JP2009014838A - 走査型共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】入射光切り替え機構による光源の切り替え、切り替え式光学部材の切り替えに伴って発生する、結像レンズの結像点の位置ずれを迅速に補正することが可能な走査型共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】入射切り替え部３の光学部材、及び励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー切り替え部５の各ポジションでの集光位置のズレ量を装置出荷前に求め、その補正値をＣＰＵ２０のメモリ２１に記憶させておく。そして、入射切り替え部３の光学部材、及び励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー部切り替え部５がある所定のポジションとされたら、ＣＰＵ２０が対応する補正値に基づいてモータ１３、１４を駆動し、集光レンズ１０をｘ軸方向、ｙ軸方向に２次元的に移動させる。このことにより、常に、集光レンズ１０の焦点位置が遮光板１１上の開口中心と一致するようにすることができる。これにより、光量ロスのない共焦点顕微鏡とすることができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、走査型共焦点顕微鏡に関するものである。

走査型共焦点顕微鏡においては、点光源からの光をスキャナにより走査光に変換して、点光源と共役な位置に置かれた標本上に集光させ、その際に標本から発生する反射光や蛍光を、前記スキャナを逆に通過させることにより非走査光に変換し、これを集光レンズにより、標本と共役な位置（点光源とも共役な位置）におかれたピンホール上に集光させ、ピンホールを通過した光を受光装置で受光して、スキャナの動きを勘案して２次元画像を形成している。

このような走査型共焦点顕微鏡においては、使用する照明光の波長を変えるために複数の光源を有し、入射光切り替え機構の光学部材によりにより選択された波長の光により照明を行うものがある。又、試料から発生する反射光を除去し、試料から発生する蛍光のみによる像を得たいときは、ダイクロイックミラー等を使用して波長の分離を行っているが、照明光の波長が変わったとき、又は観察したい蛍光の波長が変わったときには、異なるダイクロイックミラーを使用しなければならないことがあり、この場合はダイクロイックミラー切り替え機構により、使用するダイクロイックミラーを切り替えて使用している。

ところが、入射光切り替え機構による光学部材の切り替え、ダイクロイックミラー切り替え機構によるダイクロイックミラーの切り替えの際に、光学部材、ダイクロイックミラーの微妙な位置ずれ等のために光軸がずれ、それに起因して、集光レンズによる光の集光点がピンホールの中心からずれてしまうという問題点があった。

この問題に対処する方法として、特開２００２−２６７９３３号公報（特許文献１）には、集光レンズを光軸に直交する方向に移動させることにより、ピンホールと集光点を合わせる方式が記載されている。
特開２００２−２６７９３３号公報

しかしながら、この方式は、調整方法が、取得画像を目視しながら、手動で輝度が最大となる点を探すという方法であったため、再現性が良くなかった。又、試行錯誤的な調整方法であるため、調整時間がかかるという問題点もあった。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、入射光切り替え機構による光学部材の切り替え、ダイクロイックミラー切り替え機構によるダイクロイックミラーの切り替えに伴って発生する、集光レンズの集光点の位置ずれを迅速に補正することが可能な走査型共焦点顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、
複数の光源と、
前記光源からの光を試料に集光する照明光学系と、
前記試料からの光を集光する集光光学系と、
前記集光光学系の集光位置に配置されたピンホール板とを備えた走査型共焦点顕微鏡であって、
前記照明光学系及び前記集光光学系のうち少なくとも一方は、透過する光の波長を選択する光学部材を備えた波長選択切り替え機構を有し、
前記波長選択切り替え機構の切り替えに伴って発生する、前記集光光学系の集光位置の位置ずれ量を予め記憶しておく記憶手段と、
前記記憶手段に記憶された前記位置ずれ量に基づいて、前記集光光学系のうち前記ピンホール板の前に配置された集光レンズの位置を移動させることにより前記集光位置の位置ずれを補正する補正機構とを備えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記波長選択切り替え機構は、前記複数の光源からの複数波長の光のうち前記試料へ入射させる波長を選択する光学部材を備えたもの、及び前記試料から発生する光のうち蛍光の波長を選択する光学部材を供えたもののうち、少なくとも一方であることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、前記第１の手段又は第２の手段の補正機構を、前記記憶手段に記憶された前記位置ずれ量に基づいて、前記ピンホール板を移動させることにより前記集光位置の位置ずれを補正する補正機構に置き換えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡である。

本発明によれば、入射光切り替え機構による光学部材の切り替え、ダイクロイックミラー切り替え機構によるダイクロイックミラーの切り替えに伴って発生する、集光レンズの集光点の位置ずれを迅速に補正することが可能な走査型共焦点顕微鏡を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態の１例である走査型共焦点顕微鏡の光学系の概要図を示す図である。光源１、２から出射したレーザ光は、入射切り替え部３で選択されたものが通過し、ビームエキスパンダ４で拡大され、励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー部切り替え部５（切り替え式光学部材）で反射される。

