CN104428706A

CN104428706A - 显微镜和用于选择性平面照明显微术的方法

Info

Publication number: CN104428706A
Application number: CN201380034258.7A
Authority: CN
Inventors: J.西本摩根; W.辛格; T.安哈特; R.沃利申斯基
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2013-06-26
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2033-06-26
Also published as: EP2867715A2; US20150168732A1; CN107402442B; CN104428706B; WO2014005682A2; JP6282641B2; CN107402442A; DE102012013163A1; JP2015527604A; EP2867715B1; US10698225B2; WO2014005682A3; DE102012013163B4

Abstract

本发明涉及显微镜，该显微镜包括：照明装置，该照明装置包括照明光源(3)和用于以光片照亮样本(1)的照明光路；用于检测从样本(1)辐射出的光的检测装置；成像光学器件，该成像光学器件将样本(1)通过成像光路中的成像物镜(7)至少部分地在检测装置上成像，其中光片在成像物镜(7)的焦点中或在成像物镜的几何焦点附近的限定平面内基本上是平的，并且其中成像物镜(7)具有以非零角度与光片的平面相交的、优选地与光片的平面垂直相交的光轴，其中在照明光路中提供了通过如下方式作为Sinc空间过滤器起作用的幅度和/或相位滤波器，即该Sinc空间过滤器在至少一个空间方向上通过对于出现的空间频率以sinc函数滤波来限制照明光，和/或在至少一个空间方向上通过sinc滤波器函数对于照明光的相位和幅度进行限制，和/或在照明光路中提供了组合的幅度和相位滤波器，所述组合滤波器通过以sinc滤波器函数影响照明光分布的传输率进程来进行光片的成形。

Description

显微镜和用于选择性平面照明显微术的方法

技术领域

本发明涉及显微镜，所述显微镜包括用于将样本在检测器上成像的成像物镜以及用于在成像光学器件的焦平面内或在此焦平面附近限定的平面内以光片照亮样本的机构。用于照明的机构包括辐射出相干光的照明光源。

背景技术

其中照明光路和检测光路基本上相互垂直布置并且其中以光片在成像光物镜的焦平面内、即垂直于其光轴照亮样本的显微镜，被构造为用于根据选择性平面照明显微术(SPIM)的方法来检查样本。与其中三维样本在各个不同的深度的平面内被逐点扫描并且其中然后将所获得的图像信息组合为样本的三维图像的激光扫描共聚焦显微术(LSM)的差异在于，SPIM技术基于宽场显微技术并且实现了基于通过样本的各个平面的光学截面对于样本进行图像图示。

SPIM技术的优点包括：以更高的速度进行图像信息记录，生物样本的褪色的风险更低，以及焦点在样本内的更扩大的侵入深度。

原理上，在SPIM技术中，以激光激励包含在样本中的或引入到样本中的荧光团，这形成了所谓的光片。以此光片分别将样本的深度内的选择的平面照亮并且以成像光学器件获得具有光截面形式的此样本平面的图像。基本上与此使用静态光片的激励等价的是薄的旋转对称的激光束在成像物镜的焦平面内的快速往复运动。因此，有效地，即在观测的时间段内以时间平均的方式实现了光片的形状。

SPIM技术例如在如下文献中描述：Stelzer等人的Optics Letter 31,1477(2006)，Stelzer等人的Science 305,1007(2004)，DE 10257423A1和WO 2004/0530558A1。

在图1中首先图示了SPIM显微镜的基本结构。照明光源1的光通过照明光学器件2成形为光片并且偏转到样本3上。样本和光片处于成像物镜4的焦平面内。成像物镜4的光轴垂直于如下方向，样本3从该方向被照亮。照明光学器件2通常包括多个光学元件，所述光学元件将照明光源1的相干光准直并且由此形成光片。在现有技术中，照明光学器件2通常也包括多个柱透镜，所述柱透镜的平的侧指向样本并且其隆起的侧指向照明光源。在下文中将解释照明光学器件2的多个示例，以所述照明光学器件2可产生与现有技术中已知的设备相比带有高景深和小阴影的光片。

