JP6282641B2 - 顕微鏡およびｓｐｉｍ顕微鏡検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、検出器上に試料を結像するための結像対物レンズと、結像対物レンズの焦点面内またはこの焦点面の付近の規定の平面内でシート光により試料を照明するための手段とを含む顕微鏡に関する。照明のための手段は、コヒーレント光を放射する照明源を含んでいる。

照明用ビーム経路および検出用ビーム経路が実質的に互いに垂直に配置されており、かつ試料が結像対物レンズの焦点面内で、しかも結像対物レンズの光軸に垂直にシート光により照明される顕微鏡は、選択的平面照明顕微鏡検査（ＳＰＩＭ）の方法に基づいて試料を調査するために設計されている。３次元の試料を、深度の異なる個々の平面内で１点１点走査し、その際に取得された画像情報を続いて試料の３次元の結像へと組み立てる共焦点レーザ走査型顕微鏡検査（ＬＳＭ）とは異なり、ＳＰＩＭ技術は、広視野顕微鏡検査を基礎としており、試料の個々の平面の光学的断面に基づく試料の画像表示を可能にしている。

ＳＰＩＭ技術の利点は、なかでも、画像情報の捕捉を行う速度が比較的速いこと、生物試料の退色の危険性が比較的小さいこと、および試料への焦点の侵入深度が比較的大きいことに在る。

原理的には、ＳＰＩＭ技術では、試料中に含まれているかまたは試料に導入された蛍光体を、いわゆるシート光へと成形したレーザ光により励起する。試料の深度で選択した平面を１つずつシート光により照明し、結像光学系によりこれらの試料面の画像を光学的断面の形態で取得する。このような静止したシート光による励起に実質的に同等なのは、結像対物レンズの焦点面内で、薄くて回転対称のレーザビームが高速で往復移動することである。これにより実質的に、つまり観察時間全体の時間平均では、シート光の形態が生じる。

ＳＰＩＭ技術は、例えば（非特許文献１）、（非特許文献２）、（特許文献１）、および（特許文献２）に記載されている。
図１では、最初にＳＰＩＭ顕微鏡の基本構造が示されている。照明源１の光は、照明光学系２によりシート光へと成形され、試料３へと誘導される。試料およびシート光は結像対物レンズ４の焦点面内に存在している。結像対物レンズ４の光軸は、試料３が照明される方向に対して垂直である。照明光学系２は一般的に複数の光学素子を含んでおり、これらの光学素子が、照明源１のコヒーレント光をコリメートし、それを基にシート光を成形する。現況技術では、一般的に照明光学系２が円柱レンズも含んでおり、この円柱レンズの平坦な側を試料に向け、アーチ状の側を照明源の方に向けている。以下に、現況技術から知られている構成に対して被写界深度を上昇させ、かつ影投射を減少させたシート光の生成が可能な、照明光学系２の複数の例を説明する。

独国特許出願公開第１０２５７４２３号明細書 国際公開第２００４／０５３０５５８号

シュテルツァー（Ｓｔｅｌｚｅｒ）他、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１、１４７７（２００６） シュテルツァー（Ｓｔｅｌｚｅｒ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５、１００７（２００４）

１方向（ｙ方向）では１μｍ未満の広がりであるが、ほかの２つの方向ではできるだけ大きく広がっている光分布（シート光）が望ましく、これに関しｙ方向ではシート光の上および下に光が存在しないことが望ましい。このシート光の上および下の光は、観察方向（ｙ方向）からの測定を妨害する可能性がある。

これまでに知られている解決策
ａ）干渉パターンは、ｙ方向では薄く、かつ原理的には理論的にｘ方向およびｚ方向に無限に広がることができるが、ただしｙ方向に周期的に連なっており、したがってシート光の外に非常に多くの光が存在している。

ｂ）ベッセルビーム（独国特許出願公開第１０２００７０６３２７４号明細書）は、理論的にはｚ方向に無限に広がることができ、ｙでは所望の直径を有しているが、ただしビームの外ではｙ方向で出力を非常に多く復活させる。すなわちベッセルビームをｘ方向にスキャンすると確かにシート光は得られるが、所望の平面の上および下に非常に多くの光出力が伴う。

ｃ）円柱レンズによる線焦点：円柱レンズによりｘ方向の焦点を生成することができる。すなわちこのビームをデフォーカスによりｚ方向にスキャンすると、同様にシート光を実現することができる。

