CN105445238A - 在激光扫描共聚焦显微镜上的单重态氧显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种在激光扫描共聚焦显微镜上的单重态氧显微成像方法，该方法的特征是，激光扫描共聚焦显微镜物镜有两端，一端为面向检测样品的样品端，另一端为激光入口端，在激光入口端前面放置一块二向分色镜，该二向分色镜将物镜样品端那一侧返回的单重态氧红外发光与样品的其它波段发光分离，单重态氧红外发光不经过激光扫描共聚焦显微镜的扫描头就到达激光扫描共聚焦显微镜的其中一个光探测器而实现成像；采用该方法，可在激光扫描共聚焦显微镜上获得单重态氧的发光强度成像和发光寿命成像，进而更方便于研究单重态氧与环境和生物体的相互作用。
Description
技术领域
本发明属于光学显微镜技术领域，具体涉及一种在激光扫描共聚焦显微镜上的单重态氧显微成像方法。
背景技术
单重态氧是处于第一电子激发态的氧气，其光谱学符号为O2(a1Δg)。众所周知，氧气广泛存在于我们周围的环境(大气、土壤和水体等)和生物体内,对环境和生物体有着至关重要的作用。作为氧气的第一电子激发态，单重态氧很容易在环境和生物体内产生，从而也会对环境和生物体产生深刻的影响。
目前，最为普遍的单重态氧检测方法是红外辐射法，该方法通过检测单重态氧跃迁到基态O2(X3Σg －)发出的1240nm－1340nm范围的红外发光来获得单重态氧的信息。相比于普通荧光，单重态氧的红外发光强度极其微弱。单重态氧的自发辐射寿命长达65分钟，而普通荧光的自发辐射寿命为几个纳秒，在发光分子数量同样多的情况下，单重态氧的红外发光强度仅为普通荧光强度的约10-12倍。因此，红外辐射法在对微尺寸样品，如细胞中的单重态氧检测时遇到了极大的困难，不仅是因为单重态氧的红外发光信号随样品尺寸的缩小而迅速降低，更因为它需要在显微镜平台下进行，这样才能够获得微尺寸样品中的单重态氧的准确发光位置和在该位置上的发光强度及发光寿命等信息。
目前，在显微镜系统上对微尺寸样品和细胞中的单重态氧检测已有报导。十几年前，PeterR.Ogilby等人就在一台普通荧光显微镜上实现了多聚物和细胞的单重态氧发光强度成像(AccountsOfChemicalResearch,37:894-901,2004)。相比于普通荧光显微镜，激光扫描共聚焦显微镜的优点是更高的分辨率、可对样品进行逐点扫描，不但可以获得每一点的发光强度，配以时间相关记录装置还可以测出每一点的发光寿命，从而得到单重态氧在样品中的动力学信息。但至今为止在激光扫描共聚焦显微镜上的单重态氧成像还未能实现，原因很可能是激光扫描共聚焦显微镜中的扫描头所导致，扫描头中的复杂光学元件会大幅度衰减本来就非常微弱的单重态氧红外发光，使之无法被扫描头后的光信号检测器所探测。
发明内容
本发明的目的是提供在激光扫描共聚焦显微镜上实现单重态氧显微成像的方法。采用该方法，可在激光扫描共聚焦显微镜上获得单重态氧的发光强度成像和发光寿命成像，进而更方便于研究单重态氧与环境和生物体的相互作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
激光扫描共聚焦显微镜物镜的两端，一端为面向检测样品的样品端，另一端为激光入口端，于物镜激光入口端的前方放置一块二向分色镜，该二向分色镜能够将经物镜收集后所形成的单重态氧红外发光光束与样品的其它波段发光光束分成两束光，单重态氧红外发光光束不经过激光扫描共聚焦显微镜的扫描头而到达激光扫描共聚焦显微镜的其中一个光探测器，转化成电信号被信号记录装置记录下来而获得样品的发光强度和发光寿命的显微成像；
所述单重态氧是指处于第一电子激发态的氧气分子O2(a1Δg)；
所述单重态氧红外发光是指单重态氧跃迁到基态O2(X3Σg －)时发出的波长范围为1240nm－1340nm的红外光。
为更好地收集单重态氧红外发光，同时兼顾更好地收集其它波段发光，二向分色镜应设置于激光入口端正前方，与物镜的焦平面的夹角在30°－60°之间，以45°为佳。
二向分色镜的特点是对某波段光高透过而对另一波段光高反射，吸收则很小而基本上可忽略。通常的二向分色镜是对短波长光有利于透过而对长波长光有利于反射。为有效地将单重态氧红外发光与样品的其它波段发光分离，要求二向分色镜在1240nm－1340nm波段的反射率在45％－99.99％，相应的透过率则在0.01％－55％。二向分色镜的入射角度以45°为佳。
