
２３ 結像レンズ
２４ 撮像装置
２５ 画像処理装置
２６ 保持具
２７ 移動制御機構
Ａ ベッセルビームの中心光束
Ｂ 背景光
Ｃ 第１の光束
Ｄ 第２の光束
i、ii、ii、ａ、ｂ、ｃ 領域
Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｋ 線
Ｓ 標本

Claims (16)

1. 標本を照明する照明光学系の光軸と垂直な方向から、前記標本からの光を検出するライトシート顕微鏡装置であって、
   可干渉性を有する照明光を出射する光源と、
   前記照明光を集光し、前記標本に照射する前記照明光学系と、
   前記光源と前記照明光学系の間に配置された、前記照明光を変調する変調光学系であって、前記照明光から、輪帯状に光強度分布を有する光束である第１の光束と、前記第１の光束の内側に前記第１の光束の内径よりも小さな光束径を有する第２の光束と、を形成する変調光学系と、
   前記照明光学系により前記標本に形成される照明パターンを前記照明光学系の光軸方向に移動させる変調光束移動手段と、
   前記照明パターンが形成された前記標本を撮像する撮像装置と、
   前記標本の画像に基づいて、前記標本の画像を生成する画像処理を行なう画像処理装置と、を備える
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
   前記変調光学系は、
   前記照明光を分割する第１の光路分割素子と、
   分割された前記照明光のうち一方の光がたどる光路中で前記第１の光束を形成する第１の光学系と、
   分割された前記照明光のうちもう一方の光がたどる光路中で前記第２の光束を形成する第２の光学系と、
   前記第１の光束と前記第２の光束とを１つの光路中に併合する光路結合素子と、を含む
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
3. 請求項２に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
   前記第１の光学系は、リングスリットが設けられた素子であり、
   前記第２の光学系は、開口が設けられた素子である
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
4. 請求項１に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
   前記変調光学系は、リングスリットである第１の開口と、前記第１の開口の内側に形成された第２の開口を有する素子を含み、
   前記第１の開口は、前記第１の光束を作るように形成され、
   前記第２の開口は、前記第２の光束を作るように形成される
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
5. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
   前記変調光束移動手段は、前記第１の光束と前記第２の光束との間の位相差を変更する
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
6. 請求項５に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
   前記変調光束移動手段は、前記第１の光束または前記第２の光束の位相を変更する可変位相素子である
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
7. 請求項５または請求項６に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
   前記照明光学系は、第１の照明光学系と、第２の照明光学系と、を有し、
   前記変調光束移動手段は、前記第１の照明光学系を通過する光または前記第２の照明光学系を通過する光の位相を変更し、
   前記第１の照明光学系は、前記第２の照明光学系に対して１８０度反対から照明する
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
8. 請求項５に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
   前記変調光束移動手段は、前記第１の光束と前記第２の光束との間の光路長差を変更する
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
9. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
   前記変調光束移動手段は、前記照明光学系の焦点位置を変更する焦点変更手段である
   ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
10. 請求項１に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
    前記変調光学系は、
    前記変調光学系の光軸方向に負の傾斜角を有する周辺部と、前記変調光学系の光軸に垂直な平面である中心部と、を含むレンズである
    ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
11. 標本を照明する照明光学系の光軸と垂直な方向から、前記標本からの光を検出するライトシート顕微鏡装置であって、
    可干渉性を有する照明光を出射する光源と、
    前記照明光を集光し、前記標本に照射する前記照明光学系と、
    前記光源と前記照明光学系の間に配置された、前記照明光を変調する変調光学系であって、前記照明光から、輪帯状に光強度分布を有する光束である第１の光束と、前記第１の光束の内側に前記第１の光束の内径よりも小さな光束径を有する第２の光束と、を形成する変調光学系と、
    前記照明パターンが形成された前記標本を撮像する撮像装置と、
    前記標本の画像に基づいて、前記標本の画像を生成する画像処理を行なう 画像処理装置と、を備え、
    前記照明光学系は、第１の照明光学系と、第２の照明光学系と、を有し、
    前記第１の照明光学系は、前記第２の照明光学系に対して１８０度反対から照明する
    ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
12. 請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
    前記画像処理装置は、前記照明パターンが前記標本の第１の位置に形成されているときに前記撮像装置で取得した前記標本の第１の画像と、前記照明パターンが前記標本の前記第１の位置とは異なる前記標本の第２の位置に形成されているときに前記撮像装置で取得した前記標本の第２の画像と、を含む複数の前記標本の画像に基づいて、前記標本の第３の画像を生成する画像処理を行なう
    ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
13. 請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
    前記画像処理装置は、前記照明パターンが形成された前記標本の画像から、前記照明パターンの暗線を含む領域を除いた画像を生成する画像処理と、前記照明パターンの暗線を含む領域を除いた前記画像を含む複数の画像を張り合わせる画像処理と、を行なう
    ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
14. 請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載のライトシート顕微鏡装置であって、さらに、
    前記標本を固定する保持具を備え、
    前記保持具は、前記照明光学系に対する前記標本の位置を移動する移動制御機構を有する
    ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
15. 請求項１乃至請求項１４のいずれか１項に記載のライトシート顕微鏡装置であって、さらに、
    前記撮像装置へ前記標本からの光を導光する観察光学系を有し、
    前記観察光学系の開口数をＮＡ_ｄ、前記照明光学系の開口数をＮＡ_ｉとしたとき、以下の関係を満たすことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。
    ＮＡ_ｉ＜ＮＡ_ｄ ^２
16. 請求項１乃至請求項１５のいずれか１項に記載のライトシート顕微鏡装置であって、
    前記光源は、前記照明光として超短パルス光を発振し、
    前記照明光学系は、前記標本に前記光源からの前記照明光を照射し、多光子吸収を誘起する
    ことを特徴とするライトシート顕微鏡装置。