円柱レンズは、入射するコリメートされたレーザビームから、ｘ方向の線焦点を成形する（円柱レンズの後ろに間隔ｆをあけて）。この線焦点をｚ方向に変位することができる（デフォーカス、例えば変位可能なレンズまたはＳＬＭによる焦点距離ｆの変更によって実現可能）。ただし、この線焦点はｚ方向の広がりが非常に小さく（ＤＯＦ≒λ／ＮＡ^２、ＤＯＦ＝焦点深度）、この広がりは、線焦点がｙ方向で薄くなればなるほど、ますます小さくなる。

例：ＮＡ＝０．５→λ＝０．４８８μｍの場合、ＤＯＦ≒λ／ＮＡ^２≒２μｍとなる。
上に挙げた解決策の欠点は、単一ビームの広がりが小さいということ、またはビームをスキャンしなければならないという必要条件である。さらに、ベッセルビームの場合はｙ方向に、およびｘ線焦点の場合はｚ方向に、非常に多くの光が存在しており、この光は試料を退色させる可能性がある。したがって、さらなる目標は、光の焦点の広がりを大きくすることである。

本発明は独立請求項の特徴によって特徴づけられる。
好ましい変形形態は従属請求項の対象である。
特許請求項は、明確に本発明の開示内容に含まれている。

本発明は、「ＳＰＩＭ」顕微鏡検査のための顕微鏡ならびに帰属の顕微鏡方法ならびに顕微鏡の動作方法ならびに特許請求項に挙げたＳＰＩＭ顕微鏡検査のためのＳｉｎｃフィルタおよびマシュービームの有利な使用に関する。

これに関し、本発明により以下のことを提案する。
ｚ方向における伝播不変性のまたは、明確に規定された分布は、光の周波数スペクトルにおけるｚ成分を制限することによって得られる。各々のｚ成分には、「伝播」により、もう１つの位相シフトが生じるので、周波数スペクトルのｚ成分をフィルタ関数によって限定することが有利である。とりわけ、ｚ方向のフィルタ関数としてＳｉｎｃ（ｚ）関数を使用することが提案される。

原理的には、Ｓｉｎｃ（ｚ）＾２関数のようなその他の関数も考えられるが、Ｓｉｎｃ関数は、ｚでの（理想的に）一定のプロフィルを可能にするという特別な利点を提供する。

もちろん、正確なフィルタ関数はさらに最適化することができ、それゆえＳｉｎｃ関数はここでは、ｚ方向において比較的大きな領域にわたり、軸上でのほぼ一定のビームプロフィルを可能にする関数のために特に有利として挙げられている。

つまり、本発明によれば、線焦点の広がりは、ｚ方向では、円柱レンズの前のＳｉｎｃ（ｚ）フィルタによって大きくすることができる。このためにＳｉｎｃ（ｚ）フィルタはｙ方向に変形され、ｙ方向のフィルタとして実現される。ただし、これに関しては、Ｓｉｎｃ関数は正および負の値を有するので、構造が比較的複雑なフィルタが必要である。純粋な振幅フィルタは正の値しか透過できない。フィルタ透過の負の値は、λ／２の位相シフトに相当する。ただし、追加的な例えばλ／２の位相シフトにより負の値も透過することができる。このフィルタ関数はｘ方向では一定であることができる。

図２は、このような、複素フィルタの理論的に理想的な透過軌道の一例を示している。コリメートされたレーザビームＬＫが概略的に示されており、このレーザビームは、使用された光学系の瞳内に配置された空間フィルタＦを通り抜け、この空間フィルタにより振幅および位相において影響を及ぼされる。対応する空間的な光分布は、変調されたレーザビームＭＬとして概略的に示されている。

ここでは、最初に空間周波数フィルタｓｉｎｃ（ν_ｚ）が示されている。
照明方向において、円柱レンズＺＬおよび生成されたシート光ＬＢが続いている。ｓｉｎｃ（ν_ｚ）は、エヴァルトの方程式によりν_ｙ方向にリスケーリングされたν_ｙ＝０（軸上）でゼロ位のＳｉｎｃに相当することが有利である。したがって、ｙ軸上に投射されたＳｉｎｃ（ν_ｚ）はｚ方向での広がりを生じさせる。

ただし、ν_ｙ軸に投射されたＳｉｎｃ（ν_ｚ）は、未だ、ｙ方向でのビームプロフィルを理想的には制限していない。したがって、ｙ方向に投射されるｓｉｎｃ（ν_ｚ）は、例えばｓｉｎｃ（ν_ｙ）と（掛け算で）重ね合わされる。すなわち、このｓｉｎｃ（ν_ｙ）がシート光をｙ方向において制限し、その一方で、ν_ｙ軸に投射されたＳｉｎｃ（ν_ｚ）はシート光を特定のｚ距離にわたって一定にする。