为便于置入显微镜中，二向分色镜为方形或圆形，其边长或直径应限定在5mm－75mm之间，厚度在0.5mm－3mm之间。
实现单重态氧显微成像的先决条件是样品中存在单重态氧。在背景技术部分已提到，氧气广泛存在于我们周围的环境和生物体内，因此，在通常的环境下制备出来的样品或多或少都会含有氧气。在有些场合，样品还需要在更高氧气含量甚至纯氧气氛围下制备来提高样品中的氧气含量。在单重态氧显微成像中，单重态氧是由样品本身所含的氧气在紫外可见光光照以后经由光敏化过程产生的，事先需要往样品中加入单重态氧光敏剂，单重态氧光敏剂在样品中的质量分数在0.01ppm以上，或者如果样品本身就是单重态氧光敏剂，则质量分数为100％，单重态氧光敏剂具体为C60、C70、苯、卟啉中的一种或两种以上。
单重态氧的光敏化产生过程是这样的：紫外可见光照射光敏剂，处于自旋单重态的基态光敏剂分子吸收光子能量后变成自旋单重态的激发态光敏剂分子，由于具有共轭环结构，自旋单重态的激发态光敏剂分子很容易通过系间穿越过程转变为自旋三重态的激发态光敏剂分子，自旋三重态的激发态光敏剂分子最后把能量传递给氧气产生单重态氧。可以看出，单重态氧光敏剂对于单重态氧的产生是必不可少的，仅光照氧气本身并不会产生单重态氧，只有在单重态氧光敏剂存在的情况下，光照氧气才能产生单重态氧。
单重态氧光敏剂的结构特征是具有共轭环结构，这样，自旋单重态的激发态光敏剂分子才能够很容易地通过系间穿越过程转变为自旋三重态的激发态光敏剂分子。因此，所述的单重态氧光敏剂就是指在紫外可见光照射下能将氧气转变为单重态氧的具有共轭环结构的单质或有机物。由于单重态氧光敏剂的光吸收波段通常是300nm－780nm的紫外可见区，为有效产生单重态氧，激光扫描共聚焦显微镜的激发激光是300nm－780nm波段的紫外可见激光。为进行发光寿命测量，还要求激光扫描共聚焦显微镜所用的激光器是脉冲重复频率为1kHz－100MHz、脉冲宽度为10ps－10ns的脉冲激光器。
需要指出的是，取决于不同的环境，单重态氧红外发光的中心波长和范围均有所不同。在气相中，单重态氧红外发光是一个中心波长为1268nm、范围在1245nm－1295nm的发光。但在液相和固相的样品环境中，单重态氧红外发光的中心波长会发生红移，发光的波长范围也有所扩大。但无论如何，单重态氧红外发光均来自于O2(a1Δg→X3Σg －)自发辐射跃迁。
激光扫描共聚焦显微镜所用的光探测器是光电管、光电倍增管、光电二极管中的一种或二种以上，但为探测出极微弱的单重态氧红外发光，其中的光探测器D1是红外光电倍增管。
本发明的基本思路是：激光扫描共聚焦显微镜的扫描头极大地衰减了单重态氧红外发光，通过在物镜激光入口端那一侧加入二向分色镜，样品返回的单重态氧红外发光可不经过扫描头就被直接送给激光扫描共聚焦显微镜的其中一个光探测器D1，极大降低了单重态氧红外发光的衰减，从而可被显微镜的光探测器所检测。这样一来，由于单重态氧红外发光不经过扫描头，成像的分辨率自然就直接取决于物镜样品端那一侧焦点的激光光斑大小，虽然降低了成像分辨率，但却实现了单重态氧显微成像；即通过牺牲成像分辨率来换取单重态氧显微成像的实现。
有益技术效果
采用该方法，可在激光扫描共聚焦显微镜上获得单重态氧的发光强度成像和发光寿命成像，进而更方便于研究单重态氧与环境和生物体的相互作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
图1单重态氧显微成像装置示意图；其中，
1-倒置显微镜(1a-样品，1b-载物台，1c-物镜)、2-扫描头(2a-镜筒透镜，2b-扫描透镜，2c-扫描振镜)、3-皮秒脉冲激光器、4-光探测器(D1、D2、D3)、5-信号记录装置(时间相关单光子计数卡)、6-装有扫描控制卡和成像软件的计算机系统(6a-计算机和软件，6b-扫描控制卡)、7-二向分色镜、8-拍摄单重态氧发光光谱时红外CCD光谱仪的安放位置、9-红外CCD光谱仪、10-透镜；
图2单重态氧红外发光光谱；
图3单重态氧红外发光的衰减曲线；
图4单重态氧和光敏剂C60粉末的发光寿命成像和发光强度成像，其中，
A是单重态氧红外发光强度成像；
