CN113474708A - 用于在显微镜中对样本进行点状照明的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种借助照明光在显微镜、特别是MINFLUX显微镜中对样本(1)进行点状照明的方法，其中在预定义或可预定义的照明点图案(2)的照明点(3)处依序对所述样本(1)进行照明。所述方法的特征在于，所述照明点图案(2)的横向延伸小于所述照明光的最长波长并且始终仅时间上错开地对所述照明点(3)进行照明，所述照明点图案(2)的每个照明点(3)均对应有多个单个光源(4)中的固有的单个光源并且借助照明点所对应的单个光源(4)的照明光束(5)的焦点对每个照明点(3)进行照明。
Description
技术领域
本发明涉及一种借助聚焦照明光在显微镜、特别是MINFLUX显微镜中对样本进行点状照明的方法，其中在预定义或可预定义的照明点图案的照明点处依序对所述样本进行照明。此外，本发明还涉及一种检查样本的方法，其中借助上述方法对所述样本进行照明。
此外，本发明还涉及一种用于实施根据本发明的方法的装置，特别是一种用于在显微镜、特别是MINFLUX显微镜中对样本进行点状照明的装置，其中照明点图案是可预定义的，可以在所述照明点图案的照明点处依序对所述样本进行照明。此外，本发明还涉及一种具有这种装置的显微镜。
背景技术
例如在F.Balzarotti,Y.Eilers,K.C.Gwosch,A.H.
V.Westphal,F.D.Stefani,J.Elf,S.W.Hell所著的“Nanometer resolution imaging and tracking offluorescent molecules with minimal photon fluxes(具有最小光子通量的荧光分子的纳米分辨率成像和跟踪)”，Science 355,606(2017)中描述过MINFLUX显微术。根据MINFLUX原理，例如可以借助用于激发荧光的激光束的环形焦点来准确定位荧光标记。只要此荧光标记在环圈内，但并非精确地位于其零点，此荧光标记就会发射可被检测到的荧光光子。如果在照明点图案的至少三个照明点处围绕荧光标记放置环形焦点，则可以借助一种三角测量法来测定荧光标记的位置。在缩小照明点与在测定位置的先前步骤中所确定的荧光标记的位置之间的距离的迭代过程中，可以相对于荧光标记移动焦点并且关于荧光标记的位置而评估所测得的强度，直至荧光标记以期望的或最大可达到的精度进行定位或者直至荧光标记从荧光状态暂时或永久地转变为非荧光状态，例如被漂白。具有若干纳米。
已知在MINFLUX显微术中使用光电扫描仪来快速定位照明光束的焦点。但在此情况下会出现以下缺点：光电扫描仪以与偏振方向和波长相关的方式工作，因此，荧光去扫描(Descanning)在大多数情况下非常复杂或者甚至无法实现。此外，不利之处在于，需要高电压的快速切换。此外，缺点还在于在非谐振模式中的较高损耗(＝生热)。此外，所需的组件非常昂贵。光电扫描仪的另一缺点是最大可达到的偏转角较小。
在借助STED显微术与由MINFLUX显微术已知的三角测量法的组合进行图像采集或者借助STED显微术的所谓的小场扫描技术进行图像采集时，存在与MINFLUX显微术中类似的要求。在这些方法中，将用于激发荧光的激发光一般而言与荧光阻止光，具体而言与用于产生受激荧光的光，即抑制自由荧光的STED光结合使用。在此情况下，优选对此荧光阻止光进行聚焦，使得焦点具有中心最小值，而激发光例如可以以在共焦荧光显微术中常见的方式被聚焦。这两种方法均用于对远低于衍射极限且分辨率与STED显微术相比更高的结构进行定位。在此情况下可能涉及单个荧光标记的定位和并非单独以解析形式示出的荧光标记的浓度分布的检测。由于要求的相似性，现有技术中已知的装置也具有类似的缺点。
除上述方法外，还揭露了其他用于对样本进行成像的方法，其中依序对距离低于衍射极限且分辨率高于衍射极限的照明点进行照明，例如在“Superresolution inconfocal Imaging(共聚焦成像中的超分辨率)”一文中(Colin Sheppard,Optik 80,No.2(1988)，第53-54页)述及的使用像素化检测器的共聚焦显微术方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提出一种方法，所述方法允许快速地依序对照明点图案的照明点进行照明并且可以灵活地适配各个样本和检查特定的要求。
本发明用以达成上述目的的解决方案在于开篇所述及的类型的方法，其特征在于，所述照明点图案的横向延伸小于照明光的最长波长并且始终仅时间上错开地对所述照明点图案的照明点进行照明，即在任何时间点都不会同时对照明点图案的两个点进行照明，所述照明点图案的每个照明点均对应有多个单个光源中的一个固有的单个光源并且借助每个照明点所对应的单个光源的照明光束的焦点对所述照明点进行照明。
本发明的另一目的是提出一种特别是用于实施根据本发明的方法的装置，所述装置可以灵活地适配各个样本和检查特定的要求并且允许快速地依序对照明点图案的照明点进行照明。
本发明用以达成上述目的的解决方案在于开篇所述及的类型的装置，其特征在于，所述照明点图案的横向延伸小于照明光的最长波长，特别是小于照明光的最长波长的一半，所述照明点图案的每个照明点均对应有多个单个光源中的一个固有的单个光源，其中所述单个光源中的每个均发射照明光束，所述照明光束聚焦在所述单个光源所对应的照明点上，并且控制装置对照明进行控制，使得始终仅时间上错开地对所述照明点图案的各个照明点进行照明。
根据本发明，应认识到的是，MINFLUX显微术和单粒子追踪例如需要在样本中快速定位照明光的焦点，这是借助传统扫描仪，特别是检流计反射镜无法足够快速地实现的，因此提出首先使用谐振操作的扫描仪或光电扫描仪。原则上，对于其他扫描式显微术方法，例如上文已述及的方法而言，这种快速定位也是可用且有利的。
例如且特别是在MINFLUX显微术中，重要的是能够快速且准确地定位激发光，而在使用荧光阻止光的方法中，特别是在STED显微术方法中，特别是重要的是能够快速且准确地定位荧光阻止光。根据本发明，例如可以有利地将激发光连续地对准照明点图案的中心并且仅借助STED光依序对照明点图案进行照明。重要的是能够快速且准确地进行定位的光或聚焦光束在下文中被称为照明光或照明光束。如果随后述及并非同时对两个点进行照明，则这个表述始终与照明光有关，这个照明光是就其而言重要的是能够快速进行定位的光。然而，这无法明确排除借助重要之处并不在于能够快速进行定位的光同时对多个照明点进行照明。在某些方法中，需要依序借助激发光和荧光阻止光进行照明。在此，与照明光不同，重要之处并不在于能够快速进行定位的其他光或其他光束通常简称为“光”或“光束”。