両方のＳｉｎｃ関数は、影響し合う。すなわち、小さなｙ広がりは、広げられたｓｉｎｃ（ν_ｙ）を必要とし、この広げられたｓｉｎｃ（ν_ｙ）は、例に示したように、例えば投射されたｓｉｎｃ（ν_ｚ）に相当するのが望ましい。

これにより、この例では、ＤＯＦ≒８μｍを達成することができる。さらなる例を以降のページに挙げる。
さらなる一例では、実質的にｘ軸に沿って一定に形成された円柱光学系を用いる代わりに、通常の回転対称な例えば球面を有する光学系を用いてもシート光を実施することができる。この場合、ｚ方向のフィルタ関数（Ｓｉｎｃ（ν_ｚ））は、回転対称の関数としてｘ−ｙ平面内に投射され、そして、ｙでの所望の制限ならびにｘおよびｚでの所望の広がりを得るため、１つまたは２つのさらなるｘおよびｙのフィルタ関数と掛け合わされ、つまり、例えばｙ方向において薄いシート光のためのｙ方向での非常に広いｓｉｎｃ（ν_ｙ）関数およびｘ方向での大きな広がりのためのｘ方向での非常に狭いｓｉｎｃ（ν_ｘ）関数と掛け合わされる。

図３では、図２のＹ軸に沿った、Ｙ／Ｚ切断面に沿った断面での、３つのフィルタ関数（ｘ、ｙ、ｚ）を重ね合わせた振幅分布Ａを例示的に示している。
こうすることで意外にも、図示した円柱レンズのようなアナモフィック光学系を使用しなくても、ｙ方向で約１μｍの厚さで、ｚ方向で１０μｍの焦点長さの、広げられた線焦点（波長０．４８８μｍ）を実現することができる（１００μｍ×１０μｍ×１μｍ Ｘ×Ｚ×Ｙ）。

さらに、１００μｍ×１００μｍ×４μｍ（ｘの幅×ｚの深度×ｙの厚さ）のシート光を実現することができる。
軸上（角度ゼロ）で、Ｓｉｎｃ関数は単純に重なり合っており、かつ相互に「破壊」し合っており、つまり常にその時々のより小さな幅のＳｉｎｃ関数が優位である（図３も参照）。

Ｓｉｎｃ関数を互いから分離するため、つまり、できるだけ多くの周波数情報を伝送するために、軸外で対物レンズの瞳内に、理想的にはできるだけ大きな開口で（例えば対物レンズのＮＡ＝１の場合にＮＡ＝０．８５で）フィルタを設けることができる。これにより意外にも、さらに厚さの小さいシート光、例えば１００μｍ×１００μｍ×２μｍ（ｘ×ｚ×ｙ）が可能である。一般にＳｉｎｃ関数のゼロ点は、照明光学系の瞳内で自由に選択することができる。

ｙの直径が１μｍの、より小さいシート光も可能である（例えば波長０．５μｍで１０μｍ×１００μｍ×１μｍ Ｘ×Ｚ×Ｙ）。とりわけ、この新規のフィルタにより、側方の広さが大きいと同時にｙ方向の厚さが小さく、かつｙ方向でのシート光の外の光が少ないシート光を生成することができ、このシート光は、現況技術から知られている例えばガウスビームとしての、ｘもしくはｚでの寸法が少なくとも２倍大きいシート光、またはベッセルビームもしくは２ビーム干渉パターンとしての、ｙ方向でのシート光の外の光強度が少なくとも１０分の１のシート光より明らかに優れている。

このシート光はさらに、ｚ方向にもｘ方向にも延びていることができる（瞳内でのフィルタの位置に応じて）。これは構成を特に柔軟にする。
シート光をｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向に変位させるために（焦点またはシフト）、シート光を位相関数によって変調することができる。つまり、このシート光は、例えばＳＬＭ（空間光変調器）を用いて、その空間全体を移動（スキャン）することもできる。このＳＬＭは単独でまたは振幅フィルタと協働して用いられ、シート光の変位を例えばｙ方向で生じさせる。これにより、例えばｙ方向からの観察ビームによる試料全体の共焦点スキャンが可能である。

さらに、複数のＳｉｎｃ＾３フィルタ、したがって、シート光を、相並べてまたは重ね合わせて配置することができる。これによりシート光面を拡大することができ、または例えばＳＴＥＤのために、励起領域の周縁での追加的な脱励起を促すことができる。