B是C60粉末的荧光强度成像；
C是单重态氧红外发光寿命成像；
D是C60粉末的荧光寿命成像；
E是单重态氧红外发光寿命分布图，寿命集中分布在3－4ms；
F是C60粉末的荧光寿命分布图，寿命集中分布在300－400ps。
具体实施方式
实施例1
单重态氧显微成像装置请参阅图1。该装置是在一台激光扫描共聚焦显微镜(以下简称LSC-FLIM)的基础上改装而成。LSC-FLIM由倒置显微镜1、扫描头2、皮秒脉冲激光器3、光探测器4、信号记录装置(时间相关单光子计数卡，即TCSPC卡)5、装有扫描控制卡和成像软件的计算机系统6共六部分构成。
倒置显微镜的主要功能是提供载物台和物镜。物镜将来自扫描头的激发光(以粗实线表示)聚焦到载物台的样品上，样品所产生的其它波段荧/磷光(以粗虚线和细虚线表示)和单重态氧红外发光(以细实线表示)又被物镜收集，并沿原来的激发光光路返回。
实现单重态氧显微成像的关键是在物镜激光入口端那一侧的激发块盒中加入45°放置的二向分色镜7，该二向分色镜在1240nm－1340nm波段的反射率在75％－90％之间，将单重态氧红外发光与样品的其它波段发光分离，单重态氧红外发光不经过扫描头2就被直接送给激光扫描共聚焦显微镜的其中一个光探测器D1，转化成电信号被信号记录装置5记录下来而实现单重态氧显微成像。而样品的其它波段荧/磷光在二向分色镜处与单重态氧红外发光分开后则回到扫描头中并被送入其它光探测器，如D2和D3。
扫描头2的功能是将皮秒脉冲激光器3所产生的皮秒激光脉冲引导到显微镜的物镜，并将激发产生的荧/磷光引导到光探测器4中去。扫描振镜(英文名Galvanometerscanningmirror)是扫描头的核心，它通过改变激光的方向来移动物镜后的激光焦点位置，从而实现在物镜焦平面上的逐点扫描功能。返回到扫描头中的荧/磷光在通过扫描振镜后被送入到其它光探测器，如D2和D3，转化成电信号被信号记录装置5记录下来而实现除单重态氧外的其它荧/磷光波段显微成像。
尽管扫描振镜移动了焦点在物镜焦平面上的位置，但根据光路可逆性原理可知，从扫描振镜出来以后的荧/磷光光路却是“静止的”，扫描振镜的移动并不会使荧/磷光光路相对于光探测器D2和D3发生偏移。因此，可通过加入针孔来过滤掉物镜非焦点位置的发光，使得只有焦点处的发光才能进入到光探测器D2和D3，最终实现共聚焦成像。而单重态氧红外发光由于没有经过扫描头，在扫描振镜移动时它的光路相对于光探测器D1会发生移动，无法通过加入一个固定的针孔来过滤非焦点处的发光，也就无法实现共聚焦成像。因此，单重态氧显微成像与其它荧/磷光波段显微成像的区别在于，前者的发光没有经过扫描头及扫描头中的针孔就直达光探测器，属于非共聚焦成像；而后者经过了扫描头及扫描头中的针孔后才到达光探测器，是共聚焦成像。
信号记录装置5可同时记录多路光探测器送出的电信号，从而实现多个光波段的显微成像。装有扫描控制卡和成像软件的计算机系统6协调控制整个LSC-FLIM。
在本实施例中，倒置显微镜1的型号为OlympusIX81；扫描头2、皮秒脉冲激光器3、光探测器D2和D3、信号记录装置5、装有扫描控制卡和成像软件的计算机系统6均来自Becker&HicklGmbH公司出品的DCS-120激光扫描共聚焦系统；探测单重态氧红外发光的光探测器D1来自于日本滨松(Hamamatsu)公司出品的R5509-43红外光电倍增管；二向分色镜7在1240nm－1340nm波段的反射率在90％以上(即透过率在10％以下)，由OmegaOpticalInc.公司出品；所用的样品为C60粉末。
将样品C60粉末置于显微镜载物台上，所选择的物镜为10倍数物镜，所选择的激光波长为405nm、脉冲重复频率为80MHz，选择样品某个小区域进行扫描，在光探测器D1前放置红外CCD光谱仪(IR-CCDspectrometer)9，采集得到如图2所示的单重态氧红外发光光谱；然后将红外CCD光谱仪9从光路中挪开，让单重态氧红外发光光谱直接进入光探测器D1中，将激光焦点固定在样品的某一点上，测量该点的单重态氧红外发光衰减，得到图3所示的单重态氧红外发光衰减曲线，拟合后给出的发光寿命为3ms；光谱的形状和发光寿命与文献(Langmuir2013,29,9051-9056)报道的单重态氧在C60晶格中的光谱和寿命一致，证实光探测器D1所接收到的光确实是单重态氧红外发光。