发明内容

问题提出

希望的是如下光分布(光片)，即所述光片在一个方向(y方向)上的伸展小于1μm，但在另外两个方向上尽可能宽地伸展，其中在y方向上在光片上方和下方应无光。在光片的上方和下方的此光将干扰从观测方向(y方向)的测量。

目前已知的解决方案

a)干涉图案可在y方向上是薄的并且原理上在x和z方向上理论上无限地伸展，但干涉图案在y方向上周期地延续，使得很多的光处于光片外。

b)贝塞尔光束(DE 10 2007 063 274 A1)可理论上在z方向上无限地伸展，在y方向上具有希望的直径，但又有很多的功率在y方向上处于光束外；如果在x方向上扫描贝塞尔光束，则虽然得到了光片，但使得很多的光功率处于与希望的平面上方和下方。

c)使用柱透镜的直线聚焦：使用柱透镜可产生在x方向上的聚焦；如果通过散焦在z方向上扫描光束，则也可实现光片。

柱透镜由入射的准直激光束形成在x方向上的直线聚焦(在柱透镜后方的距离f处)。所述直线聚焦可在z方向上移动(例如通过以可移动透镜或SLM改变焦距f来实现散焦)。此直线聚焦当然具有很小的在z方向上的伸展(DOF～λ/NA²，DOF＝景深)，其中在y方向上的直线聚焦越细则该伸展越小。

例如，NA＝5→在λ＝0.488μm时，有DOF～λ/NA²～2μm

以上的解决方案的缺点是单光束的小伸展，或要求必须扫描光束。此外，在贝塞尔光束的情况中在y方向上并且在x直线聚焦的情况中在z方向上具有很多的光，这可能使得样本褪色。另外的目的因此是放大光聚焦的伸展。

本发明的特征在于独立权利要求的特征。优选的扩展是从属权利要求的对象。权利要求详细地在本发明的公开中论述。本发明涉及用于“SPIM”显微术的显微镜，以及所属的显微技术方法，以及用于显微镜的运行方法，以及在权利要求中阐述的Sinc滤波器和马修光束的用于SPIM显微术的有利的使用。

为此，根据本发明给出如下建议：

通过限制光的频谱中的z分量获得在z方向上传播不变的或良好限定的分布。每个z分量通过“传播”经历了另外的相移，因此有利的是以滤波器函数限制频谱的z分量。特别地建议作为z方向上的滤波器函数使用Sinc(z)函数。

原理上也可构思另外的函数，例如Sinc(z)^2函数，但Sinc函数提供的优点是在z方向上实现(理想化的)恒定的轮廓。

当然，可进一步优化精确的滤波器函数，Sinc函数在此应特别地有利地用作在z方向上在大的范围内实现了在轴上的近似恒定的光束轮廓的函数。

直线聚焦的伸展因此根据本发明可在z方向上通过柱透镜前方的Sinc(z)滤波器放大。Sinc(z)滤波器为此变换到y方向上并且实现为y方向上的滤波器。为此，当然要求相对构建复杂的滤波器，因为Sinc函数具有正值和负值。单纯的幅度滤波器对于传输率可以仅取正值。滤波器的传输率的负值对应于为λ/2的相移。以附加的例如λ/2的相移也可实现对于传输率的负值。在x方向上滤波器函数可以是恒定的。

图2示出了对于复数滤波器的理论上理想的传输曲线的这种示例。图中示意性地图示了准直的激光束LK，所述激光束LK穿过布置在所使用的光学器件的光瞳内的空间滤波器F并且在幅度和相位上受到该空间滤波器影响。相应的空间光分布作为调制激光束ML示意性地图示。

在此首先刻画了空频滤波器sinc(ν_z)。

柱透镜ZL和所生成的光片LB在照明方向上跟随。sinc(ν_z)有利地对应于通过Ewald方程在ν_z方向上放缩的Sinc，其零位置在ν_z＝0处(轴线上)。因此在y轴上投影的sinc(ν_z)导致在z方向上的伸展。

在ν_y轴投影的sinc(ν_z)当然在y方向上仍非理想地限制光束轮廓。在y方向上投影的sinc(ν_z)因此例如与sinc(ν_y)(通过乘法)叠置；此sinc(ν_y)导致光片在y方向上被限制，而在ν_y轴投影的sinc(ν_z)导致光片在一定的z距离上保持恒定。

两个Sinc函数相互影响；小的y伸展要求拉伸的sinc(ν_y)，这如在该示例中示出那样应该大约对应于投影的sinc(ν_z)。

在该示例中，因此可达到DOF～8μm。另外的示例在下页中阐述。

在另外的示例中，作为使用基本上沿x轴恒定地形成的柱形光学器件来构成光片的替代，光片也可使用带有例如球面的常规的旋转对称的光学器件来构成。在z方向上的滤波器函数(sinc(ν_z))作为旋转对称的函数在x-y平面内投影并且与在x和y上的一个或两个另外的滤波器函数相乘，以获得在y方向上的希望的限制和在x和z方向上的希望的伸展，即例如与在y方向上的很宽的sinc(ν_y)相乘以用于在y方向上薄的光片以及与在x方向上的很窄的sinc(ν_x)相乘以用于在x方向上的大的伸展。

在图3中示例地在沿图2的Y轴，沿Y/Z截面的横截面中图示了由三个滤波器函数(x，y，z)叠置的幅度分布A。

以此方式令人惊奇地也可在不使用如所图示的柱透镜的变形光学器件的情况下实现伸展的直线聚焦，其焦距在z方向上为10μm而厚度在y方向上大致为1μm(波长0.488μm)(100μm×10μm×1μm，X×Y×Z)。

此外，可实现100μm×100μm×4μm的光片(宽度x乘深度z乘在y方向上的厚度)。

Sinc函数简单地叠置地处在轴线上(零角度)并且相互“干扰”，即带有更小的宽度的各Sinc函数更占优(也见图3)。

为了将Sinc函数相互分离，即传输尽可能多的频率信息，可在物镜光瞳内离轴地设置滤波器，理想地在尽可能大的孔径下(例如，在物镜中NA＝0.85至NA＝1)。因此，令人惊奇的是可实现厚度更低的光片，例如100μm×10μm×2μm(x乘y乘z)。当然，Sinc函数的零点在照明光学器件的光瞳内可自由选择。

带有在y方向上的1μm的直径的更小的光片也是可以的(例如，在0.5μm的波长情况下10μm×100μm×1μm，X×Y×Z)。特别地，可使用新的滤波器生成带有大的侧向伸展同时带有在y方向上的低厚度和在y方向上在光片外更少的光的光片，所述光片比现有技术中已知的光片明显更好，例如在x或z方向上是高斯光束的至少两倍的尺寸，或在y方向上在光片外比贝塞尔光束或双光束干涉图案具有至少小十倍的光强度。

光片也可在z方向上以及在x方向上走向(根据滤波器在光瞳内的位置)。这使得布置特别地灵活。

光片可使用相位函数调制，以使其在x、y和z方向上移动(聚焦或移动)。因此，光片可例如也使用SLM(空间光调制器)而通过空间运动(扫描)。此SLM单独地或与幅度滤波器组合地使用，并且导致光片的移动，例如在y方向上的移动。因此，对样本的共焦扫描可以以例如来自y方向的观测光束实现。

此外可将多个Sinc^3滤波器并且因此将多个光片并列或叠置布置。因此，光片面积可扩大或例如对于STED在激励区域的边沿上刺激出附加的去激励。

光片可调制(结构化)，这通过例如将两个Sinc^3滤波器引入到光瞳内而无散焦或相移来实现。因此，可自由调节调制频率。所形成的干涉场可用于SIM(ZEISS Elyra S.1)或类似的带有结构化照明的方法。光片厚度可进一步降低(例如，0.7μm)，其中光片的伸展更低。

数学公式和定义

SINC函数：

\sin c = (\arg) = \frac{\sin (π \cdot \arg)}{π \cdot \arg}

Ewald方程：

v_{2} = \sqrt{{(\frac{n}{λ})}^{2} - v_{x}^{2} - v_{y}^{2}}

离开轴线：离开轴线的位置rv_x：

因此

\arg_{z} = π [\sqrt{{(\frac{n}{λ})}^{2} - v_{x}^{2} - v_{y}^{2}} - {rv}_{2}] / Δ_{z}

特别地：具有v_x＝0的在轴线上的位置：

\arg_{z, onaxis} = π [\sqrt{{(\frac{n}{λ})}^{2} - v_{x}^{2} - v_{x}^{2}} - \frac{n}{λ}] / Δ_{z}

f_{v_{z}} (v_{x}, v_{x}) = \frac{\sin (\arg_{z})}{\arg_{z}}

在如下的根据图4的图示中，在右上侧和左上侧分别图示了沿Z轴线的所产生的sinc(ν_z)函数，带有不同地设定的最大值。

显见的是在最大值的中间布置的情况下得到了更好的Z轮廓。

左下侧示例地图示了sinc(ν_z)，其中ν_x＝0.5*NA/λ(λ＝0.488)(左图，ν_z轴线向右)，并且相同的sinc(ν_z)滤波器在右下侧根据Ewald方程投影在横坐标上(右图)；此走向对应于光瞳内的复数滤波器，必须使用所述复数滤波器以获得在z方向上的相应的逐段恒定的走向。

根据本发明的sinc(ν_z)函数的根据Ewald方程的在y方向上的放缩(转换或投影)令人惊奇地是特别有利的。

在图5中的图示首先在左上侧作为截面图示出了作为在光瞳内的复数滤波器的、带有侧向主最大值的sinc(ν_z)滤波器，如在图4中在右下侧图示那样，上部中间图示了在透镜(物镜)的理想的聚焦位置(z＝0)处通过x-y平面的截面，在该透镜(物镜)的光瞳内布置了sinc(ν_z)滤波器(带有滤波器的系统的点扩散函数PSF)，(按照对数标度图示)并且在右上方图示了y-z走向(其中z沿光的传播方向)。

在下行从左到右在线性标度中图示了以上的元件，这对应于在右侧上的实际的光分布：

左下侧：在线性标度中的x-y截面(z＝0)-PSF

中间下侧：x-z走向

右下侧：y-z走向，线性标度，在“光针”的左侧区域内放大。

显见，可以有利地在足够长的z走向上实现在方向上一直强烈受限的光束走向。

一般地，Sinc^3滤波器

\arg_{x} = π [v_{x} - {rv}_{x}] / Δ_{x}

\arg_{y} = π [v_{y} - {rv}_{y}] / Δ_{y}

\arg_{z, offaxis} = π [\sqrt{{(\frac{n}{λ})}^{2} - v_{x}^{2} - v_{y}^{2}} - {rv}_{2}] / Δ_{z}

复数滤波器

F (v_{x}, v_{x}) = f_{v_{x}} (v_{x}, v_{x}) f_{v_{y}} (v_{x}, v_{x}) \cdot f_{v_{z}} (v_{x}, v_{x}) = \frac{\sin (\arg_{x})}{{zrg}_{x}} \cdot \frac{\sin (\arg_{y})}{\arg_{y}} \cdot \frac{\sin (\arg_{z})}{\arg_{z}}

在图6中的图示示例性地在上方以对数标度和线性标度(左上侧和右上侧)示出了根据本发明的在光瞳内的单侧离轴函数，在X-Y方向上在焦点中的照明情况(中间上部)以及在XZ方向上在焦点中的照明情况(中间下部)，以及以对数标度(右上侧)和线性标度(右下侧)给出的光的y/Z分布。

在图7中部分地可见在光瞳内的非对称的且单侧的sinc函数FSinc的示例。

图8：一般的实现(示例)

以上所述的复数滤波器可通过简单的复数滤波器在光瞳内实现(对应于F(ν_x,ν_x)；于是，当然获得了很低的传输率，因为几乎到处F(ν_x,ν_x)＝0。

替代地，可使用两个滤波器实现很高的传输率。第一滤波器1设置为使其在光瞳内产生希望的强度，所述强度对应于滤波器的幅度。滤波器1可例如构造为CGH(计算机生成的全息图)并且根据已知的方法简单地计算和制造。第二滤波器则(如示意性地给出)是纯的相位元件，其通过简单的λ/2的相位突变而产生复数滤波器的传输率的负值。

滤波器可对于准直入射的或每个任意另外地入射的相干激光束而构造。

在图8中的示例中，折射能力的一部分由第一滤波器转移到准直器内(光束成形望远镜)。

在图8中的图示在a)中示出了沿Y/Z平面的示意性截面并且在b)中示出了沿X/Z平面的示意性截面。在照明方向上在用于光束成形的元件(望远镜TL)后方是由可作为幅度滤波器的第一滤波器F1和可作为相位滤波器的第二滤波器F2组成的组合，其中有利地第二滤波器F2布置在光学器件O的入射光瞳内。

光学器件O可以是普通的物镜。

F1和F2也可都是相位滤波器。二者一起产生在入射光瞳内的光分布，所述光分布对应于三维(X,Y,Z)sinc函数，作为用于在光通过光学器件O之后形成的光分布的空间滤波器函数。

通过此复数滤波器函数，在Z方向上产生了伸展的成面的光分布LV，带有在Y方向上(垂直于光面)在5微米(甚至直至在2微米以下！)的范围以下的很小的伸展。

为实现和制造前述滤波器组合，补充地并且示例地参考如下文献：

“Iterative design of a holographic beamformer”,Eismann,Tai,Cederquist,Applied Optics Vol.28,No.13,1July 1989.

马修光束

在WO 2004/053558(A)中除通过光片的平面照明外描述了通过“直线状的”点光束的扫描运动(其中图7)可产生光片。在此，样本和照明之间的相对运动可通过样本或光束的运动进行以产生平的照明区域。

使用马修光束以形成条码扫描器的照明光束从US2003/0189097 A1中已知。

马修光束在z方向上几乎为传播不变的；其光束轮廓在xy平面内几乎与z位置无关。在z方向上可实现带有大约1μm的在y方向上的伸展的直线聚焦。在y方向上光束发散，但这可被抑制。因此，可使用马修光束通过在x方向上的扫描令人惊奇地实现SPIM光片，因为在观测方向上(y方向上)在观测光束的孔径内无干扰光。

在频域内，马修光束包括两个对置的频率量；这导致光束在x方向上的高频调制。此调制可有利地被抑制，这通过例如阻挡光瞳的一半或仅产生马修频谱的一半来阻断两个频率量之一来实现。

对于物理基础，参考“Experimental demonstration of optical Mathieubeams”,Optics Communications 195(2001),35-40。

然后描述有利的光学布置以生成在一个方向上明显地受限的马修光束，这例如在前述SPIM应用中可特别有利地使用。

在图9a)和图9b)中分别在Z平面内的侧截面中图示了由沿照明光轴的高斯光束LS生成马修光束MS。

图9c)示出了在其中布置了环形光圈RB的透镜布置L的前焦平面内的照明情况。环形光圈必须以椭圆高斯光束照亮以生成马修光束。为生成此光分布的有利的方法在图9a)中图示。包括两个合适的柱透镜ZL1、ZL2的柱透镜设备在此产生所需的椭圆照明分布。在穿过环形光圈时，环形光圈仅部分地被照明分布照到并且在光瞳平面内产生了两个对称的半圆形成分R1、R1，所述半圆形成分R1、R1在透镜布置后的继续走向中产生了y受限的马修光束。