励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー切り替え部５の分光特性は励起レーザ光の波長を反射し、観察する蛍光試薬・蛋白に対応した蛍光波長を透過させるものであり、異なる波長特性のものが複数装着されている。本ユニットも入射切り替え部３と同様に電動で切り替えることが可能である。

励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー切り替え部５のダイクロイックミラー５ａで反射されたレーザ光は２つのガルバノメータで構成された走査部６に導入され、２次元走査光に変換される。２次元走査光とされたレーザ光は走査光学系７を通り、対物レンズ８によって標本９上に結像され、標本９を２次元的に走査する。点光源である光源と、標本９の表面は共役とされており、走査光は点状の照射光となる。

標本９上の照射領域から発した蛍光は再び対物レンズ８で集められ、励起レーザ光と逆の順路を進み、走査部６を逆に通って非走査光に変えられ、ダイクロイックミラー５ａに入射する。蛍光はダイクロイックミラー５ａを透過し、集光レンズ１０で開口（ピンホール）１１ａを有する遮光板１１上に集光される。標本９の表面と遮光板１１の開口１１ａとは共役な位置関係にある。遮光板１１上の開口１１ａを通過した光のみが光検出器１２で検出され、輝度データとして使われる。

ところで、前述のように、入射切り替え部３の光学部材、または励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー切り替え部５のダイクロイックミラー５ａを切り替えるごとに光学部材自身の角度精度、装置の切り替え精度に起因する角度誤差により、集光レンズ１０の焦点位置が遮光板１１上の開口１１ａ中心と一致しなくなると云う問題が生じてしまう。本実施の形態の集光レンズ１０は光軸と直交する方向に電動で移動できる機構を備えている。すなわち、集光レンズ１０は、光軸をｚ軸方向とする３次元直交座標系において、ｘ軸方向、ｙ軸方向に、それぞれモータ１３、１４によって、移動される。移動機構の詳細については後述する。

入射切り替え部３の光学部材、及び励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー切り替え部５の光学部材の各ポジションでの集光位置のズレ量を装置出荷前に求め、その補正値をＣＰＵ２０のメモリ２１に記憶させておく。そして、入射切り替え部３の光学部材３ａ、及び励起光・信号光（蛍光）分離用ダイクロイックミラー切り替え部５のダイクロイックミラー５ａがある所定のポジションとされたら、ＣＰＵ２０が対応する補正値に基づいてモータ１３、１４を駆動し、集光レンズ１０をｘ軸方向、ｙ軸方向に２次元的に移動させる。このことにより、常に、集光レンズ１０の焦点位置が遮光板１１上の開口１１ａの中心と一致するようにすることができる。これにより、光量ロスのない共焦点顕微鏡とすることができる。

図２に、本発明の実施の形態である走査型共焦点顕微鏡に用いられる集光レンズ１０の駆動部の例を示す。集光レンズ１０はＸ方向駆動ステージ５１上にあり、Ｘ方向駆動ステージ５１は、Ｘ方向ガイド５２、５３上を、モータ１３、カップリング５５、送りねじ５６により、Ｘ方向に移動することができる。このＸ方向駆動ステージはＹ方向駆動ステージ５８上にある。また、Ｙ方向駆動ステージ５８も同様に、Ｙ方向ガイド５９、６０上を、モータ１４、カップリング６２、送りねじ６３により、Ｙ方向に駆動することができる、上述の集光レンズ駆動機構には座標原点を求めるためにＸ、Ｙ各軸にリミットセンサ５７、６４が取り付けられている。

ＣＰＵ部２０は電源投入時に、以下の方法で原点検知を行う。Ｘ方向駆動ステージ５１のリミットセンサ５７方向に駆動し、Ｘ方向駆動ステージ５１とリミットセンサ５７が接触することにより、リミットセンサ５７はＣＰＵ部２０にリミット状態であることを通知する。この通知を受けたＣＰＵ部２０はリミットセンサ５７からある一定のパルス分駆動した位置をＸ方向の原点とする。Ｙ方向も同様にＹ方向駆動ステージ５８とリミットセンサ６４が接触状態にあることを検知し、ＣＰＵ部２０はリミットセンサ６４から一定のパルス分駆動した位置をＹ方向の原点とする。原点検知後はパルスモータのパルス数のみを制御することでＸ、Ｙの位置を高い再現性で制御することが可能となる。

図１の集光レンズ駆動機構を備えた共焦点顕微鏡において、装置出荷前にダイクロイックミラー部５と入射切り替え部３のポジション毎の全ての組み合わせにおいて、集光レンズ１０の焦点位置が遮光板１１上の開口１１ａの中心と一致する集光レンズ位置（Ｘ，Ｙ）をあらかじめ計測し、ＣＰＵ２０にあるメモリ２１に格納する。ＣＰＵ２０では、図３に示す形式でメモリに格納する（図３は、入射切り替え部３ポジション、ダイクロイックミラー切り替え部５のポジションにおける参照表である）。このときの補正値はパルスモータのパルス数としているため制御が簡単である。