例えば、デフォーカスまたは位相シフトなしで２つのＳｉｎｃ＾３フィルタを瞳内に設けることにより、シート光を変調（構造化）することができる。これにより、変調周波数を自由に調整することができる。発生する干渉場は、ＳＩＭ（ＺＥＩＳＳ Ｅｌｙｒａ Ｓ．１）または構造化された照明を用いる類似の方法に利用することができる。シート光の厚さをさらに小さくすることができ（例えば０．７μｍ）、その際、シート光の広がりはより小さくなる。

数式および定義
ＳＩＮＣ関数：

エヴァルトの方程式：

軸外：軸外位置ｒν_ｘで：

したがって

特別な場合：ν_ｘ＝０で軸上位置：

後の図４に基づく表示では右上および左上にそれぞれ、生成されたｓｉｎｃ（ν_ｚ）関数がＺ軸に沿って、異なるピーク配置で示されている。

ピークを中心に配置すると、より良いＺプロフィルが生じることが明らかになっている。
左下には例として、

でのＳｉｎｃ（ν_ｚ）を示しており（左の図、ν_ｚ軸は右に向かっている）、右下では同じＳｉｎｃ（ν_ｚ）フィルタが、エヴァルトの方程式に基づいて横座標に投射されている（右の図）。すなわち、この軌道は、ｚ方向での相応の部分的に一定の軌道を得るために用いなければならない瞳内の複素フィルタに対応している。

この本発明による、ｓｉｎｃ（ν_ｚ）関数のエヴァルトの方程式に基づくｙ方向へのリスケーリング（変形または投射）は、意外にも非常に有利である。
図５の表示はそれぞれ、最初に左上に、図４で右下に示したようなサイドの主ピークを有する断面画像としての、瞳内の複素フィルタとしてのＳｉｎｃ（ν_ｚ）フィルタを示している。中央上では、瞳内にＳｉｎｃ（ｚ）フィルタが配置されたレンズ（対物レンズ）の理想的な焦点位置（ｚ＝０）でのｘ−ｙ平面の断面（フィルタを有するシステムの点広がり関数ＰＳＦ）（対数スケーリング）を示しており、右上にはｙ−ｚ軌道（ｚ、すなわち光の伝播方向に沿って）を示している。

下の列には左から右へと、上記の素子が、右側の実際の光分布に対応するリニアスケーリングで示されている。
左下：ｘ−ｙ平面（ｚ＝０）の断面 − リニアスケーリングでのＰＳＦ
中央下：ｘ−ｚ軌道
右下：ｙ−ｚ軌道、リニアスケーリング、「光針」の左の領域へのズーム。

十分に長いＺ軌道にわたって、方向を強く一定に制限されたビーム軌道が達成できるのが有利であることが明らかになっている。
一般的なＳｉｎｃ＾３フィルタ
ａｒｇ_ｘ＝π［ν_ｘ−ｒν_ｘ］／Δ_ｘ
ａｒｇ_ｙ＝π［ν_ｙ−ｒν_ｙ］／Δ_ｙ

複素フィルタ

図６の表示は、上では例として、本発明に基づく瞳内での片側の軸外関数を対数スケーリングまたはリニアスケーリングで示しており（左上および左下）、Ｘ−Ｙ方向（中央上）およびＸＺ方向（中央下）での焦点内の照明状況を示しており、かつ光のｙ／Ｚ分布を対数スケーリング（右上）およびリニアスケーリング（右下）で示している。

