JP5302220B2 - 共焦点レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、共焦点レーザ顕微鏡に関する。

レーザ走査システムでは、様々な出力レベルのレーザが使用される。さらにレーザ走査システムは、検出器としてまたは照明のために用いられる数多くの変更可能なモジュールを特徴としている。共焦点の走査型顕微鏡はレーザ・モジュールを含んでおり、このレーザ・モジュールは、様々な波長の照明光を生成する複数のレーザ放射線源から成ることが好ましい。その中で照明用放射線としての照明光が結合される走査機構は、照明用放射線を放射線偏向により、顕微鏡ユニットの顕微鏡ステージ上にある試料の上へと案内するため、主カラー・スプリッタ、ｘ−ｙスキャナおよび走査対物レンズを備えている。こうして生成された、試料から来る測定光放射線は、主カラー・スプリッタおよび結像光学系を介して、検出路の少なくとも１つの共焦点検出絞り（検出ピンホール）に方向付けられる。

図１には、走査型レーザ顕微鏡（ＬＳＭ）のこのような放射線経路が概略的に示されている。ここではモジュール、すなわち、光源、走査モジュール／検出ユニットおよび顕微鏡が示されている。これらのモジュールを以下に詳しく説明する。これに加えて独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書（Ａ１）を援用する。プレパラート中の様々な色素を特異的に励起させるために、ＬＳＭでは様々な波長のレーザが用いられる。励起波長の選択は、検査する色素の吸収特性に基づいて行われる。励起放射線は光源モジュールで発生させる。その際に、様々なレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が用いられる。さらに光源モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強度調整が、例えば音響光学結晶を用いて行われる。続いて、レーザ光線は、ファイバまたは適切なミラー構成を介して走査モジュールに達する。光源で発生したレーザ光線は、回折を制限されて、スキャナ、走査光学系、および鏡筒レンズを経由し、対物レンズによってプレパラートに集束される。焦点は点状で、試料をｘ−ｙ方向にラスタ走査する。試料を走査する際の１ピクセル滞在時間は、大抵の場合、１マイクロ秒未満から数百マイクロ秒までの範囲にある。蛍光の共焦点検出（デスキャン検出（ｄｅｓｃａｎｎｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ））の場合、焦点面（試料（Ｓｐｅｃｉｍｅｎ））から、ならびにその上および下にある平面から放出される光は、スキャナを経由して２色性ビーム・スプリッタ（ＭＤ）に達する。ビーム・スプリッタは、蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、焦点面に対する共役面に正確に存在する絞り（共焦点絞り／ピンホール）上に集束される。これにより焦点の外にある蛍光部分が抑制される。絞りのサイズを変えることで、顕微鏡の光学解像度を調整することができる。絞りの後ろには、更なる２色性のブロック・フィルタ（ＥＦ）があり、このフィルタがもう一度、励起放射線を抑制する。ブロック・フィルタを通過した後に、蛍光は、点検出器（ＰＭＴ）によって測定される。多光子吸収を用いる場合、色素の蛍光発光の励起は、励起強度が特に高い小さな体積で行われる。この領域は、共焦点構成を用いる場合に検出される領域よりほんの少しだけ大きい。したがって、共焦点絞りの使用を省略し、検出を対物レンズの直後に行ってもよい（非デスキャン検出）。

多光子吸収によって励起された色素の蛍光を検出するための更なる構成では、さらにデスキャン検出が行われるが、但し今回は対物レンズの瞳が検出ユニットに結像される（非共焦点のデスキャン検出）。

３次元で照明された画像から、対応する１光子吸収または多光子吸収と関連する両方の検出構成によって、対物レンズの焦点面にある平面（光切断面）のみが再現される。ｘ−ｙ面における試料の様々な深さｚでの複数の光切断面を記憶することによって、続いて計算機を用いて試料の３次元画像を生じさせることができる。したがってＬＳＭは、肉厚のプレパラートの検査に適している。励起波長は、使用された色素の固有の吸収特性によって決まる。色素の放出特性に合わせられた２色性フィルタは、それぞれの色素から出た蛍光だけが点検出器によって測定されることを保証する。

生物医学の応用分野では、現在、細胞の複数の異なる領域が、異なる色素によって同時に標識される（マルチ蛍光）。現況技術では、それぞれの色素は、異なる吸収特性、または異なる放出特性（スペクトル）に基づいて別々に検出できる。そのために、副ビーム・スプリッタ（ＤＢＳ）を用いて複数の色素の蛍光を追加的に分離し、それぞれの色素放出を別々の点検出器（ＰＭＴｘ）で別々に検出する。カールツァイスマイクロイメージング社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｏＩｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ）のＬＳＭ ＬＩＶＥは、毎秒約１２０の画像を生成する非常に速いライン・スキャナを実現している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｅｉｓｓ．ｄｅ／ｃ１２５６７ｂｅ００４５９７９４／Ｃｏｎｔｅｎｔｓ−Ｆｒａｍｅ／ｆｄ９ｆａ００９０ｅｅｅ０１ａ６４１２５６ａ５５００３６２６７ｂ参照）。光源モジュールと走査モジュールとの接続は、通常は光ファイバを介して行われる。独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書からは、光導波路の放出口から顕微鏡の放射線経路内にレーザ光を結合するために、変位可能なコリメーション光学系を設けることが知られている。例えば、ＵＶ照明（例えば４０５ｎｍ）の、差込み可能なグラス・ファイバ結合の後ろに、ちょうどその時に使用される対物レンズの縦色収差を補整する可動コリメータが配置されており、これによりＵＶおよび可視光の焦点は再び１つの平面内にある。その際、可動コリメータは、それぞれの対物レンズのために別の位置に動かされる。独国特許出願公開第１０３６１１７６号明細書（Ａ１）には、ファイバ・プラグ内の静的コリメータ・レンズが記載されている。輸送目的のため、欠陥のあるファイバの交換の際、および別のレーザの結合があり得る際にも、アライメントなしでの取外しおよび再度の差込みが可能なグラス・ファイバ結合の要求がある。独国特許発明第１９８２９９８８号明細書からは、確かに複数の空間方向でのファイバ・アライメントが知られているが、但しこれは比較的費用がかかる。

しかしながら、アライメントをなくすという要求は、技術的な困難を生じさせる。例えば波長４０５ｎｍ用の通常の単一モードのグラス・ファイバは、典型的には３．５μｍのモード・フィールド径および０．１の開口数を有している。これは、アライメントの不要な再現可能な差込みのためには、このファイバを走査ヘッドに繰り返し差し込む際に明らかに１μｍ未満の位置精度で位置決めしなければならないこと、その一方で角度精度はわずか１０ｍｒａｄの範囲内でなければならないことを意味する。個別にファイバを介して直接的に走査ヘッド内に結合される異なる波長の横方向の重畳を保証するか、またはシステム瞳に対するレーザ放射線の位置決め精度を保証するためには、簡単な、つまり１μｍより明らかに改善されたグラス・ファイバ差込みが再現可能でなければならず、これは現実的には、常識的な機械的アライメントの労力によってはほとんど実現不可能である。

走査型レーザ顕微鏡（ＬＳＭ）を概略的に示す図。 本願発明の基本構造を示す図。 プラグがＬＳＭの走査ヘッドのハウジング壁ＧＷに差し込まれ、走査ヘッド内に可動コリメータ（レンズＫＯ）が設けられた状態を示す図。 ３段式のコリメーションを概略的に示す図。

本発明は、１つだけの変位可能なレンズを介したコリメーションの代わりに、２つまたは３つのレンズによるコリメーション（最後のレンズの移動による）を使用することにある。基本構造は図２に示されている。ファイバを直接的に走査ヘッドに差し込む代わりに、ファイバＦおよびレンズＬ１から成るコンパクトな（差込み）ユニットを使用し、このファイバおよびレンズは、ハウジングＧ内で支持されて固定的に互いに接続されて一緒に差し込まれる。ファイバＦはハウジング内で固定的に保持されており、このハウジングはレンズＬ１のためのフレームを有している。このプラグ内で、グラス・ファイバは例えば３．５μｍのモード・フィールド径および０．１の開口数を有し得る。レンズは、ｆ＝１５ｍｍの焦点距離を有し、かつファイバ端から１０ｍｍ離れ得、これにより放射線は、平行ではなく放射角でレンズから出射する。この場合には、放出放射線の開口数は約０．０３３３であろう。つまりレンズは僅かにデフォーカスされている。このプラグはこの状態で、ＬＳＭの走査ヘッドのハウジング壁ＧＷに差し込むことが可能であり、この走査ヘッド内には、上述のように可動コリメータ（レンズＫＯ）がある。これは図３に示されている。