如果例如通过部分地关闭环形光圈挡住两个部分R1、R2的一个，则可生成在y方向上受限的光束，所述光束与马修光束相比不具有周期性结构。

原理上，当然可构思作为椭圆光束横截面的替代将环形光圈构造为在上方和下方被遮挡以产生根据图9c的两个半圆形区域。

在图9b中，作为使柱透镜将光束成形的替代，将例如“空间光调制器(SLM)”的平的光调制器布置在高斯光束后方，所述光调制器可仅将环形光圈的需要的区域施加以光，以便又如在图9a中产生马修光束。

但原理上也可作为环形光圈的替代将SLM布置在前方焦平面内并且仅将部分环形区域释放，如在图9c)中所图示。

在图10a)至图10c)中通过轴棱锥AX产生了马修光束，所述轴棱锥布置在柱透镜设备(10a)、强度调制器IM(10b)或柱透镜设备和强度调制器IM的组合的后方。

通过柱透镜设备又产生了椭圆光分布，使得在轴棱锥上不存在环形的光分布并且因此不产生贝塞尔光束而是马修光束。

在图10b中，类似于图9b，强度调制器IM又负责此光束成形。

在此，优点是通过在轴棱锥上产生了径向放缩的、椭圆高斯强度分布的强度影响，可避免贝塞尔光束和马修光束的混合。

在图10a至图10c中在右侧与左侧并排的图像图示出了到达轴棱锥的强度分布，左侧带有椭圆高斯分布，并且在10b)和图10c)中在右侧上带有通过光调制器生成的径向放缩的椭圆高斯分布。

通过IM分别附加地阻断了照明分布的中间区域，如所图示，并且仅在侧区域内产生径向放缩的椭圆分布。

不限制于图示，可通过IM、SLM或合适的变形光学器件实现光束成形的进一步的优化。

产生马修光束的另外的可能性在于在透镜L的前焦平面内引入全息图或衍射元件，并且以激光将其照亮。在使用衍射元件或SLM时，可附加地也省去透镜L。

马修光束在x方向上具有高频强度调制。因此，光束可用于通过结构化照明提高轴向分辨率。在此，在静态马修光束的情况中产生样本的三个荧光图像，其中光束在每个图像中分别在x方向上进行120°的相移。三个图像用以获得带有提高的切分的作为结果的图像。在图11中示例地图示了所产生的马修光束的在光轴内的位置z0处的XY平面中的照明分布或在沿光轴z的截面内的XZ平面内的照明分布。显见，在Y方向上的光束轮廓的有利的限制。

X方向对应于用于产生成面的光分布的扫描方向。

Claims

1.一种显微镜，包括：

○成像光学器件，所述成像光学器件通过成像物镜(7)在第一方向上接收从样本(1)以第一孔径角度辐射出的光，

○检测装置，用于检测从样本(1)以第一孔径角度辐射出的、以成像光学器件接收的光，

○照明装置，包括带有波长λ的照明光源(3)和用于以在第二方向上的照明光分布照亮样本(1)的照明光路，其中，第二方向基本上垂直于第一方向，

其特征在于，所述照明装置具有机构，使得：

○在第二方向中的截面(LZ)内，照明光分布基本上恒定，

○在由第一孔径角度张成的锥形内，在第一方向上的伸展(LY)的区域外，照明光的功率小于20％，其中：

LY<2λ，

LZ>8λ。

2.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述机构包括复数滤波器，所述复数滤波器将到照明装置的光瞳内的光分布限制在基本上圆形的区域内。

3.根据权利要求2所述的显微镜，其中，滤波器产生在照明装置的光瞳内由至少两个Sinc函数的叠置形成的照明光分布。

4.根据权利要求3所述的显微镜，其中，两个Sinc函数对应于根据Ewald方程投影到一个平面内、优选地到X-Y平面内的Sinc(z)函数。

5.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，其中，滤波器产生在照明装置的光瞳内对应于马修光束的频谱的照明光分布。

6.特别地根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，包括：

-照明装置，包括照明光源(3)和用于以光片照亮样本(1)的照明光路，

-检测装置，用于检测从样本(1)辐射出的光，

-成像光学器件，所述成像光学器件将样本(1)通过成像光路中的成像物镜(7)至少部分地成像到所述检测装置上，

-其中，光片在成像物镜(7)的焦点中或在成像物镜的几何焦点附近的限定平面内基本上是平的，并且其中，成像物镜(7)具有以非零角度与光片的平面相交的、优选地垂直相交的光轴，

-其中，在照明光路中提供了通过如下方式作为Sinc空间过滤器起作用的幅度和/或相位滤波器，即，其在至少一个空间方向上通过对于出现的空间频率以sinc函数滤波来限制照明光，

和/或在至少一个空间方向上通过sinc滤波器函数对于照明光的相位和幅度进行限制，

和/或在照明光路中提供了组合的幅度和相位滤波器，所述组合滤波器通过以sinc滤波器函数影响照明光分布的传输率进程来进行光片的成形。

7.根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜，其特征在于，

幅度和/或相位滤波器至少部分地布置在照明光学器件的光瞳平面内或其附近，

和/或滤波器通过全息图(CGH)和/或衍射光学器件实现，

和/或滤波器至少部分地通过用于光的空间调制器(空间光调制器(SLM))形成，

和/或以SLM实现光片垂直于光方向的移动，

和/或成像物镜的焦平面在光片移动时移动，

和/或在光瞳平面中产生非对称的Sinc函数/离轴分布，

和/或提供相对于光轴在轴外起作用的sinc滤波器，

和/或提供多个Sinc滤波器的叠置以用于光片结构化，

和/或提供通过Ewald方程放缩的sinc函数作为滤波器函数，

和/或在照明光路中进行滤波器与变形光学器件的组合以用于光束成形。

8.一种用于运行根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜的显微镜方法或方法。

9.一种显微镜，包括：

-检测装置，用于检测从样本(1)辐射出的光，

-成像光学器件，所述成像光学器件将样本(1)通过成像光路中的成像物镜(7)至少部分地成像到检测装置上，

其特征在于，使用马修光束在SPIM中产生光片。

10.根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜，其特征在于，使用扫描的马修光束在SPIM中产生光片。

11.特别地根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，包括：

-检测装置，用于检测从样本(1)辐射出的光，

其特征在于，

以强度调制器和/或相位调制器产生马修光束，特别是通过如下光学元件的至少一个产生马修光束：

1)部分环形光圈，特别是由两个对置的半圆形组成的光圈；

2)通过用于光的空间调制器(空间光调制器(SLM))；

3)轴棱锥；

4)全息图；

5)衍射元件。

12.根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜，其特征在于，

在环形光圈前产生椭圆高斯分布，

和/或在环形光圈前产生高斯分布，其中环形光圈的上部分和下部分不被施加以光，

和/或通过变形光学器件和/或如SLM的强度调制器进行光束成形，

和/或在轴棱锥上产生椭圆高斯分布，

和/或在轴棱锥上产生高斯分布，其中轴棱锥的上部分和下部分不被施加以光，

和/或使用强度调制器以优化光分布，

和/或将变形光学器件和强度调制器组合以优化光分布，

和/或抑制马修光束的频率分量以避免射线的周期性强度调制，

和/或产生结构化的照明，

和/或在平面检测器上，特别是CCD接收器或EMCCD接收器上或CMOS或sCMOS照相机上进行逐行检测，

和/或在平面检测器上进行面相关的检测，其中检测的面小于平面检测器的整个检测面。

13.用于运行根据前述权利要求中至少一项所述的显微镜的显微镜方法或方法。