図７では、瞳内で形成された非対称で片側のｓｉｎｃ関数ＦＳｉｎｃの例を部分的に認識することができる。

ＳＰＩＭ顕微鏡の基本構造を示す図。 複素フィルタの理論的に理想的な透過軌道の一例を示す図。 図２のＹ軸に沿った、Ｙ／Ｚ切断面に沿った断面での、３つのフィルタ関数（ｘ、ｙ、ｚ）を重ね合わせた振幅分布Ａを示すグラフ。 （右上）生成されたｓｉｎｃ（ν_ｚ）関数を示すグラフ。（左上）生成されたｓｉｎｃ（ν_ｚ）関数を示すグラフ。（左下）Ｓｉｎｃ（ν_ｚ）の例を示すグラフ。（右下）図４左下のＳｉｎｃ（ν_ｚ）をエヴァルトの方程式に基づいて横座標に投射したグラフ。 （左上）瞳内の複素フィルタとしてのＳｉｎｃ（ν_ｚ）フィルタを示す図。（中央上）瞳内にＳｉｎｃ（ｚ）フィルタが配置されたレンズ（対物レンズ）の理想的な焦点位置（ｚ＝０）でのｘ−ｙ平面の断面図。（右上）ｙ−ｚ軌道を示す図。（左下）ｘ−ｙ平面（ｚ＝０）の断面図。（中央下）ｘ−ｚ軌道を示す図。（右下）ｙ−ｚ軌道を示す図。 （左上）本発明に基づく瞳内での片側の軸外関数を対数スケーリングで示す図。（左下）本発明に基づく瞳内での片側の軸外関数をリニアスケーリングで示す図。（中央上）Ｘ−Ｙ方向での焦点内の照明状況を示す図。（中央下）ＸＺ方向での焦点内の照明状況を示す図。（右上）光のｙ／Ｚ分布を対数スケーリングで示す図。（右下）光のｙ／Ｚ分布をリニアスケーリングで示す図。 瞳内で形成された非対称で片側のｓｉｎｃ関数ＦＳｉｎｃの例を示す図。 ａ）一般的な実現例のＹ／Ｚ平面に沿った概略的な断面図。ｂ）一般的な実現例のＸ／Ｚ平面に沿った概略的な断面図。 ａ）ガウス状レーザビームＬＳからのマシュービームＭＳの生成を光学的な照明軸ｚに沿って概略的に示すＺ平面での側断面図。ｂ）ガウス状レーザビームＬＳからのマシュービームＭＳの生成を光学的な照明軸ｚに沿って概略的に示すＺ平面での側断面図。ｃ）レンズ構成Ｌの手前の焦点面内の照明状況を示す図。 ａ）円柱レンズ構成の後ろに配置されたアキシコンＡＸによってマシュービームが生成されることを示す図。ｂ）強度変調器ＩＭの後ろに配置されたアキシコンＡＸによってマシュービームが生成されることを示す図。ｃ）円柱レンズ構成と強度変調器の組合せの後ろに配置されたアキシコンＡＸによってマシュービームが生成されることを示す図。 （上）生成されたマシュービームの照明分布を光軸におけるｚ０位置でのＸＹ平面において示す図。（下）生成されたマシュービームの照明分布を光軸ｚに沿った切断でのＸＺ平面において示す図。

図８：一般的な実現化（例として）
上述の複素フィルタは、瞳内の１つの単純な複素フィルタによって実現することができる（これに対応してＦ（ν_ｘ，ν_ｘ））。ただし、ほとんどどこでもＦ（ν_ｘ，ν_ｘ）＝０なので、この場合は非常に低い透過率となる。

その代わりに、２つのフィルタで非常に高い透過率を達成することができる。第１のフィルタ１は、瞳内で所望の強度を生成するように設計されており、この強度はフィルタの振幅に対応している。フィルタ１は、例えばＣＧＨ（計算機合成ホログラム）として設計することができ、既知の方式に基づいて簡単に計算および作製することができる。この場合の第２のフィルタは、（下で概略的に示したように）純粋な位相素子であり、この位相素子は、複素フィルタの透過の負の値を、単純なλ／２の位相ジャンプによって生成する。

これらのフィルタは、コリメートされた、またはあらゆる任意のその他の入射するコヒーレントレーザビームのために設計することができる。
図８の例では、屈折力の一部が第１のフィルタから、コリメータ（ビーム成形望遠鏡）に移されている。

図８の表示は、ａ）ではＹ／Ｚ平面に沿った概略的な断面を、ｂ）ではＸ／Ｚ平面に沿った概略的な断面を示している。照明方向において、ビーム成形のための素子（望遠鏡ＴＬ）の後ろに、振幅フィルタであり得る第１のフィルタＦ１と位相フィルタとしての第２のフィルタＦ２との組合せが続いており、この第２のフィルタＦ２が光学系Ｏの入射瞳内に配置されていることが有利である。

光学系Ｏは標準的な対物レンズであることができる。
Ｆ１およびＦ２は２つの位相フィルタであってもよい。このＦ１およびＦ２は一緒に入射瞳内の光分布を生成し、この光分布は、光が光学系Ｏを通過した後に生じる光分布のための空間フィルタ関数としての３次元の（Ｘ、Ｙ、Ｚ）ｓｉｎｃ関数に対応している。

この複素フィルタ関数により、Ｚ方向に広げられた平面的な光分布ＬＶが、Ｙ方向（光面に垂直）では有利には５マイクロメートルの範囲より小さい（それどころか最大で２マイクロメートルより小さい）非常に少ない広がりで生じる。