この場合、コリメータ・レンズは、例えばｆ＝５０ｍｍの焦点距離を有し、かつ「ゼロ・ポジション」においてプラグ・レンズＬ１の２０ｍｍ後ろにあり得る。ゼロ・ポジションとは中央の位置に相当し（例えば計算によって確定される）、この位置の周りでレンズＫＯが変位され得る。この位置において、コリメータの後ろに平行な放射線が生じるであろう。つまり、固定的にファイバと接続された第１の集光レンズと、機器内に配置された変位可能な第２の集光レンズとから成る２段式のシステムによってようやく、コリメートされた放射線が得られる。この構成での利点は、とりわけ、無限遠放射線内での差込みおよび取外しが可能なように、巧みなやり方で２つのレンズを配置することであり、なぜなら、集光レンズの焦点内にあるシングル・モード・ファイバの差込みおよび取外しの場合よりもかなり緩い公差が生じるからである。使用するレンズ焦点距離は別の焦点距離であってもよい。第１のレンズの焦点距離は、とりわけ差込み工程の感度を決定する。長すぎる焦点距離は、システムの安定性に不利に影響を及ぼす。とりわけ、ここで考察した、３５５ｎｍ〜６７５ｎｍの波長領域でのシングル・モード伝送のためのコア径に関しては、コア径は２μｍ〜４μｍである。その際、第１のレンズの焦点距離は、理想的には１０ｍｍ〜１５ｍｍである。その際、第２のレンズの焦点距離は、第２のレンズの後ろで、コリメートされた場合の放射線がどのくらいの径を達成すべきかに応じて明らかとなる。この２段式システムは、全体的に、放射線をコリメートするために走査ヘッド内のシステムへの最良の接続が保証され得るように選択可能である。

こうしてコリメータの変位によって、対物レンズの縦色収差を補整することができ、これにより対象内での様々な色の焦点は再び１つの平面内にある。固定的にファイバ端と接続された第１のレンズにより、このプラグは今や、このプラグ内に比較的大きなモード・フィールド径および比較的小さな開口度のグラス・ファイバがあるかのように作用する。それによって、このプラグの位置決め精度への要求は、ファイバだけを保持しているプラグにより緩和されている。上に挙げた例では、位置精度への要求が３倍緩和された。このために、確かに角度への要求が同じ倍率で厳しくなったが（Ｌ１による放射角の縮小）、しかし、この場合、製造技術的に見ると、有利にも、より多くの遊隙がある。それぞれのレンズの焦点距離および位置に関する最良値は、適用、コリメータの必要な移動経路、プラグおよびジャックの可能な製造公差、ならびに全般的なデザイン要求に応じて、計算によってそれぞれ新たに決定しなければならず、上に挙げた値は１つの例だけを示している。２段式のシステムは確かに改善を可能にするが、しかしながら、位置アライメントへの要求は相変わらず高い。１段式の構造における０．５μｍの代わりに、例示的に提示した値ではなお１．５μｍを実現しなければならない。

位置精度に関する公差の本当に明らかな緩和（例えば１００倍）を得るためには、個々の焦点距離または間隔に関して相対的に実用的ではない値が必要である。第１のレンズは、例えば１５ｍｍの焦点距離を有し、かつファイバから１４．８５ｍｍ離れている可能性がある。その際、第２のレンズは、例えば２０００ｍｍの焦点距離を有するであろうし、かつゼロ・ポジションにおいて第１のレンズから５１５ｍｍ離れているであろう。

但し、これは、図４に概略的に描いた３段式のコリメーションによって、有利に改善し得る。
この場合はプラグが、プラグ自体から平行な放射線が出射するように構成されている（つまり、例えばｆ＝５ｍｍおよび焦点距離でのファイバ−レンズＬ１の間隔＝５ｍｍ）。ハウジング自体の中に、好ましくは固定的な第２のレンズＬ２がある（例えばプラグ内のレンズと正確に同じレンズ）。この２つのレンズＬ１、Ｌ２によって、ハウジング内の或る位置にファイバ端が結像され、この例では第２のレンズＬ２の５ｍｍ後ろである。ここで第３のレンズは再び可動コリメータＫＬであり、このコリメータは、残りの光学系の要求に応じて形成することができ、例えばｆ＝１０ｍｍの焦点距離で形成し得る。この構成の利点は、プラグから平行な光放射線が出射するので、差込みの位置精度への要求が非常に大幅に緩和されることである。