上述した集光レンズ１０の補正値がメモリに格納されている場合の本体部１５のモータ制御は、図４に示すように以下のシーケンスで行う。

処理１…コンピュータ３０内のソフトウェア３１からの駆動指示により、ＣＰＵ２０は必要な駆動部材（入射切り替え部３、ダイクロイックミラー切り替え部５、集光レンズ１０の駆動部等）の選択を行う。

処理２…処理１で駆動する部材に入射切り替え部３あるいはダイクロイックミラー切り替え部５を駆動する場合、メモリ２１から集光レンズ補正パルス数を取得する。

処理３…処理１で選択された部材の駆動を開始する。集光レンズ１０の駆動量は処理２で取得した集光レンズ補正パルス数とする。

処理４…処理１で選択された全ての駆動部が停止して処理が完了となる。

例えば、入射切り替え部３のポジションが図３の１でダイクロイックミラー切り替え部５のポジションが図３の４の場合、集光レンズ１０はＸ方向にＸ４パルス、Ｙ方向にＹ４パルス駆動させることにより、集光レンズ１０の焦点位置が遮光板１１上の開口１１ａの中心と一致する。

なお、以上の実施の形態では、走査型共焦点顕微鏡が、入射切り替え部３とダイクロイックミラー切り替え部５の駆動部の両方を有する場合について説明したが、入射切り替え部３しか有しない場合は、入射切り替え部３の駆動位置のみに対応した補正値によって集光レンズ１０を駆動すればよく、ダイクロイックミラー切り替え部５の駆動部しか有しない場合には、ダイクロイックミラー切り替え部５の駆動部の駆動位置のみに対応した補正値によって集光レンズ１０を駆動すればよい。

又、以上の実施の形態の説明においては、集光レンズ１０の集光点と遮光板１１上の開口１１ａの中心を合わせるのに、集光レンズ１０の位置を移動させていたが、遮光板１１を移動させるようにしてもよく、その移動機構も図２に示す方式が、そのまま採用可能である。

本発明の実施の形態の１例である走査型共焦点顕微鏡の光学系の概要図を示す図である。 本発明の実施の形態である走査型共焦点顕微鏡に用いられる集光レンズの駆動部の例を示す図である。 補正値の格納方式の例を示す図である。 駆動部材を駆動するシーケンスを示す図である。

符号の説明

１…光源、２…光源、３…入射切り替え部、４…ビームエキスパンダ、５…ダイクロイックミラー切り替え部、６…走査部、７…走査光学系、８…対物レンズ、９…標本、１０…集光レンズ、１１…遮光板、１２…光検出器、１３…モータ、１４…モータ、２０…ＣＰＵ、２１…メモリ、３０…コンピュータ、３１…ソフトウェア、５１…Ｘ方向駆動ステージ、５２…Ｘ方向ガイド、５３…Ｘ方向ガイド、５５…カップリング、５６…送りねじ、５７…リミットセンサ、５８…Ｙ方向駆動ステージ、５９…Ｙ方向ガイド、６０…Ｙ方向ガイド、カップリング６２…カップリング、６３…送りねじ、６４…リミットセンサ

Claims (3)

1. 複数の光源と、
   前記光源からの光を試料に集光する照明光学系と、
   前記試料からの光を集光する集光光学系と、
   前記集光光学系の集光位置に配置されたピンホール板とを備えた走査型共焦点顕微鏡であって、
   前記照明光学系及び前記集光光学系のうち少なくとも一方は、透過する光の波長を選択する光学部材を備えた波長選択切り替え機構を有し、
   前記波長選択切り替え機構の切り替えに伴って発生する、前記集光光学系の集光位置の位置ずれ量を予め記憶しておく記憶手段と、
   前記記憶手段に記憶された前記位置ずれ量に基づいて、前記集光光学系のうち前記ピンホール板の前に配置された集光レンズの位置を移動させることにより前記集光位置の位置ずれを補正する補正機構とを備えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
2. 前記波長選択切り替え機構は、前記複数の光源からの複数波長の光のうち前記試料へ入射させる波長を選択する光学部材を備えたもの、及び前記試料から発生する光のうち蛍光の波長を選択する光学部材を供えたもののうち、少なくとも一方であることを特徴とする請求項１に記載の走査型共焦点顕微鏡。
3. 請求項１又は請求項２に記載の補正機構を、前記記憶手段に記憶された前記位置ずれ量に基づいて、前記ピンホール板を移動させることにより前記集光位置の位置ずれを補正する補正機構に置き換えたことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。

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