上述のフィルタ組合せの実現および製造については、補充的および例示的に下記の文献を参照されたい。
「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｂｅａｍｆｏｒｍｅｒ」、アイスマン（Ｅｉｓｍａｎｎ）、タイ（Ｔａｉ）、セダークィスト（Ｃｅｄｅｒｑｕｉｓｔ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ Ｖｏｌ．２８、Ｎｏ．１３、１９８９年７月１日。

マシュービーム
国際公報第２００４／０５３５５８号では、シート光による平面的な照明のほかに、「線状の」点状光ビーム（そこでは図７）のスキャン移動によってシート光を生成し得ることが記載されている。この場合、試料と照明の相対移動は、試料または平面的な照明領域を生成するための光ビームの移動によって行うことができる。

そもそも、バーコードスキャナの照明ビームを成形するためのマシュービームの使用が米国特許出願公開第２００３／０１８９０９７（Ａ１）号明細書から知られている。
マシュービームは、ｚ方向においてほぼ伝播不変性であり、すなわちマシュービームのｘｙ平面でのビームプロフィルはｚ位置にはほとんど左右されない。ｚ方向では、ｙ方向での広がりが約１μｍの線焦点が可能である。このビームは確かにｙ方向に拡散するが、これは抑制することができる。したがって、観察方向（ｙ方向）では観察ビームの開口内に妨害光が存在しないので、マシュービームを用い、ｘ方向にスキャンすることにより、意外にもＳＰＩＭシート光を実現することができる。

周波数領域では、マシュービームは２つの相対する周波数寄与分からなり、これはｘ方向でビームの高周波変調を生じさせる。この変調は、両方の周波数寄与分の一方をブロックすること、例えば瞳の半分を遮蔽するか、またはマシュースペクトルの半分だけを生成することにより抑制できることが有利である。

物理的な根拠については、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｔｈｉｅｕ ｂｅａｍｓ」、Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９５（２００１）、３５−４０を参照のこと。

以下に、上述のＳＰＩＭを適用する際に特に有利に使用できるような、１方向で強く制限されたマシュービームを生成するための有利な光学的構成を説明する。
図９ａ）および図９ｂ）ではそれぞれ、ガウス状レーザビームＬＳからのマシュービームＭＳの生成を、光学的な照明軸ｚに沿って、Ｚ平面での側断面において概略的に示している。

図９ｃ）は、レンズ構成Ｌの手前の焦点面内の照明状況を示しており、この焦点面内にリング絞りＲＢが配置されている。リング絞りは、マシュービームを生成するため、楕円形のガウスビームによって照明されなければならない。この光分布を生成するための有利な方式が図９ａ）に示されている。この場合、２つの適切な円柱レンズＺＬ１、ＺＬ２からなる円柱レンズ構成が、必要な楕円形の照明分布を生成する。リング絞りを通り抜ける際、リング絞りは照明分布によって部分的にのみ捕捉され、瞳面内では２つの対称的な半円状の部分Ｒ１、Ｒ２が生じ、このＲ１、Ｒ２が、その後の軌道でレンズ構成の後ろに、ｙ制限されたマシュービームを生成する。

例えば、リング絞りを部分的に閉じることにより、両方の部分Ｒ１またはＲ２の一方を遮蔽すると、マシュービームとは異なって周期的な構造を有さず、ｙ方向で制限されたビームを生成することができる。

原理的にはもちろん、図９ｃに基づく２つの半円状の領域を生成するために、楕円形のビーム断面の代わりに、上および下が覆われたリング絞りを形成することが考えられる。
図９ｂでは、円柱レンズによるビーム成形の代わりに、「空間光変調器」（ＳＬＭ）のような平面的な光変調器が、ガウス状レーザビームの後ろに配置されており、この光変調器は、ここでも図９ａでのようにマシュービームを生成するため、リング絞りの必要な領域だけに光を当てることができる。

しかし、原理的には、手前の焦点面内にリング絞りの代わりにＳＬＭを配置し、図９ｃ）に示したような部分リング領域だけを放出することもできる。
図１０ａ）〜図１０ｃ）では、円柱レンズ構成（１０ａ）、強度変調器ＩＭ（１０ｂ）、または円柱レンズ構成と強度変調器の組合せ（１０ｃ）の後ろに配置されたアキシコンＡＸによってマシュービームが生成されている。

円柱レンズ構成によってここでも楕円形の光分布が生成され、したがって、アキシコンにリング状の光分布は当たらず、よって、ベッセルビームではなくマシュービームが生成される。

図１０ｂでは、図９ｂに類似してここでも強度変調器ＩＭがこのビーム成形を担っている。
ここでは、径方向にスケーリングされた楕円形でガウス状の強度分布をアキシコン上に生成する強度影響により、ベッセルビームとマシュービームの混合を回避できることが利点である。

図１０ａ〜図１０ｃの右には、左横にある図に対してアキシコンに届く強度分布が示されており、それぞれ左には楕円形のガウス分布による強度分布が、またｂ）およびｃ）では右側に光変調器によって生成された径方向にスケーリングされたガウス分布による強度分布が示されている。

ＩＭによりそれぞれ、図示したように照明分布の中心領域が追加的にブロックされ、かつサイドの領域内でのみ径方向にスケーリングされた楕円形の分布が生成される。
図に制限されることなく、ＩＭ、ＳＬＭ、または適切なアナモフィック光学系により、ビーム成形のさらなる最適化を行うことができる。

マシュービーム生成のさらなる可能性は、レンズＬの手前の焦点面内にホログラムまたは回折性素子を設け、これをレーザで照明することである。回折性素子またはＳＬＭを使用する場合は、さらにレンズＬをなくすこともできる。

マシュービームは、ｘ方向での高周波の強度変調を示す。したがって、このビームは、構造化された照明により軸方向の解像度を上昇させるために利用することができる。この場合、１つの静止したマシュービームで試料の３つの蛍光画像が生成され、このビームは、各々の画像で位相をそれぞれｘ方向に１２０°シフトさせている。この３つの画像を計算処理し、結果的にセクショニングが高められた画像を得る。図１１では、例として、生成されたマシュービームの照明分布が、光軸におけるｚ０位置でのＸＹ平面において、または光軸ｚに沿った切断でのＸＺ平面において示されている。Ｙ方向でのビームプロフィルの有利な制限が明らかになっている。

Ｘ方向は、平面的な光分布を生成するためのスキャン方向に相当する。

Claims (13)