まとめると本発明は、
・ファイバ・プラグと、可動コリメータとから成る組合せに関しており、このファイバ・プラグ内ではグラス・ファイバがレンズと固定的に接続されている。
・可動コリメータを備えた２段式のコリメーション光学系と、（放出口での平行な放射線経路を備えた）ファイバ・コリメータとからなる組合せに関する。焦点距離および間隔の具体的な値は、本発明の枠内で変化させ得る。レンズとして、必要な結像品質に応じて非常に様々なレンズ（球面、非球面、平凸、両凸など）が使用され得る。レンズとして、必要な結像品質に応じて単一レンズまたは接合光学素子が使用され得る。プラグの実施形態は、ほぼ任意に変化させ得る（差込み継手、キャップナット、ＦＣ形プラグなど）。

Claims (12)

1. 共焦点レーザ顕微鏡であって、
   少なくとも１つのレーザであって、該レーザの照明光が、少なくとも１つの光ファイバを介して顕微鏡対物レンズの方向に伝送される、前記少なくとも１つのレーザと、
   少なくとも部分的に変位可能なコリメーション光学系を含む第１のハウジングとを備える共焦点レーザ顕微鏡において、
   該第１のハウジングに差込み可能な第２のハウジングが設けられており、該第２のハウジング内に該光ファイバが突出しており、かつ該第２のハウジングには、その該ファイバに面していない端部において、該第１のハウジング内にある前記少なくとも部分的に変位可能なコリメーション光学系の方向に該第２のハウジング内の該ファイバから拡散性を有して出射するレーザ光を伝送するための第１の光学系が設けられていることを特徴とする共焦点レーザ顕微鏡。
2. 前記第１の光学系が１つのレンズから成る、請求項１に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
3. 拡散性の放射線束を生成するための前記第１の光学系が、その焦点距離より少ない間隔をあけて、ファイバ端から離れて配置される、請求項１または２に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
4. 前記第１の光学系と前記コリメーション光学系との間に少なくとも１つの第２の光学系が配置される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
5. 前記コリメーション光学系が、第１の不動のレンズおよび第２の変位可能なレンズを含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
6. 平行な放射線束を生成するための前記第１の光学系が、その焦点距離の間隔をあけて、ファイバ端から離れて配置される、請求項１、２、４および５のいずれか１項に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
7. 少なくとも一つの第２の光学系が前記第１の光学系と前記コリメーション光学系との間に配置され、該コリメーション光学系が第１の不動のレンズおよび第２の変位可能なレンズを含み、前記第２の光学系または前記コリメーション光学系の前記第１の不動のレンズが、前記第１の光学系の平行な放射線束内に配置される、請求項１に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
8. 前記第２の光学系の焦点と、前記顕微鏡の方向に平行束を生成するための前記コリメーション光学系の焦点とが重なり合う、請求項４または７に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
9. 共焦点レーザ顕微鏡であって、
   少なくとも１つのレーザであって、該レーザの照明光が、少なくとも１つの光ファイバを介して顕微鏡対物レンズの方向に伝送される、前記少なくとも１つのレーザと、
   コリメーション光学系を含む第１のハウジングとを備える共焦点レーザ顕微鏡において、
   該第１のハウジングに差込み可能な第２のハウジングが設けられており、該第２のハウジング内に該光ファイバが突出しており、かつ該第２のハウジングには、その該ファイバに面していない端部において、該第１のハウジング内にある前記コリメーション光学系の方向に該第２のハウジング内の該ファイバから拡散性を有して出射するレーザ光を伝送するための第１の光学系が設けられており、
   その際、該第１の光学系と該コリメーション光学系との間に少なくとも１つの第２の光学系が配置されるか、または該コリメーション光学系が、第１の不動のレンズおよび第２の変位可能なレンズを含むことを特徴とする共焦点レーザ顕微鏡。
10. 平行な放射線束を生成するための前記第１の光学系が、該第１の光学系の焦点距離の間隔をあけて、ファイバ端から離れて配置される、請求項９に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
11. 前記第２の光学系または前記コリメーション光学系の前記不動のレンズが、前記第１の光学系の平行な放射線束内に配置される、請求項１０に記載の共焦点レーザ顕微鏡。
12. 前記第２の光学系の焦点と、前記顕微鏡の方向に平行束を生成するための変位可能な前記コリメーション光学系の焦点とが重なり合う、請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の共焦点レーザ顕微鏡。

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