就MINFLUX显微术而言，例如可以有利地设定，照明点与其紧邻的照明点中的每一个之间的距离均小于λ/NA，其中λ是照明光束的最长波长，NA是产生焦点的成像光学器件的数值孔径。就MINFLUX显微术而言，借此有利地确保位于两个照明点之间的荧光标记位于照明光束的焦点区域中，无论是在对一个照明点进行照明时还是在时间上错开地对另一照明点进行照明时。在此情况下，只要荧光标记不在照明光束的焦点的最小值处，这个荧光标记就会被施加照明光并被激发而发出荧光。如果例如在MINFLUX显微术中常见的焦点具有包含中心最小值的强度分布，则也可能发生荧光标记位于照明光束中的一个的焦点的中心最小值处，因此，在对样本施加这个照明光束时，不会发出任何荧光，然而，这只是确认荧光标记位于或至少非常接近相关照明点的强度分布的强度最小值处。至少可以有利地设定，照明点与紧邻其的照明点中的每一个在垂直于对这个照明点进行照明的照明光束的传播方向的方向上的间距(横向间距)小于λ/NA或者小于λ/(2NA)。就三维照明点图案而言，至少可以有利地设定，照明点在垂直于光轴和/或照明光的传播方向的平面上的紧邻投影之间的距离为小于λ/NA或λ/(2NA)。在轴向方向上，在迭代地实施所述方法的情况下，至少在迭代的第一步骤中选择稍大的距离，因为与在横向方向上可产生的具有横向受限的零点的强度分布的零点周围的强度相比，在轴向方向上可产生的具有轴向受限的零点的强度分布的零点周围的强度通常更平缓地增大。
紧邻的照明点指的是在一个方向上最接近初始照明点的照明点。
通常(即不仅适用于MINFLUX显微术)确保位于两个照明点附近的荧光标记不会同时被施加两个单个光源的照明光，具体方式在于，始终仅时间上错开地对照明点图案的照明点进行照明。
照明点图案的横向延伸，即照明点图案在垂直于样本中的照明光束量的光轴的平面内的投影的延伸，小于照明光的最长波长，优选甚至小于所述照明光的波长的一半。
所述照明光可以具有唯一的波长。在此情况下，这个(唯一的)波长也是最长波长。作为替代方案，照明光束也可以包含多个波长的照明光。例如可以借助包含多个波长的照明光进行多色STED检查。
如上文在另一措辞中已述及的那样，特别是可以有利地设定，在预定义的或可预定义的照明点图案的照明点处重复的依序对样本进行照明，以便得到更精确的定位结果或者获得关于并非单独以解析形式示出的荧光标记的浓度分布的更精确的信息。在此情况下，特别是可以有利地设定，在第一定位过程之后，其中照明点图案的照明点时间上错开地分别借助其所对应的单个光源的照明光束的照明光的焦点而被照明，可以在迭代过程中借助照明图案实现进一步的定位过程，与此前使用的照明图案相比，这些照明点之间的间距更小，其中分别(例如通过样本和照明光的特别是自动的相对位移)确保荧光标记始终位于刚才所使用的照明点图案内。就MINFLUX显微术而言，为了提高定位精度，有利的是，在缩小照明点图案的照明点之间的间距的情况下，增大照明强度。在使用激发光和荧光阻止光的组合时，特别是可以相应地适用于荧光阻止光的强度，这个荧光阻止光在此是照明光，就这个照明光而言重要的是能够快速进行定位，其中在此具体视方法和/或被检查的样本而定，进一步增大定位精度或者获得关于并非单独以解析形式示出的荧光标记的浓度分布的更精确的信息。借此逐过程地提高定位的精度或者一般而言，逐过程地提高关于样本的信息的品质。
根据本发明，进一步应认识到的是，对于许多样本检查而言有利的是，使用三维照明点图案，其中尽管借助谐振操作的扫描仪或光电扫描仪无法或者需要很大的耗费才能在三个空间方向上对照明光的焦点快速进行定位。根据本发明的一种可能的实施方案，例如可以通过使用光纤束来实现对三维照明点图案的照明点的照明，其中这些光纤的一些用作单个光源的输出耦合端在轴向上彼此间隔一定距离，下面将进一步对此进行详细说明。
本发明的非常特殊的优点在于，不需要成本较高的、快速的扫描仪，特别是谐振操作的扫描仪或光电扫描仪。
此外，本发明的优点还在于，借助照明点所对应的单个光源的照明光束的照明光的焦点对这些照明点进行照明，而不会发生位置波动。在此情况下有利的是，无需机械或光电射束偏转装置，这个射束偏转装置将照明光束从照明点偏转至照明点。这类射束偏转装置自身的缺点在于，待进行的各个设置的可重现性受到限制。
此外，本发明有利地能够在很大程度上使用任何特别是三维的照明点图案。此外，本发明的非常特殊的优点还在于，对于照明点图案的不同照明点而言，可以采用不同的强度分布(例如环状焦点或瓶状焦点)。
根据本发明，可以有利地设定，重复扫描样本中的少量(例如<10)照明点，其中这些照明点的位置保持恒定或能够在重复的过程中进行调整。
在一种有利的实施方案中，所述照明点图案选择为，使得所述照明点图案的照明点中的至少三个处于一条直线上或者所述照明点图案的所有照明点均处于一条直线上。在涉及根据多个荧光标记分子的位置数据测定荧光标记分子和/或样本的有利结构之间的至少一个距离时，特别是有利地采用这种照明点图案。
在一种有利的实施方案中，所述照明点图案选择为，使得所述照明点图案的照明点位于一个共用的平面中。这个平面优选垂直于光轴而布置。但是，这个平面也可以相对于光轴形成有别于90度的角度。二维照明点图案特别是可以是指笛卡尔或六边形照明点图案。照明点特别是也可以位于三角形或四边形的角部处并且可选地位于其中心处。
在一种特别有利的实施方案中，所述照明点图案的照明点并非均位于一个共用的平面中。借助三维照明点图案特别是也可以对样本内的复杂结构进行检查。有利的三维照明点图案例如可以构建为立方照明点图案或立方体心照明点图案或立方面心照明点图案。作为替代或附加性方案，特别是可以有利地设定，所述照明点图案的照明点布置在诸如四面体、六面体或八面体之类的几何结构的角部处。这个照明点图案的至少一个照明点特别是可以布置在这个几何结构内。照明点特别是可以布置在这个几何结构的中心处。这个照明点图案可以具有其特别是位于柏拉图立体的角部处的照明点。这个照明点图案特别是可以具有规则的几何结构。但是，这个照明点图案也可以不具有规则结构且特别是不具有位于柏拉图立体的角部处的照明点。特别是不规则的照明点图案尤其适用于荧光标记的特别快速的定位。作为补充性方案，照明点特别是也可以位于中心处。
其中照明点距中心的距离均相同的照明点图案是特别有利的。如果就这种照明点图案而言作为对这些照明点中的每一个的照明的反应而测得相同的荧光输出，则在彼此相同的焦点中存在对称的强度分布的情况下，由此可以推断出，荧光标记恰好位于这个照明点图案的中心处。为进行控制，这个照明点图案还可以具有位于中心处的照明点。在此情况下，在使用具有中心强度最小值的激发光的焦点时，在作用于中心照明点的情况下不会发射荧光，因为这个荧光标记恰好位于强度最小值处。
一般而言，可以有利地设定，补充性地借助其他光对所述照明点进行照明。特别是可以有利地设定，补充性地借助另一光束的焦点分别对所述照明点进行照明。所述另一光束的其他光例如可以具有与照明光不同的波长。作为替代或补充性方案，所述另一光束的焦点也可以具有与所述照明光束的焦点不同的形状。
特别是在以特别高的分辨率检查样本时，照明光可以是荧光阻止光，其他光可以是激发光。在此情况下，可以有利地设定，对每个照明点施加光束的焦点和作为照明光束的荧光防止光束的焦点。特别是在这种实施方案中，有利的是，所述另一光束的焦点具有与所述照明光束的焦点互补的强度分布和/或所述另一光束的焦点在所述照明光束的焦点具有强度最小值的位置处具有强度最大值。在这种重合的情况下，两个光束可以共同形成照明光束。
为了对焦点进行成形，可以在照明光束和/或其他光束的相应光路中布置相位调制装置，下文简称为相位调制器。在一种有利的实施方案中，所述相位调制器布置在所述照明光束和/或所述其他光束的共用光路中。相位调制器特别是可以有利地构建为，使得另一光束的焦点中的强度分布不会受到这个相位调制器的影响，而相位调制器则影响照明光束的焦点中的强度分布，使得所述其他光束的焦点中的强度分布与这个照明光束的焦点中的强度分布互补，特别是使得这个照明光束的焦点中的强度分布在中心处具有局部最小值，而其他光束的焦点中的强度分布则在中心处具有最大值。
在一种特别有利的实施方案中，对每个照明点施加激发光和荧光阻止光。特别是可以有利地设定，借助包含所述荧光激发光和所述荧光阻止光的照明光束的焦点对每个照明点进行照明，其中所述焦点包含两个分量，即所述荧光阻止光和所述激发光的分量，其中所述荧光阻止光的焦点具有强度最大值，其在空间上包围所述激发光束的强度最大值。位于包含荧光激发光的照明光束的焦点外围的荧光标记分子被阻止发射荧光，从而对样本施加有效PSF，与共焦PSF相比，这个有效PSF的尺寸大幅减小。在自发发射的光子数量相同的情况下，例如通过借助这个较小的PSF对样本进行扫描而显著提高定位精度。
就根据本发明的装置的设计方案而言，可以有利地设定，所述照明光束的照明强度和/或所述照明光束和/或所述其他光束的焦点中的强度分布可以单独或共同进行调节。还可以设定，共同形成照明光的激发光束和荧光阻止光束的强度可以单独或共同进行调节。特别是为此目的，可以在每个激发光束和/或其他荧光阻止光束的光路中布置一个固有的光强度调制器。这些光强度调制器例如可以分别构建为液晶SLM或微镜阵列或者构建为声光光强度调制器或光电光强度调制器或液晶调制器。
一般而言，可以有利地设定，分别借助共同形成照明光的光的分量同时或时间上错开地对所述照明点进行照明，这也包括时间上的重合。
在一种可能的实施方案中，从所述单个光源发射所述照明光的所有分量。在此特别是可以设定，一个或多个一次光源构建为多色激光器。
在一种特殊的实施方案中，将所述照明光束和/或所述另一光束通过具有不同长度的光程长度的光路导引至所对应的照明点；同样可以将共同形成照明光的光分量通过具有不同长度的光程长度的光路导引至所对应的照明点。如果将照明光束通过具有不同长度的光程长度的光路导引至所对应的照明点，则实现这些照明点的依序照明，具体方式在于，不同单个光源的光脉冲需要不同长度的时间间隔，直至到达相应所对应的照明点。在此情况下，这些光程长度也可以共同或单独进行调节，例如借助可调的光延迟线进行调节。
特别是也可以通过将一次光源的光在空间上分成照明光束来形成这些单个光源，其中可以通过将一次光源的光的不同光分量耦合至光纤束的光纤中来实现空间上分开。为此，例如可以借助一次光源的光大面积地对光纤束的入口端进行照明，使得这些光纤的输出耦合端最终用作这些单个光源。作为替代方案，就特别好的耦合效率而言，特别是在使用单模光纤时，可以设定，将一次光源的光的不同光分量针对性地聚焦到光纤束的各个光纤中。为此，例如有利地使用与光纤束的空间条件相匹配的微透镜阵列。例如也可以借助单独的光学器件将每个光分量耦合到相应的光纤中。同样可以将多个一次光源的光，特别是不同波长的多个一次光源的光共同耦合到光纤束的光纤中，从而形成具有不同分量的照明光，例如激发光和荧光阻止光。
这些光纤可以具有不同的长度，使得照明光束的各个光脉冲时间上相继地从光纤束的不同光纤的输出耦合端发出。这样就能依序且重复地对照明点图案的照明点进行照明。
这些光纤特别是可以构建为单模光纤和/或保偏光纤。
所述装置优选地构建为，使得所述照明点图案的照明点处的照明持续时间是可调节的。例如可以通过改变一次光源的输出脉冲持续时间或者通过在光路中插入或移除具有非零群速度色散的光学介质来改变这个照明持续时间。特别是可以有利地设定，所述照明点图案的照明点处的照明持续时间可以逐照明点地单独进行调节。
特别是可以有利地设定，所述照明点图案的每个照明点处的照明持续时间均为最大50μs，特别是最大10μs，尤其特别是最大5μs。
在一种有利的实施方案中，在所有照明点处的照明序列内，所述焦点内的照明强度和/或强度分布都是相同的。作为替换方案，在所有照明点处的照明序列内，所述焦点内的照明强度和/或强度分布也可以是不同的。
在一种特别有利的实施方案中，所述照明点处的焦点内的照明强度和/或强度分布根据已实现的对照明点的依序照明的重复次数而改变。
通常，可以有利地设定，在光输出和/或波长的脉冲持续时间和/或所对应的照明点的位置处的焦点的形状方面对每个单个光源的照明光单独进行调节。
这些单个光源中的每一个均可以由发射这些照明光束中的一个的相应一次光源，特别是激光器或半导体激光器构成。特别是可以有利地设定，以预定义或可预定义的顺序分别对这些单个光源进行接通和关断，以便依序对这些照明点进行照明。
作为替代方案，也可以以随机顺序对这些单个光源进行接通和关断，以便依序对这些照明点进行照明。
如已述及的那样，作为替代方案，也可以通过将一次光源的光在空间上分成照明光束来形成这些单个光源。在此情况下，特别是可以有利地设定，所述一次光源发射脉冲光。
如同样已述及的那样，例如可以通过将一次光源的光的不同光分量耦合至不同光纤中来实现空间上分开。为此，例如可以借助一次光源的光大面积地对光纤束的入口端进行照明。作为替代方案，特别是在使用单模光纤时，可以将一次光源的光的不同光分量针对性地聚焦到光纤束的各个光纤中。为此，例如可以有利地使用与光纤束的空间条件相匹配的微透镜阵列。例如也可以借助单独的光学器件将每个光分量耦合到相应的光纤中。
为了对这些照明点进行照明，可以借助成像光学器件将这些光纤的输出耦合端成像到这些照明点中，这个成像光学器件特别是可以包含显微镜物镜。如已述及的那样，这些光纤可以具有不同的长度，以便实现依序照明。
在一种特别有利的实施方案中，至少两个光纤、特别是所有光纤的输出耦合端布置在不同的光学平面中。这个实施方案的特殊优点在于，这些光纤的用作单个光源的输出耦合端被成像光学器件相对于光传播方向(z方向)聚焦到不同的样本平面中。这样就能实现三维照明点图案。
在另一实施方案中，通过借助一次光源的光对微镜阵列的多个镜子进行照明来实现空间上分开。借助这个微镜阵列可以在不同的空间方向上反射不同的光分量，以便形成这些单个光源的照明光束。优选借助成像光学器件将这个微镜阵列成像到样本中。特别是可以使用数字微镜器件(DMD)。数字微镜器件可以构建为，使得各个镜子的可能位置由止挡部精确定义。特别是在此情况下，使用数字微镜器件能够实现非常精确的射束控制。
在一种特别有利的实施方案中，设有在偏转角方面可进行调节的射束偏转装置，借助所述射束偏转装置可以在进行照明之前和/或期间相对于样本对整个照明点图案进行定位。这个可调射束偏转装置例如可以具有检流计反射镜。
如已述及的那样，可以有利地设有将所述照明光束和/或所述另一光束成像到所述照明点中的成像光学器件。特别是可以将光纤的输出耦合端成像到所述照明点中的成像光学器件。
在一种有利的实施方案中，所述成像光学器件具有相位调制器。这个相位调制器可以用于对照明光束或其他光束的焦点进行成形。
作为替代或补充性方案，可以有利地设定，所述成像光学器件包含一个装置，借助所述装置可以对照明点图案的照明点彼此之间的间距进行调节。这对于实施迭代的MINFLUX方法和例如所谓的小场扫描方法而言都是有利的，其中可以迭代地使这些照明点接近中心。为此，这个成像光学器件例如可以具有焦距可调的透镜和/或可变形的反射镜和/或SLM。
在一种有利的实施方案中，所述成像光学器件包含变焦光学器件，借助所述变焦光学器件可以改变所述成像光学器件的成像比例，从而可以借助所述变焦光学器件对所述照明点彼此之间的间距进行调节。所述变焦光学器件可以有利地构建为，使得光瞳平面的位置不受放大系数影响地始终保持不变。在EP 1 617 251 A1中例如提出了这种变焦光学器件。这个变焦光学器件例如可以由四个可以相对于彼此进行移动的透镜组构成。在Sourav Pal和Lakshminarayan Hazra所著的刊物“Stabilization of pupils in a zoomlens with two independent movements(具有两个独立运动的变焦透镜中的光瞳的稳定)”，Appl.Opt.52,5611-5618(2013)中，描述了仅具有三个透镜的其他变焦光学器件，其至少针对多个不同的倍率具有入射光瞳和出射光瞳的相同位置。
通常可以有利地设定，所述成像光学器件将至少两个照明光束和/或其他光束聚焦到样本内的不同光学平面中。如上文已述及的那样，这一点例如可以通过以下方式实现：光纤的用作单个光源的输出耦合端布置在彼此间隔一定距离的光学平面(即沿z方向彼此间隔一定距离的平面)中。
根据本发明的一个特别有利的理念，使用多个点检测器，其中所述照明点图案的不同照明点分别对应有一个点检测器，所述点检测器检测从相应照明点发出的检测光，特别是荧光。在此情况下，特别是可以有利地设定，每个点检测器均由检测光纤和下游的单个检测器构成，使得这个照明点图案的不同照明点分别对应有一个固有的检测光纤并且从相应照明点发出的检测光被耦合至其所对应的检测光纤中。
用于检查样本的显微镜，特别是MINFLUX显微镜是特别有利的，所述显微镜具有根据本发明的用于在照明点图案的不同照明点处依序对样本进行照明的装置。在此情况下，可以有利地设定，每个照明点均对应有一个点检测器，所述点检测器检测从相应照明点发出的检测光，特别是荧光。
如上文已述及的那样，特别是可以有利地设定，所述显微镜的每个点检测器均由检测光纤和下游的单个检测器构成。照明点图案的不同照明点分别对应有一个检测光纤，其中从相应照明点发出的检测光被耦合至其所对应的检测光纤中，进而被馈送至所对应的单个检测器。这些检测光纤可以有利地合并成检测光纤束。
一般而言，可以有利地设定，以时间分辨的方式对所述检测光进行检测，从而可以将相应的检测光分别与照明光脉冲进行对应。
用于在样本中对荧光标记分子进行定位的方法是特别有利的，其中依照根据本发明的方法对样本进行照明，其中分别测量从被照明的样本区域发出的荧光量。特别是还可以有利地设定，在考虑到对各个照明点进行照明的照明光束的强度分布和分别测得的荧光量的情况下，测定荧光标记分子距这些照明点中的一个的距离。这基于以下事实：作为对借助照明光进行照明的反应而发射特定量的荧光的荧光标记只能位于(假设已知的)强度分布内的某个位置处，在这些位置上，照明强度与所测得的荧光量对应。
即使在测定荧光标记分子在照明点图案内的准确位置时，也优选将焦点中的已知强度分布考虑在内。
附图说明
在附图中示例性且示意性地示出本发明的主题，下面结合附图对本发明的主题进行说明，其中不同实施例中相同或具有相同作用的元件大多采用相同的附图标记。其中：
图1为根据本发明的用于对样本进行点状照明的装置的第一实施例，
图2为根据本发明的用于对样本进行点状照明的装置的第二实施例的详图，
图3和图4为根据本发明的用于对样本进行点状照明的装置的第三实施例的详图，
图5为根据本发明的用于对样本进行点状照明的装置的第四实施例的详图，
图6为关于光纤束14内的光纤13的可能的布局的实施例，
图7为根据本发明的用于对样本进行点状照明的装置的第五实施例的详图，
图8为根据本发明的显微镜的一个实施例的详图，所述显微镜包含根据本发明的用于对样本进行点状照明的装置，
图9为根据本发明的用于对样本进行点状照明的装置的第六实施例的详图，
图10为根据本发明的用于对样本进行点状照明的装置的第七实施例的详图，以及
图11为用于对样本进行点状照明的装置的第八实施例的详图。
具体实施方式
图1示意性地示出根据本发明的用于在显微镜、特别是MINFLUX显微镜中对样本1进行点状照明的装置的第一实施例，其中照明点图案2是可定义的，可以在这个照明点图案的照明点3处重复地依序对样本1进行照明。照明点图案2的每个照明点3均对应于多个单个光源4中的一个固有的单个光源，其中这个单个光源4中的每一个均发射照明光束5，这个照明光束5借助成像光学器件6聚焦在这些单个光源所对应的照明点3上，这个成像光学器件特别是可以包含(在图中未示出的)显微镜物镜24。
这些单个光源4中的每一个均形成为一次光源7，其例如可以实施为激光器。
图2示出根据本发明的用于对样本1进行点状照明的装置的第二实施例的详图。在这个第二实施例中，这些单个光源4由单个一次光源7的空间上分开的光8构成。为了分开单个一次光源7的光8，使用接连串联的分束器9，其特别是可以实施为中性或偏振分束器。分束器9也可以构建为二向色分束器，以便对不同的照明点3施加不同波长的照明光。
在每个照明光束5的光路中布置有作为成像光学器件6(未进一步绘示)的组成部分的SLM(空间光调制器)10，这个成像光学器件将照明光束5成像至照明点3中。SLM 10例如可以用于在照明点3的位置处实现照明光束5的焦点的特定形状。
此外，在每个照明光束5的光路中还设有光强度调制器11。借助光强度调制器11可以调节和/或时间调制每个单独的照明光束5的光输出。例如可以借助光强度调制器11以预定义或可预定义的顺序重复地对这些单个光源4进行接通和关断，以便依序(时间上相继地)对照明点3进行照明。例如还可以通过光强度调制器11的相应控制分别以随机的顺序对这些单个光源4进行接通和关断，以便根据随机原理依序对照明点3进行照明。
作为替代方案，单个一次光源7也可以构建为脉冲光源，例如构建为脉冲激光器，从而可以借助光强度调制器11单独对这些单个光源4中的每一个的脉冲照明光束5的光输出进行调节。在这种实施方式中，各个照明光束5的光程长度优选有所不同，使得各个照明光束5的照明光脉冲到达所对应的照明点所需的较长时间间隔有所不同，进而借助照明光脉冲依序对照明点3进行照明。该装置优选地构建为，使得各个照明光束5的光程长度可以共同地或单独地进行调节。为此例如可以设有可调的光延迟线。
图3示出根据本发明的装置的第三实施例的详图。在这个实施例中，在照明光束5分别经过光强度调制器11之后，分别借助耦合光学器件12将这些照明光束耦合到光纤13中。光纤13合并成纤维束14。借助准直仪53对从光纤束14的光纤13射出的照明光束5进行准直并且将其偏转，使得这些照明光束在与(未绘示的)布置有照明点的焦平面共轭的平面16中相交。例如可以有利地在这个共轭平面16中布置相位调制器17，以便例如影响照明点3的位置处的每个照明光束5的焦点的形状。
图4示出距光轴21的距离Δy如何转化成相对于共轭平面16的入射角α。
图5示出根据本发明的装置的第四实施例的详图。在这个实施例中，借助成像光学器件6将布置在对应于焦平面54的图像平面38中的输出耦合端55成像到(在图中未示出的)照明点3上。借助准直仪53对从光纤束14的光纤13的输出耦合端55射出的照明光束5进行准直，使得这些照明光束在与焦平面54共轭的平面16中相交。在这个共轭平面16中布置有相位调制器17，其例如构建为涡旋相位板。
这个示例性相位调制器17也在图5中单独示出。相位调制器17的特征一般在于，其位置相关地对穿过的光束施加不同的相位延迟。相位调制器17可以构建为，使得在样本1中实现照明光束5的环形焦点。这种焦点在光轴21上具有强度最小值，特别是强度零点。相位调制器17也可以构建为，使得在样本1中实现照明光束5的具有三维结构的焦点，其中强度最小值在横向上例如通过环形强度分布而定界，在轴向上例如以两个圆顶形强度分布为界。这种焦点可被称为3D环圈。
这个装置在中间图像平面18中具有可调射束偏转装置19，其具有第一可调镜对20和第二可调镜对(在此未绘示)。镜对20和未示出的镜对围绕相互垂直的轴对射束进行偏转，从而可以在样本内沿x方向和y方向对照明光束5的焦点进行定位。扫描透镜22联接在可调射束偏转装置19的上游，管透镜23联接在这个可调射束偏转装置的下游。成像光学器件6包含显微镜物镜24，其将照明光束5聚焦到样本1内的照明点图案2的照明点3上。
例如如图2所示，从光纤束14射出的照明光束5可以通过分开单个一次光源7的光8而产生。照明光束5也可以源自单个光源4，这些单个光源均构建为一次光源7，例如如图1所示。
作为替代方案，这些单个光源4也可以通过将一次光源7的光8在空间上分成照明光束5而形成，其中通过将一次光源7的光8的不同光分量耦合至光纤13中来实现空间上分开。为此，例如可以借助一次光源7的光8大面积地对光纤束14的入口端进行照明，使得光纤13的输出耦合端55最终用作单个光源4。作为替代方案，就特别好的耦合效率而言，可以将一次光源7的光8的不同光分量针对性地聚焦到光纤束14的各个光纤13中。为此，例如有利地使用与光纤束14的空间条件相匹配的微透镜阵列。例如也可以借助单独的光学器件将每个光分量耦合到光纤13中的一个中。
图6示出关于光纤束14内的光纤13的可能的布局的实施例。通过光纤13的输出耦合端55的空间布局确定照明点3的相对空间布局，除了按相应成像比例进行缩放外，这些照明点在图示的下部用+号表示。用作四个单个光源4的四根光纤13的输出耦合端55相对于彼此以Y形图案布置，其中光纤束14还包括空位25。
光纤13的第一光纤26对应于样本内的第一照明点27。光纤13的第二光纤28对应于样本内的第二照明点29。光纤13的第三光纤44对应于样本1内的第三照明点30。光纤13的第四光纤31对应于样本内的第四照明点32。
从光纤13射出的照明光束5被脉冲激发并耦合到光纤13中，使得光脉冲首先从第一光纤26射出，从而借助设计为环形焦点的第一焦点33对第一照明点27进行照明。然后，光脉冲从第二光纤28射出，从而借助相应的环形的第二焦点34对第二照明点29进行照明。而后，光脉冲从第三光纤44射出，从而借助相应的环形的第三焦点35对第三照明点30进行照明。最后，光脉冲从第四光纤31射出，从而借助环形的第四焦点36对第四照明点32进行照明。然后从第一照明点27的照明开始，再次重复这个序列。
图7示出根据本发明的装置的第五实施例的详示。在这个实施例中，借助多个分束器9在空间上将例如可以构建为脉冲激光器的一次光源7的脉冲光8分成单独的照明光束5。借助耦合光学器件37将这些照明光束5分别耦合到光纤13中。光纤13具有不同的长度，使得照明光束5的各个光脉冲时间上相继地从光纤13合并形成的光纤束14的出口端15射出。这样就能借助单个光源4的照明光依序且重复地对样本1内的照明点图案2的照明点3进行照明。
图8示出根据本发明的显微镜的一个实施例的详图，这个显微镜包含根据本发明的装置。在这个实施例中，光纤束14的光纤13的输出耦合端55用作单个光源4。光纤束14的光纤13保持在套筒39中。借助准直仪53对从光纤13的输出耦合端55射出的照明光束5进行准直，这些照明光束随后经过构建为二向色分束器的主分束器40。然后将照明光束5成像到图8中未示出的照明点图案2的照明点3上。单独的准直照明光束5并非精确地彼此平行，而是以平角延伸，使得这些照明光束在与未示出的焦平面54共轭的平面16(在图中也未示出)中相交。
在这个实施例中，照明点图案2的不同照明点3分别对应有一个点检测器，这个点检测器检测从相应照明点2发出的检测光，即荧光。通过透镜42将并非精确地平行于照明光束5的从照明点图案2的照明点3发出的检测光束41分别聚焦到检测光纤43的耦合端上，进而分别耦合到检测光纤43中。如此一来，照明点图案2的不同照明点3中的每一个均对应有一个固有的检测光纤43，将从相应照明点3发出的检测光束41耦合到这个检测光纤中。检测光纤43是检测光纤束56的组成部分。借助检测光纤43将每个检测光束41导引至固有的(未绘示的)检测器。各个检测器与相关检测光纤43结合用作点检测器。就此而言，每个检测光纤43既用于传输检测光，又用作共焦光阑。检测光纤43合并形成具有套管46的检测光纤束45。
图9为根据本发明的装置的第六示例性实施例的详图。在这个实施例中，将单个光源4的照明光束5耦合到光纤束14的光纤13中。从光纤13发出的照明光束5被准直仪53准直，然后到达变焦光学器件47，这个变焦光学器件允许相对于彼此对成像比例进行调节，进而对被照明的照明点3之间的间距进行调节。变焦光学器件47包含第一透镜48，其后是可调透镜49。此外，变焦光学器件47还包含第二透镜50和第三透镜51。在可调透镜49与第二透镜50之间布置有用于对照明光束5的焦点进行成形的相位调制器17。变焦光学器件47位于中间图像平面52的正前方。借助(未示出的)显微镜物镜24将从变焦光学器件47射出的照明光束5聚焦到照明点图案2的照明点3上。
在此情况下，在定位荧光标记时，例如可以以如下方式进行：首先使用照明点图案2，其中相邻照明点3之间的间距相对较大。照明点图案2优选被选择为足够大，使得待定位的荧光标记明确位于照明点图案2内。在此情况下，待选择的照明点图案2的大小与关于待定位的荧光标记的位置的先前知识的质量相关。在第一定位过程之后，其中照明点图案2的照明点3时间上错开地分别借助其所对应的单个光源4的照明光束5的照明光的焦点而被照明，可以在迭代过程中借助照明图案2实现进一步的定位过程，与此前使用的照明图案2相比，照明点3之间的间距更小，其中分别(例如通过样本和照明光学器件的相对位移)确保荧光标记位于照明图案2内。借此逐过程地提高定位的精度。
可以(就横向和轴向的三维照明图案2而言)借助变焦光学器件47缩小照明点3之间的间距。变焦光学器件47可以有利地构建为，使得就三维照明图案2而言，照明点3之间的轴向间距的减小与横向间距的减小近似二次方地关联。
图11示出适于对照明点图案2的大小进行适配的装置的替代性实施方式。
图10为根据本发明的用于对样本1进行点状照明的装置的第七实施例的详图。
在这个实施例中，光纤束14的光纤13的输出耦合端55用作单个光源4。从光纤13的输出耦合端55射出的(在图中未示出的)照明光束5被成像到(在图中未示出的)三维照明图案2的(在图中未示出的)照明点3上。
光纤13的输出耦合端55在轴向上并非全都处于同一平面内。由此考虑到以下事实：三维照明点图案2的照明点3在横向上(x-y平面)以及在光轴21的方向(z方向)上彼此间隔一定距离。光纤13的一些输出耦合端55在轴向上与其他输出耦合端55相比进一步突出，这使得照明光束5的焦点布置在样本内的不同焦平面中，以便能够对三维照明图案5的照明点3进行照明。
在这个实施例中，设有三个终止于共用的轴向平面中的第一输出耦合端57，这些第一输出耦合端布置在第一等边三角形的角部处。此外，在光纤束14的中心居中地设有一个第二输出耦合端58，其与第一输出耦合端57相比大致进一步轴向突出。此外，还设有三个终止于另一共用轴向平面中的第三输出耦合端59，这些第三输出耦合端同样布置在第二等边三角形的角部处并且与第二输出耦合端58相比大致进一步轴向突出。第一等边三角形相对于第二等边三角形旋转60度。这样就能产生照明图案2，其中从第一输出耦合端57和第三输出耦合端59射出的照明光束对八面体的角部进行照明，而从第二耦合端58射出的照明光束则对位于八面体的中心处的照明点3进行照明。
通过改变光纤束14的光纤13的数量和/或通过改变光纤束14的输出耦合端55的布局，可以实现其他的照明图案。例如可以对四面体的角部进行照明，特别是以便精确定位四面体内部的荧光标记。通常可以采用任何照明图案2，特别是具有位于三维几何图形的内部、特别是中心处的一个或多个照明点3的照明图案。
图11示出光纤束14的光纤13的输出耦合端55的另一有利的布局。输出耦合端55布置在中心处并且围绕这个中心布置在同心环上。这个布局一方面能够生成更复杂的照明点图案2，依序对这个照明点图案的照明点3进行照明，但另一方面，这个布局也能够在随着照明点图案2的大小变化而保持照明点图案2的形状的情况下，重复照明点3的依序照明。可以将这种布局用作可以相对于彼此调节照明点图案的照明点之间的间距的唯一装置或者用作具有上述功能的其他装置(例如变焦光学器件47)的补充方案。
附图说明是特别是根据MINFLUX方法进行描述的。即使在应用其他方法，例如小场扫描方法或结合MINFLUX三角测量法和STED技术的方法时，所示布局也具有相应的优势并且适用于这些方法。在这类方法中，例如可以将输出耦合端55中的一个或多个用于借助激发光进行照明，而将其他输出耦合端55用于借助随后用作照明光的荧光阻止光依序进行照明。
附图标记表
1 样本
2 照明点图案
3 照明点
4 单个光源
5 照明光束
6 成像光学器件
7 一次光源
8 光
9 分束器
10 SLM(空间光调制器)
11 光强度调制器
12 耦合光学器件
13 光纤
14 光纤束
15 光纤束14的出口端
16 共轭平面
17 相位调制器
18 中间图像平面
19 射束偏转装置
20 可调镜对
21 光轴
22 扫描透镜
23 管透镜
24 显微镜物镜
25 空位
26 光纤
27 第一照明点
28 第二光纤
29 第二照明点
30 第三照明点
31 第四光纤
32 第四照明点
33 第一焦点
34 第二焦点
35 第三焦点
36 第四焦点
37 耦合光学器件
38 图像平面
39 套筒
40 主分束器
41 检测光束
42 透镜
43 检测光纤
44 第三光纤
45 检测光纤束
46 套筒
47 变焦光学器件
48 第一透镜
49 可调透镜
50 第二透镜
51 第三透镜
52 中间图像平面
53 准直仪
54 焦平面
55 光纤13的输出耦合端
56 检测光纤束
57 第一输出耦合端
58 第二输出耦合端
59 第三输出耦合端
Claims (65)
1.一种借助照明光在显微镜、特别是MINFLUX显微镜中对样本(1)进行点状照明的方法，其中在预定义或可预定义的照明点图案(2)的照明点(3)处依序对所述样本(1)进行照明，其特征在于，所述照明点图案(2)的横向延伸小于所述照明光的最长波长并且始终仅时间上错开地对所述照明点(3)进行照明，所述照明点图案(2)的每个照明点(3)均对应有多个单个光源(4)中的一个固有的单个光源并且借助每个照明点(3)所对应的单个光源(4)的照明光束(5)的焦点对每个照明点(3)进行照明。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述照明点图案(2)的横向延伸小于所述照明光的最长波长的一半。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，照明点(3)与其紧邻的照明点(3)中的每一个之间的距离均小于λ/NA，其中λ是所述照明光的最长波长，NA是产生所述照明光束(5)的焦点的成像光学器件(6)的数值孔径。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，
a.所述照明点图案(2)的照明点(3)中的至少三个处于一条直线上，或者
b.所述照明点图案(2)的所有照明点(3)均处于一条直线上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，
a.所述照明点图案(2)的所有照明点(3)均位于共用的平面中，或者
b.所述照明点图案(2)的所有照明点(3)均位于共用的平面中并且形成笛卡尔或六边形照明点图案(2)，或者，照明点(3)位于三角形或四边形的角部处并且可选地位于其中心处。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述照明点图案(2)的照明点(3)并非位于共用的平面中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
a.所述照明点图案(2)的照明点(3)位于四面体、六面体或八面体的角部处并且可选地位于其中心处，和/或
b.所述照明点图案(2)是三维照明点图案(2)，例如立方照明点图案(2)或立方体心照明点图案(2)或立方面心照明点图案(2)或包括八面体的照明点图案(2)或包括四面体的照明点图案(2)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，除借助所述相应照明光束(5)的焦点进行照明外，借助其他光分别对所述照明点(3)进行照明。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
a.所述其他光具有与所述照明光束(5)不同的波长，和/或
b.所述其他光的光束分别具有焦点，其中所述另一光束(5)的焦点具有与所述照明光束(5)的焦点不同的形状，和/或
c.所述其他光的光束分别具有焦点，其中所述另一光束(5)的焦点具有与对同一照明点进行照明的所述照明光束(5)的焦点互补的强度分布，和/或
d.所述照明光束(5)的焦点具有强度最小值，所述其他光的光束的焦点在对同一照明点进行照明的所述照明光束(5)的焦点具有所述强度最小值的位置处具有强度最大值。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述照明光束(5)由激发光和荧光阻止光构成并且
a.借助所述激发光的焦点和所述荧光阻止光的焦点同时对所述照明点(3)进行照明，或者
b.借助所述激发光的焦点和所述荧光阻止光的焦点时间上错开地对所述照明点(3)进行照明。
11.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其特征在于，所述其他光是荧光激发光，所述照明光束(5)是荧光阻止光束。
12.根据权利要求8、9或11中任一项所述的方法，其特征在于，
a.从所述单个光源(4)发射所述其他光，或者
b.从其他单个光源(4)发射所述其他光，其中所述照明点图案的不同照明点(3)分别对应有多个其他单个光源(4)中的固有的单个光源。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述照明光束(5)的焦点具有强度最小值。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，
a.所述照明光束(5)的焦点具有包括中心的强度最小值的三维结构，所述强度最小值是横向和轴向的强度最小值，和/或
b.所述照明光束的焦点是3D环圈。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，将所述照明光束(5)和/或所述另一光束通过具有不同长度的光程长度的光路导引至所对应的照明点(3)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其特征在于，所述照明点图案(2)的每个照明点(3)处的照明持续时间均为最大50μs，特别是最大10μs，尤其特别是最大5μs。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于，
a.所有照明点(3)处的焦点内的照明强度和/或强度分布都是相同的，或者
b.所有照明点(3)处的焦点内的照明强度和/或强度分布是不同的。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其特征在于，重复实施所述方法。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述照明点(3)处的照明强度和/或强度分布根据已实现的对所述照明点(3)的依序照明的重复次数而改变。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其特征在于，在光输出和/或波长的脉冲持续时间和/或所对应的照明点(3)的位置处的焦点的形状方面对每个单个光源(4)的照明光单独进行调节。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其特征在于，所述单个光源(4)中的每一个均由发射所述照明光束(5)中的一个的相应一次光源(7)，特别是激光器或半导体激光器构成。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其特征在于，通过将一次光源(7)的光(8)在空间上分成所述照明光束(5)来形成所述单个光源(4)。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述一次光源(7)发射脉冲光(8)。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于，通过将所述一次光源(7)的光(8)的不同光分量耦合至不同光纤(13)中来实现空间上分开。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其特征在于，通过借助所述一次光源(7)的光(8)对包含多个光纤(13)的光纤束的一端进行照明来实现空间上分开。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其特征在于，将每个照明光束(5)耦合至固有的光纤(13)中。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其特征在于，将所述光纤(13)的输出耦合端(55)成像到所述照明点(3)中。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述光纤(13)具有不同的长度。
29.根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于，通过借助所述一次光源(7)的光(8)对微镜阵列的多个镜子进行照明来实现空间上分开。
30.一种检查样本(1)的方法，其特征在于，借助根据权利要求1至29中任一项所述的方法对所述样本(1)进行照明，所述照明点图案(2)的不同照明点(3)分别对应有点检测器，所述点检测器检测从相应照明点(3)发出的检测光，特别是荧光。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，每个点检测器均由检测光纤(43)和下游的单个检测器构成，使得所述照明点图案(2)的不同照明点(3)分别对应有固有的检测光纤(43)并且从相应照明点(3)发出的检测光(8)被耦合至其所对应的检测光纤(43)中。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其特征在于，借助可调的射束偏转装置(19)在进行照明之前和/或期间相对于所述样本(1)对所述照明点图案(2)进行定位。
33.一种在样本中对荧光标记分子进行定位的方法，其特征在于，依照根据权利要求1至32中任一项所述的方法对所述样本进行照明并且分别测量从所述被照明的样本区域发出的荧光量。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，在考虑到
a.所述照明光束(5)的对各个照明点(3)进行照明的焦点的强度分布和/或所述其他光的对所述各个照明点(3)进行照明的焦点的强度分布和/或形成所述照明光束(5)的激发光和荧光阻止光的焦点的相应强度分布以及
b.分别测得的荧光量的情况下，测定荧光标记分子距所述照明点(3)中的一个的距离。
35.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，在考虑到
a.所述照明光束(5)的对所述各个照明点(3)进行照明的焦点的强度分布和/或所述其他光的对所述各个照明点(3)进行照明的焦点的强度分布和/或形成所述照明光束(5)的激发光和荧光阻止光的相应焦点的相应强度分布以及
b.分别测得的荧光量的情况下，测定所述荧光标记分子相对于所述照明点图案(2)的位置。
36.一种装置，适于实施根据权利要求1至35中任一项所述的方法。
37.用于在显微镜、特别是MINFLUX显微镜中对样本(1)进行点状照明的装置，特别是根据权利要求36所述的装置，其中照明点图案(2)是可预定义的，能够在所述照明点图案的照明点(3)处依序对所述样本(1)进行照明，其特征在于，所述照明点图案(2)的横向延伸小于所述照明光的最长波长，特别是小于所述照明光的最长波长的一半，所述照明点图案(2)的每个照明点(3)均对应有多个单个光源(4)中的一个固有的单个光源，其中所述单个光源(4)中的每一个均发射聚焦至所述单个光源所对应的照明点(3)上的照明光束(5)，并且控制装置对照明进行控制，使得始终仅时间上错开地对所述照明点图案(2)的各个照明点(3)进行照明。
38.根据权利要求36或37所述的装置，其特征在于，
a.所述单个光源(4)分别发射多个波长的照明光，和/或
b.所述单个光源(4)相对于彼此发射不同波长的照明光。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的装置，其特征在于，另外借助另一光束的焦点分别对所述照明点(3)进行照明，其中
a.从所述单个光源(4)发射所述另一光束，或者其中
b.从其他单个光源(4)发射所述另一光束，其中所述照明点图案(2)的不同照明点(3)分别对应有多个其他单个光源(4)中的一个固有的单个光源。
40.根据权利要求39所述的装置，其特征在于，
a.所述另一光束具有与对同一照明点进行照明的照明光束(5)不同的波长，和/或
b.所述另一光束(5)的焦点具有与对同一照明点进行照明的照明光束(5)的焦点不同的形状，和/或
c.所述另一光束的焦点与对同一照明点进行照明的照明光束(5)的焦点互补的强度分布，和/或
d.所述照明光束(5)的焦点具有强度最小值，所述另一光束的焦点在所述照明光束(5)的焦点具有所述强度最小值的位置处具有强度最大值。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的装置，其特征在于，
a.所述照明光束(5)和/或所述其他光束的光路的光程长度有所不同，或者
b.所述照明光束(5)的光路的光程长度能够共同或单独进行调节，或者
c.所述照明光束(5)和/或所述其他光束的光路的光程长度有所不同并且所述光程长度的差别引起不同照明光束(5)的连续的照明光脉冲的至少3ns，特别是至少10ns的时间延迟。
42.根据权利要求36至41中任一项所述的装置，其特征在于，所述照明点图案(2)的每个照明点(3)处的照明持续时间是能够调节的和/或所述照明点图案(2)的每个照明点(3)处的照明持续时间均为最大50μs，特别是最大10μs，尤其特别是最大5μs。
43.根据权利要求36至42中任一项所述的装置，其特征在于，所述照明光束(5)的照明强度和/或所述照明光束(5)和/或所述其他光束(5)的焦点中的强度分布能够单独或共同进行调节。
44.根据权利要求36至43中任一项所述的装置，其特征在于，在每个照明光束(5)和/或其他光束(5)的光路中布置有单独的光强度调制器(11)。
45.根据权利要求44所述的装置，其特征在于，
a.所述光强度调制器(11)构建为液晶SLM(10)或微镜阵列，或者
b.所述光强度调制器(11)构建为声光光强度调制器(11)或光电光强度调制器(11)或液晶调制器。
46.根据权利要求36至45中任一项所述的装置，其特征在于，所述单个光源(4)中的每一个均由相应的一次光源(7)，特别是激光器或半导体激光器构成。
47.根据权利要求36至46中任一项所述的装置，其特征在于，每个照明光束(5)均通过光纤(13)而被导引和/或不同照明光束(5)始终通过不同的光纤(13)而被导引。
48.根据权利要求36至47中任一项所述的装置，其特征在于，所述单个光源(4)通过将一次光源(7)的光在空间上分成所述照明光束(5)而形成。
49.根据权利要求48所述的装置，其特征在于，所述一次光源(7)发射脉冲光(8)。
50.根据权利要求48或49所述的装置，其特征在于，通过将所述一次光源(7)的照明光的不同光分量耦合至不同光纤(13)中来实现空间上分开。
51.根据权利要求47至50中任一项所述的装置，其特征在于，
a.所述光纤(13)合并成光纤束(14)，或者
b.所述光纤(13)合并成光纤束(14)并且相对于彼此布置在笛卡尔或六边形网格中。
52.根据权利要求47至51中任一项所述的装置，其特征在于，所述光纤(13)构建为单模光纤或保偏光纤。
53.根据权利要求47至52中任一项所述的装置，其特征在于，设有成像光学器件(6)，所述成像光学器件将所述光纤(13)的输出耦合端(55)成像到所述照明点(3)中。
54.根据权利要求47至53中任一项所述的装置，其特征在于，所述光纤(13)具有不同的长度。
55.根据权利要求47至54中任一项所述的装置，其特征在于，至少两个光纤(13)的输出耦合端(55)布置在不同光学平面中。
56.根据权利要求48或49所述的装置，其特征在于，通过借助所述一次光源(7)的光(8)对微镜阵列的多个镜子进行照明来实现空间上分开。
57.根据权利要求36至56中任一项所述的装置，其特征在于，设有成像光学器件(6)，所述成像光学器件将所述照明光束(5)成像到所述照明点(3)中。
58.根据权利要求57所述的装置，其特征在于，
a.所述成像光学器件(6)具有相位调制器(17)，和/或
b.所述成像光学器件(6)包含变焦光学器件，借助所述变焦光学器件能够改变所述成像光学器件(6)的成像比例，和/或
c.所述成像光学器件(6)具有焦距可调的透镜(42)和/或可变形的反射镜和/或SLM(10)，和/或
d.所述成像光学器件(6)将至少两个照明光束(5)聚焦到所述样本(1)内的不同光学平面中。
59.根据权利要求57或58所述的装置，其特征在于，照明点(3)与其紧邻的照明点(3)中的每一个之间的距离均小于λ/NA，其中λ是所述照明光束(5)的最长波长，NA是所述成像光学器件(6)的数值孔径。
60.根据权利要求36至59中任一项所述的装置，其特征在于，在所述照明光束(5)和/或所述其他光束的光路中设有可调的射束偏转装置，借助所述射束偏转装置能够在进行照明之前和/或期间相对于所述样本(1)对用于对所述照明点图案(2)进行照明的照明光束(5)和/或其他光束的焦点进行定位。
61.一种用于检查样本(1)的显微镜，特别是MINFLUX显微镜，其特征在于，所述显微镜具有根据权利要求36至60中任一项所述的装置，所述照明点图案(2)的不同照明点(3)分别对应有点检测器，所述点检测器检测从相应照明点(3)发出的检测光，特别是荧光。
62.根据权利要求61所述的显微镜，其特征在于，每个点检测器均由检测光纤(43)和下游的单个检测器构成。
63.根据权利要求62所述的显微镜，其特征在于，所述检测光纤(43)合并成检测光纤束(45)。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的显微镜，其特征在于，在考虑到
a.所述照明光束(5)的对所述各个照明点(3)进行照明的焦点的强度分布和/或所述其他光的对所述各个照明点(3)进行照明的焦点的强度分布和/或形成所述相应照明光束(5)的激发光和荧光阻止光的相应焦点的相应强度分布以及
b.所述分别测得的荧光量的情况下，分析装置测定荧光标记分子相对于所述照明点图案(2)的位置。
65.一种将根据权利要求1至35中任一项所述的方法或根据权利要求36至60中任一项所述的装置或根据权利要求61至64中任一项所述的显微镜用于对荧光标记进行三维定位的用途，特别是在MINFLUX显微术中。
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