1. 試料（３）から第１の開口角内に放射された光を、結像対物レンズ（４）により第１の方向ｙで受光する結像光学系、
   該試料（３）から該第１の開口角内に放射され、該結像光学系によって受光された光を検出するための検出機構、
   波長λの照明光源（１）と、該第１の方向ｙに対して実質的に垂直な第２の方向ｚにおいて該試料（３）を照明光分布で照明するための照明用ビーム経路とを含む照明機構
   を備える顕微鏡において、
   該照明機構が、該第２の方向ｚの一区間（ＬＺ）内では該照明光分布が実質的に一定となる手段を有しており、
   該第１の方向ｙの広がり（ＬＹ）の領域外での該第１の開口角によって開かれた円錐内では、照明光の出力が２０％未満であり、その際、
   ＬＹ＜２λ、
   ＬＺ＞８λ
   が当てはまり、
   前記手段が空間周波数スペクトルにおけるｚ成分を制限するＳｉｎｃ（ｚ）フィルタ関数を有するフィルタを含むことを特徴とする顕微鏡。
2. 前記手段が、前記照明機構の瞳内への光分布を実質的に円形の領域内に制限する複素フィルタを含む、請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記複素フィルタが、前記照明機構の前記瞳内に、少なくとも２つのＳｉｎｃ関数の重ね合わせからなる照明光分布を生成する、請求項１または２に記載の顕微鏡。
4. 前記両方のＳｉｎｃ関数の一方が、エヴァルトの方程式に対応して好ましくはＸ−Ｙ平面内に投射されたＳｉｎｃ（ｚ）関数に相当する、請求項３に記載の顕微鏡。
5. 前記複素フィルタが、前記照明機構の前記瞳内に、マシュービームのスペクトルに対応する照明光分布を生成する、請求項２乃至４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
6. 照明光源（１）と、シート光により前記試料（３）を照明するための照明用ビーム経路とを含む照明機構、
   前記試料（３）から放射された光を検出するための検出機構、
   前記試料（３）を、結像用ビーム経路内の結像対物レンズ（４）により、少なくとも部分的に該検出機構上に結像する結像光学系からなり、
   該シート光が、該結像対物レンズ（４）の焦点内または該結像対物レンズの幾何学的焦点の付近の規定の平面内では実質的に平らであり、かつ該結像対物レンズ（４）が、該シート光の平面とゼロとは異なる角度で、好ましくは垂直に交差する光軸を有しており、
   生じる空間周波数をｓｉｎｃ（ｚ）関数によってフィルタリングすることにより照明光を前記照明用ビーム経路の光学軸と平行である少なくとも１つの空間方向で制限することでＳｉｎｃ空間フィルタとして作用する振幅フィルタおよび位相フィルタのうちの少なくとも一つが、該照明用ビーム経路内に設けられている、顕微鏡。
7. 前記振幅フィルタおよび位相フィルタのうちの少なくとも一つが、少なくとも部分的には照明光学系の瞳面内または瞳面の付近に配置されており、
   かつ／または
   前記フィルタが、ホログラム（ＣＧＨ）および／または回折性光学系によって実現されており、
   かつ／または
   前記フィルタが、少なくとも部分的には、光のための空間変調器（空間光変調器（ＳＬＭ）によって構成されており、
   かつ／または
   前記シート光の光方向に垂直な変位が、ＳＬＭによって行われ、
   かつ／または
   前記シート光が変位する際に前記結像対物レンズの焦点面の変位が行われること、
   および／または
   非対称Ｓｉｎｃ関数／軸外分布が、該瞳面内で生成されること、および／または
   光軸に対して軸外で作用するｓｉｎｃフィルタが設けられており、
   かつ／または
   シート光構造化のために複数のＳｉｎｃフィルタが重ね合わされており、
   かつ／または
   エヴァルトの方程式によってリスケーリングされたｓｉｎｃ関数がフィルタ関数として提供されており、かつ／または
   照明用ビーム経路内で、ビーム成形のために前記フィルタとアナモフィック光学系が組み合わされている
   ことを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡。
8. 請求項１乃至７のいずれか１項に記載の顕微鏡の動作方法。
9. 照明光源（１）と、シート光により試料（３）を照明するための照明用ビーム経路とを含む照明機構、
   前記試料（３）から放射された光を検出するための検出機構、
   前記試料（３）を、結像用ビーム経路内の結像対物レンズ（４）により、少なくとも部分的に該検出機構上に結像する結像光学系からなり、
   該シート光が、該結像対物レンズ（４）の焦点内または該結像対物レンズの幾何学的焦点の付近の規定の平面内では実質的に平らであり、かつ該結像対物レンズ（４）が、該シート光の平面とゼロとは異なる角度で、好ましくは垂直に交差する光軸を有している顕微鏡において、
   ＳＰＩＭの際のシート光生成のためのマシュービームの使用を特徴とする顕微鏡。
10. ＳＰＩＭの際のシート光生成のための、スキャンするマシュービームの使用を特徴とする請求項９に記載の顕微鏡。
11. 照明光源（１）と、シート光により前記試料（３）を照明するための照明用ビーム経路とを含む照明機構、
    前記試料（３）から放射された光を検出するための検出機構、
    前記試料（３）を、結像用ビーム経路内の結像対物レンズ（４）により、少なくとも部分的に該検出機構上に結像する結像光学系からなり、
    該シート光が、該結像対物レンズ（４）の焦点内または該結像対物レンズの幾何学的焦点の付近の規定の平面内では実質的に平らであり、かつ該結像対物レンズ（４）が、該シート光の平面とゼロとは異なる角度で、好ましくは垂直に交差する光軸を有している顕微鏡において、
    強度変調器および／または位相変調器、とりわけ下に挙げた光学素子１）部分的なリング絞り、とりわけ２つの向かい合う半円からなる絞り
    ２）光のための空間変調器（空間光変調器（ＳＬＭ）
    ３）アキシコン
    ４）ホログラム
    ５）回折性素子
    の少なくとも１つによってマシュービームを生成するための手段を備える
    ことを特徴とする顕微鏡。
12. 前記リング絞りの前での楕円形ガウス分布の生成
    および／または
    前記リング絞りの前での、前記リング絞りの上および下の部分に当たらないガウス分布の生成、
    および／または
    アナモフィック光学系および／またはＳＬＭのような強度変調器によるビーム成形
    および／または
    前記アキシコン上での楕円形ガウス分布の生成
    および／または
    前記アキシコン上での、前記アキシコンの上および下の部分に当たらないガウス分布の生成、
    および／または
    光分布を最適化するための強度変調器の使用
    および／または
    光分布を最適化するためのアナモフィック光学系と強度変調器の組み合わせ
    および／または
    前記ビームの周期的な強度変調を回避するための前記マシュービームの周波数成分の抑制
    および／または
    構造化された照明の生成
    および／または
    平面検出器、とりわけＣＣＤ受光器またはＥＭＣＣＤ受光器またはＣＭＯＳまたはｓＣＭＯＳカメラ上でのラインごとの検出
    および／または
    平面検出器上での、該平面検出器の検出面積全体より小さい検出面積での平面的な検出を特徴とする請求項１１に記載の顕微鏡。
13. 請求項９乃至１２のいずれか１項に記載の顕微鏡の動作方法。