将10倍数物镜换成4倍数物镜，设定样品扫描区域大小为1mm×1mm，该区域的成像像素点数为64×64个，激光焦点在每个像素点的停留时间为15.62ms，同时利用单重态氧红外发光和C60荧光进行成像，单重态氧红外发光在D1光探测器成像，C60荧光在D2光探测器成像，成像结果如图4所示；A是单重态氧红外发光强度成像；C是单重态氧红外发光寿命成像；E是单重态氧红外发光寿命分布图，寿命集中分布在3－4ms，与文献(Langmuir2013,29,9051-9056)报道的单重态氧在C60晶格中的寿命相一致；B是C60粉末的荧光强度成像；D是C60粉末的荧光寿命成像；F是C60粉末的荧光寿命分布图，寿命集中分布在300－400ps。可见，本实施例实现了单重态氧显微成像，虽然它成像分辨率低于共聚焦的C60荧光成像。
实施例2
除以下内容外同实施例1。
设定样品扫描区域大小为1mm×1mm，该区域的成像像素点数为128×128个，相当于像素点的扫描间隔较实施例1的提高了1倍。
最终的成像结果与图4相类似，除了成像清晰度有所提高外。
实施例3
除以下内容外同实施例1。
设定样品扫描区域大小为1mm×1mm，该区域的成像像素点数为32×32个，相当于像素点的扫描间隔较实施例1的提高了1倍。
最终的成像结果与图4相类似，除了成像清晰度有所降低外。
Claims (8)
1.一种在激光扫描共聚焦显微镜上的单重态氧显微成像方法，其特征在于：激光扫描共聚焦显微镜物镜的两端，一端为面向检测样品的样品端，另一端为激光入口端，于物镜激光入口端的前方放置一块二向分色镜(7)，该二向分色镜能够将经物镜收集后所形成的单重态氧红外发光光束与样品的其它波段发光光束分成两束光，其中单重态氧红外发光光束不经过激光扫描共聚焦显微镜的扫描头而到达激光扫描共聚焦显微镜的其中一个光探测器D1，转化成电信号被信号记录装置(5)记录下来而获得样品发出的单重态氧红外发光强度和发光寿命的显微成像。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，二向分色镜在1240nm－1340nm波段的反射率为45％－99.99％，相应的透过率则为0.01％－55％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单重态氧是指处于第一电子激发态的氧气分子O2(a1Δg)；
所述单重态氧红外发光是指单重态氧跃迁到基态O2(X3Σg －)时发出的波长范围为1240nm－1340nm的红外光。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样品本身就是单重态氧光敏剂，或者检测信号前往样品中加入单重态氧光敏剂，单重态氧光敏剂具体为C60、C70、苯、卟啉中的一种或两种以上，单重态氧光敏剂在样品中的质量分数为0.01ppm－100％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，激光扫描共聚焦显微镜所用的激光器是300nm－780nm波段、脉冲重复频率为1kHz－100MHz、脉冲宽度为10ps－10ns的脉冲激光器(3)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，二向分色镜(7)设置于激光入口端正前方，与物镜的焦平面的夹角在30°－60°之间；二向分色镜(7)为方形或圆形，其边长或直径限定在5mm－75mm之间，厚度在0.5mm－3mm之间。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，二向分色镜(7)与物镜的焦平面的夹角优选为45°。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：光探测器为光电管、光电倍增管、光电二极管中的一种或二种以上，其中光探测器D1为红外光电倍增管。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180123 Termination date: 20200825 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |